CN110511989A - 一种高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于高血压治疗药物相关基因检测领域，具体涉及一种高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法及其应用。本发明公开了一种高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法及其应用。该方法包括高血压治疗药物相关基因确定、高血压治疗药物相关基因扩增引物组合设计、基因组DNA提取与浓度检测、高血压治疗药物相关基因多重PCR扩增反应及产物纯化、接头序列PCR反应及产物纯化、文库质检以及高通量测序等步骤。该方法可实现一次性对与高血压治疗药物相关的33个基因的39个SNP位点进行分型检测，覆盖27种高血压治疗常用药物，检测位点更多、通量更高、数据准确性更高、更加经济，可为患者的个体化用药提供指导，提高药物治疗效率，降低毒副作用风险。

Description

一种高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法及其应用
技术领域
本发明属于高血压治疗药物相关基因检测领域，具体涉及一种高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法及其应用。
背景技术
高血压是我国最常见的慢性疾病之一，2019年《中国高血压防治指南2018年修订版》中，我国高血压疾病最新调查数据显示，2012年～2015年我国18岁及以上居民高血压患病粗率为27.9％，且我国人群高血压的患病率仍呈升高趋势。高血压作为心脑血管疾病最重要的危险因素之一，致残致死率高，流行态势严重，给家庭和社会造成沉重的经济和精神负担，已成为我国一项重要的公共卫生问题。
我国高血压控制现状严峻，据中国2015年高血压调查结果显示，中国≥18岁成人高血压的知晓率、治疗率和控制率分别为51.6％、45.8％和16.8％，治疗控制率为37.5％。临床治疗对于高血压的控制方法主要是改变饮食习惯和生活方式等非药物措施和药物治疗两方面。高血压控制率如此低，除了知晓率/治疗率低外，饮食及生活方式未改善，药物治疗疗效不尽人意，药物毒副作用较多，患者服药依从性差，缺乏个性化用药指导措施等均为重要的影响高血压疾病控制率的重要因素。
临床上常用的五大类降压药物分别为利尿药、β受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂，可用药物种类繁多。药物基因组学研究进展表明，药物进入人体内，经过吸收、转运、代谢过程发挥作用，携带不同基因型的患者在上述药物作用过程中呈现的药物应答反应和反应程度均有一定差异，表现为个体的药物应答反应差异。2017年，卫计委合理用药专家委员会及中国医师协会高血压专业委员会发布的《高血压合理用药指南(第2版)》，明确提出：精准的用药指南就是要将个体的基因型考虑在内，量身定制用药方案，避免用药不当，真正做到精准的个性化用药。
目前，对高血压用药相关基因的检测主要有实时荧光PCR法和基因芯片法。实时荧光PCR法只能检测少数几个常见突变位点，所覆盖的药物种类有限，且该方法通量较低，费用高。基因芯片法虽然能够同时对多个已知待测SNP位点进行检测，但费用高、灵活性低，且只可检测已知位点。高通量测序(NGS)技术提供了一个高通量、高精确度的检测平台。多重PCR技术通过设计多对引物实现在同一反应体系中扩増出多个目标DNA片段的PCR反应，可同时进行多个SNP位点的分型检测，是一种快速、便捷且经济的文库构建和分型检测方法。利用高通量测序(NGS)和多重PCR技术相结合进行靶向扩增测序，可实现高血压疾病治疗药物相关基因分型检测，通量高、精确度高、更经济。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法及其应用。该方法包括高血压治疗药物相关基因确定、高血压治疗药物相关基因扩增引物组合设计、基因组DNA提取与浓度检测、高血压治疗药物相关基因多重PCR扩增反应及产物纯化、接头序列PCR反应及产物纯化、文库质检以及高通量测序等步骤，该方法可一次性对与高血压疾病治疗用药相关的33个基因的39个SNP位点进行检测，覆盖27种高血压疾病治疗常用药物，最大限度的为患者的个体化用药提供指导。
一种高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法，其具体包括如下步骤：
(1)根据高血压治疗药物相关基因(根据高血压治疗药物的特征，确定影响高血压治疗药物相关
基因)，设计基因扩增引物组合；所述基因扩增引物组合，各上下游引物序列的5’端含有一段共有序
列，用于接头引物扩增；所述上下游引物的3’端为结合到目标区域的特异性序列；
(2)待测样本基因组DNA提取与浓度检测；
(3)高血压治疗药物相关基因多重PCR扩增反应及产物纯化；
(4)将步骤(3)产物作为模板，进行接头序列PCR扩增反应及产物纯化；
(5)文库质控：采用Qubit检测步骤(4)产物文库浓度，琼脂糖凝胶电泳检测步骤(4)产物文库片
段大小；
(6)高通量测序：使用高通量测序仪器对文库进行高通量测序。
所述步骤(1)，根据高血压治疗药物的特征，药物进入人体内，经过吸收、转运、代谢、效应及清除的过程发挥作用，携带不同基因型的患者在高血压治疗药物作用过程中可能表现为药物反应性的个体差异。通过检索药物基因组学知识库(PharmGKB)中高血压治疗药物相关信息及参考卫计委合理用药专家委员会及中国医师协会高血压专业委员会发布的《高血压合理用药指南(第2版)》，确定的高血压治疗药物相关基因共33个基因，39个SNP位点。具体如表1所示：
表1本发明所述方法检测基因以及对应的SNP位点
所述步骤(1)根据确定的基因进行设计并优化，得到高血压治疗药物相关基因引物组合，对应的多重PCR引物组合包括39对引物，具体如表2所示：
表2本发明所述方法设计的引物信息
所述步骤(2)中的待测样本，可为唾液样本、口腔拭子或血液。
所述步骤(2)中的待测样本基因组DNA提取，采用商用试剂盒或自配试剂进行，优选地，使用MagMAXTM DNA Multi-Sample Kit，按照试剂盒说明书操作步骤进行DNA提取。
所述步骤(2)中的DNA浓度检测方法为：将获得的基因组DNA使用Qubit进行检测，Qubit定量样品浓度≥2ng/μL；提取的DNA总量≥100ng。
