JPH0813280B2 - 変異核酸の検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は変異核酸の検出方法、こ
れに適している一組のオリゴヌクレオチド、該本発明方
法を行うための試薬キットならびに該方法を使用および
応用する遺伝子および感染の診断方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、ある核酸類または核酸群の存在に
ついて試料を試験することがますます重要になってきて
いる。これは、ある程度、核酸のヌクレオチド配列が各
微生物の特徴であるということに起因している。この分
野における最近の試みは、核酸を識別するために、ヌク
レオチドの配列の１つの差異の使用に集中する。このよ
うな差異は、例えば、点突然変異によって生じるヌクレ
オチド置換の結果であろう。このような密接に関連した
核酸の自然の例は、例えば、対立遺伝子、すなわち染色
体の所定部位の所定遺伝子の配列の補体変異体(alterna
tive variants)である。

【０００３】オンコジーン・リサーチ（Ｏncogene Ｒes
earch）１(１９８９)、２３５−２４１およびヌークリ
イック・アシッズ・リサーチ（Ｎucl.Ａcids Ｒes.）１
７(１９８９)、８０９３−８０９９から、対立遺伝子変
異体(alleic variants)を含有していると思われる領域
を、まず、特別に設計したプライマーを使用してポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅し、次いで、制限酵素
で処理する方法が知られている。次いで、該対立遺伝子
を制限断片長多型（ＲＦＬＰ）で分析した後、それらを
診断することができる。次いで、大きさによる分解産物
の電気泳動分離によって、対応する対立遺伝子がプロー
ブ中に含有されるか否かが判明する。この方法の欠点は
特異的制限消化を必要とすることである。これが扱いに
くい方法であるということの他に、もはやＲＥＬＰを生
産しなくなった各突然変異のために、所定部位で正確に
切断する制限酵素で消化されるべきである点突然変異と
隣接しているプライマーの設計が可能なことが必要であ
る。これは上記文献に挙げられている理由によって困難
であろう。

【０００４】ＥＰ−Ａ−０３３２４３５には、ヌクレオ
チド１つだけが隣接する核酸と異なる核酸を選択的に検
出する方法が開示されている。ここで用いられた効果は
以下のとおりである：検出されるべき核酸にハイブリダ
イズされたオリゴヌクレオチドだけが理論的には酵素に
よって伸長され得、ここで伸長方向の末端の該ヌクレオ
チド１つが検出されるべき核酸（１つの対立遺伝子）の
対応するヌクレオチドと相補的である。故に、該オリゴ
ヌクレオチドは試験されるべき核酸と唯一相補的である
ように選択される。かくして、他の対立遺伝子にハイブ
リダイズされるオリゴヌクレオチドは理論的には伸長し
ない。しかしながら、実際には、他の対立遺伝子にハイ
ブリダイズされたオリゴヌクレオチドも、非常に僅かな
伸長ではあるが伸長することが判明した。これは選択性
および、特に、方法の特異性を低下させる。非特異的伸
長は、特に、Ｔが３'−末端ミスマッチの一部分である
場合、または該ミスマッチがＣ：Ａミスマッチである場
合に容易に生じるであろう[クヴォク（Ｋwok）ら、(１
９９０)、ヌークリイック・アシッズ・リサーチ（Ｎucl
eic Ａcids Ｒesearch）、１８：９９９−１００５]。
特異性を増大させるために、ＥＰ−Ａ−０３３２４３５
には、末端領域が２つの核酸の対応するヌクレオチドと
相補的ではない別のヌクレオチドを含有するようにオリ
ゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を選択することが提
案されている。両方の対立遺伝子の検出のために、１つ
の反応につき２つの対立遺伝子のうちの１つだけを検出
しつつ２つの反応を行わなければならない。この方法は
対立遺伝子−特異的プライマー２つおよび相補鎖プライ
マー１つの合成を必要とする。該試料は２つの反応で増
幅される：相補鎖のプライマーおよび対立遺伝子−特異
的プライマーのうちの１つとによるＰＣＲ後、第２の同
反応、ＰＣＲにおいて相補鎖プライマーおよび第２の対
立遺伝子−特異的プライマーで増幅される。推測される
対立遺伝子−特異的ＰＣＲ産物が該反応のうちの１つで
検出されない場合は、個々の対立遺伝子は該試料中に存
在しないと予想される。ホモ接合ＤＮＡ−試料が、２つ
の反応のうちの１つだけで検出され得る２つの対立遺伝
子のうちの１つだけを含有するので、全ての反応で同一
の対照産物を生産する２つのさらなるプライマーの使用
が必要である。この対照産物は、他の対立遺伝子の個々
のＰＣＲの効率を制御するため、および個々の対立遺伝
子の不在を確証するために、特異的な産物とは異なる。
ＰＣＲ産物中に対照産物が存在するが、対立遺伝子の特
異的な産物がない場合、該試料は該反応で試験される対
立遺伝子を含有していないと思われる。この方法では、
２つの対立遺伝子の存在または不在を２つの別々の反応
で確証しなければならず、個々のＰＣＲは対照ＰＣＲを
含まなければならない。

【０００５】バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂiochem.Ｂiop
hys.Ｒes.Ｃommun.）(１９８９)、１６０：４４１−４
４７には、ｄＮＴＰ濃度を減少させることによって選択
性を増大させることが提案されている。このさらなる手
段を採用した場合でさえ、別々のバッチでの対立遺伝子
の検出は非特異的な産物を生じることがある。

【０００６】リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、ＷＯ８９／０
９８３５）では、熱安定リガーゼを使用して、２つの隣
接するオリゴヌクレオチドを特異的に連結する。これ
は、それらがストリンジェントハイブリダイゼーション
温度で相補的標的にハイブリダイズされる場合および連
鎖部位の塩基対が完全である場合だけ生じる。２つの対
立遺伝子が連鎖部位での突然変異の結果として相違する
場合、完全な塩基対の上記条件は対立遺伝子のうちの１
つだけについて満たされる。次いで、リガーゼ連鎖反応
における連結産物を増幅させるのに最初の２つのオリゴ
ヌクレオチドと相補的である２つのさらなるオリゴヌク
レオチドが必要である。現在まで、２つの対立遺伝子の
検出は少なくとも６つのオリゴヌクレオチドとの２つの
反応が必要であり、該増幅産物は放射性標識によって検
出される[プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Ｐroc.
Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）(１９９１)、８８：１８９
−１９３]。

【０００７】プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ(１９
８５)、８２：１５８５−１５８８およびニュー・イン
グランド・ジャーナル・オブ・メディスン（Ｎew Ｅngl
and Ｊournal of Ｍedicine）(１９８７)、３１７：９
８５から、「対立遺伝子−特異的」オリゴヌクレオチド
（ＡＳＯ）と該対立遺伝子との示差ハイブリダイゼーシ
ョンに基づく対立遺伝子検出方法が知られている。例え
ば、各々長さ２０ｂｐの２つのオリゴヌクレオチドを合
成する。各々は２つの異なる対立遺伝子のうちの１つと
適合するが、オリゴヌクレオチド配列の中央に位置する
他の対立遺伝子に対するミスマッチを有する。次いで、
対立遺伝子の識別は、標識オリゴヌクレオチドとの示差
ハイブリダイゼーションによって可能である。これは、
ヒトゲノムＤＮＡおよびＰＣＲ産物の両方の分析に適用
される。ゲノムＤＮＡの直接的および間接的分析もこの
方法で可能であるが、さらなる消化および電気泳動法を
必要とする。

【０００８】ヌークリイック・アシッズ・リサーチ（Ｎ
ucleic Ａcids Ｒesearch）(１９８９)、１７：２４３
７−２４４８およびＥＰ−Ａ−０３３３４６５には、対
立遺伝子−特異的プライマーの競争（競合的オリゴヌク
レオチドプライミング＝ＣＯＰ）によって２、３のさら
なるＰＣＲサイクルにおいて種々の対立遺伝子の存在に
ついて予備増幅したヒトゲノムＤＮＡを試験する方法が
開示されている。上記ＡＳＯ−法はＰＣＲ法に変換され
る。最初のＡＳＯ−法では、対応する対照間のシグナル
強度の比較によって結果の解釈が明白になるので、交差
ハイブリダイゼーションによって生じるエラー率５％は
許容される。しかしながら、プライマーが対立遺伝子−
特異的オリゴヌクレオチドであるＰＣＲ反応では、対立
遺伝子のうちの１つだけを含有する試料に関するエラー
率は、このエラーが両対立遺伝子を増幅させる試薬混合
物中で生じる場合、１０サイクル後、１２％に達するで
あろう。ギブズ（Ｇibbs）らはプライマー競争が選択性
を増大させることを実際に示すことができたが、ゲノム
ＤＮＡの関心ある領域はまずＰＣＲで増幅され、次い
で、異なる対立遺伝子についての分析が次の１０サイク
ルで行われた。２つの対立遺伝子−特異的プライマーお
よび相補鎖プライマーはこれらのサイクルにおいて使用
され、２つの反応において、対立遺伝子−特異的プライ
マーのうちの１つは放射性標識された。異なる対立遺伝
子の選択的検出は長さ１２〜１６塩基のオリゴヌクレオ
チドに対して示されたが、一方、より長いオリゴヌクレ
オチドは所定条件下で非特異的産物を産生した。

【０００９】示差ハイブリダイゼーションに基づく方法
は、ある状況下で適用され得るだけであり、さらにま
た、非常に複雑であり、かつ障害に影響され易い。ま
た、予備増幅は、研究者が除きたいＣＯＰの処理工程で
ある

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、制限
酵素による消化を必要とせず、１つの試薬混合物におい
て核酸を増幅させる変異核酸の特異的な検出のための簡
単な方法を提供することである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヌクレオチド
配列が少なくとも１つの位置(Ｘ)で異なる変異核酸の検
出方法を提供する。該方法は、ハイブリダイゼーション
のために充分な条件下、ヌクレオチド配列が位置Ｘに対
応する位置で異なる一組のオリゴヌクレオチドと検出さ
れるべき核酸とを反応させ、検出されるべき核酸を鋳型
として使用して、ハイブリダイゼーションによって付加
したオリゴヌクレオチドを伸長し、次いで該伸長産物を
検出する３つの工程からなり、これによって該一組のオ
リゴヌクレオチドが少なくとも１つの他の位置(Ｙ)で相
違しなければならない。

