JP3105907B2 - 核酸誘導体 - Google Patents
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- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
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- C12N2740/10011—Retroviridae
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- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
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- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、HIV−１サンプルのジドブジンに対する感
受性の評価方法、およびこの評価に使用される診断的検
定法に関する。
受性の評価方法、およびこの評価に使用される診断的検
定法に関する。
最近とくに重要視されているウイルスの一群にレトロ
ウイルスがある。レトロウイルスはRNAウイルスの亜群
を形成し、これは複製するためには、まずゲノムのRNA
をDNAに「逆転写」しなければならない（「転写」の語
は慣用的にDNAからRNAの合成に用いられる）。一旦DNA
の形になると、このウイルスゲノムは宿主細胞のゲノム
中に入り込んで、複製のために宿主細胞の転写／翻訳機
構をフルに活用することができる。一旦入り込んでしま
うと、ウイルスDNAは実際、宿主のDNAと識別不能で、こ
の状態ではウイルスはその細胞が生存する限り持続す
る。この形では攻撃に対して不死身と考えられていて、
治療はウイルス生活環のもつぱら他の段階に向けられな
ければならず、またすべてのウイルス感染細胞が死滅す
るまで続けられなければならないものと思われる。
ウイルスがある。レトロウイルスはRNAウイルスの亜群
を形成し、これは複製するためには、まずゲノムのRNA
をDNAに「逆転写」しなければならない（「転写」の語
は慣用的にDNAからRNAの合成に用いられる）。一旦DNA
の形になると、このウイルスゲノムは宿主細胞のゲノム
中に入り込んで、複製のために宿主細胞の転写／翻訳機
構をフルに活用することができる。一旦入り込んでしま
うと、ウイルスDNAは実際、宿主のDNAと識別不能で、こ
の状態ではウイルスはその細胞が生存する限り持続す
る。この形では攻撃に対して不死身と考えられていて、
治療はウイルス生活環のもつぱら他の段階に向けられな
ければならず、またすべてのウイルス感染細胞が死滅す
るまで続けられなければならないものと思われる。
レトロウイルスの種はまたエイズの患者から複製可能
に単離されていて、ヒト免疫不全ウイルス（HIV−１）
と命名されているが、またヒトＴ細胞ウイルスIII型（H
TLV−III）、エイズウイルス（ARV）もしくはリンパ節
疾患ウイルス（LAV）としても知られている。
に単離されていて、ヒト免疫不全ウイルス（HIV−１）
と命名されているが、またヒトＴ細胞ウイルスIII型（H
TLV−III）、エイズウイルス（ARV）もしくはリンパ節
疾患ウイルス（LAV）としても知られている。
このウイルスはOKT4表面マーカーを有するＴ細胞に好
んで感染し、これを破壊することが知られ、現在ではエ
イズの病原体として一般に受け入れられている。患者の
Ｔ細胞セツトは徐々に失われ、免疫形の全体的平衡が混
乱して、他の感染に対する抵抗性が低下し、日和見感染
を起こしやすくなり、これが致命的となることが多い。
すなわち、エイズの犠牲者の死因は通常、肺炎やウイル
ス誘発癌のような日和見感染であつて、HIV感染の直接
的な結果ではない。
んで感染し、これを破壊することが知られ、現在ではエ
イズの病原体として一般に受け入れられている。患者の
Ｔ細胞セツトは徐々に失われ、免疫形の全体的平衡が混
乱して、他の感染に対する抵抗性が低下し、日和見感染
を起こしやすくなり、これが致命的となることが多い。
すなわち、エイズの犠牲者の死因は通常、肺炎やウイル
ス誘発癌のような日和見感染であつて、HIV感染の直接
的な結果ではない。
エイズウイルスHIV−１または以前はHTLV−IIIとして
知られていたウイルスの完全なヌクレオチド配列が明ら
かにされている（Ratner,L.ら:Nature、313:277、1985
年１月24日）。
知られていたウイルスの完全なヌクレオチド配列が明ら
かにされている（Ratner,L.ら:Nature、313:277、1985
年１月24日）。
最近になつて、HIV−１は、T4マーカーを発現するＢ
細胞、マ．クロフアージ、および中枢神経系の血液に関
係のない組織を含めて、他の組織型からも回収されるよ
うになつた。この中枢神経系の感染は典型的なエイズ症
状を発現している患者に見出され、荒廃や、脳症の症
状、進行性構音障害、運動失調および失見当識を招く進
行性の脱髄を伴つている。HIV感染に伴うその他の状態
には、無症候性キヤリアー状態、進行性全身性リンパ節
疾患（PGL）およびエイズ関連コンプレツクス（ARC）が
ある。HIV−１はその他の組織または生理的液体、たと
えば尿、血漿、全血、血清、精液、涙液、唾液もしくは
脳脊髄液中にも存在する。
細胞、マ．クロフアージ、および中枢神経系の血液に関
係のない組織を含めて、他の組織型からも回収されるよ
うになつた。この中枢神経系の感染は典型的なエイズ症
状を発現している患者に見出され、荒廃や、脳症の症
状、進行性構音障害、運動失調および失見当識を招く進
行性の脱髄を伴つている。HIV感染に伴うその他の状態
には、無症候性キヤリアー状態、進行性全身性リンパ節
疾患（PGL）およびエイズ関連コンプレツクス（ARC）が
ある。HIV−１はその他の組織または生理的液体、たと
えば尿、血漿、全血、血清、精液、涙液、唾液もしくは
脳脊髄液中にも存在する。
３′−アジド−３′−デオキシチミジン（以下「ジド
ブジン」と呼ぶ）はエイズおよびARCを含むHIV感染の制
御に使用される。ジドブジンはチミジン類縁体であつ
て、そのトリホスフエート型はウイルスの逆転写酵素
（RT）への競合的結合および細胞酵素によるリン酸化後
のDNA鎖の終結によりヒト免疫不全ウイルス（HIV）の複
製を阻害する（Furman,P.A.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA、
83:8333、1986）。それは各種レトロウイルスに対してi
n vitroおよびin vivoの両者で有効な抗ウイルス剤であ
り（Mitsuya,H.ら:Cancer Res.,41:3190、1987;Ruprech
t,R.M.ら:Nature,323:476、1986）、エイズ患者および
進行したARC患者において（Fischl,M.A.ら:N.Eng.J.Me
d.,317:185、1987;Schmitt,F.A.ら:N.Eng.J.Med.,319:1
573、1988;Creagh−Kirk,T.ら:J.Am.Med.Assoc.,260300
9、1988）またCD4 +細胞レベルの低下した無症候患者に
おいて、状態の改善および延命効果が明らかにされてい
る。
ブジン」と呼ぶ）はエイズおよびARCを含むHIV感染の制
御に使用される。ジドブジンはチミジン類縁体であつ
て、そのトリホスフエート型はウイルスの逆転写酵素
（RT）への競合的結合および細胞酵素によるリン酸化後
のDNA鎖の終結によりヒト免疫不全ウイルス（HIV）の複
製を阻害する（Furman,P.A.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA、
83:8333、1986）。それは各種レトロウイルスに対してi
n vitroおよびin vivoの両者で有効な抗ウイルス剤であ
り（Mitsuya,H.ら:Cancer Res.,41:3190、1987;Ruprech
t,R.M.ら:Nature,323:476、1986）、エイズ患者および
進行したARC患者において（Fischl,M.A.ら:N.Eng.J.Me
d.,317:185、1987;Schmitt,F.A.ら:N.Eng.J.Med.,319:1
573、1988;Creagh−Kirk,T.ら:J.Am.Med.Assoc.,260300
9、1988）またCD4 +細胞レベルの低下した無症候患者に
おいて、状態の改善および延命効果が明らかにされてい
る。
抗感染剤には常に抵抗性が発生する可能性があること
から、レトロウイルスのジドブジンに対する感受性を変
える可能性が考えられる因子を調べる研究が広範囲に行
われてきた。
から、レトロウイルスのジドブジンに対する感受性を変
える可能性が考えられる因子を調べる研究が広範囲に行
われてきた。
ジドブジン処置を受けた後のAIDSまたはARC患者から
のHIV単離体のジドブジンに対する感受性を測定した研
究では、６カ月またはそれ以上処置を受けた患者からの
多数の単離体でジドブジンに対する感受性の低下を示
し、一方、その処置を受けたことのない個体および６カ
月未満の処置しか受けていない患者はその薬剤に均一な
感受性を示すことが明らかにされた（Larder,B.A.,Darb
y,G.＆ Richman,D.D.:Science,243:1731、1989年３
月）。
のHIV単離体のジドブジンに対する感受性を測定した研
究では、６カ月またはそれ以上処置を受けた患者からの
多数の単離体でジドブジンに対する感受性の低下を示
し、一方、その処置を受けたことのない個体および６カ
月未満の処置しか受けていない患者はその薬剤に均一な
感受性を示すことが明らかにされた（Larder,B.A.,Darb
y,G.＆ Richman,D.D.:Science,243:1731、1989年３
月）。
現在では、HIV−１株のジドブジンに対する感受性を
測定するためには、患者の末梢血リンパ球からHIV−１
を単離しなければならない。HIV−１単離体は、末梢血
リンパ球（PBL）を連続系の細胞MT−２と共培養するこ
とによつて作られる（Harada,S.,Koyanagi,Y.,Yamamot
o,N.:Science,229:563、1985）。この操作ではHIV−１
が単離できるまでに４日から14日もの時間を要する。HI
V−１の抵抗性株の診断は第一にウイルスの単離に、つ
いで組織培養法による感受性試験にかかつているもので
あるから、これはあまりにも遅すぎる。
測定するためには、患者の末梢血リンパ球からHIV−１
を単離しなければならない。HIV−１単離体は、末梢血
リンパ球（PBL）を連続系の細胞MT−２と共培養するこ
とによつて作られる（Harada,S.,Koyanagi,Y.,Yamamot
o,N.:Science,229:563、1985）。この操作ではHIV−１
が単離できるまでに４日から14日もの時間を要する。HI
V−１の抵抗性株の診断は第一にウイルスの単離に、つ
いで組織培養法による感受性試験にかかつているもので
あるから、これはあまりにも遅すぎる。
本発明者らは、HIV−１のジドブジンに対する抵抗性
の基盤を核酸レベルで明らかにした。すなわち、RT蛋白
質の４個のアミノ酸に変化を生じる５個のヌクレオチド
置換がHIV−１ゲノムに確認された。RTにジドブジン抵
抗性を付与するこれらのヌクレオチドの突然変異は高度
の保存性を示すことから、上述の発見は、抵抗性HIV単
離体の検出に重要な意義を有し、このような抵抗性単離
体の定常的な検出法の道を開くものである。
の基盤を核酸レベルで明らかにした。すなわち、RT蛋白
質の４個のアミノ酸に変化を生じる５個のヌクレオチド
置換がHIV−１ゲノムに確認された。RTにジドブジン抵
抗性を付与するこれらのヌクレオチドの突然変異は高度
の保存性を示すことから、上述の発見は、抵抗性HIV単
離体の検出に重要な意義を有し、このような抵抗性単離
体の定常的な検出法の道を開くものである。
すなわち、ジドブジンに対するHIV−１の感受性を評
価するため、患者からの生体サンプルをスクリーニング
する診断的検定法の実施が可能になる。HIV−１の高度
に抵抗性な株の発現に重要な突然変異として確認された
知識を用いて、このような検定法が開発できる。
価するため、患者からの生体サンプルをスクリーニング
する診断的検定法の実施が可能になる。HIV−１の高度
に抵抗性な株の発現に重要な突然変異として確認された
知識を用いて、このような検定法が開発できる。
ジドブジンに対する抵抗性を付与するHIV RT遺伝子に
おける突然変異の確認を可能にするヌクレオチド配列に
よつて、一群の抵抗性変異株の分析を実施した。完全RT
コード領域（1.7kb）は各単離体について、感染細胞DNA
のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を用いて得られ
た。ジドブジンに対する抵抗性を付与するHIV−1 RTの
５カ所の位置でのヌクレオチド変化を第１図に例示す
る。HIV−1 RT遺伝子のヌクレオチドの番号はRatnerら
の報告（Nature,313:277、1985）と同じである。
おける突然変異の確認を可能にするヌクレオチド配列に
よつて、一群の抵抗性変異株の分析を実施した。完全RT
コード領域（1.7kb）は各単離体について、感染細胞DNA
のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を用いて得られ
た。ジドブジンに対する抵抗性を付与するHIV−1 RTの