所述步骤(3)中多重PCR反应在同一反应管中进行，反应管中的人基因组DNA的含量为20～200ng。
所述步骤(3)中多重PCR反应的体系包括引物混合物8μL，人基因组DNA 5μL，NEBNext Ultra II Q5预混液(New England Biolabs)15μL，无核酸酶水2μL。
所述步骤(3)中多重PCR扩增反应的扩增程序为：98℃预变性3分钟，1个循环；98℃变性20秒，59℃退火延伸4分钟，共18～23个循环；72℃彻底延伸10分钟，1个循环。
所述步骤(3)中的产物纯化，采用核酸纯化磁珠进行纯化，优选地，核酸纯化磁珠为Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)磁珠，具体包括下述步骤：
1)向30μL PCR产物中，加入15μL室温平衡后的核酸纯化磁珠，用移液器吸打混匀数次；
2)室温孵育2～5分钟后，将EP管置于磁力架上吸附核酸纯化磁珠，直至溶液澄清为止；
3)转移上清至新的EP管，向管内加入18μL磁珠，用移液器吸打混匀数次；
4)室温孵育2～5分钟后，将PCR管置于磁力架上吸附磁珠，直至溶液澄清为止，移除上清，PCR管继续放置在磁力架上；
5)用100μL 80％新鲜配置乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠，以充分悬浮磁珠洗涤；
6)用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器尽可能移除剩余的乙醇溶液，室温静置2～5分钟，直至乙醇完全挥发。
所述步骤(4)中的接头序列PCR反应的体系，以纯化后的高血压治疗药物相关基因多重PCR扩增产物作为模版，向所得带有磁珠的PCR管中加入以下PCR体系：I5端接头引物1μL，I7端接头引物1μL，NEBNext Ultra II Q5预混液(New England Biolabs)15μL，无核酸酶水13μL。
所述步骤(4)中的接头序列PCR反应的扩增程序为：98℃预变性2分钟，1个循环；98℃变性15秒，59℃退火15秒，72℃延伸30秒，共6～8个循环；72℃彻底延伸2分钟，1个循环。
所述步骤(4)中的接头序列引物包含接头信息，分为I5端接头引物及I7端接头引物：
I5端接头引物：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-3′
I7端接头引物：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATYYYYYYYYGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-3′
所述的I5端接头引物中的X为A或T或C或G，所述的I7端接头引物中的Y为A或T或C或G。
所述的I5端接头引物中，XXXXXXXX优选出10种选择，YYYYYYYY优选出96种选择，最多可支持960个样本同时检测。
I5端接头引物中，XXXXXXXX优选序列如下：
GCCAATGC TGCACAGT GGTGATGA GAGACTCT CGATGCTA
CTTGTACT ACTGTGCA CCACTACT CTCTTCGA TCGCATCG
I7端接头引物中，YYYYYYYY优选序列如下：
CAGTCTGC ATATCACA AGATGTAC CTATCGAG TATGAGCG ATCTGCTG
TGCAGCAC ATCACGTC AGATCGTG GAGCTAGA ATCGCTGT GAGACAGC
AGATCAGC GATGTGAT CGCTCGCA CGACGATC CTATGCAC TCTGACAG
CGACACGT ATACACTC TATCATCA TCGTGATA GAGCGACT GAGCGCAC
ACGTGTGC CTGCTCGC GACGTATA TGCGTGCT GACTACGC ATCATACA
ACTACTGA GACAGCAT TAGCTCAT CGCATGCG GTCGTCGT ATCGACTA
ATAGTGTA CGCATCAT CATCAGAT GCTCACTG CTCGTGAT CATCACGC
ATCATCAC CGTCTGTA TGTCGTAC AGACGCGC CGACAGTG CGTAGAGA
CGCGACTG CACGATGC ACGTACAT GTCATAGC CATGTAGC GTACAGCT
AGCGTGAC CACATAGA ATCTACGT GCAGCGAG TCTATCTC GCATACAC
ATGAGAGA ATGAGTAG CGCAGTAG TGTAGTCG CACACATC GTGTCGAC
TCGCTGTC GATACGAC CTATATCG CACTGCGT GAGTCGCA CTCCAGAG
TGTCACTA AGCTATCT CATGCTCT TCGCTAGT ACGCTGCG TATGCAGT
TGTCATGT TATGTACA CTGCGTCG TACGAGAT GCGTATGA TCGACAGA
GTGTGCTA TAGTGTAC GTGAGCGC ACTAGTAT GATAGATA TGCTGACG
ACGCACGA TGCGTCGA GCGACTAG CTAGATGT ACAGTCTG TAGCGAGC
所述步骤(4)中的产物纯化，采用核酸纯化磁珠进行纯化，优选地，核酸纯化磁珠为Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)磁珠，具体包括下述步骤：
1)向30μL PCR产物中，加入24μL室温平衡后的核酸纯化磁珠，用移液器吸打混匀数次；
2)室温孵育2～5分钟后，将EP管置于磁力架上吸附磁珠，直至溶液澄清为止，移除上清，PCR管继续放置在磁力架上；
3)用100μL 80％新鲜配置乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠，以充分悬浮磁珠洗涤；
4)用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器尽可能移除剩余的乙醇溶液，室温静置2～5分钟，直至乙醇完全挥发；
5)加入20uL无核酸酶水或TE溶液洗脱DNA。
所述步骤(5)文库质控，优选地，采用Qubit检测步骤(5)产物文库浓度，琼脂糖凝胶电泳检测步骤(4)产物文库片段大小。