【００１２】また、本発明は、一組のオリゴヌクレオチ
ド、試薬キットならびに該方法の種々の応用および使用
を提供する。

【００１３】本発明の類似核酸または密接に関連してい
る核酸はヌクレオチド配列が実質的に同一であるが、そ
れらのヌクレオチド配列の少なくとも１つの位置で異な
る核酸である。本明細書では、この位置をＸと記す。本
発明の課題対象物がいくつかの差異を含む場合、それら
はＸ１、Ｘ２、・・・ＸＮと記されるであろう。このよう
な差異は、例えば点突然変異（例えば、いくつかの塩基
が他のものと置換される）の結果として生じるか、ある
いは１またはいくつかの塩基の欠失または挿入によって
生じるであろう。お互いに類似している核酸は、通常、
対立遺伝子と称される。

【００１４】重要な点突然変異は、例えば、ＬＤＬレセ
プターにおいて[アーティリオウスクリロウシス（Ａrte
riosklerosis）(１９８９)、９：１−８〜１−１３]ま
たはアポリポ蛋白−Ｂ−遺伝子において[コドン３５０
０のＣＧＧ→ＣＡＧ突然変異；プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユ
ーエスエイ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）(１９８
９)８６：５８７−５９１]、ＨＩＶウイルスのリバース
トランスクリプターゼの遺伝子において[コドン２１５
におけるＡ→Ｔ突然変異；サイエンス（Ｓcience）(１
９８９)２４６：１１５５−１１５８]および鎌状赤血球
貧血の場合のβ−グロビン遺伝子において[コドン６に
おけるＡ→Ｔスイッチ]見ることができる。さらにま
た、類似核酸は、関連微生物、例えば、細菌およびウイ
ルスにおいて見られる（血清突然変異体）。いくつかの
細菌菌株の核酸では、それらのリボソーム遺伝子および
それらのｒＲＮＡの配列において非常に高い類似性が見
られる。本発明で定義されるような変異核酸は検出され
るべき核酸と類似している対照核酸を含む。位置Ｘは多
型部位(polymorphous site)とも称される。検出される
べき核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。細菌の診断
にはｒＲＮＡが特に適していることが証明された。

【００１５】初期標的なる語を使用して、試料中に含有
される核酸を表示する。産物標的なる語は、初期標的の
使用による産物であるこれらのポリヌクレオチドを表
す。産物標的は標的核酸として使用され、通常、初期標
的よりも小さい。

【００１６】本明細書に記載の２つの核酸および／また
は対立遺伝子の検出は、同様に、位置Ｘにある差異に無
関係な適当なオリゴヌクレオチドによる核酸（例えば、
ありとあらゆる対立遺伝子）の検出に適用する具体例を
表す。

【００１７】位置なる語は核酸の所定部位を表す。この
ような位置は、例えば、ヌクレオチドによって占領され
ていてよい。

【００１８】ヌクレオチドは規則的なワトソン／クリッ
ク型塩基対が保証される場合に相補的であると称される
（例えば、Ｇ−Ｃ、Ａ−ＴまたはＡ−Ｕ）。この相補的
塩基対は適合となるが、非相補的塩基対はミスマッチと
なる。

【００１９】このような塩基対を生じるいずれの他の塩
基または塩基アナログ（例えば、７−デアザ−ｄＧＴ
Ｐ、ｄＩＴＰ）も相補的であると称される。

【００２０】本発明の方法の実施のためには、検出され
るべき核酸はイン・ビトロ反応に適している形態で存在
しなければならない。試験されるべき試料、例えば、組
織、個々の細胞または細胞含有液は細胞壁を破壊するた
めに公知の方法（例えば、熱溶解、酵素溶解もしくは化
学的溶解またはそれらの組合せ）で消化される。

【００２１】核酸が一本鎖として存在しない場合、それ
らは公知の方法で（例えば、熱またはアルカリ変性、鎖
の酵素的分離、またはある塩条件下での二本鎖の不安定
性化によって）この形態に変換される。

【００２２】次いで、該試料を一組のオリゴヌクレオチ
ドと接触させる。選択された条件は、本発明のオリゴヌ
クレオチドが検出されるべき核酸の対応する領域とハイ
ブリダイズするようなものである。このハイブリダイゼ
ーションは一般にアニーリングとして知られている。不
適切な核酸、すなわち検出されるべきではない核酸との
ハイブリダイゼーションは、適当なヌクレオチド配列、
長さ、温度、補助薬などを選択することによって回避さ
れる。

【００２３】本発明の一組のオリゴヌクレオチドにおけ
る異なるヌクレオチドの数は、少なくとも検出されるべ
き異なる核酸の数に相当する。故に、２つの異なるヌク
レオチドの検出は、少なくとも２つの異なるオリゴヌク
レオチド（およびできる限りは相補的オリゴヌクレオチ
ド）を必要とする。使用されるオリゴヌクレオチドは、
好ましくは１００ｎｔ未満の長さ、より好ましくは５〜
５０ｎｔの長さを有する。各オリゴヌクレオチドは、ヌ
クレオチドＸに隣接する領域に関して、このオリゴヌク
レオチドが検出されるべき核酸とハイブリダイズするこ
とができるほど非常に相補的であるヌクレオチド配列１
つを有する。しかしながら、本発明の一組のオリゴヌク
レオチドの配列は非常に特異的な差異を示す。

【００２４】一組のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド
配列における１つの差異は、ハイブリダイゼーションの
後に、核酸の位置Ｘに対応する位置にあり得る。この差
異は別の塩基または塩基アナログによる置換の結果であ
るか、あるいは欠失／挿入によって生じ得る。

【００２５】本発明では、「適合」−オリゴヌクレオチド
なる語は、検出されるべき核酸の位置Ｘで見られるヌク
レオチドと相補的であるヌクレオチドを位置Ｘに有する
１つのオリゴヌクレオチドを表す。該オリゴヌクレオチ
ドと適合する核酸（伸長のために使用する）を標的核酸
と称する。「ミスマッチ」−オリゴヌクレオチドなる語
は、位置Ｘのヌクレオチドが試験されるべき核酸の位置
Ｘのヌクレオチドと相補的ではないものであるオリゴヌ
クレオチドを表す。

【００２６】選択される本発明の方法の変形によると、
ヌクレオチドＸは、オリゴヌクレオチドの所定位置、例
えば、オリゴヌクレオチドの中央または末端に位置す
る。まず第１に、本発明の方法は競合プライミングの原
理に基づく方法の改良である（以下、変形１と記す)。
第２に、ＥＰ−Ａ−０３３２４３５に記載されたミスマ
ッチ−プライミング法および関連方法の改良である（以
下、変形２と記す)。しかしながら、適用された変形と
は無関係に、核酸の検出で使用された各オリゴヌクレオ
チドは、核酸の位置Ｘで見られるヌクレオチドと一致
し、かつ相補的であるヌクレオチドを有する。故に、こ
のオリゴヌクレオチドの位置Ｘには、試料中に含有さ
れ、かつ位置Ｘに関して異なる残りの核酸の対応するヌ
クレオチドと相補的でないヌクレオチドが存在する。

【００２７】本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも
もう１つの位置Ｙで相違する。これは、オリゴヌクレオ
チドの配列における他の塩基もしくは塩基アナログとの
置換および／または欠失／挿入によって達成され得る。
本発明の一組のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ、
好ましくは各々は、位置Ｙに、試験されるべき核酸の対
応するヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドを有す
る。本発明の方法を最適に行うためには、一組のオリゴ
ヌクレオチドの位置Ｙの位置選定は位置Ｘの位置選定と
は相対的に異なる。変形１について、オリゴヌクレオチ
ドのＹの位置選定は決定的に重大なものというわけでは
ない。故に、自由に選択され得る。

【００２８】変形２では、位置Ｙの好ましい位置選定は
オリゴヌクレオチドの３'末端のヌクレオチド位置Ｘの
付近である。位置ＹはＸから、好ましくは１〜８ヌクレ
オチド、より好ましくは１〜３ヌクレオチド離れてい
る。１つのオリゴヌクレオチドのＹが末端ヌクレオチド
(位置Ｘ)に続くヌクレオチドであり、他のオリゴヌクレ
オチドのＹが末端から２または３ヌクレオチド離れてい
るヌクレオチドである場合に望ましいことが判明した。
（３つの類似核酸の検出のための)もう１つのオリゴヌ
クレオチドにおいては、非相補的ヌクレオチドは、例え
ば、末端ヌクレオチドから２または３ヌクレオチド離れ
ていてもよかった。

【００２９】本明細書において、一組のオリゴヌクレオ
チド１、２、・・・Ｎの位置ＹはＹ１、Ｙ２、・・・ＹＮと表
される。また、位置Ｙのヌクレオチドの定義と適合する
ヌクレオチドが各オリゴヌクレオチドの１以上の位置に
あることが可能である。好ましくは、オリゴヌクレオチ
ドはこのようなヌクレオチドを１〜５つ有する。

【００３０】故に、使用される好ましい１組のオリゴヌ
クレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドを少なくと
も２個有するものである。これらのオリゴヌクレオチド
は、少なくともＸと対応するヌクレオチドにおいて、お
よび２つの別のヌクレオチドにおいて、相違しなければ
ならない。オリゴヌクレオチドにおける非相補的ヌクレ
オチドのこの配置の結果、この組のもう１つのオリゴヌ
クレオチドと一緒に位置Ｘにおけるヌクレオチドにおい
てただ１つの差異を有する伸長産物が後で行われる伸長
反応のいずれの相でも、例えばＥＰ−Ａ−０２００３６
２から公知のＰＣＲでも生産されない。しかしながら、
第２の異なるヌクレオチド位置を維持することは、ＥＰ
−Ａ−０３３２４３５から知られているように非常に重
要なことである。一組のオリゴヌクレオチドは、位置Ｙ
を除いて、試験されるべき核酸の共通配列と相補的であ
るヌクレオチド配列の少なくとも１つの共通断片を有す
る。好ましくは、これらの断片は、オリゴヌクレオチド
の長さの５０％を超える長さからなる。

【００３１】オリゴヌクレオチドの試験されるべき核酸
へのハイブリダイゼーションの後、生じるハイブリッド
は伸長反応に供せられる。この種の好ましい伸長反応は
３'---５'方向のモノヌクレオチドのオリゴヌクレオチ
ドへの付加である。これらのモノヌクレオチドは初期標
的核酸の対応するヌクレオチドと相補的である。伸長
は、伸長方向の末端ヌクレオチドであるハイブリダイズ
されたオリゴヌクレオチドのヌクレオチドが１つの核酸
の対応するヌクレオチドと相補的である場合(適合)およ
びその化学的構造が伸長される場合に生じるのが好まし
い。ポリメラーゼおよびモノヌクレオチドによってこの
ような鎖を伸長するための反応条件は、例えば、ＥＰ−
Ａ−０２０１１８４またはＥＰ−Ａ−０３３２４３５か
ら知られている。

