JP3853840B1 - Dnaが有する標的塩基を判別する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】3’末端塩基をSNP対応塩基とし、かつ3’末端から2番目の塩基はTかGとし、かつ3’末端から3番目の塩基はTかGのいずれかとし、かつ3’末端から4番目の塩基から5’末端の塩基までの塩基配列を、標的SNP塩基から3’側に対して三塩基隣の塩基から所望の塩基までの配列に対して相補的に設計する。
【選択図】図2
Description
この方法は、
(1) A(アデニン)、T(チミン)、G(グアニン)、およびC(シトシン)の4種類の塩基の中から前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基を3’末端に有するアレル特異性プライマーを前記DNAに結合させてDNA伸長反応を生じさせるDNA伸長工程、および
(2) 前記DNA伸長工程の効率を調べ、高効率であれば前記標的塩基は前記予想された塩基と同一であると判別され、低効率であれば前記標的塩基は前記予想された塩基とは異なると判別される判別工程
を有し、
前記DNAにおいて、前記標的塩基の3’末端側にすぐ隣接する塩基がGであり、もう一塩基隣の塩基がGであり、
前記アレル特異性プライマーの3’末端塩基が前記標的塩基であると予想される塩基と相補的であり、
前記アレル特異性プライマーの3’末端から2番目の塩基がTかGであり、
前記アレル特異性プライマーの3’末端から3番目の塩基がTかGのいずれかであり、かつ
前記アレル特異性プライマーの3’末端から4番目の塩基と5’末端の塩基との間の塩基配列が、前記アレル特異性プライマーの3’末端から4番目の塩基に対応する前記DNA側の塩基と前記アレル特異性プライマーの5’末端の塩基に対応する前記DNA側の塩基との間の塩基配列に相補的に結合する。
本実施の形態1では、本発明におけるアレル特異性プライマーの塩基種条件について、図2を用いて説明する。
本実施の形態2では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いてプライマー伸長反応を行うことでSNPを判別する方法について説明する。
で、上記プライマー伸長反応を行い、その表面プラズモン共鳴(SPR)現象を解析してプライマー伸長反応をモニタリングすることで、プライマー伸長反応効率を調べてもよい。
本実施の形態3では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いてPCRを行うことでSNPを判別する方法について説明する。
と相補的であり、かつその3’末端から2番目の塩基がCであり、かつその3’末端から3番目の塩基がCである。
A1や特開2004−141158号公報などで提案されている方法がある。
本実施の形態4では、本発明におけるアレル特異性プライマーを含むSNP判別用キットについて説明する。
A1で示された方法に準じて電気化学的にピロリン酸を測定することができる。
本実施の形態5では、本発明におけるアレル特異性プライマーを含むSNP判別用キットについて説明する。
本実施例1では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いたPCR反応によってλDNA中の標的塩基種判別を行った。
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGATTC−3’(λ−TTC:配列番号1)、
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGATGC−3’(λ−TGC:配列番号2)、
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGAGTC−3’(λ−GTC:配列番号3)、
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGAGGC−3’(λ−GGC:配列番号4)
からなる四種類のプライマーを用いて行うこととした。
Light Cycler−FastStart DNA Master SYBER Green Iキット(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)の酵素ミクスチャーを2μL
10μg/mLの上記野生型λDNAあるいは変異型λDNA−7129−AT、
1μMの上記四種類のプライマー(λ−TTC、λ−TGC、λ−GTC、λ−GGC)のいずれか
1μMの上記リバースプライマー
1.6mMのMgCl2
を含む反応溶液20μLを調製した。
この反応溶液をロシュ・ダイアグノスティクス社製サーマルサイクラーであるLightCyclerを用いて、変性工程:94℃、10秒間、アニーリング工程:58℃、10秒間、伸長工程:72℃、10秒間、サイクル数:20サイクルとしてPCR反応を行った。
本比較例1では、上記実施例1の比較実験として、上記実施例1の野生型λDNAと変異型λDNA−7129−ATの一塩基の違いについて、以下の五種類のプライマーを用いて判別を試みた。
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGAAAC−3’(λ−AAC:配列番号9)、