５カ所の位置でのヌクレオチド変化を第１図に例示す
る。HIV−1 RT遺伝子のヌクレオチドの番号はRatnerら
の報告（Nature,313:277、1985）と同じである。
これらのヌクレオチド変化のみを含有する感染性分子
HIVクローンがジドブジンに対して抵抗性を示すことか
ら、これらの特異的突然変異がジドブジン抵抗性を付与
することが明らかにされている（例４参照）。
HIVクローンがジドブジンに対して抵抗性を示すことか
ら、これらの特異的突然変異がジドブジン抵抗性を付与
することが明らかにされている（例４参照）。
臨床サンプルの分析から、HIV−１のジドブジンに対
する感受性は長期間を要して変化するようである。突然
変異は、ジドブジン処置の開始から時間が経過するに従
い、５個の確認された位置の１個または２個以上に起こ
るものと思われ、５カ所すべてに突然変異をもつHIV−
１サンプルがジドブジンに高度な抵抗性を示すことも明
らかである。
する感受性は長期間を要して変化するようである。突然
変異は、ジドブジン処置の開始から時間が経過するに従
い、５個の確認された位置の１個または２個以上に起こ
るものと思われ、５カ所すべてに突然変異をもつHIV−
１サンプルがジドブジンに高度な抵抗性を示すことも明
らかである。
現時点では、これらの突然変異が起こる順序を予測す
ることはできないが、野生型DNA配列（もしくはその相
当するRNA）の２個のヌクレオチド、または変異株DNA配
列（もしくはその相当するRNA）の２個のヌクレオチ
ド、第１図に示した2772および2773位置にとくに注意が
払われている。
ることはできないが、野生型DNA配列（もしくはその相
当するRNA）の２個のヌクレオチド、または変異株DNA配
列（もしくはその相当するRNA）の２個のヌクレオチ
ド、第１図に示した2772および2773位置にとくに注意が
払われている。
したがつて、本発明の第一の態様は、HIV−１サンプ
ルのジドブジンに対する感受性を測定するにあたり、
（ｉ）サンプルから核酸を単離し、（ii）この核酸を、
野生型DNA配列（もしくはその相当するRNA）または第１
図に示す変異型DNA配列（もしくはその相当するRNA）の
領域であつて、ヌクレオチド2328、2338、2772、2773ま
たは2784位置で３′末端を終結する領域に相補性のオリ
ゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、（iii）オリゴ
ヌクレオチドの３′末端から核酸のポリメリゼーシヨン
を試み、ついで（iv）オリゴヌクレオチドプライマーの
伸長生成物が存在するか否かを確認する方法を提供する
ものである。
ルのジドブジンに対する感受性を測定するにあたり、
（ｉ）サンプルから核酸を単離し、（ii）この核酸を、
野生型DNA配列（もしくはその相当するRNA）または第１
図に示す変異型DNA配列（もしくはその相当するRNA）の
領域であつて、ヌクレオチド2328、2338、2772、2773ま
たは2784位置で３′末端を終結する領域に相補性のオリ
ゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、（iii）オリゴ
ヌクレオチドの３′末端から核酸のポリメリゼーシヨン
を試み、ついで（iv）オリゴヌクレオチドプライマーの
伸長生成物が存在するか否かを確認する方法を提供する
ものである。
この方法では、HIV−１サンプルから単離されたゲノ
ムDNAまたはRNAを使用することができる。HIV−１の生
育を支持する適当な細胞、たとえばMT−２細胞を、まず
HIV−１単離体で感染させ、ある時間インキュベートす
る。細胞は遠心分離で回収する。ついで、細胞をEDTAお
よびSDSのような界面活性剤の存在下にプロテナーゼＫ
で消化し、次にフエノールで抽出してDNAを単離できる
（本発明者らがHIV−1 DNAの単離に使用した方法につい
ては例１参照）。
ムDNAまたはRNAを使用することができる。HIV−１の生
育を支持する適当な細胞、たとえばMT−２細胞を、まず
HIV−１単離体で感染させ、ある時間インキュベートす
る。細胞は遠心分離で回収する。ついで、細胞をEDTAお
よびSDSのような界面活性剤の存在下にプロテナーゼＫ
で消化し、次にフエノールで抽出してDNAを単離できる
（本発明者らがHIV−1 DNAの単離に使用した方法につい
ては例１参照）。
サンプルからのRNAの単離に際しては、よく知られて
いる抽出および精製操作が利用できる。RNAは以下の方
法を用いて単離できる。適当な細胞を再び感染させ、あ
る時間インキュベートする。細胞は遠心分離によつて回
収する。細胞をRNA抽出緩衝液中に再懸濁し、ついでプ
ロテナーゼ消化緩衝液とプロテナーゼを用いて消化す
る。フエノール／クロロホルム混合物の存在下に蛋白質
を除去する。RNAは、さらに遠心分離工程を経て回収す
ることができる（Maniatis,T.ら:Molecular Cloning,A.
Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Labo
ratory Press、1989）。
いる抽出および精製操作が利用できる。RNAは以下の方
法を用いて単離できる。適当な細胞を再び感染させ、あ
る時間インキュベートする。細胞は遠心分離によつて回
収する。細胞をRNA抽出緩衝液中に再懸濁し、ついでプ
ロテナーゼ消化緩衝液とプロテナーゼを用いて消化す
る。フエノール／クロロホルム混合物の存在下に蛋白質
を除去する。RNAは、さらに遠心分離工程を経て回収す
ることができる（Maniatis,T.ら:Molecular Cloning,A.
Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Labo
ratory Press、1989）。
核酸は増幅しないで用いることも可能であるが、HIV
−１サンプル中の核酸は比較的少量であるから、増幅す
ることが好ましい。核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）法を用いて選択的に増幅することができる。これは
少量の鋳型から、一定の長さ一定の配列の特定の核酸フ
ラグメントをin vitroで大量に生成させる方法である。
−１サンプル中の核酸は比較的少量であるから、増幅す
ることが好ましい。核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）法を用いて選択的に増幅することができる。これは
少量の鋳型から、一定の長さ一定の配列の特定の核酸フ
ラグメントをin vitroで大量に生成させる方法である。
PCRはMg2+濃厚液を用いる標準反応剤、オリゴヌクレ
オチドプライマー、およびプライマーを用いるRT遺伝子
の増幅のための温度サイクル条件からなる。プライマー
は、全RT遺伝子を増幅するように、またはHIV−１の野
生型DNA配列の第１図に示すヌクレオチド2328と2784位
置の間の領域に相当するヌクレオチドを導入する選ばれ
た配列を増幅するように選択される。例２には、標的核
酸を増幅するために用いられるPCRを説明する。
オチドプライマー、およびプライマーを用いるRT遺伝子
の増幅のための温度サイクル条件からなる。プライマー
は、全RT遺伝子を増幅するように、またはHIV−１の野
生型DNA配列の第１図に示すヌクレオチド2328と2784位
置の間の領域に相当するヌクレオチドを導入する選ばれ
た配列を増幅するように選択される。例２には、標的核
酸を増幅するために用いられるPCRを説明する。
RNAはPCRによつて直接増幅することはできない。まず
最初にその相当するcDNAを合成しなければならない。cD
NAの合成は通常、オリゴ−dTプライマーを用いる誘発逆
転写によつて実施される。プライマーは、RTの核酸配
列、野生型DNA配列領域または第１図に示す変異型DNA配
列領域のヌクレオチド2328から2784の間に相当するRNA
領域に相当するヌクレオチドを含有する選ばれた配列を
増幅するように選択される。これは、野生型DNA配列の
ヌクレオチド2328から2784に相当する配列の上流にある
RNA鎖の領域と相補性オリゴヌクレオチドプライマーを
製造することによつて達成できる。この方法（Maniati
s,T.ら：前出参照）で製造されたcDNAは、すでに述べた
DNAの場合と同様にして使用できる。
最初にその相当するcDNAを合成しなければならない。cD
NAの合成は通常、オリゴ−dTプライマーを用いる誘発逆
転写によつて実施される。プライマーは、RTの核酸配
列、野生型DNA配列領域または第１図に示す変異型DNA配
列領域のヌクレオチド2328から2784の間に相当するRNA
領域に相当するヌクレオチドを含有する選ばれた配列を
増幅するように選択される。これは、野生型DNA配列の
ヌクレオチド2328から2784に相当する配列の上流にある
RNA鎖の領域と相補性オリゴヌクレオチドプライマーを
製造することによつて達成できる。この方法（Maniati
s,T.ら：前出参照）で製造されたcDNAは、すでに述べた
DNAの場合と同様にして使用できる。
この方法の次の段階では核酸に、野生型DNA（または
その相当するRNA）の領域または第１図に示す変異型DNA
（またはその相当するRNA）の領域であつて、３′末端
がヌクレオチド2328、2338、2772、2773または2784位置
に終結する領域に相補性のオリゴヌクレオチドをハイブ
リダイズさせる。
その相当するRNA）の領域または第１図に示す変異型DNA
（またはその相当するRNA）の領域であつて、３′末端
がヌクレオチド2328、2338、2772、2773または2784位置
に終結する領域に相補性のオリゴヌクレオチドをハイブ
リダイズさせる。
条件および試薬は、オリゴヌクレオチドプライマーの
３′末端から核酸のポリメリゼーシヨンが可能なように
選択される。このようなポリメリゼーシヨン反応は本技
術分野ではよく知られている。
３′末端から核酸のポリメリゼーシヨンが可能なように
選択される。このようなポリメリゼーシヨン反応は本技
術分野ではよく知られている。
オリゴヌクレオチドプライマーがその３′末端に、変
異型ゲノタイプ、すなわち第１図に示す2328、2338、27
72、2773または2784位置にヌクレオチド変化を有するゲ
ノタイプに相補性のヌクレオチドをもつときは、サンプ
ルの核酸が変異型ゲノタイプと同一である場合にのみ、
核酸配列のポリメリゼーシヨンが起こる。野生型核酸配
列のポリメリゼーシヨンは、オリゴヌクレオチドプライ
マーの３′末端におけるヌクレオチドとサンプルの核酸
配列とのミスマツチにより、全く起こらないか少なくと
も有意な程度には起こらない。
異型ゲノタイプ、すなわち第１図に示す2328、2338、27
72、2773または2784位置にヌクレオチド変化を有するゲ
ノタイプに相補性のヌクレオチドをもつときは、サンプ
ルの核酸が変異型ゲノタイプと同一である場合にのみ、
核酸配列のポリメリゼーシヨンが起こる。野生型核酸配
列のポリメリゼーシヨンは、オリゴヌクレオチドプライ
マーの３′末端におけるヌクレオチドとサンプルの核酸
配列とのミスマツチにより、全く起こらないか少なくと
も有意な程度には起こらない。
オリゴヌクレオチドプライマーがその３′末端に、野
生型ゲノタイプ、すなわち第１図に示す相当する2328、
2338、2772、2773または2784位置に野生型ヌクレオチド
を有するゲノタイプに相補性のヌクレオチドももつとき
は、その位置が野生型である核酸配列のポリメリゼーシ
ヨンが起こる。３′位置に変異型ヌクレオチドを有する
核酸のポリメリゼーシヨンはみられない。
生型ゲノタイプ、すなわち第１図に示す相当する2328、
2338、2772、2773または2784位置に野生型ヌクレオチド
を有するゲノタイプに相補性のヌクレオチドももつとき
は、その位置が野生型である核酸配列のポリメリゼーシ
ヨンが起こる。３′位置に変異型ヌクレオチドを有する
核酸のポリメリゼーシヨンはみられない。
各オリゴヌクレオチドの好ましい長さは、15〜20ヌク
レオチドである。
レオチドである。
オリゴヌクレオチドは、本技術分野の熟練者にはよく
知られている方法で製造することが可能であり（Koste
r,H.:Drug Research,30:548、1980;Koster,H.:Tetrahed
ron Lett.,1527、1972;Caruthers:Tetrahedron Lett.,7
19、1980;Tetrahedron Lett.,1859,1981;Tetrahedron L
ett.,24:245,1983;Gate,M.:Nucl.Acids Res.,８:1081,1
980）、一般にはApplied Biosystems 381Aシンセサイザ
ーのような自動DNAシンセサイザーを用いて製造され
る。
知られている方法で製造することが可能であり（Koste
r,H.:Drug Research,30:548、1980;Koster,H.:Tetrahed
ron Lett.,1527、1972;Caruthers:Tetrahedron Lett.,7
19、1980;Tetrahedron Lett.,1859,1981;Tetrahedron L
ett.,24:245,1983;Gate,M.:Nucl.Acids Res.,８:1081,1
980）、一般にはApplied Biosystems 381Aシンセサイザ
ーのような自動DNAシンセサイザーを用いて製造され
る。
オリゴヌクレオチドプライマー伸長生成物の存在を調
べるのは簡単である。検出を実施する手段には適当な標
識の使用がある。
べるのは簡単である。検出を実施する手段には適当な標
識の使用がある。
標識はたとえば、酵素、放射性同位原子または螢光色
素である。好ましい標識はビオチンであり、これは、酵
素たとえばペルオキシダーゼまたはアルカリホスフアタ
ーゼに接合させたストレプトアビジンを用いて検出でき
る。オリゴヌクレオチドプライマー伸長生成物の存在
は、たとえば、ポリメリゼーシヨン反応をアガロースゲ
ル上で進めてエチジウムブロミドで標識された特定のDN
Aフラグメントを観察することにより検出できるし、ま
た、サザンブロツテイングおよびオートラジオグラフイ
ーに付してポリメライズされた生成物に相当するバンド
の存否を検出してもよい。標識オリゴヌクレオチドにの
み相当するバンドが顕著な場合は、ポリメリゼーシヨン
が起こらなかつたことを意味する。予想されたサイズに
等しいバンドが存在する場合には、これはポリメリゼー
シヨンが起こつたことを示している。
素である。好ましい標識はビオチンであり、これは、酵
素たとえばペルオキシダーゼまたはアルカリホスフアタ
ーゼに接合させたストレプトアビジンを用いて検出でき
る。オリゴヌクレオチドプライマー伸長生成物の存在
は、たとえば、ポリメリゼーシヨン反応をアガロースゲ
ル上で進めてエチジウムブロミドで標識された特定のDN
Aフラグメントを観察することにより検出できるし、ま
た、サザンブロツテイングおよびオートラジオグラフイ
ーに付してポリメライズされた生成物に相当するバンド
の存否を検出してもよい。標識オリゴヌクレオチドにの
み相当するバンドが顕著な場合は、ポリメリゼーシヨン
が起こらなかつたことを意味する。予想されたサイズに
等しいバンドが存在する場合には、これはポリメリゼー
シヨンが起こつたことを示している。
たとえば、本明細書に記載したように患者のリンパ球
から単離されたDNAはPCR増幅の鋳型として用いられ、つ
いで増幅した配列と適合するかまたは不適合のいずれか
のオリゴヌクレオチドプライマーが使用される。
から単離されたDNAはPCR増幅の鋳型として用いられ、つ
いで増幅した配列と適合するかまたは不適合のいずれか
のオリゴヌクレオチドプライマーが使用される。
このような突然変異の検出にPCRを利用できることは
すでに明らかにされていた。増幅不応突然変異系（ARM
S）を用いるPCRである（Newton,C.R.ら:Nucl.Acids Re
s.,17:2503、1989）。特定の突然変異に隣接しそれを包
含する領域にアニーリングする合成オリゴヌクレオチド
を、そのオリゴヌクレオチドの３′末端が変異型または
野生型配列と適合または不適合であるように製造する。
PCRを行うと、適合が起こつていればDNAフラグメントが
確認され（ゲル電気泳動を使用）、不適合であればフラ
グメントは確認されない。
すでに明らかにされていた。増幅不応突然変異系（ARM
S）を用いるPCRである（Newton,C.R.ら:Nucl.Acids Re
s.,17:2503、1989）。特定の突然変異に隣接しそれを包
含する領域にアニーリングする合成オリゴヌクレオチド
を、そのオリゴヌクレオチドの３′末端が変異型または
野生型配列と適合または不適合であるように製造する。
PCRを行うと、適合が起こつていればDNAフラグメントが
確認され（ゲル電気泳動を使用）、不適合であればフラ
グメントは確認されない。
たとえば、PCRプライマーとして以下の２種のオリゴ
ヌクレオチド のいずれか、および共通のオリゴヌクレオチドプライマ
ー ″Ｂ″５′−GGA TGG AAA GGA TCA CC−３′を用いれ
ば、感受性および抵抗性ウイルスを識別することができ
る。本明細書に記載したようにHIV−１完全Ｔ細胞からD
NAを抽出し、これらのプライマーを用いて“ARMS"PCR分
析を行う。ウイルスが感受性であれば、オリゴヌクレオ
チドＢ＋（１）で210bpフラグメントが生成するが、Ｂ
＋（２）ではその生成をみない。一方、ウイルスがジド
ブジン抵抗性であれば、Ｂ＋（２）で210bpが生成し、
Ｂ＋（１）ではその生成をみない。
ヌクレオチド のいずれか、および共通のオリゴヌクレオチドプライマ
ー ″Ｂ″５′−GGA TGG AAA GGA TCA CC−３′を用いれ
ば、感受性および抵抗性ウイルスを識別することができ
る。本明細書に記載したようにHIV−１完全Ｔ細胞からD
NAを抽出し、これらのプライマーを用いて“ARMS"PCR分
析を行う。ウイルスが感受性であれば、オリゴヌクレオ
チドＢ＋（１）で210bpフラグメントが生成するが、Ｂ
＋（２）ではその生成をみない。一方、ウイルスがジド
ブジン抵抗性であれば、Ｂ＋（２）で210bpが生成し、
Ｂ＋（１）ではその生成をみない。
フラングメントの存在は、上述のようにオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて、すなわち、標識されていて
もよいオリゴヌクレオチドプライマーを用い、相補性DN
Aのハイブリダイゼーシヨンのみが可能な緊縮条件下に
増幅DNAフラグメントのポリメリゼーシヨンを試みるこ
とにより確認される（“ARMS"法によつて増幅されたDNA
フラグメントは変異型または野生型DNAのいずれに由来
しても同一であるので、唯一の差は判別ハイブリダイゼ
ーシヨンを実施する必要がないことであり、したがつて
これらのフラグメントの存在の検出には共通のオリゴヌ
クレオチドが使用できる。このようなオリゴヌクレオチ
ドの配列は、HIV−１株内で保存されているDNAフラグメ
ントのDNA配列から誘導される。
オチドプライマーを用いて、すなわち、標識されていて
もよいオリゴヌクレオチドプライマーを用い、相補性DN
Aのハイブリダイゼーシヨンのみが可能な緊縮条件下に
増幅DNAフラグメントのポリメリゼーシヨンを試みるこ
とにより確認される（“ARMS"法によつて増幅されたDNA
フラグメントは変異型または野生型DNAのいずれに由来
しても同一であるので、唯一の差は判別ハイブリダイゼ
ーシヨンを実施する必要がないことであり、したがつて
これらのフラグメントの存在の検出には共通のオリゴヌ
クレオチドが使用できる。このようなオリゴヌクレオチ
ドの配列は、HIV−１株内で保存されているDNAフラグメ
ントのDNA配列から誘導される。
上述のPCRアツセイを適用すると、ウイルスを得るた
めに予め培養を行うことなく、感染患者のPBLサンプル
からのDNAについて、ジドブジン抵抗性に伴う突然変異
を直接検出することが可能になる。この材料は、感染リ
ンパ球培養物の場合に比べて、一般的にHIV−1 DNAの含
量はかなり少ないので、サンプル中の標的HIV−１ RT
DNAシグナルの量を増大させるために、「二重PCR」（ま
たは組重ねセツト）プロトコールを使用できる（Simmon
ds,P.,Balfe,P.,Peutherer,J.F.,Ludlam,C.A.,Bishop,
J.O.＆ Leigh Brown,A.L.:J.Virol.,64:864〜72,199
0）。二重PCRによれば、微量の鋳型配列の増幅の限界の
問題は克服される。最初には、共通して認められるすべ
ての突然変異を包含するRT領域内からのフラグメントが
増幅される。少量の予め増幅された物質を第二のPCRに
おいて、野生型と変異残基の識別を可能にするように設
計されたプライマー対とともに使用できる。
めに予め培養を行うことなく、感染患者のPBLサンプル
からのDNAについて、ジドブジン抵抗性に伴う突然変異
を直接検出することが可能になる。この材料は、感染リ
ンパ球培養物の場合に比べて、一般的にHIV−1 DNAの含
量はかなり少ないので、サンプル中の標的HIV−１ RT
DNAシグナルの量を増大させるために、「二重PCR」（ま
たは組重ねセツト）プロトコールを使用できる（Simmon
ds,P.,Balfe,P.,Peutherer,J.F.,Ludlam,C.A.,Bishop,
J.O.＆ Leigh Brown,A.L.:J.Virol.,64:864〜72,199
0）。二重PCRによれば、微量の鋳型配列の増幅の限界の
問題は克服される。最初には、共通して認められるすべ
ての突然変異を包含するRT領域内からのフラグメントが
増幅される。少量の予め増幅された物質を第二のPCRに
おいて、野生型と変異残基の識別を可能にするように設
計されたプライマー対とともに使用できる。
本発明の第一の態様における方法に従つてHIV−１サ
ンプルのジドブジンに対する抵抗性を測定するための検
定に用いるのに適した試験キツトは、野生型DNA配列
（またはその相当するRNA）または第１図に示す変異型D
NA配列のある領域でその３′末端が2328、2338、2772、
2773または2784位置のヌクレオチドで終結する領域に相
補性のオリゴヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチドの
３′末端からの核酸のポリメリゼーシヨンに必要な他の
材料、およびオリゴヌクレオチドプライマー伸長生成物
の存在を測定するための手段から構成される。この場合
の他の材料には、適当な酵素、緩衝および洗浄溶液、な
らびに標識および必要に応じて標識の基質が包含され
る。核酸の増幅にPCRを使用する場合にはさらに、野生
型DNA配列（またはその相当するRNA）または第１図に示
す変異型DNA配列（またはその相当するRNA）で、2328、
2338、2772、2773または2784位置のヌクレオチド１個ま
たは２個以上を含有する領域を増幅する適当なオリゴヌ
クレオチドプライマー、適当な酵素、およびdNTPを包含
しなければならない。
ンプルのジドブジンに対する抵抗性を測定するための検
定に用いるのに適した試験キツトは、野生型DNA配列
（またはその相当するRNA）または第１図に示す変異型D
NA配列のある領域でその３′末端が2328、2338、2772、
2773または2784位置のヌクレオチドで終結する領域に相
補性のオリゴヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチドの
３′末端からの核酸のポリメリゼーシヨンに必要な他の
材料、およびオリゴヌクレオチドプライマー伸長生成物
の存在を測定するための手段から構成される。この場合
の他の材料には、適当な酵素、緩衝および洗浄溶液、な
らびに標識および必要に応じて標識の基質が包含され
る。核酸の増幅にPCRを使用する場合にはさらに、野生
型DNA配列（またはその相当するRNA）または第１図に示
す変異型DNA配列（またはその相当するRNA）で、2328、
2338、2772、2773または2784位置のヌクレオチド１個ま
たは２個以上を含有する領域を増幅する適当なオリゴヌ
クレオチドプライマー、適当な酵素、およびdNTPを包含
しなければならない。
本発明の第二の態様においては、HIV−１サンプルの
ジブドジンに対する感受性を測定するにあたり、（ｉ）
サンプルから核酸を単離し、（ii）この核酸を、野生型
DNA配列（もしくはその相当するRNA）または第１図に示
す変異型DNA配列（もしくはその相当するRNA）の、232
8、2338、2772、2773および／または2784位置のヌクレ
オチド１個または２個以上を含有する領域に相補性のオ
リゴヌクレオチドとハイブリダイゼーシヨンさせ、（ii
i）生成したオリゴヌクレオチドと核酸のハイブリツド
がこれらの位置のいずれかでの相補性ヌクレオチドを持
つか否かを確認する方法を提供する。
ジブドジンに対する感受性を測定するにあたり、（ｉ）
サンプルから核酸を単離し、（ii）この核酸を、野生型
DNA配列（もしくはその相当するRNA）または第１図に示
す変異型DNA配列（もしくはその相当するRNA）の、232
8、2338、2772、2773および／または2784位置のヌクレ
オチド１個または２個以上を含有する領域に相補性のオ
リゴヌクレオチドとハイブリダイゼーシヨンさせ、（ii
i）生成したオリゴヌクレオチドと核酸のハイブリツド
がこれらの位置のいずれかでの相補性ヌクレオチドを持
つか否かを確認する方法を提供する。
オリゴヌクレオチドは、その相補体と完全にマツチす
るハイブリツドを形成するように設計することが好まし
い。
るハイブリツドを形成するように設計することが好まし
い。
核酸（DNAまたはRNA）は、本発明の第一の態様に関し
て上述した方法によつて、サンプルから単離される。
て上述した方法によつて、サンプルから単離される。
RT DNA（またはその相当するDNA）または好ましくは
ヌクレオチド2328、2338、2772、2775および／または27
84位置のヌクレオチド１個または２個以上を含有するDN
A（またはその相当するRNA）が導入されているRT DNA
（またはその相当するRNA）の領域を増幅するために
は、同様にPCRが使用できる（例２参照）。
ヌクレオチド2328、2338、2772、2775および／または27
84位置のヌクレオチド１個または２個以上を含有するDN
A（またはその相当するRNA）が導入されているRT DNA
（またはその相当するRNA）の領域を増幅するために
は、同様にPCRが使用できる（例２参照）。
この方法の第二段階では、核酸をついで、野生型DNA
配列（またはその相当するRNA）または第１図に示す変
異型DNA配列（またはその相当するRNA）の領域で、上述
の位置における１個または２個以上のヌクレオチドを含
有する領域に相補性のオリゴヌクレオチドとハイブリダ
イズさせるために使用する。
配列（またはその相当するRNA）または第１図に示す変
異型DNA配列（またはその相当するRNA）の領域で、上述
の位置における１個または２個以上のヌクレオチドを含
有する領域に相補性のオリゴヌクレオチドとハイブリダ
イズさせるために使用する。
オリゴヌクレオチドは、調べられる興味あるヌクレオ
チド位置の数に応じて任意の長さとすることができる。
オリゴヌクレオチドがただ１個所の興味ある位置のみの
ヌクレオチドを包含するように設計される場合には、こ
のヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの中央またはその
付近に配置されるのが好ましい。
チド位置の数に応じて任意の長さとすることができる。
オリゴヌクレオチドがただ１個所の興味ある位置のみの
ヌクレオチドを包含するように設計される場合には、こ
のヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの中央またはその
付近に配置されるのが好ましい。
たとえば、第１図を参照しながら説明すると、ヌクレ
オチド2328における突然変異を検出するためオリゴヌク
レオチドプローブは突然変異RT遺伝子配列に相補性で、
ヌクレオチド2328に相当するヌクレオチド位置には突然
変異2328ヌクレオチドに相補性のヌクレオチドを含むも
のとすることができる。野生型HIV−1 RTに対する第二
のプローブは、ヌクレオチド2328に相当するヌクレオチ
ドに、野生型2328ヌクレオチドに相補性なヌクレオチド
を含有する。第１図に示した突然変異の１個または２個
以上を検出するために設計されるオリゴヌクレオチドプ
ローブは特定の突然変異または突然変異があつたことを
検出するために使用される。
オチド2328における突然変異を検出するためオリゴヌク
レオチドプローブは突然変異RT遺伝子配列に相補性で、
ヌクレオチド2328に相当するヌクレオチド位置には突然
変異2328ヌクレオチドに相補性のヌクレオチドを含むも
のとすることができる。野生型HIV−1 RTに対する第二
のプローブは、ヌクレオチド2328に相当するヌクレオチ
ドに、野生型2328ヌクレオチドに相補性なヌクレオチド
を含有する。第１図に示した突然変異の１個または２個
以上を検出するために設計されるオリゴヌクレオチドプ
ローブは特定の突然変異または突然変異があつたことを
検出するために使用される。
オリゴヌクレオチドと核酸配列がマツチしたハイブリ
ツドを形成したか否かを確認するためには、特定のハイ
ブリダイゼーシヨン条件を、2328、2338、2772、2773お
よび2784位置の１個または２個以上のヌクレオチドがハ
イブリダイゼーシヨン可能または不能なオリゴヌクレオ
チドの相当するヌクレオチドに相補 性の場合だけハイブリツドを形成するように決定する。
ハイブリダイゼーシヨン工程を実施する前に、特異性を
保証するのに十分緊縮な条件を見出すために、たとえば
反応温度、塩溶液の濃度等を確立することが重要である
（Maniatis,T.ら:Molecular Cloning,A Laboratory Man
ual、２版、Cold Spring Harbour Laboratory Press、1
989）。オリゴヌクレオチドプローブが第１図のDNA配列
の2328、2338、2772、2773または2784位置に相当するヌ
クレオチドの１個または２個以上について野生型核酸配
列に相補性のDNA配列を有する場合は、これは野性型核
酸に完全にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーシヨ
ンが起こらなければ、サンプルから単離された核酸は１
個または２個以上の突然変異を含むことが示唆される。
ツドを形成したか否かを確認するためには、特定のハイ
ブリダイゼーシヨン条件を、2328、2338、2772、2773お
よび2784位置の１個または２個以上のヌクレオチドがハ
イブリダイゼーシヨン可能または不能なオリゴヌクレオ
チドの相当するヌクレオチドに相補 性の場合だけハイブリツドを形成するように決定する。
ハイブリダイゼーシヨン工程を実施する前に、特異性を
保証するのに十分緊縮な条件を見出すために、たとえば
反応温度、塩溶液の濃度等を確立することが重要である
（Maniatis,T.ら:Molecular Cloning,A Laboratory Man
ual、２版、Cold Spring Harbour Laboratory Press、1
989）。オリゴヌクレオチドプローブが第１図のDNA配列
の2328、2338、2772、2773または2784位置に相当するヌ
クレオチドの１個または２個以上について野生型核酸配
列に相補性のDNA配列を有する場合は、これは野性型核
酸に完全にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーシヨ
ンが起こらなければ、サンプルから単離された核酸は１
個または２個以上の突然変異を含むことが示唆される。
オリゴヌクレオチドプローブが第１図のDNA配列の232
8、2338、2772、2773または2784位置に相当するヌクレ
オチドの１個または２個以上について突然変異核酸に相
補性のDNA配列を有する場合には、このオリゴヌクレオ
チドは突然変異体核酸に完全にハイブリダイズする。ハ
イブリダイゼーシヨンが起こらない場合は、これはサン
プルから単離された核酸がこのような突然変異を含まな
いことを示唆する。このオリゴヌクレオチドプローブ
は、本発明の第一の態様の場合と同様に、検出手段とし
て標識化することができる。
8、2338、2772、2773または2784位置に相当するヌクレ
オチドの１個または２個以上について突然変異核酸に相
補性のDNA配列を有する場合には、このオリゴヌクレオ
チドは突然変異体核酸に完全にハイブリダイズする。ハ
イブリダイゼーシヨンが起こらない場合は、これはサン
プルから単離された核酸がこのような突然変異を含まな
いことを示唆する。このオリゴヌクレオチドプローブ
は、本発明の第一の態様の場合と同様に、検出手段とし
て標識化することができる。
ハイブリダイゼーションおよびその後のハイブリダイ
ズしなかつた核酸の除去は、相補性DNAのハイブリダイ
ゼーシヨンのみが容認され、ミスマツチを含むオリゴヌ
クレオチドはハイブリダイズしない緊縮条件下に実施さ
れる。すなわち、β−グロビンまたはHLA−DQα遺伝子
（Saiki,R.K.ら:Nature、324:163、1986）、活性化Ras
遺伝子（Ver Laan−de,Vires,m.ら,Gene,50:313、198
6）およびβ−サラセミア（Wong,C.ら:Nature,330:38
4、1987）を用いる鎌形赤血球突然変異の検出に関して
報告されているようなオリゴヌクレオチド特異的ハイブ
リダイゼーシヨンである。
ズしなかつた核酸の除去は、相補性DNAのハイブリダイ
ゼーシヨンのみが容認され、ミスマツチを含むオリゴヌ
クレオチドはハイブリダイズしない緊縮条件下に実施さ
れる。すなわち、β−グロビンまたはHLA−DQα遺伝子
（Saiki,R.K.ら:Nature、324:163、1986）、活性化Ras
遺伝子（Ver Laan−de,Vires,m.ら,Gene,50:313、198
6）およびβ−サラセミア（Wong,C.ら:Nature,330:38
4、1987）を用いる鎌形赤血球突然変異の検出に関して
報告されているようなオリゴヌクレオチド特異的ハイブ
リダイゼーシヨンである。
ハイブリダイゼーシヨンは、ニトロセルロース、ナイ
ロンまたは他の固体マトリツクス上にRT核酸配列を固定
化して行うこともできる（たとえばドツト−ブロツ
ト）。標識手段を用いてハイブリツドの存在を決定する
のが便利である。たとえば、化学的に合成されたオリゴ
ヌクレオチドプローブは、酵素、放射性同位元素または
螢光色素を用いて適当に標識することができる。好まし
い標識はビオチンであり、これは次に酵素たとえばペル
オキシダーゼまたはアルカリホスフアターゼに接合した
ストレプトアジビンを用いて検出できる。
ロンまたは他の固体マトリツクス上にRT核酸配列を固定
化して行うこともできる（たとえばドツト−ブロツ
ト）。標識手段を用いてハイブリツドの存在を決定する
のが便利である。たとえば、化学的に合成されたオリゴ
ヌクレオチドプローブは、酵素、放射性同位元素または
螢光色素を用いて適当に標識することができる。好まし
い標識はビオチンであり、これは次に酵素たとえばペル
オキシダーゼまたはアルカリホスフアターゼに接合した
ストレプトアジビンを用いて検出できる。
別法として、ハイブリダイゼーシヨンは、上述したよ
うな固体支持体上に、標識されていない上述のような化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドを固定化して行わ
れ、ハイブリダイゼーシヨン後に、上述したような標識
RT核酸配列により検出することもできる。
うな固体支持体上に、標識されていない上述のような化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドを固定化して行わ
れ、ハイブリダイゼーシヨン後に、上述したような標識
RT核酸配列により検出することもできる。
ハイブリダイゼーシヨンについて上述したいずれの場
合も、効率的なハイブリダイゼーシヨンが起こつたこと
を調べるために、適当な対照反応を導入することもある
（たとえばオリゴヌクレオチドの相補性オリゴヌクレオ
チドへのハイブリダイゼーシヨン）。
合も、効率的なハイブリダイゼーシヨンが起こつたこと
を調べるために、適当な対照反応を導入することもある
（たとえばオリゴヌクレオチドの相補性オリゴヌクレオ
チドへのハイブリダイゼーシヨン）。
結果は、単離された核酸が野生型オリゴヌクレオチド
または変異型オリゴヌクレオチドのいずれにハイブリダ
イズしたかとして容易に解釈される。
または変異型オリゴヌクレオチドのいずれにハイブリダ
イズしたかとして容易に解釈される。
本発明の第二の態様における方法に従つてHIV−１サ
ンプルのジドブジンに対する抵抗性を測定するための検
定に用いるのに適した試験キツトは、野生型DNA配列
（もしくはその相当するRNA）または第１図に示す変異
型DNA配列（もしくはその相当するRNA）の、2328、233
8、2772、2773および／または2784位置のヌクレオチド
１個または２個以上を含有する領域に相補性のオリゴヌ
クレオチドと、他のハイブリダイゼーシヨンに必要な材
料からなる。このような材料としては、適当な緩衝液お
よび洗浄溶液ならびに標識および標識が必要とする場合
は基質が包含される。通常はオリゴヌクレオチドが標識
される。ハイブリダイゼーシヨンの前にPCRを用いて核
酸を増幅する場合には、野生型DNA配列（またはその相
当するRNA）または第１図に示す変異型DNA配列（または
その相当するRNA）で、2328、2338、2772、2773または2
784位置のヌクレオチド１個または２個以上を含有する
領域を増幅できる適当なオリゴヌクレオチドプライマ
ー、適当な酵素、およびdNTP（テオキシヌクレオチド三
リン酸）のような物質を包含させなければならない。
ンプルのジドブジンに対する抵抗性を測定するための検
定に用いるのに適した試験キツトは、野生型DNA配列
（もしくはその相当するRNA）または第１図に示す変異
型DNA配列（もしくはその相当するRNA）の、2328、233
8、2772、2773および／または2784位置のヌクレオチド
１個または２個以上を含有する領域に相補性のオリゴヌ
クレオチドと、他のハイブリダイゼーシヨンに必要な材
料からなる。このような材料としては、適当な緩衝液お
よび洗浄溶液ならびに標識および標識が必要とする場合
は基質が包含される。通常はオリゴヌクレオチドが標識
される。ハイブリダイゼーシヨンの前にPCRを用いて核
酸を増幅する場合には、野生型DNA配列（またはその相
当するRNA）または第１図に示す変異型DNA配列（または
その相当するRNA）で、2328、2338、2772、2773または2
784位置のヌクレオチド１個または２個以上を含有する
領域を増幅できる適当なオリゴヌクレオチドプライマ
ー、適当な酵素、およびdNTP（テオキシヌクレオチド三
リン酸）のような物質を包含させなければならない。
このアツセイの別のフオーマツトでは、増幅に際して
のdNTPを検出分子たとえば放射性同位元素、ビオチン、
螢光色素とカツプリングさせてもまたさせなくてもよ
い。
のdNTPを検出分子たとえば放射性同位元素、ビオチン、
螢光色素とカツプリングさせてもまたさせなくてもよ
い。
臨床サンプルから単離されたHIV−1 RT RNA中のジド
ブジン抵抗性変異体は、RNA増幅系を用いて検出するこ
とも可能である。Guatelliら（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,87:1874〜1878、1990）の報告した方法により、レト
ロウイルスの複製に必須の３種の酵素活性、すなわち逆
転写酵素、RNアーゼＨおよびDNA依存性RNAポリメラーゼ
を用い、等温条件下in vitroで、標的核酸配列を指数関
数適に複製（増幅）することができる。この方法に続い
てハイブリダイゼーシヨン工程を行えば、上述したよう
に野生型ヌクレオチドから変異型を識別することができ
る。
ブジン抵抗性変異体は、RNA増幅系を用いて検出するこ
とも可能である。Guatelliら（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,87:1874〜1878、1990）の報告した方法により、レト
ロウイルスの複製に必須の３種の酵素活性、すなわち逆
転写酵素、RNアーゼＨおよびDNA依存性RNAポリメラーゼ
を用い、等温条件下in vitroで、標的核酸配列を指数関
数適に複製（増幅）することができる。この方法に続い
てハイブリダイゼーシヨン工程を行えば、上述したよう
に野生型ヌクレオチドから変異型を識別することができ
る。
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、いか
なる意味においても本発明を限定するものではない。添
付の図面中、 第１図は、ジドブジンに対する抵抗性を付与するHIV
−1 RT中の５つの位置におけるヌクレオチド変化を示
す。ヌクレオチドの番号はRatnerら:Nature,313:277、1
985の報告に従つた。
なる意味においても本発明を限定するものではない。添
付の図面中、 第１図は、ジドブジンに対する抵抗性を付与するHIV
−1 RT中の５つの位置におけるヌクレオチド変化を示
す。ヌクレオチドの番号はRatnerら:Nature,313:277、1
985の報告に従つた。
第２図は、ジドブジンに対する抵抗性を付与するHIV
−1 RTにおける４つの位置におけるアミノ酸変化を示
す。
−1 RTにおける４つの位置におけるアミノ酸変化を示
す。
第３図は、HIV RTの増幅およびクローニングを示す略
図である。
図である。
第４図は、ポリメラーゼ反応を用いたHIV RTの変異体
の解析を示す。
の解析を示す。
ａはHIV−１ゲノムの模式図であり、PCR反応に使用し
たRT暗号領域中のオリゴヌクレオチドプライマーの位置
および方向を示している。プライマー2Wおよび2Mはコド
ン70 において配列アニーリングし、別個にプライマーＡと使
用して227bpのDNAフラグメントを発生させる。プライマ
ー3Wおよび3Mはコドン215 において配列にアニーリングし、別個にプライマーＢと
使用して210bpフラグメントを発生させる。
たRT暗号領域中のオリゴヌクレオチドプライマーの位置
および方向を示している。プライマー2Wおよび2Mはコド
ン70 において配列アニーリングし、別個にプライマーＡと使
用して227bpのDNAフラグメントを発生させる。プライマ
ー3Wおよび3Mはコドン215 において配列にアニーリングし、別個にプライマーＢと
使用して210bpフラグメントを発生させる。
ｂはコドン70においてDNA合成を開始するPCRプライマ
ー2Wおよび2Mの詳細を示す。各プライマーの配列を示
し、標的HIV DNAと正しいマツチングを作る３′末端に
おける変化をボールド文字で強調した。この場合、Taq
DNAポリメラーゼはプライマーの３′末端からDNA合成を
開始できる（）。カツコ内のヌクレオチド配列の番号
は、Ratnerら（前出）によるものである。
ー2Wおよび2Mの詳細を示す。各プライマーの配列を示
し、標的HIV DNAと正しいマツチングを作る３′末端に
おける変化をボールド文字で強調した。この場合、Taq
DNAポリメラーゼはプライマーの３′末端からDNA合成を
開始できる（）。カツコ内のヌクレオチド配列の番号
は、Ratnerら（前出）によるものである。
ｃはコドン215においてDNA合成を開始するPCRプライ
マー3Wおよび3Mを示す。標的HIV DNAと正しいマツチン
グを形成する末端３′における配列変化をボールド文字
で強調した。
マー3Wおよび3Mを示す。標的HIV DNAと正しいマツチン
グを形成する末端３′における配列変化をボールド文字
で強調した。
第５図は、非培養PBLサンプルからのDNA中のRTコドン
215の直接分析を示す。ジドブジン療法を受けている３
例のAIDS患者（pt A、pt B、pt C）から得られた初期お
よび後期サンプルを、野生型と変異残基を識別するため
「二重」PCRに付した。オリゴヌクレオチドプライマー
ＡとNE1を最初のPCRに使用して768bp（第４図参照）を
生成させ、この増幅からの材料を用いて第二のPCRを行
つた。すなわちプライマーＢを別個に3W（WT）または3M
（Ｍ）と組合せて、野生型とコド215の変異ヌクレオチ
ドを識別した。第二のPCRの生成物（15μ）を1.5％ア
ガロースゲル上で分離し、エチジウムブロミド染色し
た。ゲルのレーンの上の数字は各サンプルを採取するま
での治療期間（月）を示す。治療期間中を通じ、すべて
の患者が１日1200mgのジドブジンを投与された。
215の直接分析を示す。ジドブジン療法を受けている３
例のAIDS患者（pt A、pt B、pt C）から得られた初期お
よび後期サンプルを、野生型と変異残基を識別するため
「二重」PCRに付した。オリゴヌクレオチドプライマー
ＡとNE1を最初のPCRに使用して768bp（第４図参照）を
生成させ、この増幅からの材料を用いて第二のPCRを行
つた。すなわちプライマーＢを別個に3W（WT）または3M
（Ｍ）と組合せて、野生型とコド215の変異ヌクレオチ
ドを識別した。第二のPCRの生成物（15μ）を1.5％ア
ガロースゲル上で分離し、エチジウムブロミド染色し
た。ゲルのレーンの上の数字は各サンプルを採取するま
での治療期間（月）を示す。治療期間中を通じ、すべて
の患者が１日1200mgのジドブジンを投与された。
例１ HIV−１の単離 HIV−１の単離はLarderらによつて報告された方法に
従つて行つた（Larrder,B.A.,Darby,G.,Richman,D.:Sci
ence、243:1731、1989）。
従つて行つた（Larrder,B.A.,Darby,G.,Richman,D.:Sci
ence、243:1731、1989）。
DNAはHIV単離体で感染させたMT−２細胞から、次のよ
うにして抽出した。
うにして抽出した。
２×106個のMT−２細胞を、約0.1TCID50/細胞の多重
度でHIV−１により感染させ、10％ウシ胎仔血清、ポリ
ブレン（２μg/ml）および抗生物質（RPMI/10）を補給
したRPM1−1640メジウム中37℃で３〜４日間インキュベ
ートした（Larder,B.A.,Kemp,S.D.:Sciencs,246:1155〜
1158、1989）。
度でHIV−１により感染させ、10％ウシ胎仔血清、ポリ
ブレン（２μg/ml）および抗生物質（RPMI/10）を補給
したRPM1−1640メジウム中37℃で３〜４日間インキュベ
ートした（Larder,B.A.,Kemp,S.D.:Sciencs,246:1155〜
1158、1989）。
DNAは細胞ペレツトから、0.4％SDS、25mM Tris−HC
l、pH8、25mM EDTAおよび150mM NaCl中で溶解し、つい
でプテナーゼＫ（1mg/ml）による50℃で１時間消化した
のち抽出した。核酸は、フエノール／クロロホルム抽出
およびエタノール沈殿で回収し、RNアーゼＡ（10μg/m
l）で処理し、DNAはさらにフエノール／クロロホルム抽
出に付し、エタノールで沈殿させた。
l、pH8、25mM EDTAおよび150mM NaCl中で溶解し、つい
でプテナーゼＫ（1mg/ml）による50℃で１時間消化した
のち抽出した。核酸は、フエノール／クロロホルム抽出
およびエタノール沈殿で回収し、RNアーゼＡ（10μg/m
l）で処理し、DNAはさらにフエノール／クロロホルム抽
出に付し、エタノールで沈殿させた。
例２ HIV逆転写酵素の増幅およびクローニング 感染細胞DNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を用
いて、各HIV−１単離体について完全RTコード領域（1.7
kb）を得た。
いて、各HIV−１単離体について完全RTコード領域（1.7
kb）を得た。
PCRはDNAまたはRNA配列を選択的に増幅するための強
力な技術である。これは定められた長さおよび配列の特
定のDNAフラグメントを、少量の鋳型から多量に生成さ
せるためのin vitroでの方法である。PCRは、標的配列
の対立する鎖にハイブリダイズする２個のオリゴヌクレ
オチドプライマーで隣接されるDNAフラグメントの酵素
的増幅に基づくものである。プライマーはそれらの３′
末端が互いの方向を指すように配置される。鋳型の熱変
性、プライマーによるその相補性配列へのアニーリング
およびアニーリングしたプライマーのDNAポリメラーゼ
による伸長のサイクルを反復することにより、PCRプラ
イマーの５′末端で定められるセグメントの増幅が起こ
る。各プライマーの伸長生成物は他のプライマーの鋳型
として働くので、サイクル毎に生成されるDNAフラグメ
ントの量は前のサイクルでの量のほぼ倍になる。これに
よつて、特定の標的フラグメントの、数時間で数百万倍
といつた指数関数的蓄積が生じる。この方法は、ゲノム
DNAのような複雑な鋳型にも使用でき、それに含まれる
単一コピーの遺伝子を増幅することもできる。また、RN
AまたはDNAの複雑な混合物中の単一標的分子を増幅する
ことも可能で、ある条件下には10kb塩基対の長さまでの
フラグメントを生成させることもできる（White,T.J.,A
rnheim,N.＆ E.Hich,A.:Technical Focus,5巻、６号、1
85頁、1989年６月）。
力な技術である。これは定められた長さおよび配列の特
定のDNAフラグメントを、少量の鋳型から多量に生成さ
せるためのin vitroでの方法である。PCRは、標的配列
の対立する鎖にハイブリダイズする２個のオリゴヌクレ
オチドプライマーで隣接されるDNAフラグメントの酵素
的増幅に基づくものである。プライマーはそれらの３′
末端が互いの方向を指すように配置される。鋳型の熱変
性、プライマーによるその相補性配列へのアニーリング
およびアニーリングしたプライマーのDNAポリメラーゼ
による伸長のサイクルを反復することにより、PCRプラ
イマーの５′末端で定められるセグメントの増幅が起こ
る。各プライマーの伸長生成物は他のプライマーの鋳型
として働くので、サイクル毎に生成されるDNAフラグメ
ントの量は前のサイクルでの量のほぼ倍になる。これに
よつて、特定の標的フラグメントの、数時間で数百万倍
といつた指数関数的蓄積が生じる。この方法は、ゲノム
DNAのような複雑な鋳型にも使用でき、それに含まれる
単一コピーの遺伝子を増幅することもできる。また、RN
AまたはDNAの複雑な混合物中の単一標的分子を増幅する
ことも可能で、ある条件下には10kb塩基対の長さまでの
フラグメントを生成させることもできる（White,T.J.,A
rnheim,N.＆ E.Hich,A.:Technical Focus,5巻、６号、1
85頁、1989年６月）。
HIV RTの増幅およびクローニングに用いた体系を模式
図として第３図に示す。総DNAはHIV単離体で感染させた
細胞から抽出し、RTコード領地の全1.7kbフラグメント
はPCRによつて得られた（Saiki,R.K.ら:Science,239:48
7、1988）。HIV−1 DNAは例１のようにして得られた。
各PCR反応あたりこのDNA約１μｇを用いて、全RTコード
領域を増幅した。各反応混合物（100μ）は25mM KC
l、1.5mM MgCl2、50mM tris−HCl、pH8.3、0.1mg/mlウ
シ血清アルブミン、dATP、dGTP、dCTP、TTP各0.2mM、各
プライマー0.25μｇおよび2.5単位のTaq DNAポリメラー
ゼ（Perkin−Elmer Cetus）を含有した。これらの混合
物を100℃に２分間加熱したのちTaq DNAポリメラーゼを
加え、100μの軽油で覆い、Perkin−Elmer Cetue DNA
熱ライクラーを用いて、変性工程（１分30秒、94℃）、
プライマーアニーリング（２分、37℃）およびDNA合成
（10分、72℃）からなるサイクルに付した。Applied Bi
osystems 381Aシンセサイザーを用いて作成したオリゴ
ヌクレオチドプライマーは、RTの５′末端には （この領域にみられる配列変動を考慮して２種のプライ
マーを使用した）、３′末端には であつた。
図として第３図に示す。総DNAはHIV単離体で感染させた
細胞から抽出し、RTコード領地の全1.7kbフラグメント
はPCRによつて得られた（Saiki,R.K.ら:Science,239:48
7、1988）。HIV−1 DNAは例１のようにして得られた。
各PCR反応あたりこのDNA約１μｇを用いて、全RTコード
領域を増幅した。各反応混合物（100μ）は25mM KC
l、1.5mM MgCl2、50mM tris−HCl、pH8.3、0.1mg/mlウ
シ血清アルブミン、dATP、dGTP、dCTP、TTP各0.2mM、各
プライマー0.25μｇおよび2.5単位のTaq DNAポリメラー
ゼ（Perkin−Elmer Cetus）を含有した。これらの混合
物を100℃に２分間加熱したのちTaq DNAポリメラーゼを
加え、100μの軽油で覆い、Perkin−Elmer Cetue DNA
熱ライクラーを用いて、変性工程（１分30秒、94℃）、
プライマーアニーリング（２分、37℃）およびDNA合成
（10分、72℃）からなるサイクルに付した。Applied Bi
osystems 381Aシンセサイザーを用いて作成したオリゴ
ヌクレオチドプライマーは、RTの５′末端には （この領域にみられる配列変動を考慮して２種のプライ
マーを使用した）、３′末端には であつた。
PCR増幅で得られたHIV RTを、PCRプライマーによつて
５′末端および３′末端に構築した認識部位によりEco
R IおよびXba Iで消化し、フラグメントをアガロースゲ
ルから精製し、予めEco R IとXba Iで消化しおいたM13m
p18の複製型（RF）に連結した。PCR増幅（Saiki,R.K.
