CN102154445A

CN102154445A - 一种预测冠心病易感性的方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN102154445A
Application number: CN201010114268XA
Authority: CN
Inventors: 汪道文; 丁虎; 吴斌
Original assignee: Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2010-02-10
Publication date: 2011-08-17

Abstract

本发明提供一种预测冠心病易感性的方法及其试剂盒，该方法具体步骤：1.提取人外周血白细胞的基因组DNA；2.对于受试者个体中DDAH1基因多态性位点-396D/I，即序列表SEQ ID 1所示，通过序列表SEQ ID 2和3所示的F和R寡核苷酸引物序列，特异性地从上述DNA中扩增出来，并通过序列表SEQ ID 4和5所示的Taqman探针碱基序列来实现对DDAH1基因-396位点不同的基因型的检测；3.将受试者个体的DDAH1基因-396位点的I/I，D/I和D/D基因型引入非条件Logistic回归分析模型中来预测冠心病的发病易感性。本发明利用探针特异性结合于多态性位点不同的基因型，来实现对不同基因型的检测。

Description

一种预测冠心病易感性的方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种预测冠心病(coronary artery disease，CAD)易感性的方法，具体说是通过测定人二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(DDAH1)基因多态性位点-396D/I来预测人群对于冠心病的易感性，该方法可以用于疾病的辅助诊断、治疗、和新药研发，属于医学生物技术和基因诊断领域。

背景技术

近年来，冠心病在我国的发病率和死亡率呈迅速上升趋势，已经成为我国居民死因构成中上升最快并威胁我国公众健康的重要疾病。传统的危险因素如高血压，糖尿病，超重与肥胖，吸烟与饮酒，高脂血症等能致动脉粥样硬化，但很多冠心病患者并无上述危险因素存在或者在上述危险因素控制较好的情况下仍然有心血管事件发生，这表明遗传因素和(或)环境因素可能参与了心血管事件的发生。

从事心血管领域的研究人员都熟知血管壁内皮功能紊乱引起动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是多种心脑血管疾病病理生理基础，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS )催化L-精氨酸转化成一氧化氮(nitric oxide，NO)，是内皮细胞合成的一种重要的血管活性因子，具有舒张血管、抑制血小板聚集、抑制单核细胞粘附、抑制平滑肌细胞增殖、减少氧自由基产生及抑制低密度脂蛋白氧化等多种生理效应。ADMA能与L-精氨酸竞争性结合一氧化氮合酶(NOS)，抑制其活性，减少一氧化氮(NO)合成，降低NO的生理效应。ADMA代谢可通过二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH)水解。DDAH分两型：DDAH1和DDAH2。DDAH1主要分布于nNOS表达占优势的组织中，据推测在许多组织中DDAH1是调节血浆ADMA浓度的关键酶，如果其功能受损导致ADMA聚集，NO产生减少，会引起血管内皮受损，体循环血管阻力增加，肺动脉高压等多种病理状态的发生，增加心脑血管事件发生的危险性。

DDAH1具有重要的生物学效应，其基因的遗传变异会影响DDAH1的表达，结构和功能改变，使个体对心脑血管疾病如冠心病的易感性发生改变。其中位于DDAH1基因启动子区-396位四个核苷酸(GCGT)插入的I/I基因型和没有四核苷酸插入的D/D基因型对该基因转录有很大的差别，从而能对冠心病的易感性产生不同的影响。

通过实验我们首次发现并证明我国汉族人在冠心病形成组中的I/I基因型频率较正常人高，对冠心病有致病效应，在校正多重心脑血管危险因子后，DDAH1 I/I基因型是冠心病的一个独立危险因素。

目前进行冠心病的遗传病因研究中，一般采用单核苷酸多态性(SNP)作为基因组标志的关联分析方法是有效的，但传统的PCR-酶切分析SNP的方法存在时间长、可重复性差、灵敏度低、准确率低等问题。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种Taqman探针法进行基因分型，通过非条件logistic回归模型来准确预测冠心病易感性的方法。

本发明的第二个目的是提供一种预测冠心病易感性的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种预测冠心病易感性的方法，该方法通过提取人的外周血白细胞基因组DNA，测定受试者的DDAH1基因-396位点的基因型，通过非条件logistic回归模型来预测受试者对冠心病的易感性。具体步骤：1.提取人外周血白细胞的基因组DNA；2.对于受试者个体中DDAH1基因多态性位点-396D/I，即序列表SEQ ID 1所示，通过序列表SEQ ID 2和3所示的F和R寡核苷酸引物序列，特异性地从上述DNA中扩增出来，并通过序列表SEQ ID 4和5所示的Taqman探针碱基序列来实现对DDAH1基因-396位点不同的基因型的检测；3.将受试者个体的DDAH1基因-396位点的I/I，D/I和D/D基因型引入非条件Logistic回归分析模型中来预测冠心病的发病易感性。

