CN105861703A - 一种同时检测cyp2c19和cyp2d6基因多位点突变的试剂盒 - Google Patents

一种同时检测cyp2c19和cyp2d6基因多位点突变的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测CYP2C19和CYP2D6基因多位点突变的试剂盒；通过精心设计、多次验证、筛选和优化，获得了一组基于Taqman等位基因分辨分析法的特异性引物和探针，可以检测CYP2C19和CYP2D6基因的单碱基置换、缺失突变、基因缺失和重复突变4种类型的8个功能性变异；从DNA提取到荧光PCR，到结果获取仅需4小时，手头操作时间小于2小时。含有这些引物的试剂盒具有省时方便、灵敏度高、样品阳性符合率及阴性符合率均99%以上等优点。

Description

一种同时检测CYP2C19和CYP2D6基因多位点突变的试剂盒
技术领域
本发明涉及基因突变检测技术领域，更具体地，涉及一种同时检测CYP2C19和CYP2D6基因多位点突变的试剂盒。
背景技术
CYP2C19亚型对药物反应起着关键性的作用，因为它们的活性存在显著的个体差异，表现为遗传多态性，从而产生血药浓度的个体差异。CYP2C19存在多种基因突变，其中，*1为正常功能等位基因，*2～*8为功能缺失或是降低等位基因，*17为功能增强等位基因。CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因是黄种人的主要弱代谢表型(PM)，占99％以上。*2，*3等位基因编码的酶无活性。通过该酶代谢的药物(如抗血小板药氯吡格雷、质子泵抑制剂奥美拉唑，抗抑郁药文拉法辛等)随患者基因型不同，其疗效和副作用也有明显不同。其中CYP2C19基因变异对氯吡格雷疗效的影响在2010年3月受到美国FDA的“黑框警告”(boxedwarning)，提醒应用氯吡格雷后出现心血管不良事件与CYP2C19功能缺失的等位基因有关。
CYP2D6是CYP酶家族重要的成员之一，占肝脏酶总量的2％～9％，但是参与20％～30％药物，包括β受体阻滞剂、抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药(如销售额最大的阿立哌唑)、镇痛药等的代谢。CYP2D6基因存在多态性，目前发现CYP2D6超过100个突变位点，但影响中国人CYP2D6功能的常见突变有8个，包括酶活性正常型等位基因*1、*2，快代谢型基因变异为基因重复变异，慢代谢型基因变异*3、*4、*5，中代谢型基因变异*9、*10、*41。这些基因突变可引起酶活性和数量的差异，从而影响药物的疗效个体差异，导致疗效不足或毒副作用的产生。在临床上，有多种情况需要同时检测CYP2D6和CYP2C19基因型，以实现精准用药。一种情况是有些药物同时受到CYP2D6和CYP2C19基因型的影响，CYP2D6基因型会影响文拉法辛及其代谢产物的O-去甲基化，而CYP2C19基因型会影响文拉法辛及其代谢产物的N-去甲基化。所以患者服用文拉法辛时，需同时检测CYP2D6和CYP2C19基因型，以调整剂量。他莫昔芬疗效也与CYP2D6和CYP2C19基因型存在相关性。另一种情况是患者可选择的药物包括受到CYP2D6或CYP2C19基因型影响的药物，如抗抑郁药西酞普兰是近年来上市的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)，最常应用于抑郁症的治疗，对其他多种精神障碍的症状同样有效。艾司西酞普兰受CYP2C19基因型影响，西酞普兰在体内的代谢主要由CYP2C19介导。另一个抗抑郁药帕罗西汀可选择性抑制突触前膜对5-HT的再摄取，CYP2D6不同基因型影响帕罗西汀血药浓度，从而影响疗效。因此对于抑郁患者，通过检测CYP2D6和CYP2C19基因型，可以帮助患者选择不同的抗抑郁药和优化剂量。
目前国内外的检测CYP2D6基因突变的产品主要建立在传统固相芯片的基础上，价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。另外，这些方法所需的检测时间较长，耗费人力，从核酸提取到结果获取超过8小时，超过1天正常工作时间。荧光PCR法没有PCR后处理，大大节省时间与人力。从DNA提取到荧光PCR，到结果获取仅需4小时，手头操作时间小于2小时。但传统的荧光PCR技术及产品往往只是针对单一位点设计，不能同时获得多个位点信息。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种同时检测CYP2C19和CYP2D6基因多位点突变的试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
一组同时检测CYP2C19和CYP2D6基因多位点突变的引物和探针，所述用于检测CYP2C19*2位点的引物如SEQ ID NO：1～2所示，相应的探针如SEQ ID NO：3～4所示；用于检测CYP2C19*3位点的引物如SEQ ID NO：5～6所示，相应的探针如SEQ ID NO：7～8所示；用于检测CYP2D6*4突变位点rs3892097的引物如SEQ ID NO：9～10所示，相应的探针如SEQ IDNO：11～12所示；用于检测CYP2D6拷贝数的引物如SEQ ID NO：13～14所示，相应的探针如SEQ ID NO：15所示；用于检测CYP2D6*9位点的引物如SEQ ID NO：19～20所示，相应的探针如SEQ ID NO：21～22所示；用于检测CYP2D6*10位点的引物对如SEQ ID NO：23～24所示，相应的探针如SEQ ID NO：25～26所示；用于检测CYP2D6*41位点的引物如SEQ ID NO：27～28所示，相应的探针如SEQ ID NO：29～30所示。