ら:Science、239:487、1988）によつて得られたHIV RT
（1.7Kb）をEco R IとXba I（BRL）で消化し、アガロー
スゲルで精製し、予めEco R IおよびXba Iで消化してお
いたM13ベクターmp18にリゲートさせた（第３図参
照）。リゲーシヨン混合物を用い、D.Hanahan:J.Mol.Bi
ol.,166:557（1983）に記載されているようにコンピー
テントにした大腸菌（株TG−１）にトランスホームし
た。これらの構築体からヌクレオチド配列決定用の一本
鎖DNAを調製した。機能性のRT酵素を発現できるクロー
ンについて、ジデオキシヌクレオチドによるチエーンタ
ーミネーター法（Sanger,F.,Nicklen,S.,Coulson,A.R.:
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463、1977）を用い配列決
定を行つた。第１表には、この操作で得られたRTクロー
ンの詳細を示し、またそれらが誘導されたHIV単離体を
掲げる。６個のRTクローンの完全配列が得られ（３例の
患者の感受性および抵抗性単離体対）、部分配列データ
は他の単離体が得られた。
５′末端および３′末端に構築した認識部位によりEco
R IおよびXba Iで消化し、フラグメントをアガロースゲ
ルから精製し、予めEco R IとXba Iで消化しおいたM13m
p18の複製型（RF）に連結した。PCR増幅（Saiki,R.K.
ら:Science、239:487、1988）によつて得られたHIV RT
（1.7Kb）をEco R IとXba I（BRL）で消化し、アガロー
スゲルで精製し、予めEco R IおよびXba Iで消化してお
いたM13ベクターmp18にリゲートさせた（第３図参
照）。リゲーシヨン混合物を用い、D.Hanahan:J.Mol.Bi
ol.,166:557（1983）に記載されているようにコンピー
テントにした大腸菌（株TG−１）にトランスホームし
た。これらの構築体からヌクレオチド配列決定用の一本
鎖DNAを調製した。機能性のRT酵素を発現できるクロー
ンについて、ジデオキシヌクレオチドによるチエーンタ
ーミネーター法（Sanger,F.,Nicklen,S.,Coulson,A.R.:
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463、1977）を用い配列決
定を行つた。第１表には、この操作で得られたRTクロー
ンの詳細を示し、またそれらが誘導されたHIV単離体を
掲げる。６個のRTクローンの完全配列が得られ（３例の
患者の感受性および抵抗性単離体対）、部分配列データ
は他の単離体が得られた。
PCRプライマーは、HIV−1 RT遺伝子の５′末端にEco
R Iのような制限酵素認識部位および３′末端にXba Iの
ような制限酵素部位が導入されるように設計できる。各
フラグメントを制限酵素で消化するとついで適当なベク
ターたとえばM136mp18ベースのベクターに導入できる。
R Iのような制限酵素認識部位および３′末端にXba Iの
ような制限酵素部位が導入されるように設計できる。各
フラグメントを制限酵素で消化するとついで適当なベク
ターたとえばM136mp18ベースのベクターに導入できる。
例３ HIV−１単離体の性質およびそれから誘導されるM13RTク
ローン ジドブジン抵抗性を付与するHIV−１突然変異 非治療または治療患者から得られたHIV単離体を、そ
れを採取した時点での治療期間およびジドブジン感受性
とともに示す。同一の患者から多種の単離体が得られた
場合には、単離体に仮の番号を付した。HT4−6C細胞単
層でプラーク減少テストにより、50％阻害容量（ID50）
が得られた（Larder,B.A.,Darby,G.,Richman,D.D.:Scie
nce、243:1731、1989;Chesebro,B.D.,Wehrly,K.:J.Viro
l.,62:3779、1988）。
ローン ジドブジン抵抗性を付与するHIV−１突然変異 非治療または治療患者から得られたHIV単離体を、そ
れを採取した時点での治療期間およびジドブジン感受性
とともに示す。同一の患者から多種の単離体が得られた
場合には、単離体に仮の番号を付した。HT4−6C細胞単
層でプラーク減少テストにより、50％阻害容量（ID50）
が得られた（Larder,B.A.,Darby,G.,Richman,D.D.:Scie
nce、243:1731、1989;Chesebro,B.D.,Wehrly,K.:J.Viro
l.,62:3779、1988）。
ジドブジン抵抗性に重要なHIV−1 RTの４つの位置の
アミノ酸残基はHIV単離体について例示する。問題の部
位の野生型での残基はAsp67、Lys70、Thr215およびLys2
19である。
アミノ酸残基はHIV単離体について例示する。問題の部
位の野生型での残基はAsp67、Lys70、Thr215およびLys2
19である。
同一の患者（患者A012、A018およびP022）から得られ
た感受性および高度に抵抗性の単離対について予想され
る全アミノ酸RT配列を比較して、14〜17の残基間の実質
的な差が明らかにされた。しかしながら、各列とも、感
受性単離体には認められない４個の残基におけるアミノ
酸変化（Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→PheまたはT
yrおよびLys210→Gln）が高度に抵抗性の単離体に認め
られた（第２図）。さらに２例の患者（患者A036および
P026）からの感受性および高度抵抗性単離体対の解析か
ら、67、70および215に同じ突然変異が明らかにされた
が、残基219は野生型のLysのままであつた（第２図）。
単離体からの多重M13クローンの配列決定では、わずか
な配列変化しか認められなかつた。報告されているHIV
−1 RT配列が、いずれの株においてもすべての４個の残
基で完全に保存されていたことは興味があり（G.Myers
ら編、Human retroviruses and AIDS:a Compilation an
d analysis of nucleic acid and amino acid sequence
s,Theoretical Biology and Biophysics,Los Alomos,Ne
w Mexico,II−22、1989）、ジドブジン抵抗性における
これらの突然変異を強く示唆している。
た感受性および高度に抵抗性の単離対について予想され
る全アミノ酸RT配列を比較して、14〜17の残基間の実質
的な差が明らかにされた。しかしながら、各列とも、感
受性単離体には認められない４個の残基におけるアミノ
酸変化（Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→PheまたはT
yrおよびLys210→Gln）が高度に抵抗性の単離体に認め
られた（第２図）。さらに２例の患者（患者A036および
P026）からの感受性および高度抵抗性単離体対の解析か
ら、67、70および215に同じ突然変異が明らかにされた
が、残基219は野生型のLysのままであつた（第２図）。
単離体からの多重M13クローンの配列決定では、わずか
な配列変化しか認められなかつた。報告されているHIV
−1 RT配列が、いずれの株においてもすべての４個の残
基で完全に保存されていたことは興味があり（G.Myers
ら編、Human retroviruses and AIDS:a Compilation an
d analysis of nucleic acid and amino acid sequence
s,Theoretical Biology and Biophysics,Los Alomos,Ne
w Mexico,II−22、1989）、ジドブジン抵抗性における
これらの突然変異を強く示唆している。
例４ 特定部位の突然変異誘発によつて作成されたHIV特異株
のジドブジン感受性 RT遺伝子における多重突然変異が高レベルの抵抗性を
説明するものかどうかを試験するため、上述の４個の突
然変異のみを含んだHIVの感染分子クローンを構築し
（単離体A012D）、このクローンからＴ細胞感染によつ
て産生したウイルスの活性を評価した。感染クローンHX
B2−Ｄ（Fisher,A.G.ら:Nature、316:262、1985）から
のHIV Pol遺伝子の2.5kbフラグメントM13ベクターmp19
に挿入し、特定の部位の突然変異の標的として使用した
（Larder,B.A.,Kemp,S.D.,Purifoy,D.J.M.:Proc.Natl.A
cad.Sci.USA、86:4803、1989）。
のジドブジン感受性 RT遺伝子における多重突然変異が高レベルの抵抗性を
説明するものかどうかを試験するため、上述の４個の突
然変異のみを含んだHIVの感染分子クローンを構築し
（単離体A012D）、このクローンからＴ細胞感染によつ
て産生したウイルスの活性を評価した。感染クローンHX
B2−Ｄ（Fisher,A.G.ら:Nature、316:262、1985）から
のHIV Pol遺伝子の2.5kbフラグメントM13ベクターmp19
に挿入し、特定の部位の突然変異の標的として使用した
（Larder,B.A.,Kemp,S.D.,Purifoy,D.J.M.:Proc.Natl.A
cad.Sci.USA、86:4803、1989）。
２種の合成オリゴヌクレオチドを用い、RT遺伝子中に
特定のヌクレオチド変化を同時に導入し、突然変異はヌ
クレオチド配列決定で確認した（Sanger,F.,Nicklen,S.
A.,Coulson,A.R.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74:5463、1
977）。全長クローンの再構築には、RT中の突然変異を
含有する1.9Kb Bal I制限フラグメントをpol遺伝子M13
クローンから取り除き、HXB2−Ｄ中に移した（Larder,
B.A.Kemp,S.D.,Purifoy,D.J.M.:Proc.Natl.Acad.Sci.US
A、86:4803、1989）。野生型および変異型感染クローン
からのDNAを用いて、次にＴ細胞リンパ芽球系、MT−４
（Harada,S.,Koyanagi,U.,Yamamoto,N.:Science、229:5
63、1985）をエレクトロポレーシヨンによつてトランス
フエクトした。ウイルス誘導CPEは各培養液中でほぼ等
しい時期（２〜４日後）に認められ、保存ウイルスはト
ランスフエクシヨンの６〜７日後に調製した。野生型お
よび変異型HIV単離体（それぞれHXB2−ＤおよびHIVRTM
C）は、HeLa−CD4 +細胞系、HT4−6C中プラークアツセイ
によつて力価を測定し、ついでHT4−6C細胞中プラーク
減少テストによつてジドブジンに対する感受性を試験し
た（Larder,B.A.,Darby,G.,Richman,D.D.:Science,243:
1731、1989;Chesebro,B.D.,Wehrly,K.:J.Virol.,62:377
9、1988）。これらの実験の結果は、第２表に示すよう
に、特定部位の突然変異誘発によつて構築した変異型ウ
イルスがジドブジンに対して高い抵抗性を有することを
明瞭に示している。HIVRTMCのLD50値は野生型ウイルス
に比べて100倍に上昇し、その抵抗性はRT遺伝子中に同
様の突然変異を含有するHIV単離体によつて天然に認め
られる抵抗性と同抵抗のものであつた。
特定のヌクレオチド変化を同時に導入し、突然変異はヌ
クレオチド配列決定で確認した（Sanger,F.,Nicklen,S.
