CN108504725A - 一种用于检测egfr tki敏感突变的引物和探针 - Google Patents
一种用于检测egfr tki敏感突变的引物和探针 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108504725A CN108504725A CN201810600648.0A CN201810600648A CN108504725A CN 108504725 A CN108504725 A CN 108504725A CN 201810600648 A CN201810600648 A CN 201810600648A CN 108504725 A CN108504725 A CN 108504725A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- probe
- mutation
- seq
- nucleotide sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于检测EGFR TKI敏感突变的引物和探针。本发明的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～13和SEQ ID NO:16～17所示；本发明的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14～15和SEQ ID NO：18所示。本发明的有益效果在于：检测时删减了突变率非常低的突变类型，在保证了其他ARMS PCR技术优点的情况下，减少了实验所需的总时间，减少了实验的成本，设计位点仍然覆盖EGFR TKI敏感突变的90％以上。另外，通过全新的设计19外显子缺失突变和L858R突变的检测引物和探针，能都得到较好的检出效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医学技术领域，具体涉及一种用于检测EGFR TKI敏感突变的引物和探针。
背景技术
表皮生长因子受体EGFR(epidermal growth factor receptor)属于表皮生长因子受体家族(HER)，在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR锚定在细胞膜上发挥生物学效应，由膜内和膜外两部分组成。膜外部分主要起到接收信号的作用，膜内部分主要通过络氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)起向下传导信号的作用。EGFR在肿瘤的发生发展中起到至关重要重要的作用，依次设计出了针对EGFR-TK的靶向抑制剂(EGFR-TK inhibitor,EGFR-TKI)，阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增殖、转移、血管生成等，促进肿瘤细胞的凋亡。但是，并不是所有肿瘤细胞对EGFR-TKI都有反应，只有当EGFR 基因18-21外显子发生EGFR-TKI敏感突变时，EGFR-TKI才会发挥较好的肿瘤抑制作用，这类突变占整个东亚人群的～45％。19外显子缺失突变和21外显子L858R突变占所有 EGFR-TKI敏感突变的90％以上。当肿瘤细胞不携带EGFR-TKI敏感突变时，EGFR-TKI 类药物的有效率将低至10％。因此，在临床实践中，检测EGFR-TKI敏感突变，对于治疗方案的选取具有重要意义。
目前针对EGFR-TKI敏感突变的常见检测方法包括：Sanger测序法、ARMS PCR、数字PCR、第二代测序法等。对于Sanger测序法来说，灵明度～1％，整个实验完成需要2-3 天的时间，主要针对组织样本。目前，虽然Sanger测序法是组织EGFR-TKI敏感突变检测的金标准，但是缺点也是十分明显的，灵敏度较低，整个实验周期较长。另外对于血液样本来说，Sanger测序法比较困难。数字PCR具有高灵敏度的特点，可以达到0.1％。但是数字PCR也有较为严重的缺点，设备价格较高、稳定性不佳、对实验环境要求较高等。另外数字PCR整体上来讲，检测价格也远高于Sanger测序法和ARMS PCR。因此，目前数字PCR对于EGFR-TKI敏感突变的检测也仅仅停留在对T790M突变的检测项目上。第二代测序技术具有高通量、高灵敏性的特点，与此同时也带来了高成、高耗时、高复杂的缺点。因此，第二代测序在实际中也并不适合于EGFR-TKI敏感突变的检测。当前，最有效检测EGFR-TKI敏感突变的方法仍然是ARMS PCR。ARMS PCR全名为突变组织扩增系统PCR(amplification refractory mutationsystem PCR)，灵敏度高达0.1％，样品来源包括组织和血液，并且成本与Sanger PCR一样较低，整个检测实验周期不超过一天。
目前，现有的EGFR-TKI敏感突变ARMS PCR检测试剂盒通常包括18外显子、19外显子、20外显子和21外显子上20个以上突变位点的检测。但是，从临床大数据分析来看，其中90％以上的突变集中在19外显子缺失突变和21外显子L858R突变。并且对于没有经过EGFR-TKI治疗的患者来说T790M和20外显子插入耐药突变的发生率非常低。虽然，目前针对EGFR-TKI灵敏突变的检测可以包括多种基因部位的突变检测，但是其中大部分都是低概率发生的突变，无形之中增加了检测成本，由此可能会加重病人的治疗负担。
发明内容
为了克服现有检测方法成本较高的缺点，本发明针对19外显子缺失突变和21外显子 L858R突变设计新型的引物和探针，通过优化使EGFR-TKI敏感突变检测灵敏度保持在90％以上的前提下，减少其他不必要的检测位点，降低检测成本，使更多患者受益。