本发明还提供含有所述引物和探针的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括2×TaqMan Master Mix。优选地，所述试剂盒还包括野生型质控模板、突变型质控模板、杂合型质控模板。更优选地，所述CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2D6*4、CYP2D6*9、CYP2D6*10、CYP2D6*41野生型质控DNA模板、突变型质控模板、杂合型质控模板的制备如下：合成包含CYP2C19基因和CYP2D6基因以上所述的位点野生型和突变型的DNA片段，DNA片段被克隆到pBluescriptII SK(-)载体，转化大肠杆菌，对插入的DNA片段进行测序验证，正确后寄回甘油菌和5μg质粒干粉，得野生型质控模板和突变型质控模板，其杂合型质控模板是野生型质控模板和突变型质控模板的1：1混合物。
优选地，所述试剂盒中各个引物的浓度为0.25～0.75μM。优选地，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应体系为：浓度为0.25～0.75μM、体积为0.5～1.25μL的引物，浓度为0.25～0.75μM、体积为0.125～0.625μL的探针，5～15μL2×Taqman Master Mix，用双蒸水补足总体积为10～25μL。
优选地，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应程序为：(i)95℃，10min；1个循环；(ii)95℃，10s；58℃，45s；40个循环；(iii)37℃，10s；1个循环。
本发明还提供所述试剂盒的应用，即利用所述试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：
S1.提取基因组DNA；S2.利用试剂盒中的引物和探针对S1所述基因组DNA进行荧光定量PCR；S3.根据荧光定量PCR扩增结果进行结果判定；
所述引物和探针为：用于检测CYP2C19*2的引物对如SEQ ID NO：1～2所示，相应的探针对如SEQ ID NO：3～4所示；所述探针分别为5’端HEX标记野生型探针和5’端FAM标记突变型探针；用于检测CYP2C19*3的引物对如SEQ ID NO：5～6所示，相应的探针如SEQ ID NO：7～8所示，采用的TaqMan探针分别为5’端HEX标记野生型探针和5’端FAM标记突变型探针；用于检测CYP2D6*4的突变位点rs3892097的引物对如SEQ ID NO：9～10所示，相应的探针如SEQ ID NO：11～12所示，采用的TaqMan探针分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端JOE标记突变型探针；用于检测CYP2D6拷贝数的引物如SEQ ID NO：13～14所示，相应的探针如SEQID NO：15所示，采用的为FAM探针；用于检测CYP2D6*9的引物对如SEQ ID NO：19～20所示，相应的探针如SEQ ID NO：21～22所示，采用的TaqMan探针分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端VIC标记突变型探针；用于检测CYP2D6*10的引物对如SEQ ID NO：23～24所示，相应的探针如SEQ ID NO：25～26所示，采用的分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端HEX标记突变型探针；用于检测CYP2D6*41的引物对如SEQ ID NO：27～28所示，相应的探针如SEQ IDNO：29～30所示，采用的分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端HEX标记突变型探针。
另外，本发明检测CYP2D6拷贝数时用的参考基因是ALB，参考基因ALB拷贝数检测的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：16～17所示；相应的探针如SEQ ID NO：18；采用的为VIC探针。
本发明针对每个突变位点分别设计了阳性突变型对照，杂合型对照，阴性野生型对照和空白无DNA模板对照。对于CYP2D6基因置换突变和缺失突变，野生型应只检测出野生序列探针的扩增曲线(Ct<35)；纯合突变型应只检测出突变序列探针的扩增曲线(Ct<35)；杂合型应检测出野生序列探针的扩增曲线(Ct<35)和突变序列探针的扩增曲线(Ct<35)，而无模板阴性对照无平滑扩增曲线(Ct>38)；这里结果判断与所选择的引物和探针有关，需要说明的是，本发明中在对CYP2C19基因进行结果判断时，FAM通道为突变型，而对CYP2D6基因，FAM通道为野生型，优选地，S3所述结果判定是：
(1)CYP2C19基因置换突变：如样品反应孔出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，阴性对照无平滑扩增曲线且循环数大于38为检测成功；如仅在HEX或VIC通道中检出荧光扩增曲线且循环数小于35为纯合的，相应探针标记的基因型；如仅在FAM通道检出荧光扩增曲线且循环数小于35为纯合的，相应探针标记的基因型；如同时在FAM和VIC/HEX通道里检出荧光扩增曲线且循环数小于35为杂合型；