A.,Coulson,A.R.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74:5463、1
977）。全長クローンの再構築には、RT中の突然変異を
含有する1.9Kb Bal I制限フラグメントをpol遺伝子M13
クローンから取り除き、HXB2−Ｄ中に移した（Larder,
B.A.Kemp,S.D.,Purifoy,D.J.M.:Proc.Natl.Acad.Sci.US
A、86:4803、1989）。野生型および変異型感染クローン
からのDNAを用いて、次にＴ細胞リンパ芽球系、MT−４
（Harada,S.,Koyanagi,U.,Yamamoto,N.:Science、229:5
63、1985）をエレクトロポレーシヨンによつてトランス
フエクトした。ウイルス誘導CPEは各培養液中でほぼ等
しい時期（２〜４日後）に認められ、保存ウイルスはト
ランスフエクシヨンの６〜７日後に調製した。野生型お
よび変異型HIV単離体（それぞれHXB2−ＤおよびHIVRTM
C）は、HeLa−CD4 +細胞系、HT4−6C中プラークアツセイ
によつて力価を測定し、ついでHT4−6C細胞中プラーク
減少テストによつてジドブジンに対する感受性を試験し
た（Larder,B.A.,Darby,G.,Richman,D.D.:Science,243:
1731、1989;Chesebro,B.D.,Wehrly,K.:J.Virol.,62:377
9、1988）。これらの実験の結果は、第２表に示すよう
に、特定部位の突然変異誘発によつて構築した変異型ウ
イルスがジドブジンに対して高い抵抗性を有することを
明瞭に示している。HIVRTMCのLD50値は野生型ウイルス
に比べて100倍に上昇し、その抵抗性はRT遺伝子中に同
様の突然変異を含有するHIV単離体によつて天然に認め
られる抵抗性と同抵抗のものであつた。
例５ 抵抗性変異体を検出するためのHIV DNAの選択的増幅 PCRのためのDNAはHIV単体により、0.1TCID50/ml（MT
−２細胞中保存ウイルスの最終希釈によつて測定された
50％組織培養感染用量）の多重度で感染させたMT−２細
胞から得て、10％ウシ胎仔血清、ポリブレン（２μg/m
l）および抗生物質を補充したRPMI1640メジウム中37℃
で３〜４日間インキユベートした。DNAは、0.4％SDS、2
5mM Tris−HCl、pH8、25mM EDTAおよび150mM NaCl中で
溶解させた細胞ペレツトから抽出した。
−２細胞中保存ウイルスの最終希釈によつて測定された
50％組織培養感染用量）の多重度で感染させたMT−２細
胞から得て、10％ウシ胎仔血清、ポリブレン（２μg/m
l）および抗生物質を補充したRPMI1640メジウム中37℃
で３〜４日間インキユベートした。DNAは、0.4％SDS、2
5mM Tris−HCl、pH8、25mM EDTAおよび150mM NaCl中で
溶解させた細胞ペレツトから抽出した。
プロテナーゼＫ（1mg/ml、50゜で１時間）によつて消
化したのち、DNAをフエノール抽出およびエタノール沈
殿で回収した。この物質約１μｇを各反応液（100μ
）ごとに使用した。反応液は、25mM KCl、50mM Tris
−HCl、pH8.3、0.1mg/mlウシ血清アルブミン（BSA）、d
ATP、dGTP、dCTPおよびdTTP各0.2mM、各オリゴヌクレオ
チドプライマーと特定の組合せについて以下の濃度のMg
Cl2を含有する。
化したのち、DNAをフエノール抽出およびエタノール沈
殿で回収した。この物質約１μｇを各反応液（100μ
）ごとに使用した。反応液は、25mM KCl、50mM Tris
−HCl、pH8.3、0.1mg/mlウシ血清アルブミン（BSA）、d
ATP、dGTP、dCTPおよびdTTP各0.2mM、各オリゴヌクレオ
チドプライマーと特定の組合せについて以下の濃度のMg
Cl2を含有する。
プライマーＡと1Wおよび1M（コドン67の分析）:2mM M
gCl2 プライマーＡと2Wおよび2M（コドン70の分析）:5mM M
gCl2 プライマーＢと3Wおよび3M（コドン215の分析）:1.5m
M MgCl2 プライマーＢと4Wおよび4M（コドン219の分析）:1.5m
M MgCl2 反応混合物を100℃に２分間加熱したのちTaq DNAポリ
メラーゼ（2.5単位、Perkin−Elmer Cetus）を添加し、
100μの軽油で覆い、変性工程（１分、94℃）、プラ
イマーアニーリング〔コドン70の分析（プライマーＡと
2Wおよび2M）およびコドン219（プライマーＢと4Wおよ
び4M）の分析のための反応では30秒、40℃）またはコド
ン67（プライマーＡと1Wおよび1M）およびコドン215
（プライマーＢと3Wおよび3M）の分析のための反応では
30秒、45℃〕、ならびにDNA合成（30秒、72℃）からな
るサイクルを、30回、Perkin−Elmer Cetus DNA熱サイ
クラーを用いて行わせた。オリゴヌクレオチドプライマ
ー（第４図）は、Applied Biosysteme381A装置を用いて
合成した。各反応混合物10μを1.5％TBEアガロースゲ
ルに流し、DNAをエチジウムブロミド染色で可視化し
た。PCRプライマー2W、2M、3Mおよび3Mの配列は第4bお
よび4c図に示す。他のオリゴヌクレオチドプライマーの
配列は次の通りである。
gCl2 プライマーＡと2Wおよび2M（コドン70の分析）:5mM M
gCl2 プライマーＢと3Wおよび3M（コドン215の分析）:1.5m
M MgCl2 プライマーＢと4Wおよび4M（コドン219の分析）:1.5m
M MgCl2 反応混合物を100℃に２分間加熱したのちTaq DNAポリ
メラーゼ（2.5単位、Perkin−Elmer Cetus）を添加し、
100μの軽油で覆い、変性工程（１分、94℃）、プラ
イマーアニーリング〔コドン70の分析（プライマーＡと
2Wおよび2M）およびコドン219（プライマーＢと4Wおよ
び4M）の分析のための反応では30秒、40℃）またはコド
ン67（プライマーＡと1Wおよび1M）およびコドン215
（プライマーＢと3Wおよび3M）の分析のための反応では
30秒、45℃〕、ならびにDNA合成（30秒、72℃）からな
るサイクルを、30回、Perkin−Elmer Cetus DNA熱サイ
クラーを用いて行わせた。オリゴヌクレオチドプライマ
ー（第４図）は、Applied Biosysteme381A装置を用いて
合成した。各反応混合物10μを1.5％TBEアガロースゲ
ルに流し、DNAをエチジウムブロミド染色で可視化し
た。PCRプライマー2W、2M、3Mおよび3Mの配列は第4bお
よび4c図に示す。他のオリゴヌクレオチドプライマーの
配列は次の通りである。
例６ RTに一定の突然変異の組合せを有するHIV変異型の構築 臨床的に単離されたDNAの配列分析によつて同定され
た変異体を模倣した変異型の構築のほかに、RT中にこれ
まで認められていない変化の組合せを有する多くの変異
型を作成した。プロウイルスクローンHXB2−Ｄから誘導
したRTのヌクレオチド配列（Fisher,A.G.,Collatti,E.,
Ratner,L.,Gallo,R.＆ Wong Staal,F.:Nature（Londo
n）、316:262〜265、1985）をまず、特定部位の突然変
異誘発によつて変化させた。変化したRTを含むM13クロ
ーンからのpol遺伝子DNAフラグメントを、除去されたRT
領域を含むBal I制限酵素フラグメントを有するXHB2−
Ｄと混合した。これらの混合物を、同種組換えによる感
染ウイルス変異体の形成を可能にするためエレクトロポ
レーシヨンによつてMT−２細胞にコトランスフエクトし
た。RTの変異体は、野生型HIV pol遺伝子の2.55kb Bal
II〜Eco R Iフラグメントを含有する前述のM13クローン
mp RT1/H（Larder,B.A.,Kemp,S.D.＆ Purifoy,D.J.M.:P
roc.Natl.Aacad.Sci.USA、864803〜4807）、1989）の特
定部位の突然変異誘発によつて作成した。すべての変異
体について、ヌクレオチド配列分析（Sanger,F.,Nickle
n,S.＆ Coulson,A.R.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74:546
3〜5467、1977）によつて確認した。野生型ウイルスHXB
2および変異体は、MT−２細胞中での同種組換えによつ
て誘導した（Clavel,F.,Hogan,M.D.,Willey,R.L.,Streb
el,K.,Martin,M.A.＆ Repaske,R.:J.Virol.、63:1455〜
1459、1989;Srinivasan,A.ら:Proc.Natl.Acad.Sci.US
A、86:6388〜6392、1989）。大部分のRTを欠く野生型全
長HIVクローンとmp RT1/HM13クローンからのpol遺伝子
フラグメントをコントランスフエクして得た。野生型感
染クローンHXB2−Ｄ（Fisher,A.G.,Collati,E.,Ratner,
L.,Gallo,R.C.＆ Wong−Staal,F.:Nature（London）、3
16:262〜265、1985）をMsc I（Bal I）で消化して、RT
の大部分からなる1.9kbフラグメントを放出させ（Ratne
r,L.ら:Nature（London）、313:277〜284、1985）、大
フラグメントをアガロースゲルで精製した。mp RT1/Hの
複製型（二本鎖DNA）または突然変異クローンをEco R I
とHing IIIで消化してpol遺伝子を線状化し、それぞれ
５μｇと５μｇのゲル精製HXB2−D DNA（Msc Iフラグメ
ントは除去）と混合した。各混合物を用いて上述のよう
にエレクトロポレーシヨンによつてMT−２細胞にトラン
スフエクトし（Larder,B.A.＆ Kemp,S.D.,前出）、感染
したウイルス（トランスフエクシヨン約14日後に培養上
清から回収）を少量ずつに分けて−70℃に保存した。変
異型ウイルスのゲノタイプは、PCRによるこれらの単離
体からクローン化したRTのDNA配列分析によつて確認し
た。これらの培養液から回収されたウイルス単離体を、
HT4−60細胞中プラーク減少テストによつてジドブジン
に対する感受性について試験した。ウイルス変異体は一
般的に、突然変異の数が増すほど、抵抗性が増大し、臨
床的単離体から得られたDNA配列のデータ（第３表）と
よく合致した。たとえば、組換えRTMF（Thr215→Tyr）
およびRTMC/WT（Asp67→Asn、Lys70→Ayg）は、変異体R
TMC/F（Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Tyr）よりも
ジドブジンに対する抵抗性は弱く、RTMC/Fの抵抗性の程
度は、RTMFおよびRTMC/WTに認められたID50の合計にの
ほぼ等しかつた。
た変異体を模倣した変異型の構築のほかに、RT中にこれ
まで認められていない変化の組合せを有する多くの変異
型を作成した。プロウイルスクローンHXB2−Ｄから誘導
したRTのヌクレオチド配列（Fisher,A.G.,Collatti,E.,
Ratner,L.,Gallo,R.＆ Wong Staal,F.:Nature（Londo
n）、316:262〜265、1985）をまず、特定部位の突然変
異誘発によつて変化させた。変化したRTを含むM13クロ
ーンからのpol遺伝子DNAフラグメントを、除去されたRT
領域を含むBal I制限酵素フラグメントを有するXHB2−
Ｄと混合した。これらの混合物を、同種組換えによる感
染ウイルス変異体の形成を可能にするためエレクトロポ
レーシヨンによつてMT−２細胞にコトランスフエクトし
た。RTの変異体は、野生型HIV pol遺伝子の2.55kb Bal
II〜Eco R Iフラグメントを含有する前述のM13クローン
mp RT1/H（Larder,B.A.,Kemp,S.D.＆ Purifoy,D.J.M.:P
roc.Natl.Aacad.Sci.USA、864803〜4807）、1989）の特
定部位の突然変異誘発によつて作成した。すべての変異
体について、ヌクレオチド配列分析（Sanger,F.,Nickle
n,S.＆ Coulson,A.R.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74:546
3〜5467、1977）によつて確認した。野生型ウイルスHXB
2および変異体は、MT−２細胞中での同種組換えによつ
て誘導した（Clavel,F.,Hogan,M.D.,Willey,R.L.,Streb
el,K.,Martin,M.A.＆ Repaske,R.:J.Virol.、63:1455〜
1459、1989;Srinivasan,A.ら:Proc.Natl.Acad.Sci.US