【００３２】さらに、このような伸長は、もう１つのオ
リゴヌクレオチドを既にハイブリダイズされた適合−オ
リゴヌクレオチドに連結することによっても行うことが
できる。ハイブリダイズされるべきオリゴヌクレオチド
は、適合−オリゴヌクレオチドがすでにハイブリダイズ
されている断片に続く核酸の一本鎖領域と実質的に相補
的でなければならない。このタイプの伸長はリガーゼ反
応で行うことができる。この種の伸長反応は、例えば、
プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Ｐroceedings
of the Ｎatl.Ａcad. of Ｓciences ＵＳＡ）(１９９
１)、８８：１８９−１９３またはＷＯ８９／０９８３
５に開示されている。本発明を適用し得る他の増幅方法
としては、修復連鎖反応（Ｒepair Ｃhain Ｒeaction）
（ＷＯ９０／０１０６９）、ＤＥ−Ａ−４０１０４６５
の方法およびＷＯ９１／０３５７３から知られている方
法の第１段階が挙げられる。

【００３３】変形１では、試験されるべき核酸にハイブ
リダイズされた全てのオリゴヌクレオチドが伸長され
る。しかしながら、１つの核酸のミスマッチ−オリゴヌ
クレオチドＰ１は少なくとも２つのミスマッチ−ヌクレ
オチド(Ｘ、Ｙ１)を有するので、位置Ｘに適合−ヌクレ
オチドを担持する適合−オリゴヌクレオチドＰ２ほど良
好ではない競合条件下でこの核酸とハイブリダイズす
る。これは、２つの競合するオリゴヌクレオチドの位置
Ｙが、それらの競争が位置Ｘに存在する個々の塩基によ
って決定されるように（Ｙ位置で見られる差異によって
ではない）選択されるという条件に基づく。変形１で
は、該オリゴヌクレオチドは、初期標的上でハイブリダ
イズされた場合、お互いに相殺されるであろう。しかし
ながら、位置Ｘおよび、好ましくは位置Ｙは、共通領域
に位置するのが好ましい。故に、伸長反応の主産物は適
合−オリゴヌクレオチドの伸長に基づく核酸である。

【００３４】変形２では、ミスマッチ−オリゴヌクレオ
チドは検出されるべき個々の核酸にハブリダイズするこ
とができる。しかしながら、適合−オリゴヌクレオチド
だけが伸長される。

【００３５】変形２における伸長反応の特異性について
予め必要な条件は、伸長反応をもたらす酵素がオリゴヌ
クレオチドの伸長を触媒することである。この方法は、
ミスマッチが存在するか否かにほとんど無関係に生じな
ければならない。これらの予め必要な条件は、例えば、
サームス・アクアティクス(Ｔhermus aquaticus)−ＤＮ
Ａ−ポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ−０２５８０１７）または
イー・コリ(Ｅ.coli)−リガーゼを使用する場合に満た
される。

【００３６】試験されるべき核酸にハイブリダイズされ
るべきオリゴヌクレオチドの両外端部間に配置された断
片を、実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド（相補
的オリゴヌクレオチド）と得られた伸長産物とを反応さ
せることによって増幅し、次いでハイブリダイズさせ
る。これらのオリゴヌクレオチドは第１工程で得られた
伸長産物を鋳型として伸長される。通常、位置Ｘは伸長
の断片に配置される。相補的オリゴヌクレオチドは検出
されるべき全ての核酸について同一であり得るが対立遺
伝子−特異性でもある。

【００３７】この伸長も、モノヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチドを添加することによって行われ得る。

【００３８】本発明のオリゴヌクレオチドが位置Ｘだけ
ではなく２つのさらなる位置においても相違する場合、
第２の伸長反応（以下、サイクル２と記す）によって、
ハイブリダイゼーションによって得られたものを除く他
の全てのオリゴヌクレオチドに関して少なくとも３つの
（すなわち、初期よりも多い）非相補的ヌクレオチドを
有する産物が得られる。これは、この時点でのミスマッ
チ−オリゴヌクレオチドの伸長をより困難にする。同様
に、さらなるＹ位置はより困難な個々の他の対立遺伝子
の増幅産物に間違ったアニーリングを行わせる。かくし
て、マッチングオリゴヌクレオチドの増幅産物のブロッ
キング、およびそれによる収率の減少は回避される。

【００３９】「図１」〜「図４」を引用し、公知の方法
のこれらの改良を以下に説明する。

【００４０】変形１の伸長反応の主産物は適合−オリゴ
ヌクレオチドの伸長に基づく核酸である。ミスマッチ−
オリゴヌクレオチドの、適合−オリゴヌクレオチドとの
ハイブリダイゼーションのサイクル２からの伸長産物へ
のハイブリダイゼーションは、すでに３つのミスマッチ
(Ｘ、Ｙ１、Ｙ２)が存在するので、実際は不可能であ
る。この状態を「図１」を例示する。成功した結果は、
実際には、適切なアニーリング温度を選択することによ
って達成される（所望により、オリゴヌクレオチド濃度
のような他の反応パラメーターを使用してもよい）。

【００４１】９０℃まで加熱し、例えば、その後、初期
標的上の両プライマーのＴ_M値以上の温度に徐冷し、次
いで、両プライマーのＴ_M値より有意に低い温度に徐冷
すると、確実に、対立遺伝子−特異的プライマーは最も
良く適合する標的にハイブリダイズする。該Ｔ_M値を、
標的配列の５０％がプライマーとハイブリダイズされる
温度と定義する。この温度では、結合したマッチングオ
リゴヌクレオチドも再度素早く放出され得る(平衡状
態)。同一標的上であまりよく適合しないオリゴヌクレ
オチドのＴ_M値はより低い。これは、この低いＴ_M値で
は、あまりよく適合しないオリゴヌクレオチドが該標的
に結合されないと思われるが、５０％を超えて結合して
いるマッチングオリゴヌクレオチドによって置換される
であろうということを意味する。温度が適当である場
合、両対立遺伝子はアニーリングされる。オリゴヌクレ
オチド／標的結合物[「図１」の(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)、
(Ｄ)]のＴ_M値と比較すると、完全に相補的である標的結
合物[「図１」の(Ｅ)、(Ｈ)]のＴ_M値は有意に上昇す
る。というのは、ＰＣＲ産物の増幅の間のにさらなる突
然変異によってミスマッチングが生じ、前者の結合物に
ついてのＴ_M値を低下させるからである。それとは反対
に、１つのオリゴヌクレオチドが非マッチング対立遺伝
子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド／ＰＣＲ産
物標的結合物[「図１」の(Ｆ)、(Ｇ)]のＴ_M値は初期標
的の値よりもさらにまた有意に低い。というのは、本発
明で選択された両オリゴヌクレオチド由来のさらなる突
然変異が蓄積されるからである。故に、ＰＣＲ産物の増
幅の特異性はさらにまた増大する。ＰＣＲにおけるアニ
ーリングについて選択された温度が完全に相補的な結合
物のＴ_M値以下である場合、ＰＣＲ産物(Ｆ)、(Ｇ)また
は初期鋳型(Ｂ)、(Ｃ)への間違ったアニーリングは実質
的に排除される。変形１の公知のＣＯＰ法よりも優れて
いる点は、続くサイクルにおける温度制御によって全く
またはほとんど示差を必要としないことである。さらに
また、ゲノム核酸は予備増幅せずに検出され得る。

【００４２】ここに記載した変形は、特に複合分析に適
している。ＰＣＲに先立つアニーリング工程では、突然
変異のためのＴ_M値および対応するプライマーが得られ
るだけではなく、全てのオリゴヌクレオチドも選択的に
アニーリングされ得る。というのは、それらがある範囲
内で徐冷されるからである。この範囲は最高のＴ_M値以
上で始まり、最低のＴ_M値以下に達する。

【００４３】「図２」〜「図４」を引用して第２の変形
を説明する。オリゴヌクレオチドの３'−末端ヌクレオ
チドが位置Ｘに対応するこの変形は、より高い選択性を
有するので好ましい。これは、そのより高い選択性のた
めに、しばしば、ミスマッチオリゴヌクレオチドがハイ
ブリダイズするか否かは問題ではないという事実によ
る。

【００４４】この原理は以下の実施例を用いて説明され
得る。ただ１つの反応容器は１つの遺伝子の２つの対立
遺伝子を同時に検出するためのＰＣＲ用試薬混合物を含
有する。これらの対立遺伝子は、１つの塩基位置で異な
る（ここで、塩基Ｍ(突然変異体)が１つの対立遺伝子に
あり、塩基Ｎ(正常体)が他の対立遺伝子にある)。該反
応において、３つのプライマー、相補的プライマー１つ
および２つの対立遺伝子のうちの１つだけについて各々
選択的であるプライマー２つを使用する。１つの選択的
プライマーの３'−末端の塩基がＭと相補的であり、他
のプライマーの塩基がＮと相補的であるというプライマ
ー選択性が生じる。２つの対立遺伝子−選択的プライマ
ーは、例えば、２つのさらなる置換によって区別され、
これによって、この２つのプライマーの各々が個々の選
択的対立遺伝子に対する１つのミスマッチおよび他の対
立遺伝子に対する２つのミスマッチを有するように１つ
の鋳型ミスマッチが各プライマーにおいて生じる。さら
にまた、得られたＰＣＲ産物を容易に区別するために、
例えば、異なる長さの対立遺伝子−特異的プライマーを
選択することができる。これらの変化（alterations）
は、個々のＰＣＲ産物に取込まれ、その結果、ＰＣＲの
間に対立遺伝子−選択的プライマーの１つから得られる
その産物はこのプライマーに対して初期標的と比較して
改良された（すなわち、完全に相補的な）標的となる。
さらにまた、他の対立遺伝子−選択的プライマーが変化
した標的（altered target）に関して３つのミスマッチ
を有するので、もはやそれは該プライマーに適している
標的ではない。故に、該プライマーによる間違った対立
遺伝子選択は、実質的に、初期標的へのアニーリング、
および／または、プライマーの次なる伸長における基礎
とされる。さらなる変化のために、利用可能なＰＣＲ産
物の次なる増幅が別々に生じる。

【００４５】「図２」は、実施例で使用したオリゴヌク
レオチドの相対的な位置を示す(３'末端で位置１)。該
実施例は、アポリポ蛋白−Ｂ−遺伝子[プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ・ユーエスエイ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad. of Ｓcience
s ＵＳＡ）(１９８９)、８６：５８７−５９１]の２つ
の対立遺伝子の検出を示す。

【００４６】Ｐ２の位置２８のＹ位置(Ｙ３：Ｃ、ミス
マッチ)および位置２９のＹ位置(Ｙ４：Ｃ、ミスマッ
チ)でのさらなる差異がオリゴヌクレオチドＰ１および
Ｐ２に含まれており、１つの反応で個々の対立遺伝子の
増幅をさらに分離する。以下において適合およびミスマ
ッチなる語は正常な対立遺伝子の配列に適用される。

【００４７】オリゴヌクレオチドＰ１：Ａｓａ短い（２
９塩基）：配列番号１ 位置Ｘのヌクレオチド：Ｔ（選択的突然変異体） 位置２(Ｙ１)のヌクレオチド：Ｇ（ミスマッチ） 位置４(Ｙ２)のヌクレオチド：Ｇ（適合） オリゴヌクレオチドＰ２：Ａｓａ長い（４９塩基）：配
列番号２ 位置Ｘのヌクレオチド：Ｃ（選択的正常体） 位置２(Ｙ１)のヌクレオチド：Ｃ（適合） 位置４(Ｙ２)のヌクレオチド：Ｔ（ミスマッチ） オリゴヌクレオチドＰ３：相補的プライマー：配列番号
３ 鎖に対して完全に相補的 オリゴヌクレオチドＰ'２：Ａｓａ長い（４９塩基）：
配列番号４ 位置Ｘのヌクレオチド：Ｃ（選択的正常体） 位置２(Ｙ１)のヌクレオチド：Ｇ（ミスマッチ） 位置４(Ｙ２)のヌクレオチド：Ｇ（適合）

【００４８】「図３」は、本発明のオリゴヌクレオチド
Ｐ１およびＰ２が１つの試薬混合物での増幅のために使
用されることを条件としたＰＣＲの最初の３サイクルの
結果を示す。オリゴヌクレオチドＰ１の３'−末端の最
後の塩基は突然変異対立遺伝子と適合し、オリゴヌクレ
オチドＰ２の３'−末端の最後の塩基は正常な対立遺伝
子と適合する。その結果、「図３」で(Ｂ)および(Ｃ)と
記号を付したプライマー／鋳型結合体のプライマーが伸
長される。核酸(Ｆ)および(Ｇ)はこの反応の産物であ
る。(Ｂ)および(Ｃ)で星印(＊)を付した差異（ミスマッ
チ）は該プライマーの伸長を完全には妨害しない。第２
のＰＣＲサイクルの間、伸長産物と正確に相補的である
鎖（(Ｉ)および(Ｋ)、上部配列）が形成される。これら
の新しく生じた産物は個々の他のオリゴヌクレオチドと
ハイブリダイズして産物(Ｏ)および(Ｌ)を形成すること
ができるが、これらのハイブリッドに存在する３つのミ
スマッチのために伸長反応が生じない。しかしながら、
伸長反応は産物（Ｍ）および（Ｎ）から対応するオリゴ
ヌクレオチドによって生じる。

【００４９】「図４」はオリゴヌクレオチドＰ１および
Ｐ２が異なる場合には、二次反応が標的感受性を非常に
低下させるので非相補的ヌクレオチドの位置Ｙが同一で
あってはならないことを示す。「図４」で示した場合、
２つのオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２'の各々は伸
長方向の末端の最初の２つの位置にミスマッチを有す
る。第２サイクルで形成されたＰＣＲ産物が個々の他の
オリゴヌクレオチドに対するミスマッチを１つだけ有す
ることは明らかである（産物ＯおよびＬ）。これらの産
物の伸長は、該産物がミスマッチを１つだけ有するので
特異性を低下させ得る。故に、公知の方法を用いて、充
分な特異性で１つの試薬混合物において両対立遺伝子を
決定することは可能ではない。

【００５０】変形２では、ＣＯＰから知られているよう
にオリゴヌクレオチドの核酸へのさらなる示差ハイブリ
ダイゼーションによって検出の特異性をさらに増大させ
ることができる。ここに記載した変形２の具体例では、
オリゴヌクレオチドはほぼ同一の効率で検出されるべき
全ての核酸とハイブリダイズする。しかしながら、該オ
リゴヌクレオチドが位置Ｙにおけるさらなる差異（例え
ば、ミスマッチ）を示す場合、増幅の特異性および収率
は、例えばＰＣＲにおけるオリゴヌクレオチドの検出さ
れるべき核酸へのハイブリダイゼーションに適切な温度
（温度は検出されるべき核酸および対応するオリゴヌク
レオチドからなるハイブリッドのＴ_M値以下である）を
選択することによって増加させることができる。これら
のさらなるＹ位置の配置選定は、例えば３'−末端付近
のある断片に制限されず、オリゴの如何なる位置も自由
に選択できる。Ｙ−位置の限定はオリゴヌクレオチドを
区別するための決定因子である。各オリゴヌクレオチド
における変化は個々の適合産物および相補鎖の対応する
産物に取込まれ、適当な温度を選択すると、それらは個
々の他のオリゴヌクレオチドを間違った産物標的に一層
アニーリングさせにくくする。したがって、ミスマッチ
−オリゴヌクレオチドは適合−オリゴヌクレオチドの該
産物へのアニーリングをほとんど妨げることができな
い。故に、増幅は別々に生じ、間違ったアニーリングを
妨げることによって増幅率の低下が排除される。

【００５１】特に変形２のさらなる具体例では、該ヌク
レオチド配列において２以上の変化（多型部位、Ｘ１、
Ｘ２、・・・・・ＸＮ）を有する２以上の核酸を検出でき
る。同様に、ヌークリイック・アシッズ・リサーチ（Ｎ
ucl.Ａcids Ｒes.）(１９８８)第１６巻、２３：１１１
４１−１１１５１に開示された方法を使用することがで
きる（複合法）。

【００５２】本発明はいくつかの可能性を提案する。第
１の具体例においては、多型部位は本発明の独立した課
題である。本発明は、種々の核酸上にある検出されるべ
き多型部位と同じくらい多くのオリゴヌクレオチドを使
用する。故に、２つの核酸上の２つの多型部位は本発明
の４つのオリゴヌクレオチドＰ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ５か
らなる一組の使用を必要とする。このような場合を「図
８」に示す。相補鎖の２つのプライマーによって制限さ
れる増幅領域は重複しないが、好ましくは長さが異な
る。これによって別々に検出される。別法として、プラ
イマーＰ６を省略できる。そのとき、相補鎖プライマー
Ｐ３は両多型部位についての増幅において使用される。

【００５３】第２の具体例は、異なる部位に属する本発
明のオリゴヌクレオチドの組は検出されるべき核酸の異
なる鎖とハイブリダイズするであろうという原理に基づ
いている（「図９」)。この実施例において、増幅断片
が重複し、これによって（オリゴヌクレオチドＰ１、Ｐ
２、Ｐ４およびＰ５の重複断片の）Ｙ−位置を同様に使
用することによって、両多型部位の増幅を確実に別々に
生じさせることが可能である。この場合も、４つのオリ
ゴヌクレオチド（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４およびＰ５）ならび
に２つの相補鎖プライマーが必要である。

【００５４】いくつかの多型の検出方法が結合される第
３の好ましい具体例では（「図１０」)、本発明のオリ
ゴヌクレオチドがそれだけで作用するので、相補鎖プラ
イマーは必要ではない。これは、対応する対立遺伝子の
存在によって４つの異なる増幅産物を形成および検出す
る簡単な方法である。故に、突然変異のシス／トランス
−位置の直接的な決定も可能である。

【００５５】同様に、上記具体例は２つより多い多型部
位について使用され得る。

【００５６】特に好ましい具体例は、以下に非常に詳細
に引用記載するＰＣＲ（ＥＰ−Ａ−０２０１１８４）を
用いる。変異核酸の検出は、本発明の一組のオリゴヌク
レオチドによるプライマーの置換を必要とする。増幅に
ついての残りの反応条件、特に相補鎖プライマーの使用
は、同様に適用する。

【００５７】リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、ＥＰ−Ａ−０
３２０３０８）も本発明において改良され得る。この改
良は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの代わりに
本発明の一組のオリゴヌクレオチドを使用する。「図１
３」は、交差産物のミスマッチの数が増加することを示
す。

【００５８】Ｙの位置によって、間違ったオリゴヌクレ
オチドの伸長および／またはアニーリングは非常に抑制
される。この具体例では、位置Ｘは１つのオリゴヌクレ
オチドの３'−末端、または他のオリゴヌクレオチドの
５'−末端に位置してよい。原則的には、Ｘがオリゴヌ
クレオチドの中央に位置する場合のＬＣＲはＣＯＰ法と
同様に行われ得る。これらは、Ｙに対応する位置にある
ヌクレオチドが本発明のオリゴヌクレオチドのＹ位置の
ヌクレオチドのいずれとも相補的ではない相補鎖オリゴ
ヌクレオチドであるのが好ましい。

【００５９】しかしながら、ＥＰ−Ａ−０３１０２２
９、ＥＰ−Ａ−０３２９８２２またはＥＰ−Ａ−０３７
３９６０の方法から知られているようにプロモーター−
活性化、循環的に配置される増幅反応において本発明の
改良を使用することができる。これらの文献の内容を引
用記載する。これらの増幅法では、プロモータープライ
マーは、プロモータープライマーの助けをかりてさらに
また増幅される多くの産物標的（ＲＮＡ）を形成するの
に供される。

【００６０】試料中の検出されるべき核酸の存在または
量の尺度である伸長産物の特異的な検出は、例えば、使
用したオリゴヌクレオチドがもう１つの特徴によって識
別されるという事実を利用することによって可能であ
る。このような識別は、例えば、一組のオリゴヌクレオ
チドの様々な長さである。異なるオリゴヌクレオチドの
伸長は異なる長さの産物を生産した。さらに、オリゴヌ
クレオチドは別々に検出可能な基Ｄを有することによっ
て区別され得る。このような検出可能なＤ基は、例え
ば、検出可能な基Ｄの助けをかりて次なる反応で検出さ
れ得る色素または蛍光分子である。この種の化学的基と
しては、例えば、ジゴキシンおよびジゴキシゲニンのよ
うなハプテンが挙げられる。ハプテンは、該ハプテンに
対する標識抗体とそれらとの反応によって検出され得
る。次いで、該標識を検出する。もう１つのハプテン
は、例えば、別々に標識された抗体またはストレプトア
ビジン（streptavidin）を使用することによって検出さ
れ得るビオチンであってよい。

【００６１】検出されるべき核酸の量および存在につい
ての尺度である種々の伸長産物は様々な方法で検出され
得る。それらは、試薬混合物を分離した後、または試薬
混合物が得られたすぐ後に、あるいは適当な標識を使用
することを条件として、公知の方法に従って同時に別々
に検出される。ＥＰ−Ａ−０３２４４７４に開示されて
いる方法は、マーカーとしてステロイドホルモン類の使
用について好ましい方法であることが証明された。他の
方法は種々の蛍光色素の使用である。オリゴヌクレオチ
ドを直接標識し得るか、あるいは化学的基に対する抗体
に、例えば、対応する蛍光標識を供給し得る。種々の対
立遺伝子産物を、いくつかのチャンネルにおける蛍光を
同時に測定することによって検出できる。また、該産物
の一部分は蛍光標識で標識され得るが、一方、同一の試
薬混合物からの他の産物について酵素が使用され得る。
原則的には、いずれの公知の標識化および検出方法を使
用することもできる。

【００６２】逐次または同時検出において、２つの異な
る化学的基、好ましくは異なる抗体によって検出される
ハプテンを使用して、例えば２つのオリゴヌクレオチド
を標識することができる。このようなハプテンとしては
ジゴキシゲニン、ビオチン、およびフルオレセインが挙
げられる。好ましくは、フルオレセインに対する抗体お
よびジゴキシゲニンに対する抗体は標識として異なる酵
素を有する。核酸は、酵素−特異的検出可能基質と逐次
または同時に接触させることによって検出される。伸長
産物の検出のための別法を「図５」〜「図７」に示す。

【００６３】一般的な伸長反応の混合物を「図５」(左)
に示される具体例の変性反応に供する。捕獲プローブを
使用して、固定されるかまたは基Ｉ(例えば、ビオチン)
を介して固定可能である固相（Ｆ）に一本鎖伸長産物を
結合する。この方法では、該反応の伸長産物は検出され
るべき全ての核酸と一緒に固定される。種々の検出可能
な基によって、該核酸は逐次検出され得る（洗浄工程に
よって分離される）。検出されるべきシクナルを１つの
容器中で同時に産生および検出し得る場合、このような
洗浄工程は省略できる。

【００６４】「図５」の右側に示される変形では、伸長
反応が生じた後、試薬混合物から少なくとも２つの（ま
たは検出が２つより多い対立遺伝子を含む場合、および
２つより多い標識化酵素を使用する場合は、対応して２
つより多い）充分な液体の微量試料を採取し、伸長産物
について各微量試料を試験する。該微量試料を複合反応
から採取し、オリゴヌクレオチドに対して使用された異
なる標識の数によって、各微量試料中の増幅産物の対応
する数が検出され得る。

【００６５】「図６」は固定化基で修飾されたモノヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチドが伸長反応の間に取
込まれる方法を示す。次いで、該伸長産物は固相に直接
（捕獲プローブを分離せず、かつ変性させずに）結合し
得る（ＤＥ−Ａ−４００１１４５と同一）。「図５」に
示すように、同時、逐次または平行して検出可能であ
る。

【００６６】「図７」の具体例は、検出されるべき種々
の核酸に関する伸長産物が少なくとも３つのヌクレオチ
ドで相違するという事実に基づく。このことは、捕獲プ
ローブによる選択的な固定化のために利用される。検出
可能な基Ｄは修飾されたモノ−またはオリゴヌクレオチ
ドを取込むことによって導入される。この基は両対立遺
伝子の伸長産物について同一であり得る。変形２におい
て詳述したように核酸の増幅が行われる場合、変化Ｙは
Ｘ付近に位置し、捕獲プローブはオリゴヌクレオチド配
列の一部分および伸長配列の一部分と同一であるように
選択され得る。これは、同時に、正しい伸長産物（加工
品は伸長配列を欠いている）および種々の対立遺伝子の
選択に供せられる。

【００６７】他の考えられる具体例としては、取込まれ
たオリゴヌクレオチドを介する選択的固定化が挙げられ
る。各対立遺伝子に対して、これらのオリゴヌクレオチ
ドはもう１つの固定可能な基を有する。次いで、取込ま
れた検出可能なモノヌクレオチド、取込まれた検出可能
な相補鎖プライマーを介して、または検出プローブによ
って検出が行われ得る。

【００６８】種々の長さのオリゴヌクレオチドを使用す
る場合、好ましい検出方法はゲルクロマトグラフィーに
よる増幅領域（該オリゴヌクレオチドを含む）と同一の
長さを有する伸長産物の分離である。次いで、ゲル（例
えば、臭化エチジウム色素）における分離の直後、標識
したオリゴヌクレオチド、モノヌクレオチドの取込みの
直後、または標識プローブとのハイブリダイゼーション
の直後に検出を行う。電気泳動移動度は、例えば、５'
末端でビオチンによってオリゴヌクレオチドを標識化す
ることによって変えられる。増幅の後、該産物の微量試
料をストレプトアビジンと一緒にインキュベートする；
ストレプトアビジンのビオチン標識産物への結合は全産
物の電気泳動移動度を有意に減少させるが、一方、他の
産物はその通常の移動度を維持する。

【００６９】変異核酸のうちの１つがプローブに含有さ
れない場合、対応するオリゴヌクレオチドを伸長するこ
とによって生じたシグナルは、好ましくはこの核酸につ
いて測定されない。故に、本発明の方法を使用して、変
異核酸の１つだけを検出できるか、またはすべての核酸
の不在を決定できる。

【００７０】１つの対立遺伝子由来の伸長産物が他の対
立遺伝子を検出するために使用されるオリゴヌクレオチ
ドと交差反応しないので、１つの試薬混合物中で、かつ
１つの反応容器中で、同時に変異核酸を検出することが
できる。該反応は、非相補的位置Ｙ（ミスマッチ）が種
々のオリゴヌクレオチドに関する核酸と同一である場
合、最適ではない。

【００７１】本発明の方法は、様々な適用において使用
される。例えば、１つだけの試験対象体（個々の診断）
から得られたプローブの対立遺伝子をある疾患（例え
ば、代謝障害）に関連付けることができる。

【００７２】さらにまた、その良好な特異性のために、
該方法は、プローブをプール−スクリーニングするアッ
セイにも適している。この原理によって、種々の試験対
象体の多くの個々のプローブが混合される。アポＢ ３
５００−遺伝子における欠失を診断すると、１つのプー
ルで６４プローブを結合させるのに適していることが判
明した。本発明の方法を用いて、プールに含有されたプ
ローブ中のこの欠失の存在または不在を決定することが
できる。確実な結果を有するプールからのいくつかの部
分的プールを本発明の方法で数回連続して試験する場
合、欠失している遺伝子を検出するのに（従来技術と比
較して）少数回の決定で充分である。

【００７３】本発明の方法において、この遺伝子が存在
するという条件で欠失していない遺伝子を同時に検出す
るのに特に優れていることが判明した。プールをスクリ
ーニングすると、突然変異産物を択一的に検出するのが
可能であるか、または突然変異対立遺伝子が存在しない
場合に正常な産物を検出するのが可能である。そのまま
で反応に対する対照として機能することに加えて、両対
立遺伝子の検出は検出されるべき核酸を定量化する手段
でもある。

【００７４】プール−スクリーニング法で使用されるプ
ローブが患者特異性ではなく特性がないので、これらの
方法は、特に疫学的関連性のある疾患、例えばＡＩＤＳ
ウイルスによる汚染率または例えば高コレステロール血
症、高血圧症または糖尿病の頻度（マス・スクリーニン
グ）の試験に使用され得る。これらの方法は対立遺伝子
の頻度を決定するのに供される。

【００７５】同様に、細菌の種診断に、場合によっては
ウイルス診断に適用する。特に関心ある領域は密接に関
連した病原性／非病原性種または菌株の同時検出に集中
する。さらに、本発明の方法は、公知のＡＴ−配列によ
って（遺伝子工学の法則に従って評価した）イー・コリ
（Ｅ.coli）Ｋ１２を確実に検出するのにも適してお
り、これによって、イー・コリの種々の菌株が区別され
る。故に、当該方法は環境条件の分析にも適用できる。

【００７６】本発明が従来技術よりも主に優れている点
は、実質的には関連二次反応を用いずに１つの容器に含
有された混合物において対立遺伝子化合物を同時に検出
することができることである。制限酵素による消化は必
要ではない。この目的は、個々の対立遺伝子の増幅工程
全てが同一容器中で生じるがそれらはほとんど別々に生
じる（交差反応は減少する)という事実によって達成さ
れる。

【００７７】また、本発明は、類似核酸とハイブリダイ
ズするのに適している少なくとも２つのオリゴヌクレオ
チドを含有する一組のオリゴヌクレオチドを提供するこ
とである。これらのオリゴヌクレオチドは、少なくとも
２つ、好ましくは３つの所定位置において、および好ま
しくはもう１つの構造的特徴において異なっていなけれ
ばならない。好ましいオリゴヌクレオチドは、差異が
３'−末端のヌクレオチド（位置Ｘに対応する）および
もう２つのヌクレオチドにあり、もう１つの構造的差異
によって区別されるものである。検出可能な構造的差異
は、オリゴヌクレオチドの異なる長さまたは検出可能な
もしくは固定化可能な基であり得る。該オリゴヌクレオ
チドは混合物状態で存在し得る。さらに、この混合物
は、本発明の一組のオリゴヌクレオチドの助けをかりて
核酸の増幅に必要なさらなるオリゴヌクレオチドを含有
し得る；それらは、特に、相補鎖オリゴヌクレオチドお
よびプライマーを含む。

【００７８】本発明の効果は、位置Ｙのヌクレオチドが
相違するオリゴヌクレオチドにおいても発揮される。し
かしながら、それらは、この位置からＸまでの距離がこ
の組のオリゴヌクレオチドにおける該距離と同一である
場合に、鋳型核酸のヌクレオチドと相補的ではない。こ
の効果は、１つのオリゴヌクレオチドだけが対応する核
酸と相補的でない位置Ｙのヌクレオチドを有する一組の
オリゴヌクレオチドでは低下する。本発明の一組のオリ
ゴヌクレオチドを使用して、本発明の方法の目的が達成
される。

【００７９】さらにまた、本発明は、核酸の検出用試薬
キットを提供するものである。該キットは、本発明の一
組のオリゴヌクレオチド、および、所望により、該オリ
ゴヌクレオチドの伸長に必要なさらなるオリゴヌクレオ
チドおよび補助薬からなる。さらに、該試薬キットはさ
らなるオリゴヌクレオチド、例えば相補鎖プライマーか
らなり得る。好ましくは、該キットは別々の容器に酵素
およびオリゴヌクレオチドならびに他の試薬を収容して
いる。

【００８０】さらにまた、本発明は、１つのプローブに
おける対立遺伝子の同時決定（例えば、ＤＮＡに基づく
移植抗原の分類化)、（患者モニターリングおよび治療
管理における）位相学的に密接に関連している感染因子
の同時決定のための本発明の方法の使用および密接に関
連している核酸の存在またはそれらの頻度に関するプロ
ーブのプールのスクリーニングにおける使用を提供する
ものである。さらに、突然変異の検出のための該方法の
適用も提供する。

【００８１】以下に、図面について簡単に説明する。

【００８２】「図１」は競合プライミングに基づく本発
明の方法を理論的に示す。

【００８３】「図２」は「図３」および実施例で使用さ
れるヌクレオチド配列の配置を示す。

【００８４】「図３」は３'−ミスマッチオリゴヌクレ
オチドの使用のための本発明の方法を示す。

【００８５】「図４」はミスマッチ−ヌクレオチドがオ
リゴヌクレオチドの末端付近の同一位置に共に配置され
る方法を示す。

【００８６】「図５」〜「図７」は本発明の方法の伸長
産物の検出に関する具体例を示す。

【００８７】「図８」〜「図１０」はいくつかの多型部
位の同時検出のために使用される本発明の方法を示す。

【００８８】「図１１」は実施例１で増幅されたプロー
ブの分析を示す。

【００８９】「図１２」は実施例２で増幅されたプロー
ブおよび負の対照の分析を示す。

【００９０】「図１３」は本発明の方法におけるＬＣＲ
の使用を示す。

【００９１】参照符のリストを以下に挙げる。 Ｉ 固定化基 Ｄ 検出基 Ｄ１、Ｄ２ 種々の検出基 Ｆ 固相 Ｐ１、Ｐ４ 本発明のプライマー１、４ Ｐ２、Ｐ５ 本発明のプライマー２、５ Ｐ２' 参照プライマー Ｐ３、Ｐ６、Ｐ７ 相補鎖プライマー Ｘ、Ｘ１、Ｘ２ 対立遺伝子位置 Ｙ１、Ｙ２ ミスマッチの位置

【００９２】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明を説明する。

【００９３】実施例１ １つの反応においてアポポリ蛋白遺伝子のコドン３５０
０におけるＣＧＧ→ＣＡＧ突然変異に関する両対立遺伝
子の検出 試料調製 ヒグチ法(Ｈiguchi method)[ニューヨークのストックト
ン・プレス、エイチ・エイ・エールリッヒ（Ｈ.Ａ.Ｅhr
lich）によって発行されたＤＮＡ増幅のためのＰＣＲ
法、原理および適用（ＰＣＲ Ｔechnology, Ｐrinciple
s and Ａpplication for ＤＮＡ Ａmplification）（１
９８９）、第３１頁〜第３８頁]の後、ＥＤＴＡ−血液
からヒトゲノムＤＮＡを単離した。ＤＮＡ溶液の最終容
量は使用したＥＤＴＡ−血液の容量と正確に一致する。
１マイクロリットル当たり平均７５００個の白血球か
ら、例えば、白血球１５０００個までを含有するプロー
ブ２マイクロリットルが得られる。故に、ＤＮＡ １０
０ｎｇまでが溶液２マイクロリットル中にあることが予
想される。ヒグチの後の方法が終了した後、該ＤＮＡを
１００℃まで加熱した。かくして、ＰＣＲに先立つ別の
変性工程はもはや必要ではない。

【００９４】ＰＣＲの助けによる本発明の増幅 ＧＥＮＥ−ＡＴＡＱ−Ｃontroller[ファルマシア（Ｐha
emacia）]を使用して、０.５ミリリットルの管(Ｓarste
dt Ｎo.７２６９９)中でＥＰ−Ａ−０２００３６２のＰ
ＣＲを行った。試薬混合物は以下の成分からなってい
た。

【００９５】ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ： 各々１０μＭ ＭgＣl₂： １ｍＭ Ｍg²⁺を含まない１０ｘ ＰＣＲ緩衝液： ６マイクロリ
ットル Ａsa短い（プライマーＰ１；９５.７ｎｇ／マイクロリ
ットル）、配列番号１： ０.６マイクロリットル Ａsa長い（プライマーＰ２；８１ｎｇ／マイクロリット
ル）、配列番号２：１マイクロリットル 相補鎖プライマーＰ３（９２.４ｎｇ／マイクロリット
ル）、配列番号４：０.６ Ｔａｑ−ポリメラーゼ（５単位／マイクロリットル、ベ
ックマン（Ｂeckmann）： ０.３マイクロリットル 全容量： ６０マイクロリットル １０ｘ ＰＣＲ緩衝液は、以下の成分からなっている：
１００ｍＭ Ｔris−ＨＣl pＨ８.３、５００ｍＭ ＫＣ
l、０.１％ゼラチン。

【００９６】温度間隔 ４５回（９５℃で１分、６５℃では１分、７２℃で１
分） ４回（６５℃で２分、７２℃で１分） １回（７２℃で５分） ＲＴに冷却

【００９７】伸長産物の検出 次いで、ＰＣＲ産物１０マイクロリットルを適用緩衝液
（スクロース４０％、ブロモフェノール・ブルー０.２
５％、キシレンシアノール０.２５％、０.１ＭＥＤＴＡ
pＨ８.０）２マイクロリットルと混合し、アガロース
ゲル中で電気泳動した。該ゲルはＮuＳieve ＧＴＧ（Ｆ
ＭＣ／バイオザイム（Ｂiozyme））３％、アガロースＮ
Ａ（ファルマシア）１％、１ ｘ ＴＡＥ、臭化エチジウ
ム０.５μｇ／ミリリットル；（５０ ｘ ＴＡＥ＝Ｔris
Ｂase ２４２ｇ、氷酢酸５７.１ミリリットル、０.５
Ｍ ＥＤＴＡ １００ミリリットル、pＨ８.０）からなっ
ていた。該ゲルを約５Ｖ／cmで０.５〜１時間走査す
る。カマック・リプロスター装置（Ｃamaq Ｒeprostar
equipment）を有するポラロイド（Ｐolaroid)６６７白
黒インスタントフィルムを使用して３００nmで蛍光を撮
影した。次いで、該写真を評価した。

【００９８】以下のプローブを分析して（「図１１」参
照）、対立遺伝子の完全な同定が対立遺伝子−選択的プ
ライマー２つを必要することを示した。 １： 長さの標準 ２： 異種の雌性試験対象体 ３： 同種の正常な雄性試験対象体および ４： クローン化された突然変異対立遺伝子、プローブ
３と同じ量（モル）

【００９９】該プローブを２つの対立遺伝子−選択的プ
ライマーＰ１、Ｐ２および相補鎖プライマーＰ３の助け
をかりて増幅した。予想通り、正常なプローブは１３４
ｂｐ産物を生産し、突然変異体プローブは１１４ｂｐ産
物だけを生産した。それらを比較すると、異種の雌性試
験対象体（「図１１」のレーン４）は、予想通りに両産
物を生産した。対立遺伝子−選択的プライマーのうちの
１つだけの使用は、それにもかかわらず鋳型が増幅され
たプライマーのうちの１つと長さが一致するＰＣＲ産物
を生じる。かくして、特に、正常な雄性試験対象体は突
然変異対立遺伝子と一致するバンド（レーン６）を生
じ、クローン化突然変異ＤＮＡは正常な選択的プライマ
ーの産物を生じる（レーン１０）。所定の試験条件下で
は、初期ＡＲＭＳ−コンセプト[シー・アール・ニュー
トン（Ｃ.Ｒ.Ｎewton）ら（１９８９）、ヌークリイッ
ク・アシッズ・リサーチ（Ｎucleic Ａcids Ｒesearc
h）１７：２５０３−２５１６]による増幅は、この場
合、対立遺伝子を区別するのに適していない。この場
合、ここに記載された本発明の使用だけは、遺伝子型を
正しくかつ完全に（レーン２、３）決定し、さらにま
た、両対立遺伝子は１つの試薬混合物において決定され
得る。

【０１００】クローン化ＤＮＡはベクターＧem３zf(−)
（アトランタ／プロメガ（Ａtlanta／Ｐromega））にお
けるＡpo Ｂ ｃＤＮＡ配列の位置１０５７３−１０７０
のからなる断片である。ＰＣＲ反応において該ＤＮＡを
加える前に、該ＤＮＡをＢamＨ１で直鎖化し、０.０６
ｐｇ／マイクロリットルに希釈した。この希釈された部
分はＤＮＡ分子約１５０００個／マイクロリットルを含
有する。この平均２マイクロリットルはＥＤＴＡ血液か
ら単離されたＤＮＡのＤＮＡ溶液２マイクロリットルと
ほぼ同一の量のＡpo Ｂ配列を含有する。

【０１０１】これらの実験は、反応が別々の容器中で行
われ、特異性を増大させるようなさらなる方法によって
支持されるが生じる非特異的な産物の発生は本発明のオ
リゴヌクレオチドを１つの反応容器中で使用した場合に
抑制され得ることを示す。

【０１０２】実施例２ アポリポ蛋白Ｂ遺伝子のコドン３５００におけるＣＧＧ
→ＣＡＧ突然変異についてのスクリーニング（プール・
スクリーニング） 本実施例は、ここに記載した方法が他の試験対象体由来
のＤＮＡを含むプールにおける担体対立遺伝子の検出に
適していることを示す。これを行うために、ヒグチ（実
施例１を参照）に従って単離することによって得られた
ＤＮＡを以下のとおり混合した。 異種ＤＮＡ：正常な同種ＤＮＡ １：５０、１：１０
０、１：２００、１：４００および１：８００ このようにして得たＤＮＡ溶液２マイクロリットルを３
つの反応工程で増幅した。

【０１０３】第１反応工程 この予備反応では、正常体−選択的プライマーだけを使
用して、調製の間に変性したＤＮＡを再転換した。故
に、一本鎖ＤＮＡが二本鎖形態に転換し直された。かく
して、ＰＣＲのための低い開始温度のために生じるであ
ろう突然変異体−選択的プライマーによる非常に過剰の
正常な対立遺伝子の間違ったプライミングが排除され
る。この予備反応によって、突然変異体−選択的プライ
マーは所望のアニーリング温度でのみ次なる反応工程の
間に一本鎖の正常な鋳型と確実に遭遇する。全容量が１
２マイクロリットルと比較的少量のために、第２の反応
工程に必要な全容量がすでにこの反応工程で含まれてい
るので、この予備反応におけるｄＮＴＰの濃度は比較的
高い。かくして、一本鎖の正常な対立遺伝子の二本鎖へ
の完全な転換は、より容易に実現できる。

【０１０４】ＤＮＡ溶液： ２マイクロリットル 試薬混合物の微量試料： １０マイクロリットル ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（２０μＭ貯蔵溶液）： １.４マイク
ロリットル Ｍg²⁺（２０ｍＭ貯蔵溶液）： ０.９マイクロリットル Ｍg²⁺を含まない１０ｘ ＰＣＲ−緩衝液（実施例１参
照）： １.２マイクロリットル プライマーＡsa長い（８１ｎｇ／マイクロリットル貯蔵
溶液）配列番号２： ０.２８マイクロリットル Ｈ₂Ｏ： ５.９９マイクロリットル Ｔａｑ−ポリメラーゼ（５Ｕ／マイクロリットル、ベッ
クマン）： ０.２３マイクロリットル 全容量： １２マイクロリットル 温度間隔：４回（６０℃で２分、７２℃で２分）、７２
℃で５分、油は適用されなかった。