本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种用于检测EGFR TKI敏感突变的引物，其包括用于检测19外显子缺失突变的上游引物E19F以及下游引物E19R-1、E19R-2、E19R-3、E19R-4、E19R-5、E19R-6、E19R-7、E19R-8和E19R-9，用于检测21外显子L858R突变的上游引物L858RF-1、L858RF-2 和下游引物L858RR，以及外控上游引物、外控下游引物；其中：上游引物E19F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物E19R-1、E19R-2、E19R-3、E19R-4、E19R-5、E19R-6、 E19R-7、E19R-8和E19R-9的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2～10所示；上游引物L858RF-1、 L858RF-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:12～13所示，下游引物L858RR的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，外控上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示，外控下游引物的核苷酸序列如SEQID NO：17所示。
本发明还提供一种用于检测EGFR TKI敏感突变的探针，其包括核苷酸序列如SEQID NO:14所示的用于检测19外显子缺失突变的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的用于检测21外显子L858R突变的探针，以及核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示的外控探针。本发明中，探针的5’端设有荧光基团FAM，3’设有淬灭基团BHQ1。
本发明还提供一种用于检测EGFR TKI敏感突变的试剂盒，其包括上述引物和探针。
与现有ARMS PCR检测EGFR TKI敏感突变技术对比，本发明主要有益效果在于，检测时删减了突变率非常低的突变类型，在保证了其他ARMS PCR技术优点的情况下，减少了实验所需的总时间，减少了实验的成本，设计位点仍然覆盖EGFR TKI敏感突变的90％以上。另外，通过全新的设计19外显子缺失突变和L858R突变的检测引物和探针，能都得到较好的检出效率。
附图说明
图1为各个突变位点最低检测限。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。
本发明根据19外显子缺失常见的10种突变(E746-A750del(Ⅰ)；E746-T750del I；E746-T751del A；E746-S752del V；E746-A750del(Ⅱ)；L747-T751del；L747-S752del；L747-A750del P；L747-P753del S；L747-T751del P)和21外显子L858R突变的特点，设计了相应的引物和探针，引物和探针如表1所示。
表1引物与探针
本发明中还包括一种用于检测EGFR TKI敏感突变19外显子缺失突变和21外显子L858R突变的试剂盒，其中包括了上述的引物和探针，还包括了含有Taq酶、dNTP、 10×buffer和MgCl2的PCR反应液。PCR反应体系如表2所示。10×buffer配方如表3所示。
表2一份PCR反应液
| 原料 | 加入量 |
| 10×buffer | 2.5μl |
| 25mM MgCl2 | 3μl |
| Taq酶 | 0.25μl |
| 模板 | 2μl |
| 25mM dNTPs | 2.5μl |
| 上游引物 | 0.25μl |
| 下游引物 | 0.25μl |
| 探针 | 0.25μl |
| ddH2O | 将总体积补至25μl |
表3 10×buffer(总体积1毫升)
| 原料 | 加入量 |
| 1M Tris | 100μl |
| 1M KCl | 500μl |
| Triton X-100 | 10μl |
| TE | 390μl |
具体实验步骤：
1、首先取三个PCR反应管，分别用于检测19外显子缺失突变(管1)、L858R突变(管2)和EGFR TK外控基因(管3)。其中EGFR TK外控基因的检测用于判断本次提取是否成功，以及与检验管对比判断排查阴性阳性。具体判断方法是完成PCR实验后，通过计算ΔCt的大小进行判断，若待检样本DNA的CT(外控)>30，提示样本DNA浓度过低或降解严重，建议更换样本或重新提取DNA；若待检样本DNA的CT(外控)≤30，则计算其ΔCT(CT(突变)-CT(外控))；若ΔCT>8(或者CT(突变)无显示)，判断为野生型；若ΔCT≤8，判断为突变型。
2、向三个PCR反应管中加样。管1加入PCR反应物如表4所示。管2加入PCR反应物如表5所示。管3加入PCR反应物如表6所示。
表4管1加样列表
| 原料 | 加入量 |
| 10×buffer | 2.5μl |
| 25mM MgCl2 | 3μl |
| Taq酶 | 0.25μl |
| 模板 | 2μl |
| 25mM dNTPs | 2.5μl |
| E19F | 0.25μl |
| E19R-1 | 0.25μl |
| E19R-2 | 0.25μl |
| E19R-3 | 0.25μl |
| E19R-4 | 0.25μl |
| E19R-5 | 0.25μl |
| E19R-6 | 0.25μl |
| E19R-7 | 0.25μl |
| E19R-8 | 0.25μl |
| E19R-9 | 0.25μl |
| E19R-Probe | 0.25μl |
| ddH2O | 12μl |
表5管2加样列表
