CN108913766A - 一种检测抑郁症个体化药物治疗基因多位点突变的特异性引物和探针及试剂盒 - Google Patents

一种检测抑郁症个体化药物治疗基因多位点突变的特异性引物和探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测抑郁症个体化药物治疗基因多位点突变的特异性引物和探针及试剂盒，检测的位点包括CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、CYP2D6*10。采用本发明所述试剂盒及方法可检测上述位点，操作简单，结果可靠，保证了高灵敏度、准确度以及精密度，有助于医生为患者正确选择药物并合理调整药物剂量。

Description

一种检测抑郁症个体化药物治疗基因多位点突变的特异性引 物和探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及基因突变检测技术领域，具体涉及一种检测抑郁症个体化药物治疗基因多位点突变的特异性引物和探针及试剂盒。
背景技术
抑郁症是常见的精神疾病之一，严重者伴有自杀观念和行为，严重威胁着患者及其家人的健康和生活。目前，治疗抑郁症最有效的手段为药物干预，但是临床上单一抗抑郁药物治疗抑郁障碍仅30％的患者获得临床缓解，超过80％的患者曾出现至少一种不良反应，包括心脏毒性、性功能障碍、自杀风险、肥胖、恶心、呕吐、静坐不能、血压异常、头晕头痛、停药反应等。且抗抑郁药有起效时间较长的缺点。故预测抗抑郁药是否对患者有效以及毒副作用的大小具有重大的临床意义。
现代医学研究发现，遗传学的差异是导致药物个体疗效差异的重要原因。CYP2D6(细胞色素P450 2D6)和CYP2C19(细胞色素P450 2C19)是肝脏中的两个主要药物代谢酶。多项研究表明，CYP2D6和CYP2C19基因的单核苷酸多态性(SNPs)与抗抑郁药物的严重不良反应有关。2006年，美国肯塔基大学心理健康研究中心的Jose De Leon博士发表了精神科医生CYP2D6和CYP2C19这两个基因的检测推荐指南。中国卫健委(卫计委)于2015年7月份发布了《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》文件，推荐进行CYP2D6和CYP2C19基因进行检测以指导阿米替林的使用。目前全世界影响力最大的两个药物基因组专业机构，临床药物基因组学实施联盟(The Clinical PharmacogeneticsImplementation Consortium,CPIC)和荷兰药物基因组学工作组(DutchPharmacogenetics Working Group,DPWG)，也发布了针对包括舍曲林、草酸艾司西酞普兰、阿米替林等临床常用抗抑郁药物进行CYP2D6和CYP2C19基因检测的推荐指南。美国FDA(食品药品管理局)也要求多种抗抑郁药物的说明书中提示CYP2D6和CYP2C19基因多态性导致药物不良反应发生。
CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，是人体重要的药物代谢酶，主要参与药物在体内的羟化反应。目前已发现CYP2C19基因至少存在25种等位基因，其中CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因占中国人弱代谢表型(PM)的99％以上，而超快代谢型以CYP2C19*17为主。细胞色素P450 2D6被认为是与包括抗精神病药物、止痛剂和心血管药物等许多药物的分解有关。目前已经发现100多个CYP2D6的等位基因，且其等位基因在不同种族人群中呈多元化的分布。在亚洲人群中，CYP2D6*10等位基因占改变功能的变异类型的90％。
目前，检测CYP2D6和CYP2C19常见变异基因型的方法主要有Sanger双脱氧链终止法测序和基因芯片检测。Sanger测序法检测灵敏度低，操作流程复杂，耗时较长，检测成本较高。基因芯片虽然检测位点更多，但多数位点没有明确临床意义，而且实验操作繁琐，检测成本高，由于仪器价格昂贵且应用范围窄，在医院的普及率低，故尚不适合临床推广。
中国专利申请201310433443.5“一种同时检测CYP2C19和CYP2D6基因多位点突变的试剂盒”公开了一种检测CYP2D6和CYP2C19两基因多态性的试剂盒，其涉及TaqMan-MGBSNP检测技术，尽管检测位点较多，但没有包含CYP2C19*17位点的检测。
发明内容
针对现有技术中检测CYP2D6和CYP2C19基因多态性的时间长、步骤繁琐、仪器要求特殊、关键位点未包含等不足，本发明提供一种检测抑郁症个体化药物治疗基因多位点突变的特异性引物和探针及试剂盒，其联合PCR和TaqMan-MGB技术来检测抗抑郁药物相关的CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17位点的多态性。PCR扩增时，所加入的一对有不同颜色荧光标记的探针可以与对应基因型的序列特异性结合，Taq酶的5`-3`外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到对应基因型颜色标记的荧光信号，进而确定该位点的基因型。
本发明所采用的技术方案如下：一种检测抑郁症个体化药物治疗基因多位点突变的特异性引物和探针，
所述用于检测CYP2D6*10点位的特异性引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，相应的探针如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
所述用于检测CYP2C19*2点位的特异性引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，相应的探针如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