(2)CYP2D6基因置换突变和缺失突变：如样品反应孔出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，阴性对照无平滑扩增曲线且循环数大于38为检测成功；如仅在HEX或VIC通道中检出荧光扩增曲线且循环数小于35为纯合的，相应探针标记的基因型；如仅在FAM通道检出荧光扩增曲线且循环数小于35为纯合的，相应探针标记的基因型；如同时在FAM和VIC/HEX通道里检出荧光扩增曲线且循环数小于35为杂合型；
(3)CYP2D6基因缺失和基因重复：采用标准曲线法和相对CT法测定CYP2D6拷贝数，用基因型为CYP2D6*1的DNA标品做系列稀释(1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000和1:1000000)制备标准曲线，得到标准曲线的相关系数达0.99以上，斜率在3.1～3.55内，测定CYP2D6拷贝数和ALB拷贝数，假设样本ALB基因有正常的双拷贝数，根据标准曲线计算样本的基因拷贝数，标准化单体型CYP2D6基因拷贝数定义为N＝CYP2D6拷贝数/ALB拷贝数，N＝0.8～1.2为正常双单体型样本，N＝0.35～0.6为单体型样本，N＝1.4～2.4为1个基因重复。
本发明所述PCR反应可以在ViiATM实时荧光定量PCR系统上进行，并使用2×TaqMan Master Mix。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种同时检测CYP2C19和CYP2D6基因多位点突变的试剂盒，通过精心设计、多次验证、筛选和优化，获得了基于Taqman等位基因分辨分析法的特异性引物和探针，可以检测CYP2C19和CYP2D6基因的单碱基置换、缺失突变、基因缺失和重复突变4种类型的8个功能性变异；从DNA提取到荧光PCR，到结果获取仅需4小时，手头操作时间小于2小时。含有这些引物和探针的试剂盒具有省时方便、灵敏度高、样品阳性符合率及阴性符合率均99％以上等优点；本发明所述利用试剂盒进行检测的方法可以用于以下多种药物的个性化用药辅助诊断：抗血小板药氯吡格雷、质子泵抑制剂、β受体阻滞剂、抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药、镇痛药等，包括：阿立哌唑、阿托西汀、文拉法辛、利哌利酮、塞托溴胺吸入、他莫昔芬、噻吗洛尔、氟西汀、奥氮平、西维美林、托特罗定、特比萘芬、曲马多、氯氮平、美托洛尔、普萘洛尔、卡维地洛、普罗帕酮、硫利达嗪、普罗替林、可待因、匹莫齐特、丁苯那嗪、伊潘立酮等。
附图说明
图1是实时荧光定量PCR检测CYP2C19*2位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2C19*2位点为纯合野生型(CYP2C19*2GG基因型)。
图2是实时荧光定量PCR检测CYP2C19*2位点的扩增曲线，在VIC通道和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，判断CYP2C19*2位点为杂合型(CYP2C19*2GA基因型)。
图3是实时荧光定量PCR检测CYP2C19*2位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2C19*2位点为纯合突变型(CYP2C19*2AA基因型)。
图4是实时荧光定量PCR检测CYP2C19*3位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2C19*3位点为纯合野生型(CYP2C19*3GG基因型)。
图5是实时荧光定量PCR检测CYP2C19*3突变位点的扩增曲线，在VIC通道和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，判断CYP2C19*3位点为杂合型(CYP2C19*3GA基因型)。
图6是实时荧光定量PCR检测CYP2C19*3突变位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2C19*3位点为纯合突变型(CYP2C19*3AA基因型)。
图7是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*4(rs3892097)位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2D6*4(rs3892097)位点为纯合突变型(rs3892097AA基因型)。
图8是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*4(rs3892097)突变位点的扩增曲线，在VIC通道和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，判断CYP2D6*4(rs3892097)位点为杂合型(rs3892097GA基因型)。
图9是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*4(rs3892097)突变位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2D6*4(rs3892097)位点为纯合野生型(rs3892097GG基因型)。
图10是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*9(rs5030656)位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2D6*9(rs5030656)位点为纯合突变型(rs5030656-/-基因型)。
