CN110218783A - 用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的引物组合、试剂盒及方法及应用 - Google Patents

用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的引物组合、试剂盒及方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的引物组合。所述引物组合包括针对ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)基因位点的特异性引物及Taqman探针。本发明还涉及包括引物组合的试剂盒及其方法及其应用。本发明提供的试剂盒及其检测方法具有操作简单、经济、检测快速、准确性高、特异性好、灵敏性好等能有效满足临床要求的优点，并且结果判读简单客观。

Description

用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的引物组 合、试剂盒及方法及应用
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的引物组合、试剂盒及方法及应用。
背景技术
阿司匹林是常用的抗血小板聚集药物，它通过抑制血小板的环氧化酶，减少前列腺素的生成，而使血小板凝聚发生抑制作用，临床上广泛用于降低急性心肌梗死疑似患者的发病风险、预防心肌梗死复发、中风的二级预防、降低短暂性脑缺血发作TIA及其继发脑卒中的风险、降低稳定性和不稳定性心绞痛患者的发病风险等。
临床发现，部分患者产生阿司匹林抵抗(AR)，发生率约为5％-60％，且存在明显的个体差异。存在AR的患者更易出现血栓事件，其死亡、心肌梗死和脑血管事件发生率是阿司匹林反应正常人群的3倍。研究表明，多个血小板聚集相关蛋白的基因，包括ITGB3、GP1BA、ITGA2和TBXA2R的多态性在AR中起着重要作用。
血小板膜糖蛋白IIIa基因由ITGB3基因编码，其外显子2第1565位氨基酸的突变(rs5918)，即T1565C(Leu59Pro)，分别决定了P1A1和P1A2两种等位基因，GP IIIa P1A2是AR主要基因，携带突变型P1A2等位基因患者行支架术后，其亚急性血栓事件发生率是P1A1纯合野生型患者的5倍，一般需要更高剂量的阿司匹林才能达到抗凝效果。
GP1BA别名GP1B(血小板糖蛋白1B基因)，该基因与阿司匹林相关的有两个SNP位点，其中rs6065(145Thr-Met)和阿司匹林的毒力相关，CC基因型，AR风险增加；CT和TT型，AR风险降低。ITGA2的807T/873A等位基因增加血小板表面的GPIa/IIa密度，从而加强血小板聚集作用，造成AR。TBXA2R(血栓素A2受体)的T等位基因也被证实与AR相关。
综上，通过对基因多态性的检测判断患者是否存在阿司匹林抗性，以便通过增加阿司匹林剂量、增加使用频率、增加新药等措施降低AR的发生。
目前临床上多采取Sanger测序法、高分辨率溶解曲线法、芯片杂交法检测基因多态性。但上述方法存在以下问题，其中Sanger测序包括PCR扩增、PCR产物纯化、DNA测序等操作，步骤繁琐，实验耗时长，专业技术要求高，且测序花费高，不适合临床推广；高分辨率溶解曲线法对设备要求特殊，且检测灵敏度不高，也不适合临床推广；芯片杂交法检测灵敏度低且特异性差，容易出现假阳性结果。荧光定量PCR的检测方法拥有成本低、灵敏度高、特异性强，结果的重复性好等优点，2小时内可完成Sanger测序12-13小时才能完成的通量，大大缩短了临床检测时间，是一种非常好的基因多态性检测手段，Genotyping基因分型散点图是基于荧光定量PCR的一种更简单快速直观判读基因型的检测方法，但是目前没有基于该方法的用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的如权利要求中的引物组合及试剂盒产品。
发明内容
为了解决传统临床经验医疗方式诊断及阿司匹林药物用药时易出现临床用药不良反应且没有快捷，经济，准确性高的试剂盒产品的技术问题，本发明提供一种操作简单、经济、检测快速、准确性高、特异性好及结果判读简单客观的用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的引物组合、试剂盒及其方法。
本发明提供了一种用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的引物组合，包括针对ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)基因位点的特异性引物及探针，如下：
ITGB3(rs5918)正向引物：
5'-TCTCTTTGGGCTCCTGTCTTACA-3'(SEQ ID NO.1)；
ITGB3(rs5918)反向引物：
5'-AGCAGATTCTCCTTCAGGTCACA-3'(SEQ ID NO.2)；
ITGB3(rs5918)T基因探针：
5'FAM-CCTGCCTCTGGGCTCACCT-TAMRA 3'(SEQ ID NO.3)；
ITGB3(rs5918)C基因探针：
5'VIC-CCCTGCCTCCGGGCTCACCTC-TAMRA 3'(SEQ ID NO.4)；
GP1BA(rs6065)正向引物：
5'-GCTGACCTCGCTGCCTCTT-3'(SEQ ID NO.5)；
GP1BA(rs6065)反向引物：
5'-TGGAGGAGAAGGGTGTCGAG-3'(SEQ ID NO.6)；
GP1BA(rs6065)C基因探针：
5'FAM-AGGGCTCCTGACGCCCACAC-TAMRA 3'(SEQ ID NO.7)；
GP1BA(rs6065)T基因探针：