所述用于检测CYP2C19*3点位的特异性引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，相应的探针如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；
所述用于检测CYP2C19*17点位的特异性引物如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，相应的探针如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
进一步的，所述探针为经过荧光标记的探针，其5`端标记有报告基团，3`端标记有非荧光淬灭基团，同时探针上还连有MGB修饰基团。
本发明的另一目的是提供一种含有上述的特异性引物和探针的试剂盒。
进一步的，所述试剂盒还包括PCR Mix。
进一步的，所述PCR Mix的成分包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、Mg2+和dNTP。
进一步的，所述试剂盒还包括野生型质控品模板、突变型质控品模板。
进一步的，所述试剂盒中各条特异性引物的浓度为0.25～0.75μM，CYP2D6*10位点野生型探针浓度为0.25μM，突变型探针浓度为0.3μM；CYP2C19*2位点野生型探针浓度为0.15μM，突变型探针浓度为0.2μM；CYP2C19*3位点野生型探针浓度为0.2μM，突变型探针浓度为0.175μM；CYP2C19*17位点野生型探针浓度为0.2μM，突变型探针浓度为0.15μM。
进一步的，所述试剂盒进行荧光定量PCR反应体系为：
浓度为0.25～0.75μM、体积为0.5μL～1.25μL的引物；
CYP2D6*10位点野生型探针浓度为0.25μM，体积为0.25μL～0.625μL，突变型探针浓度为0.3μM，体积为0.3μL～0.75μL；
CYP2C19*2位点野生型探针浓度为0.15μM，体积为0.15μL～0.375μL，突变型探针浓度为0.2μM，体积为0.2μL～0.5μL；
CYP2C19*3位点野生型探针浓度为0.2μM，体积为0.2μL～0.5μL，突变型探针浓度为0.175μM，体积为0.175μL～0.45μL；
CYP2C19*17位点野生型探针浓度为0.2μM，体积为0.2μL～0.5μL，突变型探针浓度为0.15μM，体积为0.15μL～0.375μL；
6.25μL～15.5μL 2×PCR Mix，补加ddH2O至反应的总体积为10-25μL。
进一步的，所述试剂盒进行荧光定量PCR反应程序为：(Ⅰ)95℃，10min；(Ⅱ)95℃，15s；(Ⅲ)62℃，1min；其中，(Ⅰ)进行1个循环；(Ⅱ)和(Ⅲ)进行40-45个循环。
应当指出的是，本发明涉及预测抗抑郁药物毒副反应相关的SNP的检测方法和试剂盒，并不涉及如何使用抗抑郁药物。由于多种抗抑郁药物通过CYP2D6和(或)CYP2C19代谢，本检测方案的靶标位点，与这两种酶的活性有关，使用本方案能为临床用药提供参考。但一些非遗传因素，甚至随机事件(如偶尔吃大蒜)，都有可能影响药物的代谢，进而影响到药物的毒副反应。所以利用本发明所涉及检测SNP的方法和试剂盒，得到的基因型信息不能直接用于确定抗抑郁药物的使用，应结合其他临床信息决定给药方案。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
1.敏感：本发明所设计引物和试剂盒通过PCR技术放大，敏感度很高，可以检测低至1ng的DNA样本量。
2.特异：设计TaqMan特异性探针对DNA变异位点进行识别，3`端采用MGB标记，提供的荧光定量PCR法检测变异类型，特异性高。
3.简便快速：无需PCR后的处理，操作简单，从DNA提取到获取荧光PCR结果仅需4个小时。
4.经济适用：本检测方案比测序和芯片等技术的实验成本更低，所用仪器普及性更广，适合临床大规模推广。
附图说明
图1为实时荧光PCR检测CYP2D6*10位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2D6*10位点为纯和野生基因型C/C；
图2为实时荧光PCR检测CYP2D6*10位点的扩增曲线，在VIC和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)，判断CYP2D6*10位点为杂合型C/T；
图3为实时荧光PCR检测CYP2D6*10位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2D6*10位点为纯和突变基因型T/T；
图4为实时荧光PCR检测CYP2C19*2位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2C19*2位点为纯和野生基因型G/G；
图5为实时荧光PCR检测CYP2C19*2位点的扩增曲线，在VIC和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)，判断CYP2C19*2位点为杂合型G/A；
图6为实时荧光PCR检测CYP2C19*2位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2C19*2位点为纯和突变基因型A/A；
图7为实时荧光PCR检测CYP2C19*3位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2C19*3位点为纯和野生基因型G/G；
图8为实时荧光PCR检测CYP2C19*3位点的扩增曲线，在VIC和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)，判断CYP2C19*3位点为杂合型G/A；