A、86:6388〜6392、1989）。大部分のRTを欠く野生型全
長HIVクローンとmp RT1/HM13クローンからのpol遺伝子
フラグメントをコントランスフエクして得た。野生型感
染クローンHXB2−Ｄ（Fisher,A.G.,Collati,E.,Ratner,
L.,Gallo,R.C.＆ Wong−Staal,F.:Nature（London）、3
16:262〜265、1985）をMsc I（Bal I）で消化して、RT
の大部分からなる1.9kbフラグメントを放出させ（Ratne
r,L.ら:Nature（London）、313:277〜284、1985）、大
フラグメントをアガロースゲルで精製した。mp RT1/Hの
複製型（二本鎖DNA）または突然変異クローンをEco R I
とHing IIIで消化してpol遺伝子を線状化し、それぞれ
５μｇと５μｇのゲル精製HXB2−D DNA（Msc Iフラグメ
ントは除去）と混合した。各混合物を用いて上述のよう
にエレクトロポレーシヨンによつてMT−２細胞にトラン
スフエクトし（Larder,B.A.＆ Kemp,S.D.,前出）、感染
したウイルス（トランスフエクシヨン約14日後に培養上
清から回収）を少量ずつに分けて−70℃に保存した。変
異型ウイルスのゲノタイプは、PCRによるこれらの単離
体からクローン化したRTのDNA配列分析によつて確認し
た。これらの培養液から回収されたウイルス単離体を、
HT4−60細胞中プラーク減少テストによつてジドブジン
に対する感受性について試験した。ウイルス変異体は一
般的に、突然変異の数が増すほど、抵抗性が増大し、臨
床的単離体から得られたDNA配列のデータ（第３表）と
よく合致した。たとえば、組換えRTMF（Thr215→Tyr）
およびRTMC/WT（Asp67→Asn、Lys70→Ayg）は、変異体R
TMC/F（Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Tyr）よりも
ジドブジンに対する抵抗性は弱く、RTMC/Fの抵抗性の程
度は、RTMFおよびRTMC/WTに認められたID50の合計にの
ほぼ等しかつた。
例７ 非培養リンパ球からのDNAにおける突然変異の検出 上述のPCRアツセイ（例５）は、感染患者のPBLサンプ
ルを、ウイルスを得るために予め培養することなく、ジ
ドブジン抵抗性をもつ突然変異の直接検出を可能にする
ものであつた。この材料は一般的にHIV DNA含量が、感
染リンパ球培養中におけるよりもかなり低いので、本発
明においては、二重PCR（または組重ねセツト）プロト
コール（Simmonds,P.ら：前出）を用いて、サンプル中
の標的HIV RT DNAシグナル量を増加させた。したがつ
て、本発明の方法では、まず、共通して認められるすべ
ての突然変異を包含するRT領域内からの768bフラグメン
トを増幅させた（この増幅にはPCRプライマーＡとNE1を
使用した。第4a図参照）。ついで、この少量の予め増幅
させた材料を、野生型と変異残基の識別を可能にするよ
うに設計されたプライマー対による第二のPCRに用い
た。アミノ酸残基215の典型的な分析の結果は第５図に
示す。PBLサンプルは３例のAIDS患者から、ジドブジン
療法の開始前および12〜17カ月の治療後に採取した。治
療前のサンプルの場合、すべてが野生型であつたが、一
方治療開始初期のサンプルは変異型であるかまたは両者
の混合物であつた（第５図）。
ルを、ウイルスを得るために予め培養することなく、ジ
ドブジン抵抗性をもつ突然変異の直接検出を可能にする
ものであつた。この材料は一般的にHIV DNA含量が、感
染リンパ球培養中におけるよりもかなり低いので、本発
明においては、二重PCR（または組重ねセツト）プロト
コール（Simmonds,P.ら：前出）を用いて、サンプル中
の標的HIV RT DNAシグナル量を増加させた。したがつ
て、本発明の方法では、まず、共通して認められるすべ
ての突然変異を包含するRT領域内からの768bフラグメン
トを増幅させた（この増幅にはPCRプライマーＡとNE1を
使用した。第4a図参照）。ついで、この少量の予め増幅
させた材料を、野生型と変異残基の識別を可能にするよ
うに設計されたプライマー対による第二のPCRに用い
た。アミノ酸残基215の典型的な分析の結果は第５図に
示す。PBLサンプルは３例のAIDS患者から、ジドブジン
療法の開始前および12〜17カ月の治療後に採取した。治
療前のサンプルの場合、すべてが野生型であつたが、一
方治療開始初期のサンプルは変異型であるかまたは両者
の混合物であつた（第５図）。
非培養PBLサンプルからのDNA中の突然変異のPCRによる
検出 DNAは約２×106個のPBLから、MT−２細胞培養の場合
について上述したのと同様にして抽出した。この材料0.
5〜１μｇを最初のPCR（100μ）に使用した。これに
は、25mM KCl、1.5mM MgCl2、50mM Tris−HCl、pH8.3、
0.1mg/ml BSA、各0.2mMのdATP、dGTP、dCTPおよびdTTP
プラス各プライマー（プライマーＡおよびプライマーNE
1）を含有させた。反応混合物は例５に記載したと同様
に処理し、１分94℃、１分45℃および２分72℃のサイク
ルを30回行つた。増幅後、100μのクロロホルムを加
えてサンプルを抽出し、その各0.5μを関連PCR混合物
すべての成分を含む反応チユーブに直接加えた。サンプ
ルを100μの軽油で覆い、熱サイクルに付す前に94℃
に５分間加熱した。この第二のPCRの反応混合物および
熱サイクル時間は特定の突然変異（すなわちプライマー
Ａを2Wまたは2Mと組合せ、プライマーＢを3Wまたは3Mと
組合せた）の検出のために選択的に増幅させた場合に上
述したのと全く同じとした（例５）。各反応混合物に１
μｇのニシンの精子DNAを加えると第二のPCRの選択性が
増大することがわかつている。さらに、「二重」PCRの
高い感受性により、サンプルとPCR試薬の交差汚染を避
けるために緊縮条件に注意を払わなければならない。対
照反応はDNAを加えないで常に実施し、偽増幅が起こつ
ていないことを確認した。PCRプライマーNE1の配列は次
の通りである。
検出 DNAは約２×106個のPBLから、MT−２細胞培養の場合
について上述したのと同様にして抽出した。この材料0.
5〜１μｇを最初のPCR（100μ）に使用した。これに
は、25mM KCl、1.5mM MgCl2、50mM Tris−HCl、pH8.3、
0.1mg/ml BSA、各0.2mMのdATP、dGTP、dCTPおよびdTTP
プラス各プライマー（プライマーＡおよびプライマーNE
1）を含有させた。反応混合物は例５に記載したと同様
に処理し、１分94℃、１分45℃および２分72℃のサイク
ルを30回行つた。増幅後、100μのクロロホルムを加
えてサンプルを抽出し、その各0.5μを関連PCR混合物
すべての成分を含む反応チユーブに直接加えた。サンプ
ルを100μの軽油で覆い、熱サイクルに付す前に94℃
に５分間加熱した。この第二のPCRの反応混合物および
熱サイクル時間は特定の突然変異（すなわちプライマー
Ａを2Wまたは2Mと組合せ、プライマーＢを3Wまたは3Mと
組合せた）の検出のために選択的に増幅させた場合に上
述したのと全く同じとした（例５）。各反応混合物に１
μｇのニシンの精子DNAを加えると第二のPCRの選択性が
増大することがわかつている。さらに、「二重」PCRの
高い感受性により、サンプルとPCR試薬の交差汚染を避
けるために緊縮条件に注意を払わなければならない。対
照反応はDNAを加えないで常に実施し、偽増幅が起こつ
ていないことを確認した。PCRプライマーNE1の配列は次
の通りである。
このプライマーは第4a図に示すように、プライマー3W
および3Mの下流にアニーリングする。
および3Mの下流にアニーリングする。
第１図は、ジドブジンに対する抵抗性を生じるHIV−1 R
T中のヌクレオチド変化を示す。 第２図は、ジドブジンに対する抵抗性を生じるHIV−1 R
T中のアミノ酸変化を示す。〔Myers,G et al.,ヒトレト
ロウイルス及びAIDS:核酸及びアミノ酸配列の編集と分
析（Theoretical and Biophysics,Los Alamos National
Laboratory,Los Alamos,NM,p II−22（1989）、変化し
たアミノ酸番号（RT＝プロリンの残基＃１、Myers et a
lに示されている）参照〕。 第３図はHIV RTの増幅およびクローニング工程を示す略
図である。 第４図は、HIV−１ゲノムの構成図であり、PCRに使用し
たRT暗号領域中のオリゴヌクレオチドプライマーの位置
および方向を示す。 第５図は、非培養PBLサンプルからのDNA中のRTコドン21
5の直接分析例であるアガロースゲル染色の結果であ
る。
T中のヌクレオチド変化を示す。 第２図は、ジドブジンに対する抵抗性を生じるHIV−1 R
T中のアミノ酸変化を示す。〔Myers,G et al.,ヒトレト
ロウイルス及びAIDS:核酸及びアミノ酸配列の編集と分
析（Theoretical and Biophysics,Los Alamos National
Laboratory,Los Alamos,NM,p II−22（1989）、変化し
たアミノ酸番号（RT＝プロリンの残基＃１、Myers et a
lに示されている）参照〕。 第３図はHIV RTの増幅およびクローニング工程を示す略
図である。 第４図は、HIV−１ゲノムの構成図であり、PCRに使用し
たRT暗号領域中のオリゴヌクレオチドプライマーの位置
および方向を示す。 第５図は、非培養PBLサンプルからのDNA中のRTコドン21
5の直接分析例であるアガロースゲル染色の結果であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (8)
- 【請求項１】HIV−１サンプルのジドブジンに対する感
受性を測定するにあたり、（ｉ）サンプルから核酸を単
離し、（ii）この核酸を、野生型DNA配列（もしくはそ
の相当するRNA）または第１図に示す変異型DNA配列（も
しくはその相当するRNA）の領域であつて、ヌクレオチ
ド2328、2338、2772、2773または2784位置で３′末端を
終結する領域に相補性のオリゴヌクレオチドとハイブリ
ダイズさせ、（iii）オリゴヌクレオチドの３′末端か
ら核酸のポリメリゼーシヨンを試み、ついで（iv）オリ
ゴヌクレオチドプライマーの伸長生成物が存在するか否
かを確認する方法。 - 【請求項２】HIV−１サンプルのジドブジンに対する感
受性を測定するにあたり、（ｉ）サンプルから核酸を単
離し、（ii）この核酸を、野生型DNA配列（もしくはそ
の相当するRNA）または第１図に示す変異型DNA配列（も
しくはその相当するRNA）の、2328、2338、2772、2773
および／または2784位置のヌクレオチド１個または２個
以上を含有する領域に相補性のオリゴヌクレオチドとハ
イブリダイズさせ、（iii）生成したオリゴヌクレオチ
ドと核酸のハイブリツドがこれらの位置のいずれかでの
相補性ヌクレオチドを持つか否かを確認する方法。 - 【請求項３】単離された核酸は、オリゴヌクレオチドと
ハイブリダイズする前に増幅される請求項（１）または
（２）記載の方法。 - 【請求項４】増幅はポリメラーゼ連鎖反応を用いて行わ
れる請求項（３）記載の方法。 - 【請求項５】オリゴヌクレオチドプライマー伸長生成物
の出現または相補性ヌクレオチドの存在は標識を用いて
確認する請求項（１）〜（３）のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項６】標識は、酵素、放射性同位元素または螢光
色素である請求項（５）記載の方法。 - 【請求項７】HIV−１のジドブジンに対する感受性を測
定するのに適当な試験用キツドであつて、（ｉ）野生型
DNA配列（もしくはその相当するRNA）または第１図に示
す変異型DNA配列（もしくはその相当するRNA）の領域で
あつて、ヌクレオチド2328、2338、2772、2773または27
84位置で３′末端を終結する領域に相補性のオリゴヌク
レオチド、および（ii）適当な酵素、洗浄および緩衝溶
液、ならびに標識および標識が必要とする場合は基質か
らなるキツト。 - 【請求項８】HIV−１のジドブジンに対する感受性を測
定するのに適当な試験用キツドであつて、（ｉ）野生型
DNA配列（もしくはその相当するRNA）または第１図に示
す変異型DNA配列（もしくはその相当するRNA）の、232
8、2338、2772、2773および／または2784位置のヌクレ
オチド１個または２個以上を含有する領域に相補性のオ
リゴヌクレオチド、および（ii）適当な酵素、洗浄およ
び緩衝溶液、ならびに標識および標識が必要とする場合
は基質からなるキツト。
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