表6管3加样列表
| 原料 | 加入量 |
| 10×buffer | 2.5μl |
| 25mM MgCl2 | 3μl |
| Taq酶 | 0.25μl |
| 模板 | 2μl |
| 25mM dNTPs | 2.5μl |
| 外控F | 0.25μl |
| 外控R | 0.25μl |
| 外控Probe | 0.25μl |
| ddH2O | 14μl |
3、将管1、管2和管3放入实时荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件为：
4、分析数据。
实施例1
检测引物、探针的检测限、灵敏性和特异性
分别构建含有19外显子缺失突变、L858R突变的质粒，质粒中对应的构建序列如表7 所示，包括10个19外显子确实突变、L858R突变、19外显子野生型、L858R野生型。用带有19外显子、L858R野生型质粒样本对突变质粒进行1倍、10倍、100倍、1000倍稀释后，用上述设计的引物、探针和PCR试剂盒进行检测，从而获得各个检测位点的最低检测限。结果如图1所示，每个突变位点的最低检测限为1％。当循环数为27-31的时候，如图可知突变率在0.1％-1％之间，此时为疑似突变阳性，需要再次提取DNA进行重复测试。
表7质粒检测序列
用带有19外显子、L858R野生型质粒样本对突变质粒进行100倍稀释后，用上述设计的引物、探针和PCR试剂盒对100份稀释后样本进行检测，结果显示19外显子突变检出98份，灵敏度为98％，L858R突变检出99份，灵敏度为99％。
对19外显子、L858R野生型质粒样本用上述设计的引物、探针和PCR试剂盒进行特异性检验。做100份重复，实验结果显示19外显子突变检出1份，特异性为99％，L858R 突变检出0份，特异性为100％。
实施例2
检测肺癌患者血液cfDNA的EGFR TKI敏感性突变。实验方法如下：
1、取5ml肺癌患者血液。2500转离心10min，取1ml上层血浆。
2、向血浆中加入200μl的5％SDS裂解液。
3、加入等体积饱和酚溶液，轻柔震荡5min，5000g离心15min，取上清。
4、向上清中加入等体积氯仿，震荡5min，3000g离心10min，取上清。
5、向上清中加入三倍体积冻乙醇混合，12000转离心2min，DNA沉于管底，小心弃去液体。
6、挥干管底剩余液体，加入50μlTE溶解DNA沉淀。
7、将得到的DNA用上述引物、探针和PCR试剂盒进行EGFR TKI敏感性突变检测。
此实施例一共选取了50例患者，患者组织样本均通过金标准Sanger测序进行验证，其中 20例的组织样本为19外显子突变阳性，10例的组织样本为L858R突变阳性，20例为组织阴性样本。通过对相应cfDNA的EGFR TKI进行测试，20例组织19外显子突变阳性检出17例，10例组织L858R突变阳性检出9，20例组织阴性检出0例。总体的准确性为86.7％，与金标准相比，一致性较高。虽然，不能完全达到金标准的准确性，但是对于一些无法得到组织样本的特殊患者来说，血液cfDNA的检测仍然是一种很好的替代方法。
实施例3
检测肺癌患者组织DNA的EGFR TKI敏感性突变。实验方法如下：
1、取黄豆大小新鲜组织，加入200μl 10mg/ml蛋白酶K溶液，70度孵育1h。
3、加入等体积饱和酚溶液，轻柔震荡5min，5000g离心15min，取上清。
4、向上清中加入等体积氯仿，震荡5min，3000g离心10min，取上清。
5、向上清中加入三倍体积冻乙醇混合。
6、将混合后的液体加入到DNA分离柱中，12000转离心1min，弃去下部液体。
7、加入500μl 75％乙醇溶液到分离柱中，12000转离心1min，弃去下部液体。
8、敞开放置离心柱挥干乙醇，加入50μlTE洗脱DNA。
9、将得到的DNA用上述引物、探针和PCR试剂盒进行EGFR TKI敏感性突变检测。
此实施例回顾性随机选取了30例中国籍二期肺癌手术蜡块组织进行实验，其中10例男性、 10例女性，均无吸烟史。结果显示，有16例患者检出EGFR TKI敏感性突变，突变率为 53.3％，高于文献报道的东亚人群突变率～45％。这是由于非吸烟人群的突变率高于吸烟人群，本次验证实验均无吸烟史，因此检出率略高，与文献相符。
序列表
<110> 上海浦美生物医药科技有限公司
<120> 一种用于检测EGFR TKI敏感突变的引物和探针
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(E19F)
<400> 1
actgggcagc atgtggca 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(E19R-1)
<400> 2
cttgttggct ttcggttc 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(E19R-2)
<400> 3
tgttggcttt cggaacct 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(E19R-3)
<400> 4
tggctttcgg agatgcct 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(E19R-4)
<400> 5
gttggctttc ggagattc 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(E19R-5)
<400> 6
ggctttcgga gatatttt 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(E19R-6)
<400> 7