本发明证明，受试者携带DDAH1的-396I/I基因型时，冠心病易感性升高，对冠心病有致病作用。

一组预测冠心病易感性的引物和探针序列(寡核苷酸序列)，能特异性的扩增出DDAH1基因的-396位点的扩增产物，具有序列表SEQ ID 1所示的碱基序列，其中序列表SEQ ID 2和3所示的碱基序列分别为F引物序列和R引物序列；序列表SEQ ID 4和5所示为Taqman探针混合物，以上寡核苷酸序列在一次检测中同时使用。

一种预测冠心病易感性的试剂盒，由以下试剂组成：

400μl 2×Master Mix缓冲液，600μl超纯水，各2μl 100μM/L的探针混合物，各9μl100μM/L的F和R引物混合物，F和R引物是序列表SEQ ID 2和3所示的碱基序列；taqman探针混合物是序列表SEQ ID 4和5所示的碱基序列及修饰基团；试剂盒的保存温度为-20度。

所述的Taqman探针序列5’端用FAM(6-carboxyfluorescein)或HEX(4，7，2′，4′，5′，7′-hexachloro-6-carboxyfluorescein)荧光染料修饰，3’用BHQ1(Black HoleQuencher 1)淬灭基团修饰。

本发明具有以下优点：首次阐明了DDAH1基因多态性位点和冠心病易感性的关联，提供了一种预测冠心病易感性的方法，该方法可用于冠心病的预防/辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。本发明所采用Taqman探针技术实现对多态性位点的检测，通过不同碱基组成的探针Tm值差异，利用探针特异性结合于多态性位点不同的基因型，来实现对不同基因型的检测。该方法操作简便，结果稳定，省时省力，灵敏度和特异度高。

附图说明

图1为基因分型检测结果：三种不同基因型在坐标轴中位于不同的位置，其中沿图y轴分布为型I/I纯合子，沿图x轴分布为D/D型纯合子，位于中间分布为D/I型杂合子。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

具体实施方式

实施例1制备检测冠心病易感性的试剂盒

一、试剂盒成分

检测冠心病易感性的试剂盒，包含有可扩增出DDAH1基因-396D/I启动子区的基因型的引物对，及其Taqman探针，成分和含量如下，于-20度保存：

表1：PCR扩增试剂(200人份)

2×MasterMix，由ABI供应，已经商业化，包括扩增需要的缓冲液组分，ABI的金牌酶等。

F和R引物序列可见SEQ ID 2和3所示的碱基序列。

二、使用方法

直接在ABI 7900 realtimePCR仪上进行扩增。

表2：Realtime PCR反应组分(5μl反应体系)

F引物5’-CAGGTAAAGACCAGGAAGCCC-3’(SEQ ID 2)

R引物5’-GGACCTCGGCGAAAAGC-3’(SEQ ID 3)

DDAH1-396del-probe 5’-FAM-CGCAGGTGCACACCTCCCATC-BHQ 1-3’(SEQ ID 4)

该序列5’标记FAM荧光染料，5’标记BHQ1淬灭基团。

DDAH1-396ins-probe 5’-HEX-CGCAGGTGCACGCACACCTC-BHQ1-3’(SEQ ID 5)

该序列5’标记HEX荧光染料，5’标记BHQ1淬灭基团。

2.Realtime PCR反应参数

预热阶段1：50℃，2分钟→预热阶段2：95℃，10分钟→扩增阶段：95℃，15秒→60℃，1分钟35个循环重复

PCR仪：Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System

3.实验结果

在7900HT高通量PCR上采用终点法读板，结果如图所示，沿图y轴分布为型I/I纯合子，沿图x轴分布为D/D型纯合子，位于中间分布为D/I杂合子。

实施例2：冠心病标本的采集和基因组DNA的提取

样本来自于武汉同济医院高血压病研究所承担的国家863课题收集的冠心病病例。共收集冠心病人576例，对照557例，人群基线资料见表3。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到伦理委员会的批准。

根据下列方法，用于制备人外周白细胞基因组DNA：按照日本富士公司生产的型号为DB-S试剂盒说明书要求，在QG-Mini80工作站上提取DNA。基因组DNA溶解于TE(10mMTris-HCl，pH7.5；1mM EDTA，pH8.0))溶液中，然后定量测定混合物在260nm吸收峰值。DNA工作液浓度校正至200ng/ul，置于-20度保存。