图11是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*9(rs5030656)突变位点的扩增曲线，在VIC通道和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，判断CYP2D6*9(rs5030656)位点为杂合型(rs5030656AAG/-基因型)。
图12是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*9(rs5030656)突变位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2D6*9(rs5030656)位点为纯合野生型(rs5030656AAG/AAG基因型)。
图13是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*10(rs1065852)位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2D6*10(rs1065852)位点为纯合突变型(rs1065852TT基因型)。
图14是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*10(rs1065852)突变位点的扩增曲线，在VIC通道和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，判断CYP2D6*10(rs1065852)位点为杂合型(rs1065852CT基因型)。
图15是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*10(rs1065852)突变位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2D6*10(rs1065852)位点为野生型(rs1065852CC基因型)。
图16是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*41(rs28371725)位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2D6*41(rs28371725)位点为纯合突变型(rs28371725AA基因型)。
图17是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*41(rs28371725)突变位点的扩增曲线，在VIC通道和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，判断CYP2D6*41(rs28371725)位点为杂合型(rs28371725GA基因型)。
图18是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*41(rs28371725)突变位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断CYP2D6*41(rs28371725)位点为野生型(rs28371725GG基因型)。
图19为CYP2D6拷贝数检测对照基因ALB(A)和CYP2D6基因(B)的标准曲线；用含有CYP2D6和ALB基因片段的质粒作为标准品，初始浓度质粒含有108个拷贝，以10倍梯度(1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000和1:1000000)稀释制备标准曲线，CYP2D6和ALB基因标准曲线的斜率为-3.48，相关系数为0.999。
具体实施方式
下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。
实施例1引物和探针的设计
因为CYP2C19和CYP2D6基因在基因组中存在高度同源序列，一般难以设计用于检测CYP2D6基因变异的Taqman等位基因分辨分析法的特异性引物和探针。本发明人进行了精心设计、多次验证、筛选和优化，最终获得了特异性的基于Taqman等位基因分辨分析法的引物和探针，见表1。表2和表3为不能成功特异性检测CYP2C19和CYP2D6基因突变的引物和探针。
表1
表2
表3
实施例2荧光定量PCR检测过程
1、采用8行×12列的96孔板设计，其中第1列到第6列分别检测6个临床样品，在第7列到9列装有相应野生型、突变型、杂合型质控模板，10到12列装有6个不同比例的拷贝数的标准液(表4)。
表4为96孔PCR反应板的建议布局示例
注：S代表样本，S1到S6代表6个样本；W代表野生型质控模板；M代表突变型质控模板；H代表杂合型质控模板；NTC代表没有装DNA样品的孔；STD代表拷贝数梯度标准品；其中，STD1到STD6分别代表包含CYP2D6和ALB基因片段质粒标准品的10倍梯度系列稀释(1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000和1:1000000)的标准品。
其中，CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2D6*4、CYP2D6*9、CYP2D6*10、CYP2D6*41野生型质控模板，突变型质控模板、杂合型质控模板的制备如下：合成包含CYP2D6和CYP2C19基因以上所述的位点野生型和突变型的DNA片段，DNA片段被克隆到pBluescriptII SK(-)载体，转化大肠杆菌，对插入的DNA片段进行测序验证，正确后寄回甘油菌和5μg质粒干粉，得到野生型质控模板和突变型质控模板，杂合型质控模板是野生型质控模板和突变型质控模板的1：1混合物。