ggctttcgga gatgtttt 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(E19R-7)
<400> 8
tgttggcttt cggagatgcc 20
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(E19R-8)
<400> 9
tggctttcgg agatgg 16
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(E19R-9)
<400> 10
gctttcggag atgttgg 17
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(L858RR)
<400> 11
cacccagcag tttggcac 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(L858RF-1)
<400> 12
cacccagctg tttggcac 18
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(L858RF-2)
<400> 13
tcagggcatg aactacttgg 20
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(E19R-Probe)
<400> 14
agagtcccta tgacagagag agaagg 26
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(L858R-Probe)
<400> 15
tgatcttgac atgctgcggt gt 22
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 外控F(人工序列)
<400> 16
tgtcctggca cccaag 16
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 外控R(人工序列)
<400> 17
cagagacaag ggtcacctca 20
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 外控Probe(人工序列)
<400> 18
tggaaagcag tgccagacat gg 22
<210> 19
<211> 184
<212> DNA
<213> 质粒检测序列1(人工序列)
<400> 19
taacatccac ccagatcact gggcagcatg tggcaccatc tcacaattgc cagttaacgt 60
cttccttctc tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc 120
cgtcgctatc aaggaaccga aagccaacaa ggaaatcctc gatgtgagtt tctgctttgc 180
tgtg 184
<210> 20
<211> 184
<212> DNA
<213> 质粒检测序列2(人工序列)
<400> 20
taacatccac ccagatcact gggcagcatg tggcaccatc tcacaattgc cagttaacgt 60
cttccttctc tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc 120
cgtcgctatc aaggttccga aagccaacaa ggaaatcctc gatgtgagtt tctgctttgc 180
tgtg 184
<210> 21
<211> 187
<212> DNA
<213> 质粒检测序列3(人工序列)
<400> 21
taacatccac ccagatcact gggcagcatg tggcaccatc tcacaattgc cagttaacgt 60
cttccttctc tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc 120
cgtcgctatc aaggcatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctcgatgtga gtttctgctt 180
tgctgtg 187
<210> 22
<211> 187
<212> DNA
<213> 质粒检测序列4(人工序列)
<400> 22
taacatccac ccagatcact gggcagcatg tggcaccatc tcacaattgc cagttaacgt 60
cttccttctc tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc 120
cgtcgctatc aaggaatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctcgatgtga gtttctgctt 180
tgctgtg 187
<210> 23
<211> 187
<212> DNA
<213> 质粒检测序列5(人工序列)
<400> 23
taacatccac ccagatcact gggcagcatg tggcaccatc tcacaattgc cagttaacgt 60
cttccttctc tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc 120
cgtcgctatc aaaatatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctcgatgtga gtttctgctt 180
tgctgtg 187