实施例3：DDAH1基因-396D/I启动子区多态性与冠心病的相关性研究

一、多态性位点识别确定

使用以上检测试剂盒，运用7900PCR仪进行扩增，最终对扩增结果进行读取分析。

二、统计方法

应用SPSS 15.0软件统计进行数据处理，计量资料符合正态分布以均值±标准差表示。计量资料组间比较用t检验。计数资料、基因型和等位基因频率比较采用卡方(χ²)检验计算。基因型和冠心病的相关性采用多因素Logistic回归分析调整心脑血管疾病传统危险因素的影响，包括性别、年龄、高血压、糖尿病、高胆固醇血症。基因型与冠心病发病的相对风险率用比值比(odds ratio，OR)和95％的可信区间(confidence interval，CI)表示。P＜0.05作为显著性标准。

表3：病例组和对照组的基础临床资料

^&P＜0.05，^*P＜0.01.

三、DDAH1-396D/I基因多态性与冠心病相关性分析

DDAH1基因在病例组和对照组基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡。DDAH1 I/I基因型(插入突变纯合子)和D/I基因型(杂合子)频率在冠心病组为24.4％较对照组17.7％降低(P＜0.01)，为调整传统心脑血管高危因素的影响，以性别、年龄、高血压、糖尿病、高胆固醇血症等因素为自变量，DDAH1-396D/I基因多态性与冠心病的相关性分别进行了非条件Logistic回归分析。在调整多重心脑血管危险因素以后，DDAH1-396I/I基因型(插入突变纯合子)和D/I型杂合子对冠心病具有致病作用，相对危险度为1.45(CI1.03-2.06)(见表4)。

表4：多因素Logistic回归分析该基因多态性在校正其它危险因素后与冠心病的相关性

DD缺失型纯合子，I/I插入型纯合子，D/I为杂合子。

OR针对显性模型D/I+I/I统计。

多元Logistic回归模型中危险因素包括性别，年龄，高血压，糖尿病，高胆固醇血症，吸烟。

本发明具有实用性的例证

1)本发明的的检测方法可用于分析DDAH1基因启动子区-396D/I多态性，应用在对冠心病的辅助性诊断和对个体有多大的冠心病患病风险进行评估。以利于开展冠心病的早期干预和治疗。

2)利用本发明阐述关于缺血性脑中新的基因多态性，作为生物标志物之一，可以用作药物设计分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节DDAH1表达的活性分子，促进降解ADMA的新药的开发。

3)本发明建立的检测DDAH1基因启动子区-396D/I多态性的核酸序列和冠心病相关位点，可高灵敏度、高特异性地应用于冠心病易感基因诊断用的试剂盒。

本发明所述的DDAH1基因和冠心病相关的DDAH1基因多态性位点-396D/I，提供了一种快速准确的测定方法，可以应用于冠心病相关基因多态性的基因诊断。

序列表

<110>华中科技大学同济医学院附属同济医院

<120>一种预测冠心病易感性的方法及其试剂盒

<130>

<160>5

<170>Patentin version 3.5

<210>1

<211>147

<212>DNA

<213>人属，人种

<220>

<221>SNP位点

<222>(86)

<223>x＝有gcgt或无gcgt

<400>1

caggtaaaga ccaggaagcc ctccagctgc tctgtccaga ccgaggccgg 50

ctctccaagt ccgcgctggg gacgatggga ggtgtxgcacc tgcgacagaa 100

cacaggtacc gccaggtccg ggtagcggtg gcttttcgcc gaggtcc 147

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

CAGGTAAAGA CCAGGAAGCC C 21

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

GGACCTCGGC GAAAAGC 17

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

CGCAGGTGCA CACCTCCCAT C 21

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

CGCAGGTGCA CGCACACCTC

Claims

1.一种预测冠心病易感性的方法，具体步骤是：

a.提取人外周血白细胞的基因组DNA；

b.对于受试者个体中DDAH1基因多态性位点-396 D/I，即序列表SEQ ID 1所示，通过序列表SEQ ID 2和3所示的F和R寡核苷酸引物序列，特异性地从上述DNA中扩增出来，并通过序列表SEQ ID 4和5所示的Taqman探针碱基序列来实现对DDAH1基因-396位点不同的基因型的检测；

c.将受试者个体的DDAH1基因-396位点的I/I，D/I和D/D基因型引入非条件Logistic回归分析模型中来预测冠心病的发病易感性。

2.一种用于制备测定权利要求1预测冠心病易感性方法的试剂盒，其特征在于：由以下试剂组成：400μl 2×Master Mix缓冲液，600μl超纯水，各2μl 100μM/L的探针混合物，各9μl100μM/L的F和R引物混合物，F和R引物是序列表SEQ ID 2和3所示的碱基序列；Taqman探针混合物是序列表SEQ ID 4和5所示的碱基序列及修饰基团；试剂盒的保存温度为-20度。