【０１０５】第２反応工程 この工程はプライマーＰ１、Ｐ２および相補鎖プライマ
ーＰ７によるＰＣＲである（「図２」からの相補鎖プラ
イマーＰ３への５'、配列番号５）。さらなる相補鎖プ
ライマーを使用してプライマー二量体問題を排除した。
多数回のサイクルで、プライマーＰ７およびプライマー
Ｐ３は共にプライマー二量体を生じる。ある環境下で、
所望のＰＣＲ産物はもはや生じなくなった。プライマー
Ｐ７による増幅（この第２反応工程）に次ぐプライマー
Ｐ３によるもう１つの増幅（第３反応工程）はプライマ
ー二量体の形成を抑制する。

【０１０６】この反応では、正常体−選択的プライマー
の濃度は突然変異体−選択的プライマーの濃度よりも有
意に低い。これは、第１反応で存在した正常体−選択的
プライマーの量だけを第２反応で使用したという事実に
よる。かくして、突然変異対立遺伝子の好ましい増幅は
可能である。しかしながら、正常体−選択的プライマー
の利用可能な量は、第３反応工程後に目に見える増幅産
物を得るために、かくしてプールスクリーニングの間に
ＰＣＲ反応を内在的に制御させるために、試薬混合物が
突然変異対立遺伝子を含まないことを条件に充分であ
る。

【０１０７】試薬混合物： 第１反応工程の試薬混合物： １２マイクロリットル 試薬混合物の微量試料： ５８マイクロリットル プライマーＰ７（５１.１ｎｇ／マイクロリットル貯蔵
溶液）配列番号５： １.４マイクロリットル Ａsa短い（９５.７ｎｇ／マイクロリットル貯蔵溶液）
配列番号１： ０.７マイクロリットル ２０ｍＭ ＭgＣl₂溶液からのＭg²⁺： ０.８５マイクロ
リットル Ｍg²⁺を含まない１０ｘ ＰＣＲ緩衝液： ５.８マイク
ロリットル Ｔａｑ−ポリメラーゼ： ０.１２マイクロリットル Ｈ₂Ｏ： ４９.１３マイクロリットル 全容量： ７０マイクロリットル 該試料をヘビー・ホワイト・ミネラル・オイル（heavy
white mineral oil）[シグマ（Ｓigma）Ｃat.Ｎo.４０
０−５]約５０マイクロリットルで覆った。 温度間隔：２０回（９５℃で１分、６０℃で１分、７２
℃で１分） ４回（６０℃で２分、７２℃で２分）、７２℃で５分

【０１０８】最後の４回のサイクル（アニーリングおよ
び伸長だけで、変性は含まない）の目的は、第３反応工
程のための混合物を調製する前に一本鎖ＤＮＡがもはや
存在しないことを確実にするためである。

【０１０９】第３反応工程 相補鎖プライマーＰ３によるＰＣＲ 第２反応工程からの産物： ７マイクロリットル 試薬混合物の微量試料： ４３マイクロリットル プライマー３（９２.４ｎｇ／マイクロリットル）配列
番号４： ０.５マイクロリットル Ａsa短い、配列番号１： ０.６５マイクロリットル Ａsa長い、配列番号２： ０.２マイクロリットル Ｍg²⁺を含まない１０ｘ 緩衝液： ５マイクロリットル １０ｍＭ ＭgＣl₂溶液からのＭg²⁺： ２.１４マイクロ
リットル 各々１００μＭのｄＮＴＰ４つを含有するｄＮＴＰ混合
物： ２.５マイクロリットル Ｈ₂Ｏ： ３１.７６マイクロリットル Ｔaq−ポリメラーゼ（５Ｕ／マイクロリットル、ベック
マン）： ０.２５マイクロリットル 全容量： ５０マイクロリットル 温度間隔：４０回（９５℃で１分、６５℃で１分、７２
℃で１分） ４回（６５℃で２分、７２℃で２分）、７２℃で５分

【０１１０】第２反応では、選択性は低いｄＮＴＰ濃度
（２μＭ）によって実質的に決定されるが、アニーリン
グ温度６０℃は比較的低く、充分なアニーリングが確実
に行われる。それと比較して、第３反応では非常に多量
のｄＮＴＰが使用され、その結果、形成されるべき産物
の量が相当に高くなる。プライマーにおけるさらなる突
然変異が第２反応の間にＰＣＲ産物に取込まれたので、
第３反応のアニーリング温度は６５℃に上昇することが
できた。

【０１１１】Ｂ３５００突然変異についてのスクリーニ
ングに使用する場合、試料をプールするためのパターン
は個体群間の突然変異の頻度に合わせられた。Ｂ３５０
０突然変異は５００〜７００人につき１人の割合で生じ
る。該プローブは３つの工程で分析されるべきである： １．比較的大きいプールの分析 ２．より大きいプールから形成されたより小さいプール
の分析 ３．個々のプローブの分析。

【０１１２】ＥＤＴＡ血液の試料８つを混合して基本的
なプールを形成し、これらのプールの各々から１つの微
量試料を得て６４−試料プールを得た。これは８³に
１、すなわち５１２に１の突然変異頻度で三工程分析に
最適のパターンである。該パターンは他の頻度率の幅広
い範囲で適用され得る。ＥＤＴＡ試料を混合する場合、
個々の試料の種々の白血球濃度は異なる容量によって説
明された。故に、該プールで使用した白血球の数は各試
験対象体について同一であった。まず、各試験対象体に
ついて、ＥＤＴＡ血液１００マイクロリットルを微量滴
定プレート上にピペットで移し、その結果、次なるピペ
ッティングをピペッティングロボター（pipetting robo
ter）[Ｔecan ＲＳＰ ５０５２、ツィンサー・アナリテ
ィク（Ｚinsser Ａnalytic）、フランクフルト]によっ
て行うことができた。該装置によってまず０.９％ＮaＣ
l溶液１００マイクロリットルで各試料を希釈し、白血
球約８００００個を含有する微量試料を合わせて基本的
な８−試料プールを形成した（容量はコンピューターに
よって白血球濃度から算出した）。（該装置による混合
後）８−試料プールの各々から白血球１６００００個を
６４−試料プールにピペットで移した。まず、６４−試
料プールだけについてＤＮＡ分離を行った。試料約４１
００個をこの方法で分析した。突然変異配列を含有する
６４−試料プール６個を個の方法で得た。６４−試料プ
ールと同一の方法で対応する８−試料プールのＤＮＡを
単離および分析した。次いで、８−試料プールにおいて
陽性であると同定された個々の試料のＤＮＡを単離し、
実施例１に従ってアッセイした。かくして異種キャリア
６個を同定した。

【０１１３】負の対照に関して正常なバンドだけが得ら
れた。オリゴヌクレオチド混合物が僅かに別々に調製さ
れる場合（より小さいＡＳＡ）、突然変異産物の位置の
バンドは、常に、負の対照に対して若干弱いかもしれな
い。相補鎖の合成の間のＴａｑポリメラーゼのミスプラ
イミングおよびエラーがほとんど目に見えないバックグ
ランドを生産するので、これはこのシステムでできる限
り最高レベルの選択性である。これは、実際に存在する
突然変異起源がバックグランドよりも過剰であることを
条件に、それらが少量であっても確実に検出する（次い
で、正常なバンドが現れる）。

【０１１４】「図１２」は増幅したプローブおよび１つ
の負の対照の分析を示す。長いＰＣＲ産物だけが負の対
照（１３４ｂｐ、レーン２）の間に生じるが、３および
４は突然変異体ＰＣＲ産物（１１４ｂｐ）だけを示す。
５〜７の希釈では、突然変異体ＰＣＲ産物は効果があ
り、正常な産物の非常に小さい部分も見られる。故に、
記載した方法を用いて、８００個の正常な試験対象体の
ＤＮＡを含有する混合物中でさえ異種試験対象体のＤＮ
Ａを検出するのが可能である。より高い希釈物はまだ試
験されなかった。 １： 長さの標準 ２： 負の対照 ３： １：５０ ４： １：１００ ５： １：２００ ５： １：４００ ６： １：８００

【０１１５】実施例３ 伸長され得ないオリゴヌクレオチドを対立遺伝子の１つ
に使用する方法 特に複合方法において、オリゴヌクレオチド伸長は、例
えば、３'−末端でジデオキシヌクレオチドを取込むこ
とによってブロックされ得る[コザレリィ（Ｃozzarell
i）ら、（１９６９）ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー（Ｊournal of Ｍolecular Ｂiology）
４５：５１３]。かくして、いくつかの公知の（稀な）
突然変異のうちの１つ（またはそれ以上）の存在を決定
するのに供される複合工程において、正常な対立遺伝子
は増幅から排除され、その結果、各試験対象体に関する
増幅産物の数は、通常、バンド１〜３個に制限される
（対照に関する増幅における１つの正常なバンドおよび
突然変異対立遺伝子のバンド１〜２個を含む)。１次ア
ニーリング工程の後のサイクルにおける初期鋳型への間
違ったアニーリングは、初期標的に完全に相補的である
ブロックされたオリゴヌクレオチドを後に添加すると生
じるであろう。

【０１１６】変形２を使用して対立遺伝子の概算濃度あ
るいは感染因子または体細胞突然変異体（癌遺伝子）の
単離を評価する場合、標準として第３の人工対立遺伝子
を使用することができる。３'−ＯＨ末端を有する本発
明のプライマーはこの後者の対立遺伝子および評価され
るべき対立遺伝子のために使用されるが、全ての他の対
立遺伝子の増幅はジデオキシオリゴヌクレオチドによっ
て妨害される。この人工的な第３の対立遺伝子はすでに
対応するプライマーのＹ−差異を含んでいてもよい。プ
ライマーが鋳型に直接適合する程度によって、増幅の単
離を確実にするために比較的多くのＹ位置を有する。