2、根据表4的布局，对样品进行荧光定量PCR，具体过程如下：
(1)血液基因组DNA提取：使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒提取基因组DNA作为模板。提取出的基因组DNA溶解于TE缓冲溶液中，即10mmol/L Tris-HCl(PH8.0)，1mmol/LEDTA(PH8.0)，经紫外分光光度计测定浓度，配成50ng/μL的溶液，作为PCR扩增模板。
(2)特异性引物和荧光探针序列如表1所示。
(3)荧光定量PCR反应体系：(体系如表5)在ViiATM 7实时荧光定量PCR系统上进行，使用Universal PCR Master Mix。
表5反应体系
成分 浓度 体积
模板(样品) 100ng/25μL
每条引物 0.5μM 0.5～1.25μL
每条探针 0.25μM 0.125～0.625μL
2×qPCR Master Mix 5～15μL
ddH2O 补至10～25μL
反应程序为：(i)95℃，10min；1个循环；(ii)95℃，10s；58℃，45s；40个循环；(iii)37℃，10s；1个循环。
(4)检测结果判定：
A.CYP2C19基因置换突变：如样品反应孔出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，阴性对照无平滑扩增曲线且循环数大于38为检测成功；如仅在HEX或VIC通道中检出荧光扩增曲线且循环数小于35为纯合的，相应探针标记的基因型；如仅在FAM通道检出荧光扩增曲线且循环数小于35为纯合的，相应探针标记的基因型；如同时在FAM和VIC/HEX通道里检出荧光扩增曲线且循环数小于35为杂合型。
B.CYP2D6基因置换突变和缺失突变：如反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线且拐点清楚，无模板阴性对照无平滑扩增曲线(Ct大于38)，则为检测成功；如仅在VIC通道中检测出典型荧光扩增曲线(Ct小于35)为纯合突变型；如仅在FAM通道检测出典型荧光扩增曲线(Ct小于35)为纯合野生型；如同时在FAM和VIC通道里检测出典型荧光曲线(Ct小于35)为杂合型。
C.CYP2D6基因缺失和基因重复：采用标准曲线法和相对CT法测定CYP2D6拷贝数，用基因型为CYP2D6*1的DNA标品做系列稀释制备标准曲线，得到标准曲线的相关系数达0.99以上，斜率在3.1～3.55内，假设样本ALB基因有正常的双拷贝数，根据标准曲线计算样本的基因拷贝数，标准化单体型CYP2D6基因拷贝数定义为N＝CYP2D6拷贝数/ALB拷贝数，当N＝0.8～1.2时为正常双单体型样本，N＝0.35～0.6时为基因缺失的单体型样本，当N＝1.4～2.4时为1个基因重复(图19)。
实施例3检测试剂盒的组装
一种同时检测CYP2C19和CYP2D6基因多位点突变的试剂盒，包含以下成分：浓度为0.25～0.75μM、体积为0.5～1.25μL的表1所述的各个引物(包括针对各个基因位点设计的正向引物和反向引物，例如，针对CYP2D6*2位点，则加入检测CYP2D6*2位点的引物)，浓度为0.25～0.75μM、体积为0.125～0.625μL的表1所述的各个探针(包括针对各个基因位点设计的野生等位基因探针和突变等位基因探针，例如，针对CYP2D6*2位点，则加入检测CYP2D6*2位点的探针)，5～15μL 2×Taqman Master Mix，用双蒸水补足总体积为10～25μL；野生型质控模板；突变型质控模板；杂合型质控模板。
为了更简洁的说明上述试剂盒的组成，这里，给出一种组分实例，该试剂盒的成分如下：适当浓度和体积的样品基因组DNA，浓度为0.5μM、体积为0.5μL的表1所述的各个引物，浓度为0.25μM、体积为0.125μL的表1所述的各个探针，5μL 2×Taqman Master Mix，用双蒸水补足总体积为25μL。
利用所述试剂盒进行同时检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变时，利用荧光定量PCR进行检测，所述荧光定量PCR的反应程序为：(i)95℃，10min；1个循环；(ii)95℃，10s；58℃，45s；40个循环；(iii)37℃，10s；1个循环。
实施例4
目前市面上在售的CYP2D6基因多态性检测试剂盒与本发明检测方法和试剂盒的比较，结果如表6所示。
表6本发明检测方法与多种市售试剂盒的比较
实施例5临床样品检测
选了752例冠心病患者，这些患者均使用氯吡格雷和β受体阻滞剂治疗。用实施例4所述试剂盒检测这些患者的CYP2C19*2和*3，CYP2D6*、4*、*9、*10、*41和拷贝数变异。并用Sanger测序的方法进行验证，计算阳性符合率和阴性符合率，结果如表7所示(针对具体的基因型，若患者例数小于30例，则对全部患者的全血进行测序，若患者例数大于30例，则选取其中的一部分患者全血作为测序样本，测序样本数均为30，例如，CYP2C19*2基因型为GG的患者为366例，在对其全血进行检测时，只选取30例作为检测样本，CYP2C19*3基因型为AA的患者为6例，则对这6例患者的全血都进行检测)。
表7 752例冠心病患者全血DNA检测结果统计
表中，发生突变(突变型和杂合性)为阳性，野生型为阴性，阳性率和阴性率是Sanger测序检测结果例数/用于Sanger测序验证的例数的比值*％。