图9为实时荧光PCR检测CYP2C19*3位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2C19*3位点为纯和突变基因型A/A；
图10为实时荧光PCR检测CYP2C19*17位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2C19*17位点为纯和野生基因型C/C；
图11为实时荧光PCR检测CYP2C19*17位点的扩增曲线，在VIC和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)，判断CYP2C19*17位点为杂合型C/T；
图12为实时荧光PCR检测CYP2C19*17位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2C19*17位点为纯和突变基因型T/T。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规实验条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
实施例1：特异性引物和探针的设计
因为CYP2D6基因在基因组中存在高度同源序列，一般难以设计用于检测该基因变异的Taqman等位基因分辨分析法的特异性引物和探针。我们针对与抗抑郁药物代谢相关的主要位点CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17，设计对应特异性PCR引物和探针(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12)。经过精心设计、多次验证，最终获得了特异性的基于Taqman等位基因分辨分析法的引物和探针，见表1。
表1：
相关引物在生工生物工程(上海)有限公司进行合成。实验时，合成的引物和探针用ddH2O配成100μM的储存液，使用时再配成10μM的工作液。
以下检测过程参照赛默飞公司《TaqMan universal master mixⅡ说明书》进行操作。
实施例2：检测试剂盒的组装
一种同时检测CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17位点多态性的试剂盒，包含4管分别检测这4个位点多态性的PCR反应液，根据PCR反应体系各成分使用量，计算21人份和42人份两种规格成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。经过实验摸索，优选地荧光PCR反应体系如下：
各条特异性引物的浓度为0.5μM，体积为1μL；CYP2D6*10位点野生型探针浓度为0.25μM，体积为0.5μL，突变型探针浓度为0.3μM，体积为0.6μL；CYP2C19*2位点野生型探针浓度为0.15μM，体积为0.3μL，突变型探针浓度为0.2μM，体积为0.4μL；CYP2C19*3位点野生型探针浓度为0.2μM，体积为0.4μL，突变型探针浓度为0.175μM，体积为0.35μL；CYP2C19*17位点野生型探针浓度为0.2μM，体积为0.4μL，突变型探针浓度为0.15μM，体积为0.3μL；12.5μL PCR反应混合液(TaqMan universal master mix)，加入1～5μL DNA模板；补加ddH2O至反应体系的总体积为20μL。
实施例3：检测试剂盒的组装
一种同时检测CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17位点多态性的试剂盒，包含4管分别检测这4个位点多态性的PCR反应液，根据PCR反应体系各成分使用量，计算21人份和42人份两种规格成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。经过实验摸索，荧光PCR反应体系如下：
各条特异性引物的浓度为0.25μM，体积为0.5μL；CYP2D6*10位点野生型探针浓度为0.25μM，体积为0.25μL，突变型探针浓度为0.3μM，体积为0.3μL；CYP2C19*2位点野生型探针浓度为0.15μM，体积为0.15μL，突变型探针浓度为0.2μM，体积为0.2μL；CYP2C19*3位点野生型探针浓度为0.2μM，体积为0.2μL，突变型探针浓度为0.175μM，体积为0.175μL；CYP2C19*17位点野生型探针浓度为0.2μM，体积为0.2μL，突变型探针浓度为0.15μM，体积为0.15μL；6.25μL PCR反应混合液(TaqMan universal master mix)，加入1～2μL DNA模板；补加ddH2O至反应体系的总体积为10μL。
实施例4：检测试剂盒的组装
一种同时检测CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17位点多态性的试剂盒，包含4管分别检测这4个位点多态性的PCR反应液，根据PCR反应体系各成分使用量，计算21人份和42人份两种规格成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。经过实验摸索，荧光PCR反应体系如下：
各条特异性引物的浓度为0.75μM，体积为1.25μL；CYP2D6*10位点野生型探针浓度为0.25μM，体积为0.625μL，突变型探针浓度为0.3μM，体积为0.75μL；CYP2C19*2位点野生型探针浓度为0.15μM，体积为0.375μL，突变型探针浓度为0.2μM，体积为0.5μL；CYP2C19*3位点野生型探针浓度为0.2μM，体积为0.5μL，突变型探针浓度为0.175μM，体积为0.45μL；CYP2C19*17位点野生型探针浓度为0.2μM，体积为0.5μL，突变型探针浓度为0.15μM，体积为0.375μL；15.5μL PCR反应混合液(TaqMan universal master mix)，加入1～5μL DNA模板；补加ddH2O至反应体系的总体积为25μL。
