JP3859686B1 - Dnaが有する標的塩基を判別する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 3’末端塩基をSNP対応塩基とし、かつ3’末端から2番目および3番目の塩基からなる配列が、5’-AT-3’、5’-GT-3’、5’-CA-3’、5’-CT-3’のいずれかとし、かつ3’末端から4番目の塩基から5’末端の塩基までの塩基配列を、標的SNP塩基から3’側に対して三塩基隣の塩基から所望の塩基までの配列に対して相補的に設計する。
【選択図】 図2
Description
この方法は、
(1) A(アデニン)、T(チミン)、G(グアニン)、およびC(シトシン)の4種類の塩基の中から前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基を3’末端に有するアレル特異性プライマーを前記DNAに結合させてDNA伸長反応を生じさせるDNA伸長工程、および
(2) 前記DNA伸長工程の効率を調べ、高効率であれば前記標的塩基は前記予想された塩基と同一であると判別され、低効率であれば前記標的塩基は前記予想された塩基とは異なると判別される判別工程
を有し、
前記DNAにおいて、前記標的塩基の3’末端側にすぐ隣接する塩基がCであり、もう一塩基隣の塩基がAであり、
前記アレル特異性プライマーの3’末端塩基が前記標的塩基であると予想される塩基と相補的であり、
前記アレル特異性プライマーの3’末端から2番目および3番目の塩基からなる配列が、5’-AT-3’、5’-GT-3’、5’-CA-3’、5’-CT-3’のいずれかであり、かつ
前記アレル特異性プライマーの3’末端から4番目の塩基と5’末端の塩基との間の塩基配列が、前記アレル特異性プライマーの3’末端から4番目の塩基に対応する前記DNA側の塩基と前記アレル特異性プライマーの5’末端の塩基に対応する前記DNA側の塩基との間の塩基配列に相補的に結合する。
本実施の形態1では、本発明におけるアレル特異性プライマーの塩基種条件について、図2を用いて説明する。
本実施の形態2では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いてプライマー伸長反応を行うことでSNPを判別する方法について説明する。
本実施の形態3では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いてPCRを行うことでSNPを判別する方法について説明する。
本実施の形態4では、本発明におけるアレル特異性プライマーを含むSNP判別用キットについて説明する。
本実施の形態5では、本発明におけるアレル特異性プライマーを含むSNP判別用キットについて説明する。
本実施例1では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いたプライマー伸長反応によってλDNA中の標的塩基種判別を行った。
5’−CTGACGGGGACGAAAGAAGAACATG−3’(λ−ATG:配列番号1)、
5’−CTGACGGGGACGAAAGAAGAACGTG−3’(λ−GTG:配列番号2)、
5’−CTGACGGGGACGAAAGAAGAACCAG−3’(λ−CAG:配列番号3)、および
5’−CTGACGGGGACGAAAGAAGAACCTG−3’(λ−CTG:配列番号4)
からなる四種類のプライマーを用いて行うこととした。
20μMの上記野生型λDNAあるいは変異型λDNA−7292−AT、
10μMのλ−ATGあるいはλ−GTGあるいはλ−CAGあるいはλ−CTGのいずれか、
0.5U/μLのTaKaRa Taq(タカラバイオ(株)製)、
10mMのTris−HCl(pH8.3)、
50mMのKCl、
1.5mMのMgCl2および、
各1mMのdNTPs
を含む反応溶液10μLを調製した。
本比較例1では、上記実施例1の比較実験として、上記実施例1の野生型λDNAと変異型λDNA−7292−ATの一塩基の違いについて、以下の三種類のプライマーを用いて判別を試みた。
5’−CTGACGGGGACGAAAGAAGAACAAG−3’(λ−AAG:配列番号7)、
5’−CTGACGGGGACGAAAGAAGAACGAG−3’(λ−GAG:配列番号8)、および
5’−CTGACGGGGACGAAAGAAGAACGCG−3’(λ−GCG:配列番号9)
の配列からなる三種類のプライマーを用いて、実施例1と同様の実験を行った。
本実施例2では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いたPCR反応によってλDNA中の標的塩基種判別を行った。
5’−CTGGCTGACCCTGATGAGTTCGATT−3’(λ−ATT:配列番号10)、
5’−CTGGCTGACCCTGATGAGTTCGGTT−3’(λ−GTT:配列番号11)、
5’−CTGGCTGACCCTGATGAGTTCGCAT−3’(λ−CAT:配列番号12)、
5’−CTGGCTGACCCTGATGAGTTCGCTT−3’(λ−CTT:配列番号13)
からなる四種類のプライマーをフォワードプライマーとして用いたPCR反応によって行うこととした。
Light Cycler−FastStart DNA Master SYBER Green Iキット(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)の酵素ミクスチャーを2μL
10μg/mLの上記野生型λDNAあるいは変異型λDNA−7143−GC、
1μMのλ−ATTあるいはλ−GTTあるいはλ−CATあるいはλ−CTTのいずれか
1μMの上記リバースプライマー
1.6mMのMgCl2
を含む反応溶液20μLを調製した。
この反応溶液をロシュ・ダイアグノスティクス社製サーマルサイクラーであるLightCyclerを用いて、変性工程:94℃、10秒間、アニーリング工程:58℃、10秒間、伸長工程:72℃、10秒間、サイクル数:20サイクルとしてPCR反応を行った。
本比較例2では、上記実施例2の比較実験として、上記実施例2の野生型λDNAと変異型λDNA−7143−GCの一塩基の違いについて、以下の三種類のプライマーを用いて判別を試みた。
5’−CTGGCTGACCCTGATGAGTTCGAAT−3’(λ−AAT:配列番号18)、
5’−CTGGCTGACCCTGATGAGTTCGACT−3’(λ−ACT:配列番号19)、
5’−CTGGCTGACCCTGATGAGTTCGGCT−3’(λ−GCT:配列番号20)
の配列からなる三種類のプライマーを用いて、実施例2と同様の実験を行った。
2:従来技術におけるテンプレートDNA
3:本発明におけるアレル特異性プライマー
4:本発明におけるテンプレートDNA
Claims (8)
- DNAが有する標的塩基を判別する方法であって、
前記方法は、
(1) A、T、G、およびCの4種類の塩基の中から前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基を3’末端に有するアレル特異性プライマーを前記DNAに結合させてDNA伸長反応を生じさせるDNA伸長工程、および
(2) 前記DNA伸長工程の効率を調べ、高効率であれば前記標的塩基は前記予想された塩基と同一であると判別され、低効率であれば前記標的塩基は前記予想された塩基とは異なると判別される判別工程
を有し、
前記DNAにおいて、前記標的塩基の3’末端側にすぐ隣接する塩基がCであり、もう一塩基隣の塩基がAであり、
前記アレル特異性プライマーの3’末端塩基が前記標的塩基であると予想される塩基と相補的であり、
前記アレル特異性プライマーの3’末端から2番目および3番目の塩基からなる配列が、5’-AT-3’、5’-GT-3’、5’-CA-3’、5’-CT-3’のいずれかであり、かつ
前記アレル特異性プライマーの3’末端から4番目の塩基と5’末端の塩基との間の塩基配列が、前記アレル特異性プライマーの3’末端から4番目の塩基に対応する前記DNA側の塩基と前記アレル特異性プライマーの5’末端の塩基に対応する前記DNA側の塩基との間の塩基配列に相補的に結合する、方法。 - 前記DNA伸長反応がプライマー伸長反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA伸長反応が、前記アレル特異性プライマーのみからのプライマー伸長反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記プライマー伸長反応により産生されるピロリン酸の濃度を調べることによって前記効率を調べる、請求項2に記載の方法。
- 前記ピロリン酸の濃度を発光強度として検出する、請求項4に記載の方法。
- 前記DNA伸長反応がPCR反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA伸長反応が、前記アレル特異性プライマーともう一つの異なるプライマーからなるPCR反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記PCR反応により産生された増幅DNAの濃度を、電気泳動法により測定することによって前記効率を調べる、請求項6に記載の方法。
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