<210> 24
<211> 187
<212> DNA
<213> 质粒检测序列6(人工序列)
<400> 24
taacatccac ccagatcact gggcagcatg tggcaccatc tcacaattgc cagttaacgt 60
cttccttctc tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc 120
cgtcgctatc aaaacatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctcgatgtga gtttctgctt 180
tgctgtg 187
<210> 25
<211> 187
<212> DNA
<213> 质粒检测序列7(人工序列)
<400> 25
taacatccac ccagatcact gggcagcatg tggcaccatc tcacaattgc cagttaacgt 60
cttccttctc tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc 120
cgtcgctatc aagacatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctcgatgtga gtttctgctt 180
tgctgtg 187
<210> 26
<211> 190
<212> DNA
<213> 质粒检测序列8(人工序列)
<400> 26
taacatccac ccagatcact gggcagcatg tggcaccatc tcacaattgc cagttaacgt 60
cttccttctc tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc 120
cgtcgctatc aaggaaccat ctccgaaagc caacaaggaa atcctcgatg tgagtttctg 180
ctttgctgtg 190
<210> 27
<211> 193
<212> DNA
<213> 质粒检测序列9(人工序列)
<400> 27
taacatccac ccagatcact gggcagcatg tggcaccatc tcacaattgc cagttaacgt 60
cttccttctc tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc 120
cgtcgctatc aaggaaccaa catctccgaa agccaacaag gaaatcctcg atgtgagttt 180
ctgctttgct gtg 193
<210> 28
<211> 202
<212> DNA
<213> 质粒检测序列10(人工序列)
<400> 28
taacatccac ccagatcact gggcagcatg tggcaccatc tcacaattgc cagttaacgt 60
cttccttctc tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc 120
cgtcgctatc aaggaattaa gagaagcaac atctccgaaa gccaacaagg aaatcctcga 180
tgtgagtttc tgctttgctg tg 202
<210> 29
<211> 213
<212> DNA
<213> 质粒检测序列11(人工序列)
<400> 29
ggcatgaact acttggagga ccgtcgcttg gtgcaccgcg acctggcagc caggaacgta 60
ctggtgaaaa caccgcagca tgtcaagatc acagattttg ggcgggccaa actgctgggt 120
gcggaagaga aagaatacca tgcagaagga ggcaaagtaa ggaggtggct ttaggtcagc 180
cagcattttc ctgacaccag ggaccaggct gcc 213
<210> 30
<211> 213
<212> DNA
<213> 质粒检测序列12(人工序列)
<400> 30
ggcatgaact acttggagga ccgtcgcttg gtgcaccgcg acctggcagc caggaacgta 60
ctggtgaaaa caccgcagca tgtcaagatc acagattttg ggctggccaa actgctgggt 120
gcggaagaga aagaatacca tgcagaagga ggcaaagtaa ggaggtggct ttaggtcagc 180
cagcattttc ctgacaccag ggaccaggct gcc 213
Claims (3)
1.一种用于检测EGFR TKI敏感突变的引物，其特征在于，其包括用于检测19外显子缺失突变的上游引物E19F以及下游引物E19R-1、E19R-2、E19R-3、E19R-4、E19R-5、E19R-6、E19R-7、E19R-8和E19R-9，用于检测21外显子L858R突变的上游引物L858RF-1、L858RF-2和下游引物L858RR，以及外控上游引物、外控下游引物；其中：上游引物E19F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物E19R-1、E19R-2、E19R-3、E19R-4、E19R-5、E19R-6、E19R-7、E19R-8和E19R-9的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2～10所示；上游引物L858RF-1、L858RF-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:12～13所示，下游引物L858RR的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，外控上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示，外控下游引物的核苷酸序列如SEQID NO：17所示。