实施例5：口腔黏膜脱落细胞样本检测CYP2D6和CYP2C19多态性，采用实施例2的试剂盒进行检测
利用TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测人类CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17基因位点多态性。
本检测方法通过荧光定量PCR的荧光信号产生的Ct值和扩增曲线来判断相应位点的基因型。
本检测方法可用于检测来源于口腔拭子采集的口腔脱落细胞。本案例中针对5个口腔拭子样本，采用4个8连管设计，每个8连管一个位点，每个孔一个样本，第6-8孔装有相应NTC、野生型、突变型质控模板。
实验步骤如下：
(1)口腔黏膜脱落细胞基因组DNA提取：使用百代公司的口腔黏膜细胞DNA提取试剂盒(货号：51029)提取5个口腔黏膜细胞中的基因组DNA作为模板。提取出的基因组DNA溶解于TE缓冲溶液中，即10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)1mmol/L EDTA(pH 8.0)，经紫外分光光度计测定浓度，配成50ng/μL的溶液，作为PCR扩增模板。
(2)荧光定量PCR反应体系：取15.5μL PCR反应混合液(PCR Mix)，加入1μL步骤(1)所述的模板；补加ddH2O至反应体系的总体积为20μL，在ABI 7500实时荧光定量PCR系统上进行PCR反应。
(3)所述荧光定量PCR反应的反应程序是：
(Ⅰ)95℃，10min；(Ⅱ)95℃，15s；(Ⅲ)62℃，1min；其中，(Ⅰ)进行1个循环，(Ⅱ)和(Ⅲ)进行40个循环；PCR反应程序中退火温度为62℃，可以更好的保证检测结果的特异性。
(5)检测结果判定：
当PCR结束后，反应孔及质控对照孔出现平滑扩增曲线且拐点清楚，无模版阴性对照(NTC)孔无平滑扩增曲线且循环数大于38，则为检测成功；野生型只检测出野生序列探针的扩增曲线且循环数小于35；纯合突变型只检测出突变序列探针的扩增曲线且循环数小于35；杂合型检测出野生序列探针的扩增曲线和突变序列探针的扩增曲线且循环数均小于35。
根据结果判断，CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17四个位点基因型分别是，样本1：突变型、杂合型、野生型、野生型；样本2：突变型、野生型、野生型、野生型；样本3：突变型、野生型、杂合型、野生型；样本4：野生型、杂合型、野生型、野生型；样本5：突变型、野生型、野生型、野生型。
熟悉荧光定量PCR技术的实验人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的样品荧光量，根据不同序列探针对应标记的荧光信号的强弱来确定所检测的突变位点的基因型。
实施例6：血液样本检测CYP2D6和CYP2C19基因多态性，采用实施例2的试剂盒进行检测
本案例中针对21个血液样本，采用96孔PCR板，每3列检测一个位点，每个孔一个样本，第三列最后3个孔依次是野生型、突变型质控模板和空白对照。表2为96孔PCR反应板的建议布局。
表2：
S1～S21代表21个样本，W代表野生型质控模板，M代表突变型质控模板，NTC代表空白对照。
具体实验步骤：
(1)血液基因组DNA提取：使用天根生物公司血液DNA提取试剂盒提取21个EDTA保存的血液样本中的基因组DNA作为模板。提取出的基因组DNA溶解于TE缓冲溶液中，经紫外分光光度计测定浓度，配成50ng/μL的溶液，作为PCR扩增模板。
(2)PCR反应体系和程序同实施例5；
(3)检测结果判定：
当PCR结束后，反应孔及质控对照出现平滑扩增曲线且拐点清楚，无模版阴性对照(NTC)孔无平滑扩增曲线且循环数大于38，则为检测成功；野生型只检测出野生序列探针的扩增曲线且循环数小于35；纯合突变型只检测出突变序列探针的扩增曲线且循环数小于35；杂合型检测出野生序列探针的扩增曲线和突变序列探针的扩增曲线且循环数均小于35。
根据结果可明确得出实验结果，21个样本中，CYP2D6*10位点5个野生型、6个杂合型、10个突变型；CYP2C19*2位点8个野生型、11个杂合型、2个突变型；CYP2C19*3位点19个野生型、2个杂合型；CYP2C19*17位点21个样本全部是野生型。这一结果符合已知的相应位点突变频率。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种检测抑郁症个体化药物治疗基因多位点突变的特异性引物和探针及试剂盒
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ccaccatcca tgtttgcttc tg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
cagaggagcc catttggtag t 21
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
ctgcacgcta ccca 14
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
ctgcacgcta ctca 14
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
tcttagatat gcaataattt tcccactatc 30
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
cattttgatc aggaagcaat caat 24
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
ttgttatggg ttcccgg 17