所述步骤(6)使用高通量测序仪器对文库进行高通量测序，优选地，高通量测序仪器指illumina平台的高通量测序仪器。
本发明的方法可应用于高血压临床治疗中的个体化用药指导，所述的高血压治疗药物包括：利尿剂类药物、肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂类药物、钙通道阻滞剂类药物、肾上腺素能受体阻滞剂类药物、交感神经抑制剂类药物、直接血管扩张剂类药物、硝酸酯类药物等高血压治疗常用药物。
1、本发明提供了一种用于高血压治疗药物高通量测序的基因扩增引物组合，各上下游引物序列的5’端含有一段共有序列，用于接头引物扩增；所述上下游引物的3’端为结合到目标区域的特异性序列，具体为如下39对引物：
本发明还提供了基因扩增引物组合在制备高血压治疗药物相关基因高通量测序试剂中的应用。
所述高血压治疗药物相关基因高通量测序试剂的高通量测序方法为：
1)待测样本基因组DNA提取与浓度检测；
2)高血压治疗药物相关基因多重PCR扩增反应及产物纯化；
3)将步骤(2)产物作为模板，进行接头序列PCR扩增反应及产物纯化；
4)文库质控：采用Qubit检测步骤(3)产物文库浓度，琼脂糖凝胶电泳检测步骤(3)产物文库片段大小；
5)高通量测序：使用高通量测序仪器对文库进行高通量测序。
本发明与以往技术相比的有益效果在于：
(1)本方法可一次性对ABCB1、ABCC4、ACE、ADD1、ADRA1A、ADRB1、ADRB2、AGT、AGTR1、APOB、BDKRB2、CACNA1C、CAMK1D、CYP11B2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、GNB3、GPR83、KCNH2、NEDD4L、NOS3、NPHS1、NR3C2、PLCD3、PRKCA、PROX1、PTGS2、PTPRD、SLC14A2、SLCO1B1、UGT1A1、YEATS4共33个高血压治疗药物相关基因的39个SNP位点，进行基因分型检测，覆盖绝大部分常见高血压类疾病治疗药物，最大限度的为病人的个体化用药提供全面的指导，提高治疗效率。
(2)本方法通过采用特异性多重PCR扩增反应后进行高通量测序的方法，富集了目标测序区域，去掉了非目标区域的干扰和数据冗余，确保目标区域有效测序深度高，大大提高了高血压类疾病治疗药物相关基因突变检测的准确性。
(3)本方法与实时荧光PCR法相比，通量高，可一次实现对多个样本进行全部目标基因区域SNP位点的分型检测。相比于基因芯片法，本方法采用多重PCR法进行目标区域捕获，不仅能够检测不同个体各个已知位点的突变，而且具备对罕见突变和未知突变位点的检测能力，同时引物及相关试剂价格便宜，在测序技术成本持续下降的背景下，更具检测成本优势。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。
实施例1：
基于Illumina测序平台对高血压治疗药物相关基因进行检测
试剂：NEBNext Ultra II Q5预混液(New England Biolabs)，Agencourt AMPureXP(Beckman Coulter)，QubitdsDNA HS Assay Kit(ThermoFisher)，MagMAXTM DNA Multi-Sample Kit(ThermoFisher)，高血压治疗药物相关基因扩增引物(壹基因)，I5端接头引物(壹基因)，I7端接头引物(壹基因)
1.待测样本基因组DNA提取与浓度检测：
取三例高血压患者：样本1、样本2、样本3的抗凝血样本，使用MagMAXTM DNA Multi-Sample Kit，按照试剂盒说明书操作步骤进行DNA提取。对提取的基因组DNA，用Qubit定量检测样品浓度。结果如下：
样本 样本1 样本2 样本3
浓度(ng/μL) 46 39 25
2.高血压治疗药物相关基因多重PCR扩增
将人基因组DNA与PCR引物、PCR扩增试剂混合，进行PCR反应，对目的基因进行扩增。体系在一个反应管中进行。DNA的起始量为20～200ng/反应管；引物终浓度为每条引物0.1μM～1μM。
2.1反应体系如下：
所述的多重PCR反应体系包括引物混合物8μL，人基因组DNA5μL，NEBNext UltraII Q5预混液(含PCR扩增酶)15μL，无核酸酶水2μL。
2.2上机程序如下：
2.3高血压治疗药物相关基因多重PCR引物序列：
3.采用Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)磁珠，对高血压治疗药物相关基因多重PCR扩增产物进行纯化。
(1)向30μL PCR产物中，加入15μL室温平衡后的Agencourt AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠，用移液器吸打混匀数次；
(2)室温孵育2min后，将EP管置于磁力架上吸附磁珠，直至溶液澄清为止；
(3)转移上清至新的EP管，向管内加入18μL Agencourt AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠，用移液器吸打混匀数次；
(4)室温孵育2min后，将PCR管置于磁力架上吸附磁珠，直至溶液澄清为止，移除上清，PCR管继续放置在磁力架上；
(5)用100μL 80％乙醇溶液洗涤，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠，以充分悬浮磁珠洗涤；
(6)用移液器尽可能移除剩余的乙醇溶液，室温静置，直至乙醇完全挥发；
4.接头序列PCR扩增反应
4.1反应体系如下：
将纯化后的高血压治疗药物相关基因多重PCR产物作为模版，向所得带有磁珠的PCR管中加入以下PCR体系：I5端接头引物1μL，I7端接头引物1μL，酶混合液15μL，无核酸酶水13μL。
4.2反应程序如下
4.3接头序列PCR扩增反应引物：
I5端接头引物：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-3′
I7端接头引物：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATYYYYYYYYGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-3′
I5端接头引物XXXXXXXX：GCCAATGC；3例高血压患者样本1、样本2、样本3的I7端接头引物YYYYYYYY分别为：Barcode1、Barcode2、Barcode3
Barcode1：CAGTCTGC
Barcode2：ATATCACA
Barcode3：AGATGTAC
5.接头序列PCR扩增产物纯化
采用Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)磁珠，对接头序列PCR扩增产物进行纯化。
(1)向30μL PCR产物中，加入24μL室温平衡后的Agencourt AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠，用移液器吸打混匀数次；
(2)室温孵育2min后，将EP管置于磁力架上吸附磁珠，直至溶液澄清为止，移除上清，PCR管继续放置在磁力架上；
(3)用100μL 80％乙醇溶液洗涤，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠，以充分悬浮磁珠洗涤；
(4)用移液器尽可能移除剩余的乙醇溶液，室温静置，直至乙醇完全挥发；
(5)加入20uL无核酸酶水或TE溶液洗脱DNA。
6.文库检测
采用Qubit和琼脂糖凝胶电泳的方法检测文库浓度及文库片段大小。
7.高通量测序
使用Illumina测序平台进行检测。
实施例2
取三例高血压患者：样本1、样本2、样本3的抗凝血样本进行检测，操作步骤按实施例1操作，经Illumina测序平台测序并进行数据分析后得出如下结果：
氯沙坦属于血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，是一种常用的抗高血压药。CYP2C9编码的蛋白属于药物代谢酶CYP450家族成员，可将催化氯沙坦体内代谢为为活性产物EXP-3174，进而发挥降压作用。CYP2C9基因的某些位点多态性影响氯沙坦活性产物EXP-3174的生成，进而影响降压效果。携带CYP2C9*3(rs1057910，A1075C，Ile359Leu)等位基因的个体服用氯沙坦后，EXP-3174的生成减少，氯沙坦的代谢率降低。口服单剂量氯沙坦，CYP2C9*1/*3基因型个体中氯沙坦的降压作用下降，需适当增加用药剂量以增强降压疗效。对于三位患者，主治医师若打算使用药物氯沙坦，根据以上结果可知样本1和样本2CYP2C9基因型为野生型，酶活性正常；样本3为携带*3基因型，酶活性减弱，医生可参考以上结果调整患者的用药剂量，对患者实行个体化精准化用药，以提高治疗效果。
序列表
<110> 杭州和壹基因科技有限公司
<120> 一种高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法及其应用
<130> 21-2019-0102
<160> 78
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctctttccct acacgacgct cttccgatct caactaaccc aaacaggaag tgtg 54
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggagttcctt ggcacccgag aattccagct gagaacattg cctatggaga 50
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctctttccct acacgacgct cttccgatct gtttttgagt ccaagaactg gcttt 55
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggagttcctt ggcacccgag aattccacaa tagcaggagt tgttgaaatg aa 52
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctctttccct acacgacgct cttccgatct gtgctggaca aacctaaaca cctg 54
<210> 6
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggagttcctt ggcacccgag aattccaggt aaaaggtttg gaagtttcag gga 53
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctctttccct acacgacgct cttccgatct cacggtgggc aggctc 46
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggagttcctt ggcacccgag aattccaggc cgaggttcct ggc 43
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctctttccct acacgacgct cttccgatct gactcatggc tggatcatga gc 52
<210> 10
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggagttcctt ggcacccgag aattccactc acagaaattg aggaattttc tcaagg 56
<210> 11
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctctttccct acacgacgct cttccgatct taaagacgga ccacagtgtg ag 52
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggagttcctt ggcacccgag aattccactc gccctctaag atcacacaat 50
<210> 13
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctctttccct acacgacgct cttccgatct ctagggctac agaactggct ac 52
<210> 14
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggagttcctt ggcacccgag aattccatgt aatgttcgtc cacaccttag tc 52
<210> 15
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctctttccct acacgacgct cttccgatct gtggtacagg aggattggtc tt 52
<210> 16
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggagttcctt ggcacccgag aattccagcc aagagttcaa aaaggccttt c 51
<210> 17
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctctttccct acacgacgct cttccgatct gcctcttcgt cttcttcaac tg 52
<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggagttcctt ggcacccgag aattccatct ccgtgggtcg cgt 43
<210> 19
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctctttccct acacgacgct cttccgatct ccttcttgct ggcaccca 48
<210> 20
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggagttcctt ggcacccgag aattccaatc agcacaggcc agtgaagt 48
<210> 21
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctctttccct acacgacgct cttccgatct ggcttacctt ctgctgtagt ac 52
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggagttcctt ggcacccgag aattccagct cactctgttc agcagtgaaa 50
<210> 23
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctctttccct acacgacgct cttccgatct caaaagccaa atcccactca aa 52
<210> 24
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggagttcctt ggcacccgag aattccatgt tcagagcttt agaaaagtcg gtt 53
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ctctttccct acacgacgct cttccgatct gatgattgtg aaaactcagt aattccctg 59
<210> 26
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggagttcctt ggcacccgag aattccagct ctgcagcttc atcctgaag 49
<210> 27
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ctctttccct acacgacgct cttccgatct ggctacgcaa acatggaaat ct 52
<210> 28
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggagttcctt ggcacccgag aattccagcg ggaacagctc atctttcaa 49
<210> 29
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ctctttccct acacgacgct cttccgatct gtcaataagg ttgagccagc aac 53
<210> 30
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggagttcctt ggcacccgag aattccaaga acacatgcat gaccttgaga 50
<210> 31
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctctttccct acacgacgct cttccgatct gtctccttat ggatgggatg gtaaa 55
<210> 32
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggagttcctt ggcacccgag aattccatct gaatgttgat tgactcatct attgctc 57
<210> 33
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctctttccct acacgacgct cttccgatct ccaaaggtag atgaaggaga agtc 54
<210> 34
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ggagttcctt ggcacccgag aattccagca gtttttgatc aattttgcaa tgaacta 57
<210> 35
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ctctttccct acacgacgct cttccgatct caggaagaga ttgaacgtgt gat 53
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ggagttcctt ggcacccgag aattccaacc cggtgatggt agaggtttaa 50