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGAATC−3’(λ−ATC:配列番号10)、
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGAAGC−3’(λ−AGC:配列番号11)、
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGATAC−3’(λ−TAC:配列番号12)、および
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGAGAC−3’(λ−GAC:配列番号13)
の配列からなる五種類のプライマーを用いて、実施例1と同様の実験を行った。
本実施例2では、実施例1や比較例1同様に、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いたPCR反応によってλDNA中の標的塩基種判別を行った。
野生型λDNA中の7130番目のT/A塩基対について人工的にG/C塩基対に置換した変異型λDNA。
2.変異型λDNA−7068−AT
野生型λDNA中の7068番目のG/C塩基対について人工的にA/T塩基対に置換した変異型λDNA。
3.変異型λDNA−7092−TA
野生型λDNA中の7092番目のA/T塩基対について人工的にT/A塩基対に置換した変異型λDNA。
野生型λDNA中の7130番目のT/A塩基対と、変異型λDNA−7130−GCの7130番目のG/C塩基対の判別。
判別2
野生型λDNA中の7068番目のG/C塩基対と、変異型λDNA−7068−ATの7068番目のA/T塩基対の判別。
判別3
野生型λDNA中の7092番目のA/T塩基対と、変異型λDNA−7092−TAの7092番目のT/A塩基対の判別。
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGACAAT−3’(λ1−AAT:配列番号14)
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGACATT−3’(λ1−ATT:配列番号15)
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGACAGT−3’(λ1−AGT:配列番号16)
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGACTAT−3’(λ1−TAT:配列番号17)
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGACTTT−3’(λ1−TTT:配列番号18)
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGACTGT−3’(λ1−TGT:配列番号19)
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGACGAT−3’(λ1−GAT:配列番号20)
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGACGTT−3’(λ1−GTT:配列番号21)
5’−GCTGATGCTGCTGGCTGACGGT−3’(λ1−GGT:配列番号22)
5’−CCGAAAAACTGGGTGACCAAAG−3’(λ2−AAG:配列番号25)
5’−CCGAAAAACTGGGTGACCAATG−3’(λ2−ATG:配列番号26)
5’−CCGAAAAACTGGGTGACCAAGG−3’(λ2−AGG:配列番号27)
5’−CCGAAAAACTGGGTGACCATAG−3’(λ2−TAG:配列番号28)
5’−CCGAAAAACTGGGTGACCATTG−3’(λ2−TTG:配列番号29)
5’−CCGAAAAACTGGGTGACCATGG−3’(λ2−TGG:配列番号30)
5’−CCGAAAAACTGGGTGACCAGAG−3’(λ2−GAG:配列番号31)
5’−CCGAAAAACTGGGTGACCAGTG−3’(λ2−GTG:配列番号32)
5’−CCGAAAAACTGGGTGACCAGGG−3’(λ2−GGG:配列番号33)
5’−CCGGCGCGTGAGTTCAAAA−3’(λ3−AAA:配列番号36)
5’−CCGGCGCGTGAGTTCAATA−3’(λ3−ATA:配列番号37)
5’−CCGGCGCGTGAGTTCAAGA−3’(λ3−AGA:配列番号38)
5’−CCGGCGCGTGAGTTCATAA−3’(λ3−TAA:配列番号39)
5’−CCGGCGCGTGAGTTCATTA−3’(λ3−TTA:配列番号40)
5’−CCGGCGCGTGAGTTCATGA−3’(λ3−TGA:配列番号41)
5’−CCGGCGCGTGAGTTCAGAA−3’(λ3−GAA:配列番号42)
5’−CCGGCGCGTGAGTTCAGTA−3’(λ3−GTA:配列番号43)
5’−CCGGCGCGTGAGTTCAGGA−3’(λ3−GGA:配列番号44)
・Light Cycler−FastStart DNA Master SYBER Green Iキット(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)の酵素ミクスチャーを2μL
・10μg/mLの野生型λDNAあるいは変異型λDNA−7130−GC、
・1μMの上記判別1用プライマーのいずれか
・1μMの上記リバースプライマー
・1.6mMのMgCl2
を含む反応溶液20μL。
・Light Cycler−FastStart DNA Master SYBER Green Iキット(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)の酵素ミクスチャーを2μL
・10μg/mLの野生型λDNAあるいは変異型λDNA−7068−AT、
・1μMの上記判別2用プライマーのいずれか
・1μMの上記リバースプライマー
・1.6mMのMgCl2
を含む反応溶液20μL。
・Light Cycler−FastStart DNA Master SYBER Green Iキット(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)の酵素ミクスチャーを2μL
・10μg/mLの野生型λDNAあるいは変異型λDNA−7092−TA、
・1μMの上記判別3用プライマーのいずれか
・1μMの上記リバースプライマー
・1.6mMのMgCl2
を含む反応溶液20μL。
判別1における各目的PCR産物比較濃度(%)=100×(各目的PCR産物濃度(nM))/(テンプレートとして野生型λDNAを用い、フォワードプライマーとしてλ1−GGTを用いたときの目的PCR産物濃度(nM))
計算式2
判別2における各目的PCR産物比較濃度(%)=100×(各目的PCR産物濃度(nM))/(テンプレートとして野生型λDNAを用い、フォワードプライマーとしてλ2−GTGを用いたときの目的PCR産物濃度(nM))
計算式3
判別3における各目的PCR産物比較濃度(%)=100×(各目的PCR産物濃度(nM))/(テンプレートとして野生型λDNAを用い、フォワードプライマーとしてλ3−GTAを用いたときの目的PCR産物濃度(nM))
実施例1および比較例1における各目的PCR産物比較濃度(%)=100×(各目的PCR産物濃度(nM))/(テンプレートとして野生型λDNAを用い、フォワードプライマーとしてλ−GTCを用いたときの目的PCR産物濃度(nM))
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(野生型λDNA/λ−AAC)
(野生型λDNA/λ1−AAT)
(野生型λDNA/λ2−AAG)
(野生型λDNA/λ3−AAA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(変異型λDNA−7129−AT/λ−AAC)
(変異型λDNA−7130−GC/λ1−AAT)
(変異型λDNA−7068−AT/λ2−AAG)
(変異型λDNA−7092−TA/λ3−AAA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(野生型λDNA/λ−ATC)
(野生型λDNA/λ1−ATT)
(野生型λDNA/λ2−ATG)
(野生型λDNA/λ3−ATA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(変異型λDNA−7129−AT/λ−ATC)
(変異型λDNA−7130−GC/λ1−ATT)
(変異型λDNA−7068−AT/λ2−ATG)
(変異型λDNA−7092−TA/λ3−ATA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(野生型λDNA/λ−AGC)
(野生型λDNA/λ1−AGT)
(野生型λDNA/λ2−AGG)
(野生型λDNA/λ3−AGA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(変異型λDNA−7129−AT/λ−AGC)
(変異型λDNA−7130−GC/λ1−AGT)
(変異型λDNA−7068−AT/λ2−AGG)
(変異型λDNA−7092−TA/λ3−AGA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(野生型λDNA/λ−TAC)
(野生型λDNA/λ1−TAT)
(野生型λDNA/λ2−TAG)
(野生型λDNA/λ3−TAA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(変異型λDNA−7129−AT/λ−TAC)
(変異型λDNA−7130−GC/λ1−TAT)
(変異型λDNA−7068−AT/λ2−TAG)
(変異型λDNA−7092−TA/λ3−TAA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(野生型λDNA/λ−TTC)
(野生型λDNA/λ1−TTT)
(野生型λDNA/λ2−TTG)
(野生型λDNA/λ3−TTA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(変異型λDNA−7129−AT/λ−TTC)
(変異型λDNA−7130−GC/λ1−TTT)
(変異型λDNA−7068−AT/λ2−TTG)
(変異型λDNA−7092−TA/λ3−TTA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(野生型λDNA/λ−TGC)
(野生型λDNA/λ1−TGT)
(野生型λDNA/λ2−TGG)
(野生型λDNA/λ3−TGA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(変異型λDNA−7129−AT/λ−TGC)
(変異型λDNA−7130−GC/λ1−TGT)
(変異型λDNA−7068−AT/λ2−TGG)
(変異型λDNA−7092−TA/λ3−TGA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(野生型λDNA/λ−GAC)
(野生型λDNA/λ1−GAT)
(野生型λDNA/λ2−GAG)
(野生型λDNA/λ3−GAA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(変異型λDNA−7129−AT/λ−GAC)
(変異型λDNA−7130−GC/λ1−GAT)
(変異型λDNA−7068−AT/λ2−GAG)
(変異型λDNA−7092−TA/λ3−GAA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(野生型λDNA/λ−GTC)
(野生型λDNA/λ1−GTT)
(野生型λDNA/λ2−GTG)
(野生型λDNA/λ3−GTA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(変異型λDNA−7129−AT/λ−GTC)
(変異型λDNA−7130−GC/λ1−GTT)
(変異型λDNA−7068−AT/λ2−GTG)
(変異型λDNA−7092−TA/λ3−GTA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(野生型λDNA/λ−GGC)
(野生型λDNA/λ1−GGT)
(野生型λDNA/λ2−GGG)
(野生型λDNA/λ3−GGA)
以下の四種類の(テンプレート/フォワードプライマー)の組み合わせにおける目的PCR産物比較濃度(%)の平均値。
(変異型λDNA−7129−AT/λ−GGC)
(変異型λDNA−7130−GC/λ1−GGT)
(変異型λDNA−7068−AT/λ2−GGG)
(変異型λDNA−7092−TA/λ3−GGA)
2:従来技術におけるテンプレートDNA
3:本発明におけるアレル特異性プライマー
4:本発明におけるテンプレートDNA
Claims (8)
- DNAが有する標的塩基を判別する方法であって、
前記方法は、
(1) A、T、G、およびCの4種類の塩基の中から前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基を3’末端に有するアレル特異性プライマーを前記DNAに結合させてDNA伸長反応を生じさせるDNA伸長工程、および
(2) 前記DNA伸長工程の効率を調べ、高効率であれば前記標的塩基は前記予想された塩基と同一であると判別され、低効率であれば前記標的塩基は前記予想された塩基とは異なると判別される判別工程
を有し、
前記DNAにおいて、前記標的塩基の3’末端側にすぐ隣接する塩基がGであり、もう一塩基隣の塩基がGであり、
前記アレル特異性プライマーの3’末端塩基が前記標的塩基であると予想される塩基と相補的であり、
前記アレル特異性プライマーの3’末端から2番目の塩基がTかGであり、
前記アレル特異性プライマーの3’末端から3番目の塩基がTかGのいずれかであり、かつ
前記アレル特異性プライマーの3’末端から4番目の塩基と5’末端の塩基との間の塩基配列が、前記アレル特異性プライマーの3’末端から4番目の塩基に対応する前記DNA側の塩基と前記アレル特異性プライマーの5’末端の塩基に対応する前記DNA側の塩基との間の塩基配列に相補的に結合する、方法。 - 前記DNA伸長反応がプライマー伸長反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA伸長反応が、前記アレル特異性プライマーのみからのプライマー伸長反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記プライマー伸長反応により産生されるピロリン酸の濃度を調べることによって前記効率を調べる、請求項2に記載の方法。
- 前記ピロリン酸の濃度を発光強度として検出する、請求項4に記載の方法。
- 前記DNA伸長反応がPCR反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA伸長反応が、前記アレル特異性プライマーともう一つの異なるプライマーからなるPCR反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記PCR反応により産生された増幅DNAの濃度を、電気泳動法により測定することによって前記効率を調べる、請求項6に記載の方法。
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