2.一种用于检测EGFR TKI敏感突变的探针，其特征在于，其包括核苷酸序列如SEQ IDNO:14所示的用于检测19外显子缺失突变的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的用于检测21外显子L858R突变的探针，以及核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示的外控探针。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，探针的5’端设有荧光基团FAM，3’设有淬灭基团BHQ1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810600648.0A CN108504725A (zh) | 2018-06-12 | 2018-06-12 | 一种用于检测egfr tki敏感突变的引物和探针 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810600648.0A CN108504725A (zh) | 2018-06-12 | 2018-06-12 | 一种用于检测egfr tki敏感突变的引物和探针 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108504725A true CN108504725A (zh) | 2018-09-07 |
Family
ID=63403333
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810600648.0A Pending CN108504725A (zh) | 2018-06-12 | 2018-06-12 | 一种用于检测egfr tki敏感突变的引物和探针 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108504725A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109207595A (zh) * | 2018-10-07 | 2019-01-15 | 浙江数问生物技术有限公司 | 一种人egfr基因t790m突变检测试剂盒及其检测方法 |
| WO2020145711A1 (ko) * | 2019-01-11 | 2020-07-16 | 주식회사 진캐스트 | Egfr 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트 |
| WO2024000270A1 (zh) * | 2022-06-29 | 2024-01-04 | 京东方科技集团股份有限公司 | 用于检测egfr基因突变的引物探针组合物和试剂盒 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102234683A (zh) * | 2010-04-23 | 2011-11-09 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种egfr基因突变检测液相芯片 |
| CN102851375A (zh) * | 2012-09-11 | 2013-01-02 | 上海源奇生物医药科技有限公司 | 检测egfr基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法 |
| CN105349654A (zh) * | 2015-11-23 | 2016-02-24 | 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 | 一种用于检测egfr基因突变的探针、引物、检测体系及试剂盒 |
| CN106801091A (zh) * | 2017-01-20 | 2017-06-06 | 北京泛生子基因科技有限公司 | 检测人类egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒及反应体系 |
| CN107723213A (zh) * | 2017-11-28 | 2018-02-23 | 北京爱普拜生物技术有限公司 | 一种人egfr基因四重多位点突变检测试剂盒及方法 |
| US20190085406A1 (en) * | 2016-04-14 | 2019-03-21 | Guardant Health, Inc. | Methods for early detection of cancer |
-
2018
- 2018-06-12 CN CN201810600648.0A patent/CN108504725A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102234683A (zh) * | 2010-04-23 | 2011-11-09 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种egfr基因突变检测液相芯片 |
| CN102851375A (zh) * | 2012-09-11 | 2013-01-02 | 上海源奇生物医药科技有限公司 | 检测egfr基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法 |