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
ttgttatggg ttcctgg 17
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
cctgtgatcc cactttcatc ct 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
aatgtacttc agggcttggt caat 24
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 11
ccttacctgg atcca 15
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 12
ccttacctgg attca 15
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 13
tgtttggaag ttgttttgtt ttgct 25
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 14
tggtgccaca cagctcatag 20
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 15
tgttctcaaa gcatc 15
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 16
ctgttctcaa agtatc 16

Claims (9)

1.一种检测抑郁症个体化药物治疗基因多位点突变的特异性引物和探针，其特征在于，
所述用于检测CYP2D6*10点位的特异性引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，相应的探针如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
所述用于检测CYP2C19*2点位的特异性引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，相应的探针如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
所述用于检测CYP2C19*3点位的特异性引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，相应的探针如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
所述用于检测CYP2C19*17点位的特异性引物如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，相应的探针如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
2.根据权利要求1所述一种检测抑郁症个体化药物治疗基因多位点突变的特异性引物和探针，其特征在于，所述探针为经过荧光标记的探针，其5`端标记有报告基团，3`端标记有非荧光淬灭基团，同时探针上还连有MGB修饰基团。
3.含有权利要求1或2所述的特异性引物和探针的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR Mix。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR Mix的成分包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、Mg2+和dNTP。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括野生型质控品模板、突变型质控品模板。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，反应体系中优选地各条特异性引物的浓度为0.25～0.75μM，CYP2D6*10位点野生型探针浓度为0.25μM，突变型探针浓度为0.3μM；CYP2C19*2位点野生型探针浓度为0.15μM，突变型探针浓度为0.2μM；CYP2C19*3位点野生型探针浓度为0.2μM，突变型探针浓度为0.175μM；CYP2C19*17位点野生型探针浓度为0.2μM，突变型探针浓度为0.15μM。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行荧光定量PCR反应体系为：
浓度为0.25～0.75μM、体积为0.5μL～1.25μL的引物；
CYP2D6*10位点野生型探针浓度为0.25μM，体积为0.25μL～0.625μL，突变型探针浓度为0.3μM，体积为0.3μL～0.75μL；
CYP2C19*2位点野生型探针浓度为0.15μM，体积为0.15μL～0.375μL，突变型探针浓度为0.2μM，体积为0.2μL～0.5μL；
CYP2C19*3位点野生型探针浓度为0.2μM，体积为0.2μL～0.5μL，突变型探针浓度为0.175μM，体积为0.175μL～0.45μL；
CYP2C19*17位点野生型探针浓度为0.2μM，体积为0.2μL～0.5μL，突变型探针浓度为0.15μM，体积为0.15μL～0.375μL；
6.25μL～15.5μL 2×PCR Mix，补加ddH2O至反应的总体积为10-25μL。
9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行荧光定量PCR反应程序为：(Ⅰ)95℃，10min；(Ⅱ)95℃，15s；(Ⅲ)62℃，1min；其中，(Ⅰ)进行1个循环；(Ⅱ)和(Ⅲ)进行40-45个循环。
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