<210> 37
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctctttccct acacgacgct cttccgatct cagagactcc tcggtctctc g 51
<210> 38
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ggagttcctt ggcacccgag aattccagtg atgggcagaa gggcacaaag 50
<210> 39
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ctctttccct acacgacgct cttccgatct tcacctggtc gaagcagtat gg 52
<210> 40
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ggagttcctt ggcacccgag aattccacag aggagcccat ttggtagtg 49
<210> 41
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ctctttccct acacgacgct cttccgatct cagagggaaa gttacagctg taatgt 56
<210> 42
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ggagttcctt ggcacccgag aattccaaaa ccctgtcatc atatgcaac 49
<210> 43
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ctctttccct acacgacgct cttccgatct actcactgac ctcctttgag ttca 54
<210> 44
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ggagttcctt ggcacccgag aattccattg gaaggatgtg taggagtctt ct 52
<210> 45
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ctctttccct acacgacgct cttccgatct ttctcccacg agagcatcat ct 52
<210> 46
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ggagttcctt ggcacccgag aattccaagt gacaagggac agcagtaag 49
<210> 47
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ctctttccct acacgacgct cttccgatct agcttgatgg gtcaggttca ag 52
<210> 48
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ggagttcctt ggcacccgag aattccatgt gctacctagg ttgggaact 49
<210> 49
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ctctttccct acacgacgct cttccgatct gtacagccgc tggatgatgg 50
<210> 50
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ggagttcctt ggcacccgag aattccagcc accatcgtga catggttt 48
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ctctttccct acacgacgct cttccgatct ccagagagga acaaccgtgt 50
<210> 52
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ggagttcctt ggcacccgag aattccacca caggaaggta aaacctcct 49
<210> 53
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ctctttccct acacgacgct cttccgatct tggagatgaa ggcaggagac agtg 54
<210> 54
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ggagttcctt ggcacccgag aattccacag tcaatccctt tggtgctca 49
<210> 55
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ctctttccct acacgacgct cttccgatct tctctcaccc atacccagga t 51
<210> 56
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ggagttcctt ggcacccgag aattccagac cctgctagag gtaagggat 49
<210> 57
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ctctttccct acacgacgct cttccgatct gtggaggaca cagagttgat tc 52
<210> 58
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ggagttcctt ggcacccgag aattccaaag gaagcatgag tccagctaag 50
<210> 59
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ctctttccct acacgacgct cttccgatct ccaaaccaca ccatttctta gcc 53
<210> 60
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ggagttcctt ggcacccgag aattccatcc ctggagagtc atggacttta tc 52
<210> 61
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ctctttccct acacgacgct cttccgatct tcagggaatc atggttcctc tagtg 55
<210> 62
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
ggagttcctt ggcacccgag aattccagat gctggtcact ctcctctttc 50
<210> 65
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ctctttccct acacgacgct cttccgatct ggctaaagtg caagccattt tt 52
<210> 64
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
ggagttcctt ggcacccgag aattccagat ctgagaatgg atcaaagcta ctttctt 57
<210> 65
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ctctttccct acacgacgct cttccgatct taggcaggag aacatataac attaccca 58
<210> 66
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ggagttcctt ggcacccgag aattccagtt ggcagcaaat tgagcaaaag 50
<210> 67
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ctctttccct acacgacgct cttccgatct accttgctaa aatgaagaaa caggatct 58
<210> 68
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ggagttcctt ggcacccgag aattccatat gaaattgccc tatgctctcc ctatat 56
<210> 69
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ctctttccct acacgacgct cttccgatct aggaaactca acatcctaat ccatcagt 58
<210> 70
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
ggagttcctt ggcacccgag aattccaggg ttatcacagc cgtacacttg 50
<210> 71
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
ctctttccct acacgacgct cttccgatct atcaatgaag tatcaatgcc ctcaaagc 58
<210> 72
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
ggagttcctt ggcacccgag aattccattc tctcctggga caggtagtag atg 53
<210> 73
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
ctctttccct acacgacgct cttccgatct ataggttgtt taaaggaatc tgggtcata 59
<210> 74
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
ggagttcctt ggcacccgag aattccattc aaaagtagac aaagggaaag tgatca 56
<210> 75
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
ctctttccct acacgacgct cttccgatct tgtcccatgc tgggaagata ct 52
<210> 76
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ggagttcctt ggcacccgag aattccaatc acacgctgca ggaaagaat 49
<210> 77
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
ctctttccct acacgacgct cttccgatct gagatgagta agaggattgc aaaggtat 58
<210> 78
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ggagttcctt ggcacccgag aattccagtc tgacggatcc aaagtttttc c 51

Claims (10)

1.一种高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法，具体包括如下步骤：
(1)根据高血压治疗药物相关基因，设计基因扩增引物组合；
所述基因扩增引物组合，各上下游引物序列的5’端含有一段共有序列，用于接头引物扩增；所述上下游引物的3’端为结合到目标区域的特异性序列；
(2)待测样本基因组DNA提取与浓度检测；
(3)高血压治疗药物相关基因多重PCR扩增反应及产物纯化；
(4)将步骤(3)产物作为模板，进行接头序列PCR扩增反应及产物纯化；
(5)文库质控：采用Qubit检测步骤(4)产物文库浓度，琼脂糖凝胶电泳检测步骤(4)产物文库片段大小；
(6)高通量测序：使用高通量测序仪器对文库进行高通量测序。
2.根据权利要求1所述的高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法，其特征在于，所述高血压治疗药物相关基因，具体为：ABCB1、ABCC4、ACE、ADD1、ADRA1A、ADRB1、ADRB2、AGT、AGTR1、APOB、BDKRB2、CACNA1C、CAMK1D、CYP11B2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、GNB3、GPR83、KCNH2、NEDD4L、NOS3、NPHS1、NR3C2、PLCD3、PRKCA、PROX1、PTGS2、PTPRD、SLC14A2、SLCO1B1、UGT1A1、YEATS4；所述基因扩增引物组合为39对引物，具体为：
3.根据权利要求l所述的高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法，其特征在于，所述步骤(2)中的待测样本为唾液样本、口腔拭子或血液样本；基因组DNA提取，使用MagMAXTMDNA Multi-Sample Kit，按照试剂盒说明书操作步骤进行DNA提取；DNA浓度检测方法为：将获得的基因组DNA使用Qubit进行检测，Qubit定量样品浓度≥2ng/μL；提取的DNA总量≥100ng。
4.根据权利要求1所述的高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法，其特征在于：所述步骤(3)中高血压治疗药物相关基因多重PCR反应的体系包括引物混合物8μL，人基因组DNA 5μL，NEBNext Ultra II Q5预混液(New England Biolabs)15μL，无核酸酶水2μL；所述步骤(3)中高血压治疗药物相关基因多重PCR扩增反应的扩增程序为：98℃预变性3分钟，1个循环；98℃变性20秒，59℃退火延伸4分钟，共18～23个循环；72℃彻底延伸10分钟，1个循环。
5.根据权利要求1所述的高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法，其特征在于：
所述步骤(3)中的产物纯化，采用核酸纯化磁珠进行纯化，具体包括下述步骤：
1)向30μL PCR产物中，加入15μL室温平衡后的核酸纯化磁珠，用移液器吸打混匀数次；
2)室温孵育2～5分钟后，将EP管置于磁力架上吸附核酸纯化磁珠，直至溶液澄清为止；
3)转移上清至新的EP管，向管内加入18μL磁珠，用移液器吸打混匀数次；
4)室温孵育2～5分钟后，将PCR管置于磁力架上吸附磁珠，直至溶液澄清为止，移除上清，PCR管继续放置在磁力架上；
5)用100μL80％新鲜配置乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠，以充分悬浮磁珠洗涤；
6)用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器尽可能移除剩余的乙醇溶液，室温静置2～5分钟，直至乙醇完全挥发；
所述步骤(4)中的产物纯化，采用核酸纯化磁珠进行纯化，具体包括下述步骤：
1)向30μL PCR产物中，加入24μL室温平衡后的核酸纯化磁珠，用移液器吸打混匀数次；
2)室温孵育2～5分钟后，将EP管置于磁力架上吸附磁珠，直至溶液澄清为止，移除上清，PCR管继续放置在磁力架上；
3)用100μL 80％新鲜配置乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠，以充分悬浮磁珠洗涤；
4)用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器尽可能移除剩余的乙醇溶液，室温静置2～5分钟，直至乙醇完全挥发；
5)加入20uL无核酸酶水或TE溶液洗脱DNA。
6.根据权利要求1所述的高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法，其特征在于，所述步骤(4)中的接头序列PCR反应，以纯化后的高血压治疗药物相关基因多重PCR扩增产物作为模版，向所得带有磁珠的PCR管中加入以下PCR体系：I5端接头引物1μL，I7端接头引物1μL，NEBNext Ultra II Q5预混液(New England Biolabs)15μL，无核酸酶水13μL；所述步骤(4)中的接头序列PCR反应的扩增程序为：98℃预变性2分钟，1个循环；98℃变性15秒，59℃退火15秒，72℃延伸30秒，共6～8个循环；72℃彻底延伸2分钟，1个循环。
7.根据权利要求1所述的高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法，其特征在于，所述步骤(4)中的接头序列引物包含接头信息，分为I5端接头引物及I7端接头引物：
I5端接头引物：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-3′
I7端接头引物：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATYYYYYYYYGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-3′
其中，
I5端接头引物中的X为A或T或C或G，所述的I7端接头引物中的Y为A或T或C或G。
8.一种用于高血压治疗药物高通量测序的基因扩增引物组合，各上下游引物序列的5’端含有一段共有序列，用于接头引物扩增；所述上下游引物的3’端为结合到目标区域的特异性序列。
9.根据权利要求8所述的基因扩增引物组合，具体为如下39对引物：
；
所述的高血压治疗药物包括：利尿剂类药物、肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂类药物、钙通道阻滞剂类药物、肾上腺素能受体阻滞剂类药物、交感神经抑制剂类药物、直接血管扩张剂类药物和硝酸酯类药物。
10.权利要求8或9所述的基因扩增引物组合在制备高血压治疗药物相关基因高通量测序试剂中的应用。
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