阳性符合率(临床灵敏度)＝253/(250+3)＝100％；
阴性符合率(临床特异性)＝287/(287+3)＝98.96％；
总符合率＝(253+287)/(250+3+3+287)＝99.4％。
SEQUENCE LISTING
<110> 钟诗龙
<120> 一种同时检测CYP2C19和CYP2D6基因多位点突变的试剂盒
<130>
<160> 30
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> CYP2C19*2（681G>A，rs4244285）正向引物
<400> 1
agatatgcaa taattttccc ac 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> CYP2C19*2（681G>A，rs4244285）反向引物
<400> 2
tctccaaaat atcactttcc at 22
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> CYP2C19*2（681G>A，rs4244285）野生型等位基因探针序列
<400> 3
attatttccc gggaacc 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> CYP2C19*2（681G>A，rs4244285）突变型等位基因探针序列
<400> 4
attatttccc aggaacc 17
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> CYP2C19*3（636G>A, rs4986893）正向引物
<400> 5
gatcagcaat ttcttaactt gatgga 26
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> CYP2C19*3（636G>A, rs4986893）反向引物
<400> 6
actgtaagtg gtttctcagg aagca 25
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> CYP2C19*3（636G>A, rs4986893）野生型等位基因探针序列
<400> 7
attgtaagca ccccctggat ccag 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> CYP2C19*3（636G>A, rs4986893）突变型等位基因探针序列
<400> 8
ttgtaagcac cccctgaatc cagg 24
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> CYP2D6*4 (1846G>A，rs3892097）正向引物
<400> 9
cgccttcgcc aaccact 17
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> CYP2D6*4 (1846G>A，rs3892097）反向引物
<400> 10
ctcacggctt tgtccaagag a 21
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> CYP2D6*4 (1846G>A，rs3892097）野生型等位基因探针序列
<400> 11
acccccagga cgccccttt 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> CYP2D6*4 (1846G>A，rs3892097）突变型等位基因探针序列
<400> 12
acccccaaga cgcccctttc 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> CYP2D6拷贝数检测正向引物
<400> 13
cttcacctcc ctgctgcag 19
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> CYP2D6拷贝数检测反向引物
<400> 14
gctcaccagg aaagcaaaga c 21
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> CYP2D6拷贝数检测FAM探针序列
<400> 15
ccggcccagc caccatgg 18
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 参考基因ALB拷贝数检测正向引物
<400> 16
ttatgtgtgt tgcatgagaa aacg 24
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 参考基因ALB拷贝数检测反向引物
<400> 17
gtcgcctgtt caccaaggat 20
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 参考基因ALB拷贝数检测VIC探针序列
<400> 18
aagtgacaga gtcaccaaat gctgcacag 29
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> CYP2D6*9 (2615-2617delAAG，rs5030656)正向引物
<400> 19
gagacctgac tgaggccttc ct 22
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> CYP2D6*9 (2615-2617delAAG，rs5030656)反向引物
<400> 20
tcattcctcc tgggacgct 19
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> CYP2D6*9 (2615-2617delAAG，rs5030656) 野生型等位基因探针序列
<400> 21
tctcaccttc tccatct 17
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> CYP2D6*9 (2615-2617delAAG，rs5030656) 突变型等位基因探针序列
<400> 22
tctcacctcc atctc 15
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> CYP2D6*10（100C>T，rs1065852）正向引物
<400> 23
ccatttggta gtgaggcagg t 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> CYP2D6*10（100C>T，rs1065852）反向引物
<400> 24
tctggtaggg gagcctcagc 20
<210> 25
<211> 14
<212> DNA
<213> CYP2D6*10（100C>T，rs1065852）野生型等位基因探针序列
<400> 25
ctgcacgcta ccca 14
<210> 26
<211> 14
<212> DNA
<213> CYP2D6*10（100C>T，rs1065852）突变型等位基因探针
<400> 26
ctgcacgcta ctca 14
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> CYP2D6*41（2988G>A，rs28371725）正向引物
<400> 27
ttggaggagg tcaggcttac a 21
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> CYP2D6*41（2988G>A，rs28371725）反向引物
<400> 28
cgtgagccca tctgggaaa 19
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> CYP2D6*41（2988G>A，rs28371725）野生型等位基因探针序列
<400> 29
cgcctgtacc cttcctccct cg 22
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> CYP2D6*41（2988G>A，rs28371725）突变型等位基因探针序列
<400> 30
cgcctgtacc ctttctccct cg 22

Claims (7)

1.一组同时检测CYP2C19和CYP2D6基因多位点突变的引物和探针，其特征在于，所述用于检测CYP2C19*2位点的引物如SEQ ID NO：1～2所示，相应的探针如SEQ ID NO：3～4所示；用于检测CYP2C19*3位点的引物如SEQ ID NO：5～6所示，相应的探针如SEQ ID NO：7～8所示；用于检测CYP2D6*4突变位点rs3892097的引物如SEQ ID NO：9～10所示，相应的探针如SEQ ID NO：11～12所示；用于检测CYP2D6拷贝数的引物如SEQ ID NO：13～14所示，相应的探针如SEQ ID NO：15所示；用于检测CYP2D6*9位点的引物如SEQ ID NO：19～20所示，相应的探针如SEQ ID NO：21～22所示；用于检测CYP2D6*10位点的引物对如SEQ ID NO：23～24所示，相应的探针如SEQ ID NO：25～26所示；用于检测CYP2D6*41位点的引物如SEQ ID NO：27～28所示，相应的探针如SEQ ID NO：29～30所示。
2.含有权利要求1所述引物和探针的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括TaqMan Master Mix。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括野生型质控模板、突变型质控模板、杂合型质控模板。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各个引物的浓度为0.25～0.75μM。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应体系为：浓度为0.25～0.75μM、体积为0.5～1.25μL的引物，浓度为0.25～0.75μM、体积为0.125～0.625μL的探针，5～15μL 2×Taqman Master Mix，用双蒸水补足总体积为10～25μL。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应程序为：（i）95℃，10min；1个循环；（ii）95℃，10s； 58℃，45s；40个循环；（iii）37℃，10s；1个循环。
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