5'VIC-CAGGGCTCCTGATGCCCACAC-TAMRA 3'(SEQ ID NO.8)；
ITGA2(rs1126643)正向引物：
5'-AAACCAAAGAAGAAATGATTGTAGC-3'(SEQ ID NO.9)；
ITGA2(rs1126643)反向引物：
5'-CACCAAAACTTACCTTGCATATTG-3'(SEQ ID NO.10)；
ITGA2(rs1126643)C基因探针：
5'FAM-ACAAACACATTCGGAG-MGB 3'(SEQ ID NO.11)；
ITGA2(rs1126643)T基因探针：
5'VIC-ACAAACACATTTGGAG-MGB 3'(SEQ ID NO.12)；
ITGA2(rs1062535)正向引物：
5'-TCTTTATTTAATTTTATCTGCCACAGAAA-3'(SEQ ID NO.13)；
ITGA2(rs1062535)反向引物：
5'-TGCCAAACCTCAGTATATTGTCATG-3'(SEQ ID NO.14)；
ITGA2(rs1062535)G基因探针：
5'FAM-CGAAGTGCTACGAAAG-MGB 3'(SEQ ID NO.15)；
ITGA2(rs1062535)A基因探针：
5'VIC-AAGTGCTACAAAAGT-MGB 3'(SEQ ID NO.16)；
TBXA2R(rs4523)正向引物：
5'-TGCTCATCTACTTGCGCGTG-3'(SEQ ID NO.17)；
TBXA2R(rs4523)反向引物：
5'-CTGGAGGGACAGCGACCTG-3'(SEQ ID NO.18)；
TBXA2R(rs4523)T基因探针：
5'FAM-ATCCTGGACCCCTGGGTGTATATC-TAMRA 3'(SEQ ID NO.19)；
TBXA2R(rs4523)C基因探针：
5'VIC-CCTGGACCCCTGGGTGTACATC-TAMRA 3'(SEQ ID NO.20)。
本发明还提供了一种用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，包括含有如权利要求1所述的特异性引物及探针的qPCR反应液，所述qPCR反应液分别为ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)qPCR反应液，其分别包括：
ITGB3(rs5918)正向引物、ITGB3(rs5918)反向引物、ITGB3(rs5918)T基因探针及ITGB3(rs5918)C基因探针；
GP1BA(rs6065)正向引物、GP1BA(rs6065)反向引物、GP1BA(rs6065)C基因探针及GP1BA(rs6065)T基因探针；
ITGA2(rs1126643)正向引物、ITGA2(rs1126643)反向引物、ITGA2(rs1126643)C基因探针及ITGA2(rs1126643)T基因探针；
ITGA2(rs1062535)正向引物、ITGA2(rs1062535)反向引物、ITGA2(rs1062535)G基因探针及ITGA2(rs1062535)A基因探针；
TBXA2R(rs4523)正向引物、TBXA2R(rs4523)反向引物、TBXA2R(rs4523)T基因探针及TBXA2R(rs4523)C基因探针；
上述qPCR反应液还包括NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液及无核酸酶水。
在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述qPCR反应液的成分终浓度为：1×NuHi SNP Mix，0.5μM的各特异性引物及0.2μM探针。
在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，还包括阳性对照品一、阳性对照品二及阳性对照品三；
所述阳性对照品一分别为ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)基因位点TT型、CC型、CC型、GG型、TT型质粒；
所述阳性对照品二分别为ITGB3(rs5918)基因位点TT型与CC型、GP1BA(rs6065)基因位点CC型与TT型、ITGA2(rs1126643)基因位点CC型与TT型、ITGA2(rs1062535)基因位点GG型与AA型、TBXA2R(rs4523)基因位点TT型与CC型按1：1数量比杂合的质粒；
所述阳性对照品三分别为ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)基因位点CC型、TT型、TT型、AA型、CC型质粒。
在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，还包括空白对照品，所述空白对照品为无核酸酶水。
本发明还提供了一种用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的方法，包括如下步骤：
步骤一：取待检测样本抽提的DNA，作为qPCR模板；
步骤二：提供如权利要求5所述的试剂盒，取出适量qPCR反应液，将所述qPCR反应液与适量所述qPCR模板混匀；
步骤三：进行qPCR扩增反应：95℃变性5min；95℃10sec，60℃40sec(采集荧光)，45cycles；
步骤四：qPCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线及Genotyping基因分型散点图进行结果判定，得到用于阿司匹林药物个体化用药相关基因的基因型。
本发明还提供了所述试剂盒的应用，其中，所述应用为用于制备指导阿司匹林药物个体化用药的装置。
本发明的有益效果在于：
综上，本发明具有操作简单、经济、检测快速、准确性高、特异性好及结果判读简单的特点，实现对用于阿司匹林药物个体化用药相关基因多态性的快速及准确测定，以降低临床阿司匹林药物常见用药的不良反应，降低医疗成本，节约社会资源。
附图说明
图1为临床样本ITGB3(rs5918)采用引物探针的TT分型的引物探针qPCR扩增曲线图(FAM曲线在上)；
图2为临床样本ITGB3(rs5918)采用引物探针的TC分型的引物探针qPCR扩增曲线图(FAM曲线在上)；
图3为临床样本ITGB3(rs5918)采用引物探针的CC分型的引物探针qPCR扩增曲线图(FAM曲线在下)；
图4为临床样本ITGB3(rs5918)采用引物探针的TT,TC,CC三种分型的散点曲线图；
图5为临床样本GP1BA(rs6065)采用引物探针的CC分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在上)；
图6为临床样本GP1BA(rs6065)采用引物探针的CT分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在下)；
图7为临床样本GP1BA(rs6065)采用引物探针的TT分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在下)；
图8为临床样本GP1BA(rs6065)采用引物探针的CC,CT,TT三种分型的散点曲线图；
图9为临床样本ITGA2(rs1126643)采用引物探针的CC分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在下)；
图10为临床样本ITGA2(rs1126643)采用引物探针的CT分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线靠上)；
图11为临床样本ITGA2(rs1126643)采用引物探针的TT分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在上)；
图12为临床样本ITGA2(rs1126643)采用引物探针的CC,CT,TT三种分型的散点曲线图；
图13为临床样本ITGA2(rs1062535)采用引物探针的GG分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在上)；
图14为临床样本ITGA2(rs1062535)采用引物探针的GA分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在上)；
图15为临床样本ITGA2(rs1062535)采用引物探针的AA分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在上)；
图16为临床样本ITGA2(rs1062535)采用引物探针的GG,GA,AA三种分型的散点曲线图；
图17为临床样本TBXA2R(rs4523)采用引物探针的TT分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在上)；
图18为临床样本TBXA2R(rs4523)采用引物探针的TC分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在上)；
图19为临床样本TBXA2R(rs4523)采用引物探针的CC分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在下)；
图20为临床样本TBXA2R(rs4523)采用引物探针的TT,TC,CC三种分型的散点曲线图；
图21为临床样本ITGA2(rs1126643)采用对比引物探针的CC分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在上)；
图22为临床样本ITGA2(rs1126643)采用对比引物探针的CT分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在上)；
图23为临床样本ITGA2(rs1126643)采用对比引物探针的TT型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在上)；
图24为临床样本ITGA2(rs1126643)采用对比引物探针的CC,CT,TT三种分型的散点曲线图；
图25为临床样本ITGA2(rs1062535)采用对比引物探针的GG分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在上)；
图26为临床样本ITGA2(rs1062535)采用对比引物探针的GA分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在下)；
图27为临床样本ITGA2(rs1062535)采用对比引物探针的AA分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在下)；
图28为临床样本ITGA2(rs1062535)采用对比引物探针的GG,GA,AA三种分型的散点曲线图；
图29为临床样本TBXA2R(rs4523)采用对比引物探针的TT分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在上)；
图30为临床样本TBXA2R(rs4523)采用对比引物探针的TC分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在下)；
图31为临床样本TBXA2R(rs4523)采用对比引物探针的CC分型的qPCR扩增曲线图(FAM曲线在下)；
图32为临床样本TBXA2R(rs4523)采用对比引物探针的TT,TC,CC三种分型的散点曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所基于的发明原理在于：
通过设计特异性高的引物及Taqman荧光检测探针并通过检测荧光的释放和强度来检测基因多态性。引物设计在探针结合区域的上下游，两条探针分别对应两种不同基因型，qPCR过程中，当探针与模板链互补结合后，探针被酶切水解时，5’端连接的FAM或VIC报告基团发出对应的荧光信号，通过荧光扩增曲线可判读基因型；以三种对应基因型的阳性对照品作为多态性分布标准，通过Genotyping基因分型散点图更加直观快速判读样本基因型。此外本发明所述试剂盒采用预混合的方式进行包装，使用时仅需加入基因组DNA，简化了qPCR的反应程序。
下面通过具体的实施例和对比例来进一步说明本发明。
实施例1：试剂盒的制备
一、引物和探针的设计与合成
针对人基因组中ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)基因位点(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列)，使用Primer Premier 5.0及Primer Express 3.0软件，分别设计特异性引物及Taqman探针。
特异性引物及探针序列，如下表表1所示：
表1引物和探针序列和长度信息
二、对照品选择
所述阳性对照品一分别为ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)基因位点TT型、CC型、CC型、GG型、TT型质粒；
所述阳性对照品二分别为ITGB3(rs5918)基因位点TT型与CC型、GP1BA(rs6065)基因位点CC型与TT型、ITGA2(rs1126643)基因位点CC型与TT型、ITGA2(rs1062535)基因位点GG型与AA型、TBXA2R(rs4523)基因位点TT型与CC型按1：1数量比杂合的质粒；
所述阳性对照品三分别为ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)基因位点CC型、TT型、TT型、AA型、CC型质粒；
空白对照品为无核酸酶水。
三、qPCR反应液组成
包括含有上述特异性引物及探针的qPCR反应液，所述qPCR反应液分别为ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)qPCR反应液，其分别包括：
ITGB3(rs5918)正向引物、ITGB3(rs5918)反向引物、ITGB3(rs5918)T基因探针及ITGB3(rs5918)C基因探针；
GP1BA(rs6065)正向引物、GP1BA(rs6065)反向引物、GP1BA(rs6065)C基因探针及GP1BA(rs6065)T基因探针；
ITGA2(rs1126643)正向引物、ITGA2(rs1126643)反向引物、ITGA2(rs1126643)C基因探针及ITGA2(rs1126643)T基因探针；
ITGA2(rs1062535)正向引物、ITGA2(rs1062535)反向引物、ITGA2(rs1062535)G基因探针及ITGA2(rs1062535)A基因探针；
TBXA2R(rs4523)正向引物、TBXA2R(rs4523)反向引物、TBXA2R(rs4523)T基因探针及TBXA2R(rs4523)C基因探针；
上述qPCR反应液还包括NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液及无核酸酶水；
其中，所述NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液购自苏州新海生物科技股份有限公司；所述无核酸酶水为Ambion品牌Nuclease-Free Water。
所述qPCR反应液成分的终浓度为：
1×NuHi SNP Mix
0.5μM特异性引物
0.2μM探针
无核酸酶水适量(将体系补充至23ul)。
实施例2：利用上述试剂盒进行用于阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的方法
一、生物样本
本发明所采用的生物材料均来自派森诺医学检验所。为2018年9-12月期间在派森诺医学检验所检测的100例剩余人群抗凝血。
二、取待检测样本抽提的DNA，作为qPCR模板：
DNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的提取试剂盒《血液基因组DNA提取试剂盒》进行提取(货号：DP318)。
1)取全血400ul，加800ul细胞裂解液CL混匀，10000rpm/11500×g，1min离心，弃上清，若裂解不彻底可重复一次。
2)沉淀中加入200ul缓冲液GS，混匀，再加入20ul蛋白酶K，混匀。
3)加入200ul缓冲液GB，混匀，56℃，10min，期间颠倒数次，直至溶液变澄清(若未澄清，可延长时间至澄清)。
4)加200ul无水乙醇混匀，短暂离心。
5)转移样本混合液到吸附柱CB3，13400×g/12000rpm，30s离心，弃滤液。
6)加入500ul缓冲液GD到吸附柱CB3，13400×g/12000rpm，30s离心，弃滤液。
7)加入600ul缓冲液PW到吸附柱CB3，13400×g/12000rpm，30s离心，弃滤液，重复一次。
8)吸附柱CB3放入干净离心管中，13400×g/12000rpm，2min离心，弃滤液，室温静置3分钟，晾干。
9)加100ulddH2O，室温孵育2-5min,13400×g/12000rpm，2min离心，收集洗脱产物，-20℃保存。
三、提供所述试剂盒，取出适量qPCR反应液，将所述qPCR反应液与适量所述qPCR模板混匀：
从试剂盒中取出所需数量qPCR反应液8连管(每检测位点的qPCR管数＝样本数+1个空白对照+3个阳性对照)。
qPCR反应液室温融解后，瞬时离心，揭开管盖。
从待检样本DNA(或对照品)中取2μL加至qPCR反应液中。
振荡混匀后，瞬时离心10s，将其移至扩增区。
四、进行qPCR扩增反应：95℃变性5min；95℃10sec，60℃40sec(采集荧光)，45cycles。
使用的qPCR仪器为ABI StepOnePlus，反应体系为25ul；
qPCR反应条件如下表2所示：
表2 qPCR反应条件
五、qPCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线及Genotyping基因分型散点图进行结果判定，得到用于阿司匹林药物个体化用药相关基因的基因型。
结果有效性判定，如下表表3所示：
表3：不同检测位点对照品基因分型
检测位点对照品 阳性对照品 阳性对照品二 阳性对照品三
ITGB3(rs5918) TT型 TC型 CC型
GP1BA(rs6065) CC型 CT型 TT型
ITGA2(rs1126643) CC型 CT型 TT型
ITGA2(rs1062535) GG型 GA型 AA型
TBXA2R(rs4523) TT型 TC型 CC型
空白对照结果为阴性(No Ct或Ct值≥38)。
本实施例中100例样本的判读结果如下：
ITGB3(rs5918)TT型样本87例，其中1例检测结果如图1所示，ITGB3(rs5918)TC型样本11例，其中1例检测结果如图2所示，ITGB3(rs5918)CC型样本2例，其中1例检测结果如图3所示；其中11个的Genotyping基因分型散点图如图4所示；
GP1BA(rs6065)CC型样本85例，其中1例检测结果如图5所示，GP1BA(rs6065)CT型样本14例，其中1例检测结果如图6所示，GP1BA(rs6065)TT型样本1例；其中1例检测结果如图7所示；其中10个的Genotyping基因分型散点图如图8所示；
ITGA2(rs1126643)CC型样本33例，其中1例检测结果如图9所示，ITGA2(rs1126643)CT型样本49例，其中1例检测结果如图10所示，ITGA2(rs1126643)TT型样本18例；其中1例检测结果如图11所示；其中8个的Genotyping基因分型散点图如图12所示；
ITGA2(rs1062535)GG型样本36例，其中1例检测结果如图13所示，ITGA2(rs1062535)GA型样本48例，其中1例检测结果如图14所示，ITGA2(rs1062535)AA型样本16例；其中1例检测结果如图15所示；其中13个的Genotyping基因分型散点图如图16所示。
TBXA2R(rs4523)TT型样本6例，其中1例检测结果如图17所示，TBXA2R(rs4523)TC型样本38例，其中1例检测结果如图18所示，TBXA2R(rs4523)CC型样本56例，其中1例检测结果如图19所示；其中18个的Genotyping基因分型散点图如图20所示；
六、本发明的试剂盒检测结果在指导阿司匹林药物用药中的应用
根据荧光定量qPCR中的结果判定得出ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)各位点的基因型。基因型与阿司匹林药物个体化用药关系对应表如下表4所示：
表4不同位点、不同基因型和阿司匹林药物个体化用药对应关系
对比例1
改变引物组合序列信息检测人抗凝血组织样本的基因分型。
1材料与方法
1.1样本来源
本发明所采用的生物材料均来自派森诺医学检验所。为2018年9-12月期间在派森诺医学检验所检测的100例剩余人群抗凝血。
1.2取待检测样本抽提的DNA，作为qPCR模板：
DNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的提取试剂盒《血液基因组DNA提取试剂盒》进行提取(货号：DP318)，具体抽提步骤同实施例2中的人DNA抽提步骤。
1.3合成PCR扩增引物
利用生物信息学知识和DNAstar等相关生物信息学软件，对Genbank数据库中所能检索到的ITGB3，GP1BA，ITGA2，TBXA2R基因核酸序列进行基因序列比对分析，选定目标区域的特异性序列，设计出针对各个区域的相应特异性基因片段的PCR引物和探针(见下表5)。
表5不同基因位点本申请保护的特异性引物探针和对比引物探针序列和长度信息
1.4准备qPCR反应液
对ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)不同的引物，探针组合进行分组，具体的引物和探针序列见表5：
第一组添加基因位点为ITGA2(rs1126643)的引物探针，引物序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，探针序列为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；
第二组添加基因位点为ITGA2(rs1126643)的引物探针，引物序列为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.33，探针序列为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；
第三组添加基因位点为ITGA2(rs1062535)的引物探针，引物序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，探针序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；
第四组添加基因位点为ITGA2(rs1062535)的引物探针，引物序列为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26，探针序列为SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28；
第五组添加基因位点为TBXA2R(rs4523)的引物探针，引物序列为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18的引物，探针序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20的探针；
第六组添加基因位点为TBXA2R(rs4523)的引物探针，引物序列为SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30，探针序列为SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32；
上述qPCR反应液还包括NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液及无核酸酶水；
所述qPCR反应液成分的终浓度为：
1×NuHi SNP Mix
0.5μM特异性引物
0.2μM探针
无核酸酶水适量(将体系补充至23ul)。
1.5进行qPCR扩增反应：95℃变性5min；95℃10sec，60℃40sec(采集荧光)，45cycles。
使用的qPCR仪器为ABI StepOnePlus，反应体系为25ul；
qPCR反应条件如表2所示。
2结果
2.1对比引物组合1的分型图如图9,10,11,12所示，图9,10,11为组合1临床样本ITGA2(rs1126643)CC、CT、TT共3种分型的qPCR扩增曲线图，图12为组合1临床样本ITGA2(rs1126643)的3种基因分型散点图，扩增曲线及基因分型散点图均区分良好。
2.2对比引物组合2的分型图如图21,22,23,24所示，图21,22,23为组合2临床样本ITGA2(rs1126643)CC、CT、TT共3种分型的qPCR扩增曲线图，图24为组合2临床样本ITGA2(rs1126643)的3种基因分型散点图，扩增曲线及基因分型散点图区分效果不佳；
2.3对比引物组合3的分形图如图13,14,15,16所示，图13,14,15为组合3临床样本ITGA2(rs1062535)GG、GA、AA共3种分型的qPCR扩增曲线图，图16为组合3临床样本ITGA2(rs1062535)的3种基因分型散点图，扩增曲线及基因分型散点图均区分良好。
2.4对比引物组合4的分型图如图25,26,27,28所示，图25,26,27为组合4临床样本ITGA2(rs1062535)GG、GA、AA共3种分型的qPCR扩增曲线图，图28为组合4临床样本ITGA2(rs1062535)的3种基因分型散点图，扩增曲线及基因分型散点图区分效果不佳。
2.5对比引物组合5的分形图如图17,18,19,20所示，图25,26,27为组合5临床样本TBXA2R(rs4523)TT、TC、CC共3种分型的qPCR扩增曲线图，图20为组合5临床样本TBXA2R(rs4523)的3种基因分型散点图，扩增曲线及基因分型散点图区分良好。
2.6对比引物组合6的分型图如图29,30,31,32所示，图29,30,31为组合6临床样本TBXA2R(rs4523)TT、TC、CC共3种分型的qPCR扩增曲线图，图32为组合6临床样本TBXA2R(rs4523)的3种基因分型散点图，扩增曲线及基因分型图区分效果不佳。
综上对比可见，本申请所提供的引物组合分型良好，利于后期应用。
本发明的原理在于：该方法通过设计针对不同基因位点区域，包括：ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)，检测主要的影响阿司匹林疗效基因位点的突变类型，通过设计引物组合对目标序列直接进行qPCR扩增，时间上和检测成本上都有效降低，同时在检测位点上，通过5个反应体系，完成影响阿司匹林疗效的基因位点的检测。
序列表
<110> 上海派森诺生物科技股份有限公司
<120> 用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的引物组合、试剂盒及方法及应用
<130> 20190430
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
tctctttggg ctcctgtctt aca 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
agcagattct ccttcaggtc aca 23
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
cctgcctctg ggctcacct 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
ccctgcctcc gggctcacct c 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
gctgacctcg ctgcctctt 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
tggaggagaa gggtgtcgag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
agggctcctg acgcccacac 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
cagggctcct gatgcccaca c 21
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
aaaccaaaga agaaatgatt gtagc 25
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
caccaaaact taccttgcat attg 24
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
acaaacacat tcggag 16
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
acaaacacat ttggag 16
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
tctttattta attttatctg ccacagaaa 29
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
tgccaaacct cagtatattg tcatg 25
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
cgaagtgcta cgaaag 16
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
aagtgctaca aaagt 15
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
tgctcatcta cttgcgcgtg 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
ctggagggac agcgacctg 19
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 19
atcctggacc cctgggtgta tatc 24
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 20
cctggacccc tgggtgtaca tc 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 21
aaccaaagaa gaaatgattg ta 22
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 22
accaaaactt accttgcata taaccaaaga agaaatgatt gta 43
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 23
caaacacatt cggagcaatt caata 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 24
caaacacatt tggagcaatt caata 25
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 25
ttcagcagct tctggtggg 19
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 26
gaaccatcat gtgattcacc gt 22
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 27
cgaagtgcta cgaaagtaat ggt 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 28
cgaagtgcta caaaagtaat ggt 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 29
gaaggagctg ctcatctact tgc 23
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 30
cgctctgtcc acttcctact gc 22
<210> 31
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 31
ctgggtgtat atcct 15
<210> 32
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 32
ctgggtgtac atcct 15
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 33
aaccaaagaa gaaatgattg ta 22

Claims (7)

1.一种用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的引物组合，其特征在于，包括针对ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)基因位点的特异性引物及探针，如下：
ITGB3(rs5918)正向引物：
5'-TCTCTTTGGGCTCCTGTCTTACA-3'；
ITGB3(rs5918)反向引物：
5'-AGCAGATTCTCCTTCAGGTCACA-3'；
ITGB3(rs5918)T基因探针：
5'FAM-CCTGCCTCTGGGCTCACCT-TAMRA3'；
ITGB3(rs5918)C基因探针：
5'VIC-CCCTGCCTCCGGGCTCACCTC-TAMRA3'；
GP1BA(rs6065)正向引物：
5'-GCTGACCTCGCTGCCTCTT-3'；
GP1BA(rs6065)反向引物：
5'-TGGAGGAGAAGGGTGTCGAG-3'；
