CN110205370A - 用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合，其特征在于，包括针对SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)基因位点的特异性引物及探针。本发明还公开了其试剂盒和方法。本发明具有操作简单、经济、检测快速、准确性高、特异性好及结果判读简单的特点，实现对用于普伐他汀药物个体化用药相关基因多态性的快速及准确测定，以降低临床普伐他汀药物常见用药的不良反应，降低医疗成本，节约社会资源。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合、试剂盒及方法。
背景技术
高脂血症为临床上常见的代谢疾病，是因脂肪代谢或转异常导致血浆一种或多种脂质高于正常指标的疾病。高血脂症是一种血脂水平偏高的慢性疾病，其发病原因较为复杂，年龄、性别、遗传、环境和不良的生活习惯均会导致该病的发生。临床研究表明，高血脂是多种心血管疾病的诱发因素，如动脉粥样硬化、冠心病等。近些年，随着人们物质生活的不断提高，该病的发病率也逐年增高，目前该病是公认的心肌梗死、脑卒中等致残、致死性动脉粥样硬化性病变的独立危险因素之一，并与糖尿病、心血管疾病发生有关。
普伐他汀被FDA批准用于治疗家族祖性高胆固醇血症，临床上主要用于饮食限制仍不能控制的原发性高胆固醇血症或合并有高甘油三酯血症患者(IIa和IIb型)。HMG-CoA还原酶(HMGCR)是体内胆固醇合成的关键酶，是普伐他汀的作用靶点。研究表明，HMGCR基因相关位点突变会降低普伐他汀的降脂疗效。
《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》指出：对药物代谢酶和药物靶点基因进行检测，可指导临床针对特定的患者选择合适的药物和给药剂量实现“个体化”用药，从而提高药物治疗的有效性和安全性。建议临床上根据SLCO1B1基因型选择他汀类药物进行治疗。
家族祖性高胆固醇血症通常是由LDLR基因突变导致的，其检测位点为rs1433099。LDLR(rs1433099)基因座的遗传变异可影响基线脂质，普伐他汀反应和接受他汀类药物治疗的受试者的CVD风险。普伐他汀对rs1433099位点突变纯合型(CC)患者的治疗效果比野生型纯合子型(TT)差。
综上，通过对基因多态性的检测判断患者是否存在普伐他汀抗性，以便通过增加普伐他汀剂量、增加使用频率、增加新药等措施降低高脂血症的发生。
目前市场上还没有针对普伐他汀耐药性检测的基因检测试剂盒，临床上基因检测类试剂盒多采取Sanger测序法、高分辨率溶解曲线法、芯片杂交法检测基因多态性。但上述方法存在以下问题，其中Sanger测序包括PCR扩增、PCR产物纯化、DNA测序等操作，步骤繁琐，实验耗时长，专业技术要求高，且测序花费高，不适合临床推广；高分辨率溶解曲线法对设备要求特殊，且检测灵敏度不高，也不适合临床推广；芯片杂交法检测灵敏度低且特异性差，容易出现假阳性结果。荧光定量PCR的检测方法较以上方法，其拥有成本低、灵敏度高、特异性强，结果的重复性好等优点，2小时内可完成Sanger测序12-13小时才能完成的通量，大大缩短了临床检测时间，是一种非常好的基因多态性检测手段，Genotyping基因分型散点图是基于荧光定量PCR的一种更简单快速直观判读基因型的检测方法，但是目前没有基于该方法的用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的如权利要求中的引物组合及试剂盒产品。
发明内容
为了解决传统临床经验医疗方式诊断及普伐他汀药物用药时易出现临床用药不良反应且没有合适的试剂盒产品的技术问题。
本发明的目的之一在于提供一种用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合。
本发明的目的之二在于提供保护所述引物组合的试剂盒，所述试剂盒使用起来操作简单、检测快速、准确性高及特异性好。
本发明的目的之三在于所述试剂盒在指导普伐他汀药物个体化用药相关基因方面的检测方法。
为了实现本发明的目的之一，所采用的技术方案是：
一种用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合，包括针对SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)基因位点的特异性引物及探针，如下：
SLCO1B1(rs4149015)正向引物：
5'-CAACAAATGTCCCATGAATGATAAG-3'(SEQ ID NO.1)；
SLCO1B1(rs4149015)反向引物：
5'-TGAAATAAAGTACAGACCCTTCTCTCAC-3'(SEQ ID NO.2)；
SLCO1B1(rs4149015)野生型探针：
5'FAM-CACACTTTTACCTGTATAC-MGB 3'(SEQ ID NO.3)；
SLCO1B1(rs4149015)突变型探针：
5'VIC-ACACACTTTTACTTGTATAC-MGB 3'(SEQ ID NO.4)；
HMGCR(rs17244841)正向引物：
5'-GCAGAGGTTGCAGTGAACCAAG-3'(SEQ ID NO.5)；
HMGCR(rs17244841)反向引物：
5'-GGCTTATATTAATATCAAATTACTATTCAAAGAG-3'(SEQ ID NO.6)；
HMGCR(rs17244841)野生型探针：
5'FAM-ATTGTAATATAAAGGATTTTAA-MGB3'(SEQ ID NO.7)；
HMGCR(rs17244841)突变型探针：
5'VIC-ATTGTAATATAAAGGATTTAAA-MGB3'(SEQ ID NO.8)；
LDLR(rs1433099)正向引物：
5'-TGACAGCCACACCTGGGTG-3'(SEQ ID NO.9)；
LDLR(rs1433099)反向引物：
5'-TTCATGGCGTCGGAAATGAT-3'(SEQ ID NO.10)；
LDLR(rs1433099)野生型探针：
5'FAM-TAAGGGTGACCAGTGAC-MGB 3'(SEQ ID NO.11)；
LDLR(rs1433099)突变型探针：
5'VIC-TAAGGGTGACCGGTGAC-MGB 3'(SEQ ID NO.12)。
为了实现本发明的目的之二，所采用的技术方案是：
一种用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，包括含有如权利要求1所述的特异性引物及探针的PCR反应液，所述PCR反应液分别为SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)的PCR反应液，其分别包括：
SLCO1B1(rs4149015)正向引物、SLCO1B1(rs4149015)反向引物、SLCO1B1(rs4149015)野生型探针及SLCO1B1(rs4149015)突变型探针；
HMGCR(rs17244841)正向引物、HMGCR(rs17244841)反向引物、HMGCR(rs17244841)野生型探针及HMGCR(rs17244841)突变型探针；
LDLR(rs1433099)正向引物、LDLR(rs1433099)反向引物、LDLR(rs1433099)野生型探针及LDLR(rs1433099)突变型探针；
上述PCR反应液还包括NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液及无核酸酶水。
在本发明的一个优选实施例中，所述PCR反应液的成分终浓度为：1×NuHiSNPMix，0.5μM的各特异性引物及0.2μM探针。
在本发明的一个优选实施例中，还包括阳性对照品一、阳性对照品二及阳性对照品三；
所述阳性对照品一分别为SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)基因位点野生型质粒；
所述阳性对照品二分别为SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)基因位点野生型与突变型按1：1数量比杂合的质粒；
所述阳性对照品三分别为SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)基因位点突变型质粒。
在本发明的一个优选实施例中，还包括空白对照品，所述空白对照品为无核酸酶水。
为了实现本发明的目的之三，所采用的技术方案是：
一种用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的方法，包括如下步骤：
步骤一：取待检测样本抽提的DNA，作为PCR模板；
步骤二：提供如权利要求5所述的试剂盒，取出适量PCR反应液，将所述PCR反应液与适量所述PCR模板混匀；
步骤三：进行PCR扩增反应：95℃变性5min；95℃10sec，60℃40sec(采集荧光)，45cycles；
步骤四：PCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线及Genotyping基因分型散点图进行结果判定，得到用于普伐他汀药物个体化用药相关基因的基因型。
本发明的有益效果在于：
本发明具有操作简单、经济、检测快速、准确性高、特异性好及结果判读简单的特点，实现对用于普伐他汀药物个体化用药相关基因多态性的快速及准确测定，以降低临床普伐他汀药物常见用药的不良反应，降低医疗成本，节约社会资源。
附图说明
图1为临床样本SLCO1B1(rs4149015)采用本专利申请保护引物探针的GG分型的本专利申请保护引物探针qPCR扩增曲线图(FAM在上)；
图2为临床样本SLCO1B1(rs4149015)采用本专利申请保护引物探针的GA分型的本专利申请保护引物探针qPCR扩增曲线图(FAM在上)；
图3为临床样本SLCO1B1(rs4149015)采用本专利申请保护引物探针的AA分型的本专利申请保护引物探针qPCR扩增曲线图(FAM在下)；
图4为临床样本SLCO1B1(rs4149015)采用本专利申请保护引物探针的GG,GA,AA三种分型的散点曲线图；
图5为临床样本HMGCR(rs17244841)采用本专利申请保护引物探针的AA分型的qPCR扩增曲线图(FAM在上)；
图6为临床样本HMGCR(rs17244841)采用本专利申请保护引物探针的AT分型的qPCR扩增曲线图(FAM在下)；
图7为临床样本HMGCR(rs17244841)采用本专利申请保护引物探针的TT分型的qPCR扩增曲线图(FAM在下)；
图8为临床样本HMGCR(rs17244841)采用本专利申请保护引物探针的AA,AT,TT三种分型的散点曲线图；
图9为临床样本LDLR(rs1433099)采用本专利申请保护引物探针的TT分型的qPCR扩增曲线图(FAM在上)；
图10为临床样本LDLR(rs1433099)采用本专利申请保护引物探针的TC分型的qPCR扩增曲线图(FAM在上)；
图11为临床样本LDLR(rs1433099)采用本专利申请保护引物探针的CC分型的qPCR扩增曲线图(FAM在下)；
图12为临床样本LDLR(rs1433099)采用本专利申请保护引物探针的TT,TC,CC三种分型的散点曲线图；
图13为临床样本SLCO1B1(rs4149015)采用对比引物探针的GG分型的qPCR扩增曲线图(FAM在下)；
图14为临床样本SLCO1B1(rs4149015)采用对比引物探针的GA分型的qPCR扩增曲线图(FAM在下)；
图15为临床样本SLCO1B1(rs4149015)采用对比引物探针的AA型的qPCR扩增曲线图(FAM在下)；
图16为临床样本SLCO1B1(rs4149015)采用对比引物探针的GG,GA,AA三种分型的散点曲线图；
图17为临床样本LDLR(rs1433099)采用对比引物探针的TT分型的qPCR扩增曲线图(FAM在下)；
图18为临床样本LDLR(rs1433099)采用对比引物探针的TC分型的qPCR扩增曲线图(FAM在下)；
图19为临床样本LDLR(rs1433099)采用对比引物探针的CC分型的qPCR扩增曲线图(FAM在上)；
图20为临床样本LDLR(rs1433099)采用对比引物探针的TT,TC,CC三种分型的散点曲线图。
具体实施方式
本发明所基于的原理在于：
通过设计特异性高的引物及Taqman荧光检测探针并通过检测荧光的释放和强度来检测基因多态性。引物设计在探针结合区域的上下游，两条探针分别对应两种不同基因型，qPCR过程中，当探针与模板链互补结合后，探针被酶切水解时，5’端连接的FAM或VIC报告基团发出对应的荧光信号，通过荧光扩增曲线可判读基因型；以三种对应基因型的阳性对照品作为多态性分布标准，通过Genotyping基因分型散点图更加直观快速判读样本基因型。此外本发明所述试剂盒采用预混合的方式进行包装，使用时仅需加入基因组DNA，简化了qPCR的反应程序。综上，本发明具有操作简单、经济、检测快速、准确性高、特异性好及结果判读简单的特点，实现对用于普伐他汀药物个体化用药相关基因多态性的快速及准确测定，以降低临床普伐他汀药物常见用药的不良反应，降低医疗成本，节约社会资源。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：试剂盒的制备
一、引物和探针的设计与合成
针对人基因组中SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)基因位点(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列)，使用Primer Premier 5.0及Primer Express 3.0软件，分别设计特异性引物及Taqman探针。
特异性引物及探针序列，如下表1所示：
表1引物和探针序列和长度信息
二、对照品选择
所述阳性对照品一分别为SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)基因位点野生型质粒；
所述阳性对照品二分别为SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)基因位点野生型与突变型按1：1数量比杂合的质粒；
所述阳性对照品三分别为SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)基因位点突变型质粒。
空白对照品为无核酸酶水。
三、PCR反应液组成
包括含有上述特异性引物及探针的PCR反应液，所述PCR反应液分别为SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)PCR反应液，其分别包括：
SLCO1B1(rs4149015)正向引物、SLCO1B1(rs4149015)反向引物、SLCO1B1(rs4149015)野生型探针及SLCO1B1(rs4149015)突变型探针；
HMGCR(rs17244841)正向引物、HMGCR(rs17244841)反向引物、HMGCR(rs17244841)野生型探针及HMGCR(rs17244841)突变型探针；
LDLR(rs1433099)正向引物、LDLR(rs1433099)反向引物、LDLR(rs1433099)野生型探针及LDLR(rs1433099)突变型探针；
上述PCR反应液还包括NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液及无核酸酶水；
其中，所述NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液购自苏州新海生物科技股份有限公司；所述无核酸酶水为Ambion品牌Nuclease-Free Water。
所述PCR反应液成分的终浓度为：
1×NuHi SNP Mix
0.5μM特异性引物
0.2μM探针
无核酸酶水适量(将体系补充至23ul)。
实施例2：利用上述试剂盒进行用于普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的方法
一、生物样本
本发明所采用的生物材料均来自派森诺医学检验所。为2018年9-12月期间在派森诺医学检验所检测的100例剩余人群抗凝血。
二、取待检测样本抽提的DNA，作为PCR模板：
DNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的提取试剂盒《血液基因组DNA提取试剂盒》进行提取(货号：DP318)。
1)取全血400ul，加800ul细胞裂解液CL混匀，10000rpm/11500×g，1min离心，弃上清，若裂解不彻底可重复一次。
2)沉淀中加入200ul缓冲液GS，混匀，再加入20ul蛋白酶K，混匀。
3)加入200ul缓冲液GB，混匀，56℃，10min，期间颠倒数次，直至溶液变澄清(若未澄清，可延长时间至澄清)。
4)加200ul无水乙醇混匀，短暂离心。
5)转移样本混合液到吸附柱CB3，13400×g/12000rpm，30s离心，弃滤液。
6)加入500ul缓冲液GD到吸附柱CB3，13400×g/12000rpm，30s离心，弃滤液。
7)加入600ul缓冲液PW到吸附柱CB3，13400×g/12000rpm，30s离心，弃滤液，重复一次。
8)吸附柱CB3放入干净离心管中，13400×g/12000rpm，2min离心，弃滤液，室温静置3分钟，晾干。
9)加100ulddH2O，室温孵育2-5min,13400×g/12000rpm，2min离心，收集洗脱产物，-20℃保存。
三、提供所述试剂盒，取出适量PCR反应液，将所述PCR反应液与适量所述PCR模板混匀：
从试剂盒中取出所需数量PCR反应液8连管(每检测位点的PCR管数＝样本数+1个空白对照+3个阳性对照)。
PCR反应液室温融解后，瞬时离心，揭开管盖。
从待检样本DNA(或对照品)中取2μL加至PCR反应液中。
振荡混匀后，瞬时离心10s，将其移至扩增区。
四、进行PCR扩增反应：95℃变性5min；95℃10sec，60℃40sec(采集荧光)，45cycles。
使用的PCR仪器为ABI StepOnePlus，反应体系为25ul；
PCR反应条件如下表2所示：
表2 qPCR反应条件
五、PCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线及Genotyping基因分型散点图进行结果判定，得到用于普伐他汀药物个体化用药相关基因的基因型。
结果有效性判定，如下表3所示：
表3：不同检测位点对照品基因分型
| 对照品检测位点 | 阳性对照品一 | 阳性对照品二 | 阳性对照品三 |
| SLCO1B1(rs4149015) | 纯合野生(GG型) | 杂合突变(GA型) | 纯合突变(AA型) |
| HMGCR(rs17244841) | 纯合野生(AA型) | 杂合突变(AT型) | 纯合突变(TT型) |
| LDLR(rs1433099) | 纯合野生(TT型) | 杂合突变(TC型) | 纯合突变(CC型) |
空白对照结果为阴性(No Ct或Ct值≥38)。
PCR结果判定，根据荧光扩增曲线及Genotyping基因分型散点图区分各基因位点野生型、杂合型及突变型，详见说明书附图。
本实施例中100例样本的判读结果如下：
SLCO1B1(rs4149015)GG型样本87例，其中1例检测结果如图1所示，SLCO1B1(rs4149015)GA型样本13例，其中1例检测结果如图2所示，SLCO1B1(rs4149015)AA型样本0例，因此，该位点AA型检测结果参照该位点阳性参考品3，检测结果如图3所示；其中10个的Genotyping基因分型散点图(其中AA型为该位点阳性对照品3)如图4所示；
HMGCR(rs17244841)AA型样本85例，其中1例检测结果如图5所示，HMGCR(rs17244841)AT型样本15例，其中1例检测结果如图6所示，HMGCR(rs17244841)TT型样本0例；因此，该位点TT型检测结果参照该位点阳性参考品3；检测结果如图7所示；其中16个的Genotyping基因分型散点图(其中AA型为该位点阳性对照品3)如图8所示；
LDLR(rs1433099)TT型样本74例，其中1例检测结果如图9所示，LDLR(rs1433099)TC型样本23例，其中1例检测结果如图10所示，LDLR(rs1433099)CC型样本3例；其中1例检测结果如图11所示；其中15个的Genotyping基因分型散点图如图12所示；
六、本发明的试剂盒检测结果在指导普伐他汀药物用药中的应用
根据荧光定量PCR中的结果判定得出SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)各位点的基因型。基因型与普伐他汀药物个体化用药关系对应表如下表4所示：
表4不同位点、不同基因型和阿司匹林药物个体化用药对应关系
对比例1
改变引物组合序列信息检测人抗凝血组织样本的基因分型。
1材料与方法
1.1样本来源
本发明所采用的生物材料均来自派森诺医学检验所。为2018年9-12月期间在派森诺医学检验所检测的100例剩余人群抗凝血。
1.2取待检测样本抽提的DNA，作为qPCR模板：
DNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的提取试剂盒《血液基因组DNA提取试剂盒》进行提取(货号：DP318)，具体抽提步骤同实施例2中的人DNA抽提步骤。
1.3合成PCR扩增引物
利用生物信息学知识和DNAstar等相关生物信息学软件，对Genbank数据库中所能检索到的SLCO1B1、HMGCR、LDLR基因核酸序列进行基因序列比对分析，选定目标区域的特异性序列，设计出针对各个区域的相应特异性基因片段的PCR引物和探针(见下表5)。
表5不同基因位点本申请保护的特异性引物探针和对比引物探针序列和长度信息
1.4准备qPCR反应液
对SLCO1B1(rs4149015)、LDLR(rs1433099)不同的引物，探针组合进行分组，具体的引物和探针序列见表5：
第一组添加基因位点为SLCO1B1(rs4149015)的引物探针，引物序列为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2，探针序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
第二组添加基因位点为SLCO1B1(rs4149015)的引物探针，引物序列为SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14，探针序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；
第三组添加基因位点为LDLR(rs1433099)的引物探针，引物序列为SEQID NO.9和SEQ ID NO.10，探针序列为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；
第四组添加基因位点为ITGA2(rs1062535)的引物探针，引物序列为SEQID NO.17和SEQ ID NO.18，探针序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；
上述qPCR反应液还包括NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液及无核酸酶水；
所述qPCR反应液成分的终浓度为：
1×NuHi SNP Mix
0.5μM特异性引物
0.2μM探针
无核酸酶水适量(将体系补充至23ul)。
1.5进行qPCR扩增反应：95℃变性5min；95℃10sec，60℃40sec(采集荧光)，45cycles。
使用的qPCR仪器为ABI StepOnePlus，反应体系为25ul；
qPCR反应条件如表2所示。
2结果
2.1对比引物组合1的分型图如图1,2,3,4所示，图1,2,3为组合1临床样本SLCO1B1(rs4149015)GG、GA、AA共3种分型的qPCR扩增曲线图，图4为组合1临床样本SLCO1B1(rs4149015)的3种基因分型散点图，扩增曲线及基因分型散点图均区分良好。
2.2对比引物组合2的分型图如图13,14,15,16所示，图13,14,15,为组合2临床样本SLCO1B1(rs4149015)GG、GA、AA共3种分型的qPCR扩增曲线图，图16为组合2临床样本SLCO1B1(rs4149015)的3种基因分型散点图，扩增曲线及基因分型散点图区分效果不佳；
2.3对比引物组合3的分形图如图9,10,11,12所示，图9,10,11为组合3临床样本LDLR(rs1433099)TT,TC,CC共3种分型的qPCR扩增曲线图，图12为组合3临床样本LDLR(rs1433099)的3种基因分型散点图，扩增曲线及基因分型散点图均区分良好。
2.4对比引物组合4的分型图如图17,18,19,20所示，图17,18,19为组合4临床样本本LDLR(rs1433099)TT,TC,CC共3种分型的qPCR扩增曲线图，图20为组合4临床样本LDLR(rs1433099)的3种基因分型散点图，扩增曲线及基因分型散点图区分效果不佳。
本发明的原理在于：该方法通过设计针对不同基因位点区域，包括：SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)，检测主要的影响普伐他汀疗效基因位点的突变类型，通过设计引物组合对目标序列直接进行qPCR扩增，时间上和检测成本上都有效降低，同时在检测位点上，通过3个反应体系，完成影响普伐他汀疗效的基因位点的检测。
序列表
<110> 南京派森诺基因科技有限公司
<120> 用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合、试剂盒及方法
<130> 20190513
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 1
caacaaatgt cccatgaatg ataag 25
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 2
tgaaataaag tacagaccct tctctcac 28
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 3
cacactttta cctgtatac 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 4
acacactttt acttgtatac 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 5
gcagaggttg cagtgaacca ag 22
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 6
ggcttatatt aatatcaaat tactattcaa agag 34
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 7
attgtaatat aaaggatttt aa 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 8
attgtaatat aaaggattta aa 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 9
tgacagccac acctgggtg 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 10
ttcatggcgt cggaaatgat 20
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 11
taagggtgac cagtgac 17
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 12
taagggtgac cggtgac 17
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 13
caacaaatgt cccatgaatg ataa 24
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 14
gaaataaagt acagaccctt ctctcac 27
<210> 15
<211> 55
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 15
ctcatatatg catcctcaca ttaccacata tatatatgtg catatgtgta tagag 55
<210> 16
<211> 55
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 16
ctcatatatg catcctcaca ttaccacata tatatatgtg catatgtgta tagac 55
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 17
tgggtagggg tcgggagg 18
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 18
gcaccgagac caaactcatt ca 22
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 19
cccagaggca gagcctgagt ctct 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 20
cccagaggca gagcctgagt ctcc 24
Claims (6)
1.一种用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合，其特征在于，包括针对SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)基因位点的特异性引物及探针，如下：
SLCO1B1(rs4149015)正向引物：
5'-CAACAAATGTCCCATGAATGATAAG-3'；
SLCO1B1(rs4149015)反向引物：
5'-TGAAATAAAGTACAGACCCTTCTCTCAC-3'；
SLCO1B1(rs4149015)野生型探针：
5'FAM-CACACTTTTACCTGTATAC-MGB3'；
SLCO1B1(rs4149015)突变型探针：
5'VIC-ACACACTTTTACTTGTATAC-MGB3'；
HMGCR(rs17244841)正向引物：
5'-GCAGAGGTTGCAGTGAACCAAG-3'；
HMGCR(rs17244841)反向引物：
5'-GGCTTATATTAATATCAAATTACTATTCAAAGAG-3'；
HMGCR(rs17244841)野生型探针：
5'FAM-ATTGTAATATAAAGGATTTTAA-MGB3'；
HMGCR(rs17244841)突变型探针：
5'VIC-ATTGTAATATAAAGGATTTAAA-MGB3'；
LDLR(rs1433099)正向引物：
5'-TGACAGCCACACCTGGGTG-3'；
LDLR(rs1433099)反向引物：
5'-TTCATGGCGTCGGAAATGAT-3'；
LDLR(rs1433099)野生型探针：
5'FAM-TAAGGGTGACCAGTGAC-MGB3'；
LDLR(rs1433099)突变型探针：
5'VIC-TAAGGGTGACCGGTGAC-MGB3'。
2.一种用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的特异性引物及探针的PCR反应液，所述PCR反应液分别为SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)PCR反应液，其分别包括：
SLCO1B1(rs4149015)正向引物、SLCO1B1(rs4149015)反向引物、SLCO1B1(rs4149015)野生型探针及SLCO1B1(rs4149015)突变型探针；
HMGCR(rs17244841)正向引物、HMGCR(rs17244841)反向引物、HMGCR(rs17244841)野生型探针及HMGCR(rs17244841)突变型探针；
LDLR(rs1433099)正向引物、LDLR(rs1433099)反向引物、LDLR(rs1433099)野生型探针及LDLR(rs1433099)突变型探针；
上述PCR反应液还包括NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液及无核酸酶水。
3.根据权利要求2所述的用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液的成分终浓度为：1×NuHi SNP Mix，0.5μM的各特异性引物及0.2μM探针。
4.根据权利要求2-3中任一所述的用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品一、阳性对照品二及阳性对照品三；
所述阳性对照品一分别为SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)基因位点野生型质粒；
所述阳性对照品二分别为SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)基因位点野生型与突变型按1：1数量比杂合的质粒；
所述阳性对照品三分别为SLCO1B1(rs4149015)、HMGCR(rs17244841)、LDLR(rs1433099)基因位点突变型质粒。
5.根据权利要求4所述的用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，还包括空白对照品，所述空白对照品为无核酸酶水。
6.一种用于指导普伐他汀药物个体化用药相关基因检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：取待检测样本抽提的DNA，作为PCR模板；
步骤二：提供如权利要求5所述的试剂盒，取出适量PCR反应液，将所述PCR反应液与适量所述PCR模板混匀；
步骤三：进行PCR扩增反应：95℃变性5min；95℃10sec，60℃40sec，45cycles；
步骤四：PCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线及Genotyping基因分型散点图进行结果判定，得到用于普伐他汀药物个体化用药相关基因的基因型。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN105803099A (zh) * | 2016-05-16 | 2016-07-27 | 钟诗龙 | 一种同时检测slco1b1、apoe和ldlr基因多位点突变的试剂盒 |
| CN107099602A (zh) * | 2017-05-27 | 2017-08-29 | 宁波美晶医疗技术有限公司 | 一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒 |
-
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