| CN105349654A (zh) * | 2015-11-23 | 2016-02-24 | 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 | 一种用于检测egfr基因突变的探针、引物、检测体系及试剂盒 |
| US20190085406A1 (en) * | 2016-04-14 | 2019-03-21 | Guardant Health, Inc. | Methods for early detection of cancer |
| CN106801091A (zh) * | 2017-01-20 | 2017-06-06 | 北京泛生子基因科技有限公司 | 检测人类egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒及反应体系 |
| CN107723213A (zh) * | 2017-11-28 | 2018-02-23 | 北京爱普拜生物技术有限公司 | 一种人egfr基因四重多位点突变检测试剂盒及方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109207595A (zh) * | 2018-10-07 | 2019-01-15 | 浙江数问生物技术有限公司 | 一种人egfr基因t790m突变检测试剂盒及其检测方法 |
| WO2020145711A1 (ko) * | 2019-01-11 | 2020-07-16 | 주식회사 진캐스트 | Egfr 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트 |
| WO2024000270A1 (zh) * | 2022-06-29 | 2024-01-04 | 京东方科技集团股份有限公司 | 用于检测egfr基因突变的引物探针组合物和试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102851375B (zh) | 检测egfr基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法 | |
| CN105349654B (zh) | 一种用于检测egfr基因突变的探针、引物、检测体系及试剂盒 | |
| CN108949990B (zh) | 一种检测egfr基因突变的试剂盒及方法 | |
| CN101608240B (zh) | 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针及其使用方法 | |
| CN108504725A (zh) | 一种用于检测egfr tki敏感突变的引物和探针 | |
| CN107663533A (zh) | 一种肺癌EGFR L858R和19Del的ddPCR检测方法及应用 | |
| CN105886648A (zh) | 用于检测egfr基因t790m突变的试剂盒 | |
| CN107058528A (zh) | 一种肺癌EGFR T790M位点的ddPCR检测优化方法及应用 | |
| CN102776286B (zh) | 用于检测ros1基因融合突变的引物、探针及检测试剂盒 | |
| CN109055557B (zh) | 一种与胰腺癌辅助诊断相关的血清miRNA标志物及其应用 | |
| CN110055312A (zh) | 用于检测egfr基因c797s和t790m顺反式突变的引物、探针及试剂盒 | |
| CN105463111A (zh) | 用于检测人类pik3ca基因5种突变的探针、引物及试剂盒 | |
| CN108913775A (zh) | 检测L858R和Del19突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法 | |
| CN105803076A (zh) | 检测egfr基因t790m位点的特异性引物及探针 | |
| CN108130362A (zh) | 用于egfr基因突变检测的试剂盒及应用 | |
| CN108913766A (zh) | 一种检测抑郁症个体化药物治疗基因多位点突变的特异性引物和探针及试剂盒 | |
| CN107937524A (zh) | 人类kras基因突变检测试剂盒及检测方法 | |
| CN107385066A (zh) | 检测egfr基因突变的引物对、试剂盒、检测方法及应用 | |
| CN107164495A (zh) | 用于人类kras基因突变检测的试剂盒及其检测方法 | |
| CN110438206A (zh) | 一组检测egfr基因19外显子缺失突变的引物、探针和试剂盒 | |
| CN107177682A (zh) | 用于brafv600e基因突变的试剂盒及检测方法 | |
| CN109666746A (zh) | 用于检测人类ros1基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法 | |
| CN109295225A (zh) | Egfr基因l858r突变数字pcr检测体系的优化方法及检测产品 | |
| CN109082468A (zh) | 检测egfr基因19外显子突变的试剂盒及方法 | |
| CN106048023B (zh) | 一种检测人类C-Kit基因13号外显子突变的诊断试剂盒和方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180907 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |