JPH03133400A - 核酸誘導体 - Google Patents
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
受性の評価方法、およびこの評価に使用される診断的検
定法に関する0 最近とくに重要視されているウィルスの一群にレトロウ
ィルスがある。レトロウィルスはRNAウィルスの亜郭
を形成し、これは複製するためには、1ずデノムのRN
A k DNAに「逆転写」しなけnばならない(「転
写」の飴は慣用的にDNAからRNAの合成に用いらす
る)〇−旦DNAの形になると、このウィルスゲツムは
宿主細胞のデノム甲に入り込んで、複製のために宿主細
胞の転写/翻訳機構をフルに活用することができる〇−
旦入り込んでし1うと、ウィルスDNAは実際、宿主の
DNAと識別不能で、この状態ではウィルスは七〇細胞
が主存する限り持続する。この形では攻撃に対して不死
身と考えられていて、治療はウィルス生活環のもっばら
他の段階に向けら扛なけれはならず、またすべてのウィ
ルス感染細胞が死滅するでで続けられなけれはならない
ものと思わnるQレトロウィルスの梅はlたエイズの想
名から複製可能に単離されていて、ヒト免疫不全ウィル
ス(H工v−1)と命名さnているが、lたヒトT細胞
つ(ルス[型(■TLV −1)、エイズウィルス(A
RM ) % L <はリンノく節扶想ウィルス(LA
V )としても知らnているO このウィルスはOKT’表面マーカーに’flNするT
細胞に好んで感染し、こ八を破壊することが仰らn、現
在ではエイズの病原体として一般に受は人nらnている
O患者のT細胞セントは徐々に矢わn1免疫系の全体的
平衡が混乱して、他の感染に対する抵抗性が低下し、日
和見感染を起こしやすくなり、こ几が致砧的となること
が多いOすなわち、エイズの犠牲者の死因は通常、肺炎
やウィルス誘発癌のような日和見感染であって、HIV
感染の直接的な結果ではないO エイズウィルスH工■−1また以前は…T’LV−覆と
して仰らルてい友ウィルスの完全なヌクレオチド配列が
明らかにさnている( Ratnsr、L 、ら:Na
ture 、 316: 277.1985年1月24
日〕0 最近になって、H工V −1は、T4マーカーを発現ス
るB細胞、マ、クロファーゾ、2よび中枢神経系の血液
に関係のないm織を含めて、他の組織型からも回収ざn
るようになったOこの中枢f+n系の感染は典型的なエ
イズ症状を発現している患者に見出てn、荒廃や、脳症
の症状、進行性構音降害、運動失調および失見当識を招
く進行性の脱髄を伴っているoH工■感なに伴うその他
の状態には、無症候性キャリアー状態、進行性全身性リ
ンパ節f5” 忠(PGL )およびエイズ関連コンプ
レックス(ARC)があるoH工V−1はその他の組織
でたは主地的液体、たとえば尿、血漿、金工、押漬、鞘
液、涙欲、唾液もしくは脳を髄准甲にも存在する0 3’−アンド−3’−デオキシチミジン(以下「ジドブ
ジン」と呼ふ〕はエイズ2よぴARCi含む1tIV感
染のii制御に使用される0ンドブシンはチミシンポ碌
体であって、そのトリホスフェートtzhウィルスの逆
転写酵素(RT)への競合的結合および細胞酵素による
リン酸化後のDNA鎖の終結によジヒト免疫不全ウィル
ス(HIV)の複製を阻害する( Furman、P、
A、ら: Proc、Natl、Acad、Sci。
種の両名で有効な抗ウィルス剤で勘り(MJ−tsu7
ahH。
: 3 1 9 0 、 1 987 ;Rup
recht、RlM、ら: Nature 、 323
: 476.191”f6,1.エイズ想省および進
行したARC恵渚患者いて(Fischl、M、A、ら
: N、Eng、J、Med、。
、A、ら:N、Eng、、T、Med、、 3 1
9 : 1 573、1988;Oreaglx−
Kirk、T、ら: J、Au+、M9d、As5oc
、、 26 D :3009.1988)iたCD4+
細胞ノベルの低下しfc無症候、@者において、状態の
改善および延命効果が明らかにさnている。
ら、レトロウィルスのジドブジンに対するに受注?俊え
る可能性が考えらnる因−p ’w t+qべる研究が
広範囲に行わnてさた。
渚からのH工T単離体の7ドプゾンに対する感受性を測
定した研究では、6力月またはそれ以上処置を受けた患
者からの多数の単離体で7ドプシンに対する感受性の低
下を示し、−万、その処置を受けたことのない個体およ
び6力月未満の処置しか受けていない患者はその薬剤に
均一な感受性を示すことが明らかにさnた( Lard
er、B、A、、Darby。
e、 243 : 1731.1989年3月)0 現在では、■工V−1株の7ドプ7ンに対する感受性を
測定するためには、患者の末梢血リンパ球からHIV−
1’i単離しなけnはならないOHHIV1単離体は、
末梢血リンパ球(PBL )を連続系の細胞MT−2と
共培貢することによって作らnる( Harada、8
.、KOyanagi、Y、、Yamamoto、N、
: 5cience。
−1が単離できる1でに4日から14日もの時間を要す
る。HIV−1の抵抗性体の診断は第一にウィルスの単
離に、ついで組織培養法による感受性試験にかかつてい
るものであるから、こnはめ1りにも遅すぎるO ;4【兄明名らは、HIV −1のジドブジンに対する
シー抗性の基盤を杉厳レベルで明らかにした0丁なl)
ち、RT虫臼買の4個のアミノ酸に変化?生じる5個の
ヌクレオチド!換がHLV −1ゲノムに硲趨8した(
IRTにジドブジン抵抗性を付与するこれらのスクレオ
テドQ医然変異は高度の保存性を示すことから、土赴の
発見は、抵抗性H工V$離体の快出に重要な意義を有し
、このような抵抗性単離体の足お的な恢出伝の道?開く
ものである〇すなわち、シドブシ゛ンに対する■工V−
1の感受8:紮訂価するため、恵ネからの生体サンプル
勿スクリーニングする6#的伏定法の実施がp]能にな
る。HiV −1の高度に抵抗性な休の発現VC* 要
な突然変異として確認ち扛た知識を用いて、このような
決定法が開発できる0 ジドブジンに対する抵抗a?付与するHIV RT遺伝
子vc2ける突然変異の確認を可能にするヌクレオチド
エ列Vこよって、−群の抵抗性変異株の分析を実施した
O元金RTコード領域(1,7kb )は各単離体につ
いて、感染細胞DNAのポリメラーゼ連鎖反応(P(:
!R)増幅を用いて得ら7’した0ゾドブンンに対する
抵抗性上付与するHIV −I RTの5カ所の位置で
のヌクレオチド変化を第1図に例示する。 HIV −
I RT遺伝子のヌクレオチドの番号はRatnerら
の報告(Naturs 、 313 : 277.19
85)と同じである〇 こnらのヌクレオチド変化の+全含儒する感染性分子H
工Vクローンが7ドプゾンに対し−C抵抗性を示すこと
から、これらの特異的突然変異がジドブジン抵抗性を付
与することが明らかに31シている(例4蚕照り。
する感受性は艮ル」間を安して変化するようでろる0突
然変異は、ジドブジン処櫨の開始から時間が経過するに
従い、5iiI!ilの確餡場扛た伍濾の1個または2
個以上に起こるものと思わA、5カ所すべてに医然変異
に%つHIV−1サンノルが7ドプゾンに高度な抵抗性
を示すことも明らかであるO 現時点では、これらの突然変異が起こる順序を予測する
ことはできないが、野生型DNA配列(もしくはその相
当するRNA)の21向のヌクレオチド、または変異株
DNA配列(%しくにその相当するRNA )の2個の
ヌクレオチド、第1図に示した2772および2776
位値にとくに注意が払わ扛ている0 したがって、本発明の第一の態様は、H工v−1サンプ
ルのジドブジンに対する感受性を測定するにあたり、(
i)サンプルから核#Rを単離し、(11)この核1!
&’k、野生ffi DNA配列(tしくにその相当す
るRNA ) i fcは第1内に示す変異型DNA配
夕1」(もしくはその相当するRNA)の領域であって
、ヌクレオチド2628%2338.2772.277
3または2784位値で3’末端を終結する領域に相補
性のオリゴヌクレオチドと−・イブリダイズちせ、(1
iuオリゴヌクレオチドの3’末端から核酸のポリメリ
ゼーション?I−Eみ、ついでOv+オリゴヌクレオチ
ドプライマーの伸艮生成物が存在するか否かt確餡する
方法?提供するものである0 この方法では、■工v−1サンプルから単離されたゲノ
ム])NA ’! 7’CはRNA k便用することが
できる口HIV −1の生育上支持する適当な細胞・た
とえばMT−2細胞勿、1ずR工V−1単に体で感染さ
せ、ある時間インキュベートする0細胞は遠心分層で回
収するOついで・細胞k EDTAおよびSDSのよう
な界面活性剤の存在下にグロテナーゼXで消化し、次に
フェノールで抽出してDNA k単離できる(本発明名
らがH工v −I DNA0単離に使用した方法につい
ては例1参照)O サンプル〃)らのRNAの単離に除しては、よく昶らn
ている抽出および精製操作が利用できる0RNAは以下
の方法?用いて年なできる0通坐な細胞?再び感染させ
、ある時間インキュベートするO細胞は遠心分離によっ
て回収する0細胞を即A抽出緩衝液甲に再11(iiL
、ついでグロテナーゼ消化ha液とグロテナーゼを用い
て消化するOフェノール/クロロホルム混合物の存在下
に蛋白質?除去する。 RNAは、さらに遠心分離工程
を経て回収することができる( Mania(iis、
T、ら: MOlflCularCloning、A、
Laboratory Manual、第2版、Col
dSpringHarbor Laboratory
Press、 1989)O核酸は増幅しないで用いる
ことも可能であるが、HIM−1サンプル甲のF:酸は
比較的少量でめるから、増幅することが好フしい0核醒
は、ポリメラーゼ連趙反応(FOR)法を用いて選択的
に増幅することができる0こfは少誼の鋳型から、一定
の長と一足の配列の時定の核ヒフラグメント勿in v
itroで大雪に生成妊せる方法である0FORはMg
2+績厚に!1.を用いる倖準反応剤、オリゴヌクレ
オチドブライマー pよひプライマーを用いるRT遺伝
子の増電のための湿度サイクル采件からなる。プライマ
ーa、全RT遺伝子?増幅するように、またはHIM
−1の野生型DNA配列の第1図に示すヌクレオチド2
328と2784位値の間の領域に相当するヌクレオチ
ドで等大する選ば1した配列を増幅するように逆捩てn
る0例2には、標的核酸を増幅するために用いらrしる
FORを翫1カする〇 油AはPCHによって直後Nφ品することはでさない0
1ず最初にその相当するcDNA 5合成しなけ才りば
ならないo cDNAの合成は通常、オリコ’−dTブ
ライマーを用いる誘発逆転与によって実施さnる。プラ
イマーは、RTの核酸配列、野生型り加A配列領域また
は第1図に示す変異型DNA配列偽域のヌクレオチド2
328から2784の曲に相当するハA佃域に相当する
ヌクレオチド?宮■する遇はrした配列?増幅するよう
K xIA択きr、る。こ扛ば、野生型DNA配列のヌ
クレオチド2628から2784に相当する配列の上匠
pc−ちる卦A釦の領域と相補性のオリゴヌクレオチド
プライマーIJ9造することによって遜成できる。この
方法(Mania(iis、T、ら: Ii+J出参照
)で製造さル”;’CcDNAは、すでに述べたDNA
の肩付と同様にして1史用できる。
はその相当するRNA )の領域1 fcは第1図に示
す変典型卯A(47jμその相当する沿Jへつの領域で
あって、3’木端がヌクレオチド2328.2668.
2772、2773筐たぼ2784位置に終結する領域
に相補性のオリゴヌクレオチドに−・イブリダイズさぜ
る0 条件および試薬は、オリゴヌクレオチドプライマーの3
’床端から核酸のポリメリゼーションが可能なように選
択さnる。このようなポリメリゼーション反応は本技術
分野ではよく卸られている〇オリゴヌクレオチドプライ
マーが七の3’末端に、変異型ゲッタイブ、すなわち第
1図に示す2328.2368.2772.2773ま
たは2784位置にヌクレオチド変化を頁するゲッタイ
ブに相補性のヌクレオチドr%つときは、サンプルの核
酸が変異型ゲッタイブと同一である場合にのみ、核酸配
列のポリメリゼーションが起こる。野生型核酸配列のポ
リメリゼーションは、オリゴヌクレオチドプライマーの
3’末端におけるヌクレオチドとサンプルの核酸配列と
のミスマツチにより、全く起こらないか少なくとも有意
な程度には起こらない0 オリ、−1ヌクVオテドブライマーがその3′末端に、
野生型ゲッタイブ、′fなわち第1図に示す相当する2
328.2368.2772.2773または2784
位置に野生型ヌクレオチドtWするゲッタイブに相補性
のヌクレオチドをもつとt!は、その位置が封缶型であ
る核酸配列のポリメリゼーションが起こる03’位置に
変異型ヌクレオチドをπする核酸のポリメリゼーション
はみられない0各オリゴヌクレオチドの好ましい長さは
、15〜20ヌクレオチドである0 オリゴヌクレオチドは、本技術分野の熟#!省にはよく
昶らnている方法で製造することが可能で69 (Ko
ster、!(、: Drug Re5earch、
30 : 548%1980 : KOeter、H,
: Tetrahedron Lett、。
etrabedronLett、、 719.1980
; Tetrahedron Lett、。
ett、、 24 :245 e 1983 ; Ga
te、M、 : Nucl、AQid8 P、es、
。
dBtoeyatemts 581 Aシンセサイず−
のような自動DNAシンセサイザーを用いて製造さ牡る
0オリコ1ヌクレオチドプライマー伸長生成物の存在を
調べるのは簡単である0検出を実施する手段には適指な
標識の使用が多る0 標識はたとえば、酵素、放射性同位元素ま′fcは螢光
色素である0好lしい標識はビオチンであり、これは、
酵素たとえはペルオキシダーゼ’E7’Cはアルカリホ
スファターゼに接合式ぞたストレプトアビクン?用いて
検出できる。オリゴヌクレオチドブラづマー伸長生成物
の存在は、たとえは・ポリメリゼーション反応にアガロ
ースゲル上で進めてエチゾウムブロミドで標識さnた特
定のDNAフラグメントを観察することにより検出でき
るし、また、サデンブロツテイングおよびオートラジオ
グラフィーに付してポリメライズさnた生成物に相当す
るバンドの存否に!出してもよい。標識オリゴヌクレオ
チドにのみ相当するバンドが顕著な場合は、ポリメリゼ
ーションが起こらなかったことを慧味する。予想式れた
サイズに等しいバンドが存在する場合には、こnはポリ
メリゼーションが起こったことを示している〇 たとえは、本明細書に記載し7c裏うに患名のりンバ球
から単離されたDNAはFOR増幅の鋳型として用いら
れ、ついで増幅した配列と適合するかまたは不適合のい
ずnかのオリゴヌクレオチドプライマーが使用さnるO このような矢然変異の検出にPCR’i利用できること
はすでに明らかにさnていfco増幅不応英然変異系(
ARMf3 ) k用いるPCRである( Newto
n。
:2503.1989)0%足の突然変異に隣接しそれ
を包含する領域にアニーリングする曾成オリゴヌクレオ
チドを、そのオリゴヌクレオチドの3’末端が変異型ま
たは野生型配列と適8または不適合であるように製造す
る。PcR?r:行うと、適合が起こっていればDNA
フラグメントが確認さn(デル電気泳動を使用)、不適
合であnばフラグメントはrd、蛤さnない0 たとえは、FORブライマーとして以下の2柵のオリゴ
ヌクレオチド 5’ −ATG TTT TTT GTCTGG TG
T ()GT−3’ (1)5’ −ATG T
TT ’I’TT GTOTGG TGT GAA−3
’ (2)のいずれか、および共通のオリゴヌク
レオチドプライマー “B“5’ −GGA TGG AAA GGA TC
A Co−6’ t”用いnば、感受性および抵抗性ウ
ィルスを識別することができる0本明細督に記載したよ
うにH工V−1感染T細胞からDNA ’i抽出し、こ
nらのクライマーを用いて@ARMS”FOR分1ff
rを行90ウィルスが感受性で6fLは、オリゴヌクレ
オチドB+(1)で210 bpフラグメントが生成す
るが、B + (27ではその生成をみない0−万、ウ
ィルスがジドブジン抵抗性であれば、B + (27で
210 bpが庄成し、B + (11ではその生成t
みない。
ドプライマーを用いて、すなわち、標識さ扛ていてもよ
いオリがヌクレオチドプライマー?用い、相補性DNA
のハイブリダイゼーションのみが可能な緊縮条件下に増
幅DNAフラグメントのポリメリゼーションを試みるこ
とにより確餡さnる( ”ARMS”法によって増幅さ
n 7j DNAフラグメントは変異型または野生型D
NAのいすnに出来しても同一であるので、唯一の差は
判別−イブリダイゼーションを実施する必要がないこと
であり、したがってこれらの7ラグメントの存在の検出
には共通のオリゴヌクレオチドが使用できる0このよう
なオリゴヌクレオチドの配列は、H工v−1株内で保存
嘔nているDNAフラグメントのDNA配列から跡導さ
れる0 上述のPCBアンセイケ適用すると、ウィルスを得るた
めに予め培養を行うことなく、感染患者のPBLサンプ
ルからのDNAについて、ジドブジン抵抗性に伴う朶然
変異を直接検出することが可能になる。この材料は、感
染リンパ球培養物の場合に比べて、−数的にH工V −
I DNAの言置はがな9少ないので、サンプル中の標
的H工’7−I RT I))JAシグナルのJiを
増大させるために、「二3f(PCRJ(’Eたは組重
ねセット〕プロトコール?便用できる( Simmon
ds、P、、Ba1fe、P、jPeutherer、
J、FlLudlam、O,A、、B15hop、J、
O0& Lsigh Brown、A、L、:J、Vi
rol、、 64 :l:164〜872 、1990
)。
幅の限界の問題は克服される0最初には、共通して認め
らfLるすべての突然変異?包含するRT仙城円からの
7ラグメントが増幅式nる0クシの予め増幅δnだ物質
を第二のFORにおいて、野生型と変異残基の識別r可
能にするように設計さnたプライマ一対とともに使用で
きる0 不発明の第一の態殊に2ける方法に従ってH工V−1サ
ンプルのシ゛ドブシ゛ンに幻する抵抗性?測定するため
の検定に用いるのに遍した試験キットは、野生U DN
A配列(−f7こはその、山当する■出A)または第1
図に示す変異型DuAp4C列のある領域でその3′末
端が2328.2338.2772、2773または2
784位置のヌクレオチドで終結する領域に相補性のオ
リゴヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチドの3’末端
からの強酸のポリメリゼーションに必要な他の材料、2
よび万すゴヌクレオテドゲライマー伸長主底物の存在?
!−側足するための手段から摘放芒nる0この場合の池
の材料には、適当な酵ネ、敬@′iνよひ況浄浴歇、な
らひに標識および必女に応じて偉泳の基質が包言嘔nる
0杉酸の増幅にPORk使用する場合にはさらに、野生
型DNA配列(またはその相当するRNA )−または
第1図に示す変異型DNA配列(’E7’Cはその相当
するRNA)で、2328、2338、2772.27
7+’!たrt、2784位籠のヌクレオチド11固ま
たは2個以上を言合する領域を増幅する適当なオリゴヌ
クレオチドプライマー 適当な#素、およびdNTP
k仮言しなけnはならない。
のシプドゾンに対する感受性【測定するにあ7Cりil
Jサンプルから核1111単離し、t::ノこの核部t
1野生型IINA配列(もしくはその相百する卦A)ま
たは第1図に示すX異型DNA配列(もしくはその相当
するRNA)の、2628.2668.2772.27
73および/または2784位竹のヌクレオチド1個ま
たは2個以上を言有する領域に相補性のオリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズちゼ、(+i+1生成したオリゴ
ヌクレオチドと核酸のハイグリッドがこ扛らの位置のい
す扛がでの相補性ヌクレオチド1個つか否かに―誌する
方法を提供する0 オリゴヌクレオチドは、七の相補体と完全にマツチする
ハイブリッドを形成するように設計することが好ましい
0 核酸(DNA!fcはRNA )は、不発明の第一の態
様に関して上述した方法によって、サンプルから単離さ
n;ha RT DNA (vたはその相当するDNA )または
好1しくはヌクレオチド2628.2668.2772
.2775および/lfcは2784位置のヌクレオチ
ド1 (1! ’! 7(は2個以上kfiNするDN
A (1次はその相当するRNA)が導入さnているR
T DNA (tたはその相当するRNA )の領域を
増幅するためには、同様にFORが使用できる(例2参
照〕0 この方法の第二段階では、核酸tついで、野生型DNA
配列(lたはその相当するRNA ) または第1図に
示す変異型DNA配列(lたはその相当するRNA)の
頌城で、上述の位置に2ける1個’!7’(は2 (1
!]以上のヌクレオチドを含有する領域に相補性のオリ
ゴヌクレオチドとノ・イブリダイズさせるために使用す
るO オリゴヌクレオチドは、調べらルる興IJ4i6るヌク
レオチド位置の数に応じて任意の長さとすることができ
る0オリゴヌクレオチドがただ1個所の興味ある位置の
みのヌクレオチドを包含するように設計さルる場合には
、このヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの中央1fc
はその付近に配置さnるのが好筐しいO たとえは、第1図全参照しながら説明すると、ヌクレオ
チド2328における突然変異に&出するためオリゴ1
ヌクレオチドプローブは突然変異RT遺伝子配列に相補
性で、ヌクレオチド2628に相当するヌクレオチド位
置には突然変異2628ヌクレオチドに相補性のヌクレ
オチドを含むものとすることができるO封生型H工V
−I RTに対する第二のグローブは、ヌクレオチド2
628に相当するヌクレオチドに、野生型2628ヌク
Vオテドに相補性なヌクレオチド?宮封するO第1図に
示した突然変異の1個または2個以上を侠出するだめに
設計されるオリゴヌクレオチドプローブは特定の突然変
異または突然変異があったこと七恢出するために使用さ
nる0 オリゴヌクレオチドと核酸配列がマツチしたハイブリッ
ドケ形成したか否かを確認するためには、特定のハイブ
リダイゼーション条件に、 2328.2668.27
72、2773および2784位益の1個または2個以
上のヌクレオチドがノへイブリダイゼーション可能また
は不能のオリゴヌクレオチドの相当するヌクレオチドに
相補性の場合だけ−・イブリッドを形成するように決定
する0ノ・イブリダイゼーション工程?実施する前に、
特異性を保証するのに十分緊縮な条件を見出丁ために、
たとえば反応温度、塩溶液の殴度等?61立することが
MMである( Mania(iis、T、ら: Mo1
θcularC10ning、A LaklOral;
Or7 Manual、2版、COlaSpriCol
aSprin Laboratory Press、1
989)。
328、2338、2772.2773−fたは278
4位置に相当するヌクレオチドの1個または2個以上に
ついて野生型核酸配列に相補性のDNA配列忙nする場
合は、これは野性型8酸に完全にハイブリダイズする0
ノ・イブリダイゼーションが起こらなけnは、サンプル
から早離さ1tた核酸は11固または2個以上の突が変
異を宮むことが示梗さnるQ オリゴヌクレオチドプローブが第1図のDNA配列の2
328、2338、2772.2773フたは2784
位置に相当するヌクレオチドの11−または2個以上に
ついて災然変異杉餓に相補性のDNA配列七有する場合
には、このオリゴヌクレオチドば失然父異体核H’を乞
完全にノ・イブリダイズする。ハイブリダイゼーション
が起こらない場合は、こnはサンプル〃)ら単離さnた
核酸がこのような突然変異【冨まないことを小製する0
このオリゴヌクレオチドプローブは、不発明の第一の態
様の場合と一様に、慣用手段として標識化することがで
きる〇 −・イブリダイゼーションおよび七の伎の−へイブリダ
イズしなかった核酸のi;ヌ云は、相71b性DNA、
の−・イブリダイゼーションのみが容昭さn5 ミスマ
ンチを宮むオリゴヌクレオチドはノ〜イブリダイズしな
い緊′S条件下に実施されるojなわち、β−グロビン
fたはHLA−DQ、(z M伝子(5aiki、R,
に、ら:Nature、 324 : 163.19
86)、=性化Ra8遺体子(Ver Laan−de
、Vires、M、ら、 Gene。
ng、O,ら: Nature 、 660 : 38
4.1987Jt−用いる鎌形赤血球突然変異の検出に
関して報告さnているよりなオリゴヌクVオテド持異的
ハイブリダイゼーションである0ハイブリダイゼーシヨ
ンは、ニトロセルロース、ナイロンまたは他の固体マト
リックス上にRT核核酸配列面固定化て行うこともでき
る(fcとえはトントープロット)o標識手段を用いて
戸イブリントの存在を決定するの〃二便利でろるOfC
,とえば、化4的に合成烙扛たオリゴヌクレオチドプロ
ーブは、酵素、放射性同位元素または螢光色素r用いて
適当に標識することができるO好ましい標識はビオチン
でり9、こnは仄に酵素たとえばペルオキシダーゼまた
はアルカリホスファターゼに接合したストレプトアビ7
ンを用いて検出できるO別法として、ハイブリダイゼー
ションは、上述したような固体支持体上に、標識でルで
いない上述のような化学的に合成−JAたオリゴヌクレ
オチド全固定化して行わn、ハイブリダイゼーション後
に、上述したような標識RTT酸配列により検出するこ
ともできるO −・イブリダイゼーションについて上述したいずnの場
合も、効率的なノーイブリダイゼーションが起こったこ
とを調べるために、適当な対照反応を尋人することもあ
る(たとえばオリゴヌクレオチドの相補性オリゴヌクレ
オチドへのハイブリダイゼーション)0 結果は、単離さnた核酸が野生屋オリゴヌクVオチドま
たは変異型オリゴヌクレオチドのいずれにハイブリダイ
ズしたかとして容易に解釈される0本発明の第二の態様
における方法に従ってH工■−1サンプルの7ドプシン
に対する抵抗性を測定する丸めの検定に用いるのに遇し
た臥験キットは、野生型DNA配列(もしくはその相当
するびA)lたは第1図Vこ示す変異型DNA配列(も
しくはその和尚するRNA )の、232B、2668
.2772.2773、i>よひ/また1d2784位
置のヌクレオチド1%!ll’S:たは2個以上を台材
する領域に相補性のオリゴヌクレオチドと、1■のハイ
ブリダイゼーションに必要な材料からなる0このような
材料としては、適当な緩衝液および洗浄浴欺ならびに標
識Σよひ株式が必要とするく台は基質が包含毛nる。通
常はオリゴヌクレオチドが標、1fIIc fL−る0
ハイブリダイゼーシヨンの前にFOR’?用いて核噌ヲ
増幅する場合には、野生型DNA配列1」(1丸はその
相主°」するRNA ) または第1図に示す変異型D
NA配列リ(工1ζはその相当するRNA)で、262
8.2338.2772.2773iたは2784位随
のヌクレオチド1個1 fcは2個以上τ含有する1、
l;繋ケ増:届できる適当な71°リゴヌクレオチドプ
ラ1マー 適当な酵素、およびdNTP (デオキソヌ
クレオチド三リン酸)のような物質ケ色宮ちせな+−y
nげlらない。
dNTP ’al” 検出分子たとえば放射性同位元素
、ビオチン、螢光色素とカップリングさぞてもまたさせ
なくてもよい。
A甲の7ドブノン抵抗性変異体は、RNA増幅系を用い
て検出することも可能でおるoGuatelliら(P
r0c、Natl、Acad、Sci、USA、 87
: 1874〜1878.1990)の報告した方法
により、レトロウィルスのisに必須の6糧の酵素活性
、すなわち逆転写酵素、RNアーゼHおよびDNA依存
性RNAポリメラーゼを用い、等温条件下in vit
r。
ができる。この方法に絖いてハイブリダイゼーション工
程を行えば、上述したように封缶型ヌクレオチドから変
異型km別することができる。
る意味においても本発明を限定するものではない。添付
の図面中、 第1図は、ンドプンンに対する抵抗性を付与する■工V
−I RT甲の5つの位置におけるヌクレオチド変化
を示す。ヌクレオチドの番号はRatnerら: Na
ture、 313 : 277.1985の報告に従
った〇 第2図は、ジドブジンに対する抵抗性?付与するH工M
−I RT KL−ける4つの位置に2けるアミノ酸
変化ゲ示す。
′j略図である。
異体の解析を示すO aはH工V−1ゲノムの模式図であり、FOR反応に使
用し7’CRT ’ft号領域甲のオリコ1ヌクレオチ
ドブライマーの位置および方向を示している。プライマ
ー2wおよび2Mはコドン70(ムで示す〕において配
列にアニーリングし、別個にプライマーAと使用して2
27 bpのDNA 7ラグメントを発生させる0ブラ
イマ一3wpよび6Mはコドン215(Aで示す)Ks
、−いて配列にアニーリングし、別個にグラ1マーBと
使用して210 bpフラグメントを発生させるO bはコドン70に2いてDNA会成を開始するFORブ
ライマー2Wおよび2Mの詳細を示す0各ブライマーの
配列を示し、標的H工V DNAと正しいマツチング紫
作る3′末端における変化ヲIIで一ルド文字で強調し
た。この場合、Taq DNAポリメラーゼはプライマ
ーの3’床端からDNA合成ケ開始できる(←−)oカ
ンコ内のヌクレオチド配列の番号は、Ratnerら(
前出)によるものであるOCはコドン215においてD
NA合成金囲始するFORプライマー3Wおよび3Mk
示す0標的H工VDNAと正しいマツチングを形成する
末端3’における配列変化音ボールド文字で強調した。
コドン215の直接分析を示す。ンブドシ゛ン療法?受
けている3例のAよりS忌省(ptA。
プルを・野生型と変異残基?識別するため「二重」FO
Rに付した。オリゴヌクレオチドブライマーAとh F
lilを最初のPCRi/C’tt用L”’(768b
p(第4図参照)を生成させ、この増幅からの材料を用
いて第二のpCRk行った0すなわちブライマーB全別
個に3w(w’r)’zたは3M(M)と組合わせて、
野生型とコドン215の変異ヌクレオチドを識別し7c
o第二のPCHの生成物(15μl)を1.5%アガロ
ースデル上で分離し、エテンウムブロミド染色した。デ
ルのV−ンの上の数字は谷すンプルケ採取する1での治
療期間(月)を示す。
ドブジンを投与さnた0 例1 H工V−1の単離 H工V −1の単離はLarderらによって報告さn
た方法に従って行った( Laraer、B、A、、D
arby、G、。
246 : 1 7 3 1.1989、l 。
次のようにして抽出した。
I)5゜/細胞の多1度でH工V −1により感染でぜ
、10チウシ胎仔血渭、ポリブレン(2μg/d):d
よび抗生物質(RPMI/10J’に補給したRPM
1−1640メゾウム甲37℃で6〜4日間インキュベ
ートした( Larcler、B、A、、Kemp、8
.D、: 5cience。
工細胞ペレントから、0.4%SDS、25mM Tr
le−Hal 、 p)(B、25 n+M EDTA
2よび150mM Na0J甲で浴解し、ついでプロ
テナーゼK(1■/ml)により50°Cで1時間泊化
したのち抽出した。核酸は、フェノール/クロロホルム
抽出おヨヒエタノール沈穀で回収し、RN 7−セA
(10μ&/ml)で処理し、DNA i gらにフェ
ノール/クロロホルム抽出に付し、エタノールで沈べさ
せ之。
を用いて、各H工V−1早席体について完全RTコード
領域(1,7kb )ケ侍た0FORはDNA tたは
RNA配タリ?選択的に増幅するための強力な成約でち
る(・こ′nは定めら几た長さおよび配列の特定のDN
Aフラグメント全、少量の鋳型刀、ら多重に生成式ぜる
ためのin VitrOでの方法である6 FORは、
標的配列の対立する鎖にノ・イブリダイズする2個のオ
リゴヌクレオチドブライマーで瞬接嘔nるDNAフラグ
メントの酵素的増幅に基つくものである0プライマーは
そ扛らの3’末端が互いの方向七指丁ように配置嘔nる
O鋳型の熱変性、プライマーによるその相補性配列への
アニーリングおよびアニーリングしたブライマーのDt
JAポリメラーゼによる伸長のサイクル?反復すること
により、FORブライマーの5′末端で定めらfLるセ
グメントの増幅が起こる。各ブライマーの伸長生成物は
他のプライマーの@型として働くので、サイクル毎に生
成でnるDNAフラグメントのm−は前のサイクルでの
4のitは倍になる0こnによって、特定の標的フラグ
メントの、数時間で叡臼万倍といった指数関数的蓄積が
生じる。この方法は、ケ1ツムDNAのような複雑な鋳
型にも便用でさ、JCf′I−に宮1几る単一コピーの
遺伝子?増幅することもできるC・また、RNA’!た
はDNAの複雑な混合物中の単一標的分子全増幅するこ
とも5]北で、ある榮件下には10 kb墳基対の長さ
1での7ラグメントtlE成サーヒることもでさる(
whitθ。
: Technical Focus。
RTの増幅およびクローニングに用いた体系を模式−と
して第3図に示す0総DNAはH工■単離体で感染でゼ
た細胞〃1ら抽出し、RTコード頌地ノ41,7 kl
:+フラグメントはPORK 、r ツテ得’)nfc
(5aiki、R,に、 i;、: 5cience、
239 : 487.1988 ) o Hl:V
−I DIVIAは例1のようにして得られた0各FO
R反応あたりこのDNA附1μyを用いて、全RTコー
ド領域?増幅した0各反応混付物(100μl ) U
25 sM KCI 、 1.5 mM MgC!3
z、50 mM tris−HOl、 p)+ 8.3
.0.1 %/ mウシ皿消アルブミン、dATP%d
GTP、 dcTP% T’rP各062mM 、各ブ
ライマー0.25μy寂よび2.5単位のTaq Db
+Aポリメラーゼ(Perkin−Elmer 0et
us )を宮付し罠。こ几らの混合物?100“Cに2
分間刀口熱したのちTaq D!IAホリメラーゼ?刀
口元、100μjの経油で1にい、Perkin−El
zer 0etusDNA熱うづクラー?用いて、変性
工程(1分30和1.94°C)、1ライマーアニーリ
ング(2分、67°C)およびDpj八合へ(10分、
72℃)からなるサイクルK(”iした。 Appli
ed Biosystems681人シンセサイデ−ケ
用いて作成した第17 ヒヌクレオチドブライマーは、
RTの5′末端には5’−T’l’GCACT’l’T
GAATT(!TCOOAT’i”八G−3’ と5
’−TGTAOTTTC)AATTOOOCCATTA
G−3’ (この@域にみら几る配列変動を考lして2
種のプライマー七使用した)、3’木端には 5′−CTTA1゛CTATTCCATCTAGAAA
TAGT−3′であつfこ0 PCR増1+−で得ら几たH工V RTを、PCRプラ
イマーによって5′末端2.1:ひ3’末端に構築した
騎識部位によりEcORI &・よひX−oa工で消化
し、フラグメントをアガロ−スケ1ルから和装し、予め
Eco RIとXba 工で消化し;・いたM 13
mp 18の41製型(RF)に連結した。 PCRm
is (5a1ki、Roに、ら:8C1enC(’l
b 239 : 487.1988 ) Kよって得
られ* H工T RT (1,7Kb) k ECOR
IとXba 工(BRL)で消化し、アガロースゲルで
鞘製し、予めBcORIおよびXba工で消化して2い
たM13ベクターmp1BKリゲートさぜ1こ(第69
参照)0リゲーシヨン混9 ”y7J f用い、 D
、Hanahan : JoMol。
いるようにしてコンビ−テントにした犬MM(尿TG−
1)にトランスホームし7とOこnらの体築体からヌク
レオチド配列決定用の一本鎖DNAケ調製した0依能性
のRT酵素を発現できるクローンについて、ジデオキシ
ヌクレオチドによるチェーンターミネータ−法(San
get、F、、N1cklen、S、。
、Acad、Sci、UIEA、 7 4 :54
63.1977)k用い配列決定ケ行った。
示し、また−tnらンバ錦4トきtたH工■単離体會掲
げる。・6個のRTクローンの完全配列が得らt(3例
の患名のと;受注および抵抗性単離体対〕、部分配列デ
ータは他の単離体が得ら扛た0アORブライマー(ゴ、
■工V−1RTJ仏子の5′木端にEco R工のよう
な制限酵素認識部位および3′不端にXba Iのよう
な制限#素部位が褥入妊nるように設計できる。各フラ
グメントを制限酵素で消化するとついで適当なベクター
たとえばM13mp 18ベースのベクターに導入でき
る。
13RTクローン 非治療lたは治療患者から侍らnた■工V単離体ケ、そ
′nt採取した時点での治療期間およびジドブジン感受
性とともに示す0同一の思考〃1ら多種の単離体が得ら
nた場合には、単離体に仮の番号?付した0HT4−6
0細胞単層でプラーク減少テストにより、50チ酌害用
蓋(より50)が得らnた( Larder、B、A、
、Darby、G、、Rlchman、D、D、 :5
cience、243:1731.1989;Chee
ebro、B、D、、Wehrly、に、 : J、V
irol、、 62 :3779.1988)。
位置のアミノ酸残基は■工V単離体について例示する0
問題の部位の封缶型での残基はAsp 67、L787
0、Thr 215およびLys 219である0同一
の患者(、り渚A012、A018yよぴPO22)か
ら得らnた感受性および高度に抵抗性の単離対について
予想さ乳る全アミノ酸RT配列を比較して、14〜17
残基間の実質的な差が明らかにさf′した0しかしなが
ら、各側とも、感受性単離体には認めら扛ない4個の残
基に2けるアミノ酸変化(Asp 57−+Asn、
Lys 70−Arg、Thr 215−Pho ’
EatはTyr &よひ1,7θ210−G4n )が
高度に抵抗性の単離体に認めらnた(第2図)0さらに
2例の患者(患者A066およびp026)からの感受
性2よび高度抵抗性単離体対の解析から、67.702
よひ215に同じ突然変異が明らかにさf′したが、残
基2191よ封缶型のLyeのままでおった(第2図)
0単離体からの多1M13クローンの配列決足では、わ
ずかな配列変化しか認めらfなかった。報告で扛ている
■工V −I RT配列が、いずnの株においてもすべ
ての4個の残基で完全に保存されていたことは興味かぁ
り (G、Myersら編、Human retrov
irusesancL AIDS : a Compi
la(iion and analysis ofnu
clθic acid and amino acid
5equences。
B10physics、Los Alomos。
ドブジン抵抗性におけるこnらの突然変異を強く示唆し
ている0 71 例4 特異株のクドブゾン感受性 RT遺伝子における多重突然変異が高レベルの抵抗性?
説明するものかどうかを試数するため、上述の4個の突
然変異のみを含んだHITの感染分子クローン?構築し
く単離体AQ12D、l、このクローンからT細胞感染
によって埋土じたウィルスの活性を評価した0感染クロ
ーンHXB 2− D(Fisher、A、()、ら:
Nature1316 : 262.1985)から
のHIV PO1遺伝子(7) 2.5 Kb 7 ラ
グメントkM13ベクターmp 19に挿入し、特定部
位の突然変異の標卸として使用しfc (IArder
。
8M、: Proc、Natl。
.1989)。
特定のヌクレオチド変化を同時に尋人し、突然変異はヌ
クレオチド配列決定で硲枕した( Sanger、F、
、N1cklen、S、A、、0Oulson、A、R
,:Proc、Natl、Acad、Sci、USA
、 74 : 5463.1977)o全長クローンの
再構築には、RT甲の夫然変異忙含有する1、9 Kb
Bal工制限フラグメ7トk pol遺伝子M13クロ
ーンから取り除き、HXB 2− D甲に移し7c (
Larder、B、A、Kemp、S、D、。
l、Acad、Sci、USA。
染クローンからのDNA k用いて、次にT細胞リンパ
芽球系、M T −A (Harada、8.、Koy
anagi。
s 229 : 563.1985Jkエレクトロポレ
ーシヨンによってトジンスフエクトした0ウイルス防専
CPBは各培養液中でほぼ寺しい時期(2〜4日後)に
認めら扛、保存ウィルスはトランスフェクションの6〜
7日後・に調製した0野生型および変異型HIV単離体
(そnぞnHXB 2− Dj−JCびH工vRTv、
c ) a、HeLa−0D4 +m 側糸、l(T
4−60甲)゛ラークアンセイによって力価’k al
l定し、ついでHT4−60細胞甲プラーク減少テスト
によつ1ンドブシ゛ンに対する感受性ケ試験し* (L
arder、B、A、、Darby。
、 243 : 1731、1 9 89 ; C
hese’bro、B、DlWehrly、に、:
J、Virol、。
結果は、第2表に示すよりに、特定部位の矢然変異訪発
によって@築した変異型ウィルスがジドブジンに対して
高い抵抗ak!するととを明瞭に示しているo HIV
RTM○のLD5Q値は野生型ウィルスに比べて100
倍に上昇し、七の抵抗性はRT遺伝子中に同様の突然変
異’t を有するH工V単離体によって天然に鎗めらn
る抵抗性と同程度のものであった0 第2表 xxxB 2− D O,013(0,0
05) 1x(■vRTnc
1.28 (0,24)
98AD 12B O,013(0,
005) IAO121)
2.56 N、03) 19
7例5 増幅 FORのためのDNAはH工■羊体により、0.IT(
3より5o/d(MT−2細胞中保存ウイルスの最終希
釈によって飼足嘔れた50%初織培養感呆用童)の多薦
度で感染嘔ゼたMT−2細胞から待て、10%ウシ胎仔
皿渭、ポリブレン(2μ、? / Ml )2よび抗生
物質2袖光したR1’M1’640メジウム甲37℃で
3〜4日間インキュベートしfcODNAは、0,4%
SDS 、 25 mM Trls−mal 、 pH
8,25mM KDTAおよび150 mM Na0A
甲でHmiせた細胞ペレットから抽出したO プロテナーゼz(1ダ/d、50°で1時間)によって
消化したのち、DNA iフェノール抽出2よびエタノ
ール沈殿で回収した○このm負約1μyを各反応a(1
00μj)ごとに使用したO反応液は、25 mM x
B、50 mM Tria−HO7、…8.3.0.1
■/−ウシ血清アルブミン(ESA )、臥TP。
オリゴヌクレオチドプライマーと特定の組合せについて
以下の濃度のMgOA2 k含有する プライマーAとIW2よびIM(コドン67の分−Fr
) : 2 mM MgR2プライマーAと2Wおよ
び2M(コドン70の分”r ) : 5 mM Mg
CJ2ブライマーBと6Wおよび3M(コドン215の
分4?T ) ” 、5 rrIMMgC12プライマ
ーBと4Wおよび4M(コドン219の分析) : 1
.5 rnM Mg(4z反応混合物を100°Cに2
分間刀口熱したのちTaq DNAポリメラーゼ(2,
5単位、Perkin−1inerCetuθ)七添加
し、100μノの軽油で覆い、変性工程(1分、94°
C)、プライマーアニーリング〔コドン70の分析(プ
ライマーAと2W′s?よび2M)およびコドン219
(プライマーBと4Wi、−よび4M)の分析のための
反応では30f5).40°C)またはコドン67(プ
ライマーAと1W3よび1M)2よびコドン215(プ
ライマーBと3 ws−、にび3L1)の分析のための
反応では60秒、45℃〕、ならびにDNA合成(30
秒、72℃)からなるサイクルに、30[a、Perk
in−]14marOetus DNA熱サイクラ−を
用いて行わf7c。オリゴヌクレオチドプライマー(第
4図りは、AppliedBiosystems 38
1 A a St k用いて合成し7c o各反応混合
物10μeを1.5%TBEアガロースデルに流し、D
NA ’iエチゾウムブロミド染色で可視化した。 P
ORプライマー 2 V/、2M、3W2よび3Mの配
列は第4bおよび40図に示す0他のオリゴヌクレオチ
ドプライマーの配列は久の通りであるO A、 5’ −TTOC(!ATTAt)TOOT
ATT−3’ ;B 、 5’ −
GGATGGAAAGGATOAOO−3’ ;I W
−5’ −TT TT (’T(lCkTTTAGT
AOTGAO−3’ ;1 M、 5’ −TTTT
OTCC!ATOTAGTAOTGAT−3’ ;4
W 5’ −A()GTTCTTTOTC)A
TGTTTT人’r−3’ ;4 M、 5’ −A
GGTTOTTTOTGATGTTTTAG−3’。
友変六体1−1倣した変異型の構築のほかに、RT甲に
こn4で帥めらnていない変化の組合せ七■する多くの
変異型勿作成した0プロウイルスクローンE[XB 2
− Dから誘導したRTのヌクレオチド配列(Fish
er、A、G、、0ollat(ii、Fi、、Rat
ner、L、。
Nature (I+andon)、316:262
〜265.1985)kまず、特定部位の突然変異誘発
発によって変化さぞ7′cO変化したRTk含むM13
クローンからのp01遺伝子DNAフラグメントを、除
去さnfcRT省域を含むBa’l I制限酵素フラグ
メントヤ有するHXB 2− Dと混合した0こnらの
混合物を、同種組換えによる感染ウィルス変異体の形成
ケ可能にするためエレクトロポレーションによってMT
−2mmにコトランスフエクトした。RTのダ異体は、
野生型グメント?f−宮竹する前述のM1313クロー
ンR’rl/ H(Larclar、B、A、、Kem
p、8.D、 & P+trifoy、D、J、M。
、 86 : 4803〜4807% 1989)の
特定部位の突然変異誘発によって作成したOすべでの変
異体について、ヌクレオチド配りリ分C’r (8an
ger、lF、、N1cklen、E+、&0ouls
on、A、R0: Proc、Nat’1.Acad、
Sci、USA s 74 :5463〜5467.1
977)によって母誌した0野庄型ウイルスHXB 2
および変異体に、MT−2細胞甲での同種組換えによっ
て誇尋した< +1’1avel、F、 、Hogan
、M、D、 、Willey、R,L、、+3treb
el。
ke、R,: 、T、Virol、、 、53:145
5〜1459.1989 ;8rinivasan、A
。
、 86 : 6388〜6392.1989)O大
部分のRTk久く野生型全長■工■クローンとzp R
T 17 HM i 3クローン力為らのpo1遺伝子
フラグメントをコトランスフエクして得た0野生型感染
クローンEXE 2− D(Fisher、A、G、、
uolla(ii、lli、、Ratner、I+、、
Ga1lo、R。
e (LondonJ、316=262〜265.19
b5)’gMsc工(Bal 工)で消化して、RTの
大部分からなる1、9kb7ラグメントを放出さ−Jc
(Ratner、L、 b : Nature(Lo
nclon)、313:277〜284.1985)、
大フラグメントヲアガロースケ1ルで和製したOmpR
・’4: 1 / 111の複製型(二不釦罪A )
−fたは矢然変昇クローンをKco RTとH1nd厘
で消化してpol、I<伝子?線状化し、そバぞれ5〜
と5μ9のゲル2il+’14 HXB 2−1)
DNA (Msc Iフラグメントは除去)と混合した
cs’?’を混曾吻を用いて上述のようにエレクトロポ
レーションによってnT−2mmにトランスフェクトし
CLarasr、B、A、& Kemp、8゜D、+
FIIT出)、感染したウィルス(トランスフエクショ
ノ約14日後1こ培養土rt’t n島ら回収)τ2童
ずつ:Iこ分けて一70″c vc h存した0変異型
ウイルスのrツタイブは、PCRによるこfLらの$W
体からクローン化し′fCRTのDNA配列分析によっ
て確認し7coこ汎らの培#液からU収嘔ル罠つィルス
卓雅体?、MT4−60細側甲プラーク減少テストシ′
こよってジドブジンに対する感d乏1生につい°C試験
し7こ0ウィルス変異体は一般Lf:JVC1矢然友異
の以が増アはど、抵抗性が増大し、臨沫的率離体から得
L:):n、 fc Dk者A配タリのデータ(編6表
)と工ぐせ致した0たとえば、組換えRTMF (Th
r 215−Tyr )およびRTMO/ WT (A
sp 67− Asn 。
(Asp 67−+Asn、ILys 70−Arg
%Thr 215−*Tyr )よりもジドブジンに対
する抵抗性は弱く、RTMC/IT’の抵抗性の程度は
、RTMFおよびRTMC/ WT K認めらfL;l
’cID5oの合計にほぼ等しかった。
の性質 (より501μM) HXB2 C
1−01HIVRTMI B16フ 、
、 、 0.01HIV
RTMJ 、 R70,、C1,[18H工
VRTMF 、 、 Y215.
U、16H工VRTMK 、 、
5zx5. 0−01H工VRTMA2
、 、 、 Q219 C1
−01a工vRTMazyr N67 R2O、、
U、17HIVRTMA3 、 、 72
15 Qzxo 0−22H工VRTMO/A2
N67 R)o、 Q219
(J、28H工VRTMC/F N67R7
0Y2.5. 0・65HIVRTMON67
R70F215 Q、z19166例7 非培養リンパ球からのDNAにおける突然変異の検出 上述のFORアンセイ(例5)は、感染悪名のPBLサ
ンプルケ、ウィルスを得るために予め培養することなく
、ジドブジン抵抗性をもつ突然変異の直接検出を可能に
するものであった0この材料は一般的にHIV DNA
宮量が、感染リンパ琢培養甲に2けるよりもかなり低い
ので、不発明に2いては、二! PC!R(’Eたは組
重ねセット)グロトコール(5inunonda、P、
ら:前出〕を用いて、サンプル甲の標的H工V RT
DNAシグナルitt増加させた。
牡るすべての突然変異?包合するRTQ域内からの76
8bフラグメントを増幅させた(この増幅にはFORブ
ライマーAとNKI七使用した。
料?、野生型と変異残基の識別?!−可能にするように
設計さf′L*ブライマ一対による第二のPCHに用い
た0アミノ酸残基215の典型的な分析の結果は第5図
に示す。 PBLサンプルは3例の人よりB思渚から、
ジドブジン療法の開始前および12〜17力月の治療後
に採取し7’CO治僚前のサンプルの場合、すべてが野
生をであったが、−万治療開始初期のサンプルは変異型
であるかまたは両名の混合物であった(第5図)O FORによる検出 DNAは約2 X 106(向のPBLから、MT −
2細胞培養の場合について上述したのと同様にして抽出
した。この材料0.5〜1μsケ最初のpcR(100
〕J )に使用した0これには、25 mM KCJ
、 1.5mM MgCl2.5 [1mlJ Tr
is−HR、p)18.3.0.1■/ at BBA
、各[]、2 mMのdATP 、 dGTP 1d
cTP PよびdTTPプラス各クライマー(クライマ
ーAおよびプライマーNEI)k官有式ぜたO反応混合
物は例5に記載したと同様に処理し、1分94′C11
分45゛Cおよび2分72℃のサイクルを30回行った
。増輻佼、100μEのクロロホルム?加えてサンプル
を抽出し、その各0.5μlJ’c関連PCR混合物の
すべての成分を含む反応チューブに直接刃口えた0サン
プルを100μノの軽油で覆い、熱サイクルに付す前に
94℃に5分間加熱した〇この第二のFORの反応混合
物および熱サイクル時間は、特定の突然変異(すなわち
プライマーAを2Wまたは2Mと刊合せ、プライマーB
を6Wまたは3Mと組合せfc)の検出のために選択的
に増幅さJF!:fc場合に上述したのと全く同じとし
7’CC例5)o各反応混合物に1μ9のニシンの和子
DNAを加えると第二のpcRの選択性が増大すること
がわかっている。さらに、「二重J panの高い感受
性により、サンプルとFOR試楽0交差汚染に!けるた
めに緊縮条件に注意?払わなけnIiならない。
こっていないことを確認したn PCRブライマーNE
Iの配列は矢の通りである。
’このプライマーは第4a図に示すように、プライマー
3Wおよび3Mの下流にアニーリングする0
−I RT甲のヌクレオチド変化を示TO第2図は、シ
ドプ7/に対する抵抗性を生じるH工V −I RT甲
のアミノ酸変化を示す。 [Myers。 G et al、、ヒトレトロウィルス及びAよりS:
核酸及びアミノ酸配列の編集と分析(TheOre(i
icaland Biophysics、Los A、
1amos Na(iional Laborator
y。 Los Alamos、NM、pト22 (1989)
、変化したアミノ酸番号CRT−プロリンの残基す1、
Myeraθta、1に示さルている)参照〕。 第5図はH工V RTの増幅およびクローニング工程を
示す略図でbるO 第41は、H工v−1rツムの構成図でらり、PCBに
使用し7’c、RT暗号領域甲のオリゴヌクレオチドプ
ライマーの位置および方向r示す091j 5図は、非
培養PBLサンプルからのDNA中のRTコドン215
の直接分析例であるアガロースゲル染色の結果でおる0 図面の浄書(内容に変更なし)
Claims (8)
- (1)HIV−1サンプルのジドブジンに対する感受性
を測定するにあたり、(i)サンプルから核酸を単離し
、(ii)この核酸を、野生型DNA配列(もしくはそ
の相当するRNA)または第1図に示す変異型DNA配
列(もしくはその相当するRNA)の領域であつて、ヌ
クレオチド2328、2338、2772、2773ま
たは2784位置で3’末端を終結する領域に相補性の
オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、(iii)
オリゴヌクレオチドの3’末端から核酸のポリメリゼー
シヨンを試み、ついで(iv)オリゴヌクレオチドプラ
イマーの伸長生成物が存在するか否かを確認する方法。 - (2)HIV−1サンプルのジドブジンに対する感受性
を測定するにあたり、(i)サンプルから核酸を単離し
、(ii)この核酸を、野生型DNA配列(もしくはそ
の相当するRNA)または第1図に示す変異型DNA配
列(もしくはその相当するRNA)の、2328、23
38、2772、2773および/または2784位置
のヌクレオチド1個または2個以上を含有する領域に相
補性のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、(i
ii)生成したオリゴヌクレオチドと核酸のハイブリッ
ドがこれらの位置のいずれかでの相補性ヌクレオチドを
持つか否かを確認する方法。 - (3)単離された核酸は、オリゴヌクレオチドとハイブ
リダイズする前に増幅される請求項(1)または(2)
記載の方法。 - (4)増幅はポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる請
求項(3)記載の方法。 - (5)オリゴヌクレオチドプライマー伸長生成物の出現
または相補性ヌクレオチドの存在は標識を用いて確認す
る請求項(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。 - (6)標識は、酵素、放射性同位元素または螢光色素で
ある請求項(5)記載の方法。 - (7)HIV−1のジドブジンに対する感受性を測定す
るのに適当な試験用キッドであつて、(i)野生型DN
A配列(もしくはその相当するRNA)または第1図に
示す変異型DNA配列(もしくはその相当するRNA)
の領域であつて、ヌクレオチド2328、2338、2
772、2773または2784位置で3’末端を終結
する領域に相補性のオリゴヌクレオチド、および(ii
)適当な酵素、洗浄および緩衝溶液、ならびに標識およ
び標識が必要とする場合は基質からなるキット。 - (8)HIV−1のジドブジンに対する感受性を測定す
るのに適当な試験用キッドであつて、(i)野生型DN
A配列(もしくはその相当するRNA)または第1図に
示す変異型DNA配列(もしくはその相当するRNA)
の、2328、2338、2772、2773および/
または2784位置のヌクレオチド1個または2個以上
を含有する領域に相補性のオリゴヌクレオチド、および
(ii)適当な酵素、洗浄および緩衝溶液、ならびに標
識および標識が必要とする場合は基質からなるキット。
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