GP1BA(rs6065)C基因探针：
5'FAM-AGGGCTCCTGACGCCCACAC-TAMRA3'；
GP1BA(rs6065)T基因探针：
5'VIC-CAGGGCTCCTGATGCCCACAC-TAMRA3'；
ITGA2(rs1126643)正向引物：
5'-AAACCAAAGAAGAAATGATTGTAGC-3'；
ITGA2(rs1126643)反向引物：
5'-CACCAAAACTTACCTTGCATATTG-3'；
ITGA2(rs1126643)C基因探针：
5'FAM-ACAAACACATTCGGAG-MGB3'；
ITGA2(rs1126643)T基因探针：
5'VIC-ACAAACACATTTGGAG-MGB3'；
ITGA2(rs1062535)正向引物：
5'-TCTTTATTTAATTTTATCTGCCACAGAAA-3'；
ITGA2(rs1062535)反向引物：
5'-TGCCAAACCTCAGTATATTGTCATG-3'；
ITGA2(rs1062535)G基因探针：
5'FAM-CGAAGTGCTACGAAAG-MGB3'；
ITGA2(rs1062535)A基因探针：
5'VIC-AAGTGCTACAAAAGT-MGB3'；
TBXA2R(rs4523)正向引物：
5'-TGCTCATCTACTTGCGCGTG-3'；
TBXA2R(rs4523)反向引物：
5'-CTGGAGGGACAGCGACCTG-3'；
TBXA2R(rs4523)T基因探针：
5'FAM-ATCCTGGACCCCTGGGTGTATATC-TAMRA3'；
TBXA2R(rs4523)C基因探针：
5'VIC-CCTGGACCCCTGGGTGTACATC-TAMRA3'。
2.一种用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的特异性引物及探针的qPCR反应液，所述qPCR反应液分别为ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)qPCR反应液，其分别包括：
ITGB3(rs5918)正向引物、ITGB3(rs5918)反向引物、ITGB3(rs5918)T基因探针及ITGB3(rs5918)C基因探针；
GP1BA(rs6065)正向引物、GP1BA(rs6065)反向引物、GP1BA(rs6065)C基因探针及GP1BA(rs6065)T基因探针；
ITGA2(rs1126643)正向引物、ITGA2(rs1126643)反向引物、ITGA2(rs1126643)C基因探针及ITGA2(rs1126643)T基因探针；
ITGA2(rs1062535)正向引物、ITGA2(rs1062535)反向引物、ITGA2(rs1062535)G基因探针及ITGA2(rs1062535)A基因探针；
TBXA2R(rs4523)正向引物、TBXA2R(rs4523)反向引物、TBXA2R(rs4523)T基因探针及TBXA2R(rs4523)C基因探针；
上述qPCR反应液还包括NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液及无核酸酶水。
3.根据权利要求2所述的用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，所述qPCR反应液的成分终浓度为：1×NuHi SNP Mix，0.5μM的各特异性引物及0.2μM探针。
4.根据权利要求2-3中任一所述的用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品一、阳性对照品二及阳性对照品三；
所述阳性对照品一分别为ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)基因位点TT型、CC型、CC型、GG型、TT型质粒；
所述阳性对照品二分别为ITGB3(rs5918)基因位点TT型与CC型、GP1BA(rs6065)基因位点CC型与TT型、ITGA2(rs1126643)基因位点CC型与TT型、ITGA2(rs1062535)基因位点GG型与AA型、TBXA2R(rs4523)基因位点TT型与CC型按1：1数量比杂合的质粒；
所述阳性对照品三分别为ITGB3(rs5918)、GP1BA(rs6065)、ITGA2(rs1126643)、ITGA2(rs1062535)、TBXA2R(rs4523)基因位点CC型、TT型、TT型、AA型、CC型质粒。
5.根据权利要求4所述的用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，还包括空白对照品，所述空白对照品为无核酸酶水。
6.一种用于指导阿司匹林药物个体化用药相关基因检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：取待检测样本抽提的DNA，作为qPCR模板；
步骤二：提供如权利要求5所述的试剂盒，取出适量qPCR反应液，将所述qPCR反应液与适量所述qPCR模板混匀；
步骤三：进行qPCR扩增反应：95℃变性5min；95℃10sec，60℃40sec，45cycles；
步骤四：qPCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线及Genotyping基因分型散点图进行结果判定，得到用于阿司匹林药物个体化用药相关基因的基因型。
7.如权利要求2-5当中任意一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述应用为用于制备指导阿司匹林药物个体化用药的装置。
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