【０１１７】ヌクレオチドがポリヌクレオチド中に重合
される場合、ホスホジエステル結合は５'−ＯＨ基を３'
−ＯＨ基に連結させる。ジデオキシオリゴヌクレオチド
は３'−ＯＨ基を有していない。故に、核酸の末端はジ
デオキシヌクレオチドでは伸長され得ない。この効果
は、例えば、配列決定法において利用される。しかしな
がら、複合法では、最初にいくらか分散している多くの
バンドが形成される。本発明者らの研究では、例えば、
変形２（対立遺伝子−特異的プライマー）をすでに使用
して１つの試薬混合物において５つの突然変異のための
複合方法を行った。少なくとも５つのバンド（正常な個
体または突然変異）がこの方法で生じる。個体が２つの
突然変異に対して異種である場合、バンドの数は７つに
増加する。しかしながら、ある遺伝子（この場合、例え
ば、ＬＣＡＴ、しかしＬＤＬレセプターでもある）およ
びある個体の試験が既知の突然変異の不在または存在を
確立することに制限される場合、正常な対立遺伝子（Ｐ
ＣＲ対照としての１つのバンドを除く）を増幅する必要
はない。正常な個体では、バンドの数は１つに減少す
る。突然変異につき１つのバンドが加えられるであろ
う。ＰＣＲの全収量は有意に少ないバンドに分配され、
バンドパターンは簡素化される。例えば、４０種類の起
こり得る欠失のうちの１つが（いくつかの複合反応で）
検出された場合、（ジデオキシプライマーの代わりに正
常なプライマーを使用して）異種性または同種性につい
て試験するのが可能である。（各突然変異部位に関す
る）ジデオキシオリゴヌクレオチドは、このような複合
方法で対立遺伝子を覆うのに供せられ、例えば、間違っ
たＣＯＰプライマーとのハイブリダイゼーションを排除
する。本発明の残りのプライマーのために、突然変異プ
ライマーは多分に生じる突然変異体対立遺伝子のＰＣＲ
産物を完全に適合する。変形２（対立遺伝子−特異的プ
ライマー）において、他のプライマーの間違ったアニー
リングおよびプライミングはジデオキシオリゴヌクレオ
チドを使用することによって減少できた。

【０１１８】同様に、ＬＣＲ反応において５'−末端オ
リゴヌクレオチドを使用することができる。プロモータ
ー制御された変形において、上記オリゴヌクレオチドの
１つまたはプロモーター配列の非活性変異を含むプライ
マーを同様に使用することができる。

【０１１９】

【配列表】

【０１２０】配列番号：１ 配列の長さ：２９塩基 配列の型：デオキシリボヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 存在位置：１０６５８−１０６８６（ジャーナル・オブ
・バイロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂiol.Ｃhem.）
（１９８６）２６１：１２９１８−１２９２１） 配列 3'-TGAGAAGTCA CTTCGACGTC CCGTGAAGG-5'

【０１２１】配列番号：２ 配列の長さ：４９塩基 配列の型：デオキシリボヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 存在位置：１０６５８−１０７０６ 配列 3'-CCATAAGTCA CTTCGACGTC CCGTGAACCT TTTAACTACT ATAGACCTT-5'

【０１２２】配列番号：３ 配列の長さ：４９塩基 配列の型：デオキシリボヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 存在位置：１０６５８−１０７０６ 配列 3'-CGAGAAGTCA CTTCGACGTC CCGTGAACCT TTTAACTACT ATAGACCTT-5'

【０１２３】配列番号：４ 配列の長さ：２８塩基 配列の型：デオキシリボヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 存在位置：１０５７３−１０６００ 配列 5'-GATGTCAAGG GTTCGGTTCT TTCTCGGG-3'

【０１２４】配列番号：５ 配列の長さ：３１塩基 配列の型：デオキシリボヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 存在位置：１０５３２−１０５６２ 配列 5'-GCCTCACCTC TTACTTTTCC ATTGAGTCAT C-3'

【図面の簡単な説明】

【図１】 競合プライミングに基づく本発明の方法を理
論的に示す流れ図。

【図２】 「図３」および実施例で使用されるヌクレオ
チド配列の配置を示す模式図。

【図３】 ３'−ミスマッチオリゴヌクレオチドの使用
に関する本発明の方法を示す流れ図。

【図４】 ミスマッチ−ヌクレオチドがオリゴヌクレオ
チドの末端付近の同一位置に共に配置される方法を示す
流れ図。

【図５】 本発明の方法の伸長産物の検出に関する具体
例を示す流れ図。

【図６】 本発明の方法の伸長産物の検出に関する具体
例を示す流れ図。

【図７】 本発明の方法の伸長産物の検出に関する具体
例を示す流れ図。

【図８】 いくつかの多型部位の同時検出のために使用
される本発明の方法を示す模式図。

【図９】 いくつかの多型部位の同時検出のために使用
される本発明の方法を示す模式図。

【図１０】 いくつかの多型部位の同時検出のために使
用される本発明の方法を示す模式図。

【図１１】 実施例１で増幅されたプローブの分析結果
のクロマトグラムを示す図面代用写真。

【図１２】 実施例２で増幅されたプローブおよび負の
対照の分析結果のクロマトグラムを示す図面代用写真。

【図１３】 本発明の方法におけるＬＣＲの使用を示す
流れ図。

【符号の説明】

Ｉ 固定化基 Ｄ 検出基 Ｄ１、Ｄ２ 種々の検出基 Ｆ 固相 Ｐ１、Ｐ４ 本発明のプライマー１、４ Ｐ２、Ｐ５ 本発明のプライマー２、５ Ｐ２' 参照プライマー Ｐ３、Ｐ６、Ｐ７ 相補鎖プライマー Ｘ、Ｘ１、Ｘ２ 対立遺伝子位置 Ｙ１、Ｙ２ ミスマッチの位置

フロントページの続き (72)発明者 クリストフ・ケスラー ドイツ連邦共和国デー−8021ドルフェン、 シュロスベルクヴェーク11番 (72)発明者 ゲルト・アスマン ドイツ連邦共和国デー−4400ミュンスタ ー、フリーデリクスシュトラーセ15番 (72)発明者 ハラルト・フンケ ドイツ連邦共和国デー−4400ミュンスタ ー、ゲルハルトシュトラーセ13番 (72)発明者 ステファン・ルスト ドイツ連邦共和国デー−4400ミュンスタ ー、ダクスライテ69番

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）ハイブリダイゼーションのために充
   分な条件下、ヌクレオチド配列が位置Ｘに対応する位置
   で相違する一組のオリゴヌクレオチドと検出されるべき
   核酸とを反応させ、 ｂ）検出されるべき核酸を鋳型として使用して、ハイブ
   リダイゼーションによって付加したオリゴヌクレオチド
   を伸長させ、次いで ｃ）該伸長生成物を検出することからなり、この一組の
   オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの別の位置(Ｙ)で
   相違することを特徴とする、ヌクレオチド配列が少なく
   とも１つの位置(Ｘ)で相違する変異核酸の検出方法。
2. 【請求項２】 伸長生成物またはその実質的な部分に対
   して相補的な核酸を形成し、 該相補的核酸を標的核酸として使用して、新しい一組の
   オリゴヌクレオチドを伸長させてポリヌクレオチドを形
   成することからなる請求項１記載の検出方法。
3. 【請求項３】 常に、Ｘと対応するオリゴヌクレオチド
   の１つのヌクレオチドが検出されるべき１つの核酸のヌ
   クレオチドＸに対して相補的であるが、他の核酸のヌク
   レオチドＸに対して相補的ではない請求項１記載の方
   法。
4. 【請求項４】 オリゴヌクレオチドが位置Ｘと対応する
   ヌクレオチドで終わる請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 位置Ｙが末端ヌクレオチドから１〜８ヌ
   クレオチド離れた位置にあるオリゴヌクレオチド断片か
   ら選択される請求項１または２記載の方法。
6. 【請求項６】 オリゴヌクレオチドの伸長反応が同時に
   生じる請求項１〜５いずれか１項記載の方法。
7. 【請求項７】 請求項１記載の方法を使用して１つのプ
   ローブの対立遺伝子を同時に決定する方法。
8. 【請求項８】 請求項１記載の方法を使用して位相学的
   に密接に関係している感染因子を同時に検出する方法。
9. 【請求項９】 請求項１記載の方法を使用して密接に関
   係している核酸の存在についてプローブのプールをスク
   リーニングする方法。
10. 【請求項１０】 請求項１記載の方法を使用して、検出
    されるべき１または数個の核酸と類似している１つの核
    酸が対照核酸として検出される１または数個の核酸の検
    出方法。
11. 【請求項１１】 請求項１記載の方法を使用する突然変
    異の決定方法。
12. 【請求項１２】 ａ）ハイブリダイゼーション条件下、
    ヌクレオチド配列が位置Ｘに応答する位置および少なく
    とも１つのさらなる位置Ｙにおいて相違する一組のオリ
    ゴヌクレオチドを、検出されるべき核酸と合わせ、 ｂ）検出されるべき核酸を鋳型として使用して、該核酸
    にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを伸長させ
    て、伸長生成物を形成させ、 ｃ）工程ｂ）の伸長生成物を、オリゴヌクレレオチドの
    組からのオリゴヌクレオチドの配列の、位置ＸおよびＹ
    を含む、少なくとも一部に対して相補的である少なくと
    も１つのオリゴヌクレオチドおよび工程ｂ）における伸
    長によって付加された配列の少なくとも一部に対して相
    補的な配列からなるさらなる少なくとも１つのオリゴヌ
    クレオチドとハイブリダイズさせ、 ｄ）工程ｃ）のハイブリダイゼーション生成物を検出す
    ることを特徴とする、ヌクレオチド配列が少なくとも１
    つの位置Ｘにおいて相違する変異核酸の検出方法。
13. 【請求項１３】 工程ｃ）の少なくとも１つのオリゴヌ
    クレオチドが少なくとも１つの固定可能なまたは１つの
    検出可能な基からなる請求項１２記載の検出方法。
14. 【請求項１４】 ａ）ハイブリダイゼーション条件下、
    ヌクレオチド配列が位置Ｘに応答する位置および少なく
    とも１つのさらなる位置Ｙにおいて相違する一組のオリ
    ゴヌクレオチドを、検出されるべき核酸と合わせ、 ｂ）検出されるべき核酸を鋳型として使用して、該核酸
    にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを伸長させ
    て、伸長生成物を形成させ、 ｃ）工程ｂ）において形成された伸長生成物の少なくと
    も一部に対して相補的な核酸を形成させ、 ｄ）工程ｃ）の核酸を、工程ｃ）において形成された核
    酸の配列の、位置ＸおよびＹを含む、少なくとも一部に
    対して相補的な配列からなる少なくとも１つのオリゴヌ
    クレオチドとハイブリダイズし、 ｅ）工程ｄ）のハイブリダイゼーション生成物を検出す
    ることを特徴とする、ヌクレオチド配列が少なくとも１
    つの位置Ｘにおいて相違する変異核酸の検出方法。
15. 【請求項１５】 工程ｄ）の少なくとも１つのオリゴヌ
    クレオチドが少なくとも１つの固定可能なまたは１つの
    検出可能な基からなる請求項１４記載の検出方法。