CN101354344A - 遗传信息及健康评估管理 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测个体心血管疾病遗传风险和健康评估和管理的试剂盒。该试剂盒包括检测血管紧张素转换酶基因(ACE)上rs4646994号SNP多态性基因型的电泳检测引物对、检测血管紧张素II－1型受体基因(AGTR1)上rs5186号SNP位点、G蛋白3亚单位基因(GNB3)上rs5443号SNP位点、内皮型一氧化氮合成酶基因(NOS3)上rs1799983号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件等。通过评估被检者心血管疾病的发病遗传风险对被检者进行心血管健康的评估，并根据被检者心血管疾病发病遗传风险相关的这4个SNP位点的基因型，制定符合被检者遗传体质的健康管理计划。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体遗传信息进行健康评估和管理的试剂盒。
背景技术
心血管疾病每年夺走1200万人的生命，接近世界人口总死亡数的1/4，成为人类健康的头号大敌。尽管近30年来，心血管病死亡率除东欧各国外的大多数国家都有不同程度的下降，但是在多数国家45岁以上男性死亡原因中仍高居首位，在女性中则是仅次于肿瘤的第二位死因，严重影响着人类的期望寿命和生存质量。随着我国步入老龄化社会，心脑血管疾病是整个社会面临的严重问题。
医学专家公认：控制心血管疾病重在预防，如早日知道健康状况，并采取措施，则50％以上的死亡是可以避免的。目前对心血管疾病的临床诊断措施是根据临床表现、心脏超声、心电图、X线检查。以上诊断措施可以诊断出已患上心血管疾病的人群，但存在滞后性，患病人群往往是在出现相应的临床症状后入院检查。另外通过这些诊断手段无法确定心血管疾病的真正原因，心血管疾病的机理比较复杂，需要一个科学的全面的解释。
WHO的专家指出：尽管心血管病是头号杀手，但如果积极开展预防，每年可挽救600万人的生命。不论是发展中国家还是发达国家，预防是最实际最少花费的办法，是不用药物而保持健康生活的方法。而已有的研究成果显示，高血压、冠心病等心血管疾病的相关因素都是受到遗传因素调控的。不同遗传体质的人发生心血管疾病的风险不同，所需的预防方式也存在差异。因此，了解自身的遗传状况及其对心血管健康的影响十分必要，也只有如此才能真正做到以积极的、有目的且有效的干预手段维持心血管系统健康，提高生命质量。通过利用先进的基因检测手段，破解心血管疾病代谢相关的易感基因，能够实现比较准确地预测心血管疾病的发病遗传风险，具有重要的应用价值和广泛的应用前景。
心血管疾病是遗传易感性和环境因素相互作用的结果。一般认为在比例上，遗传因素约占40％，环境因素约占60％。心血管疾病的遗传易感基因主要为血管紧张素转换酶基因(ACE)、血管紧张素II-1型受体基因(AGTR1)、G蛋白3亚单位基因(GNB3)、内皮型一氧化氮合成酶基因(NOS3)。经过国家生物基因检测技术应用评估认证中心的认定，确定这四种基因上四个多态性位点与心血管疾病的关联性得到了在中国人群中实验性数据支持，且从基因功能和通路上能解释基因变异导致心血管疾病的作用机理。通过检测这些基因位点，可以正确提示心血管疾病的风险。
在西藏人群中的研究表明ACE的I/D多态与西藏女性的原发性高血压发病、DBP、MAP的数值都有显著相关，而与男性的发病未发现明显相关。在中国汉族人群中对ACE的I/D多态进行了Meta分析，共对18项研究中的1612个病例对1710个对照进行分析，结果发现带有DD基因型的个体对其他个体的相对危险度为1.37(95％CI＝1.15-1.63，P＜0.01)，因此认为ACE的I/D多态在中国汉族人群中是原发性高血压的发病危险因子。在中国武汉的116例原发性高血压对91例正常对照的研究中发现，ACE的I/D多态中DD基因型对男性的原发性高血压的发病和血压升高有显著的影响(P＜0.05)。另外的研究也表明了ACE的I/D多态在中国的各地区的多个人群中与原发性高血压的发病相关，其中DD基因型可以作为原发性高血压的独立危险因子。
血管紧张素II-1型受体作为肾素-血管紧张素系统级联反应最后作用于靶细胞的共同通路倍受关注。血管紧张素II-1型受体基因A1166C多态性位于3’端非翻译区的5’末端，由碱基A被C替换而形成。该基因的这一位点一直是高血压及冠心病领域前沿的研究热点，目前主要集中在AGTR1基因多态A1166C与高血压、冠心病及其手术后再狭窄等副作用、心肌肥厚、心力衰竭等方面。通过大量研究表明，AGTR1基因AC基因型与原发性高血压有关，在中国汉族人群中C等位基因是高血压的危险因子。
对大庆地区187个高血压家系和189个非高血压家系的第一代子女进行空腹血糖、空腹胰岛素、血脂和纤维蛋白原等指标的测定，以多因素分析探讨GNB3C825T多态性与血压、胰岛素抵抗的关系。结果显示GNB3C825T基因型与胰岛素敏感性、血压水平及体重指数均相关。GNB3C825T等位基因增加胰岛素抵抗的升压作用，在相似的胰岛素抵抗条件下，CT/TT基因型者血压水平更高。
内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)主要分布于冠状血管及心腔面的内膜，主要功能是参与精氨酸和脯氨酸代谢，并催化生成一氧化氮(NO)。NO是一种内皮松弛因子，具有舒张血管、调节血流、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制血小板和白细胞粘附等重要功能，参与了多种疾病的病理生理过程。对192个高血压病人和122个健康人进行研究，发现高血压患者中G894G基因型的频率显著低于正常人群，说明G894G基因型降低了高血压的易感性。
发明内容
根据国家生物基因检测技术应用评估认证中心颁布的《中国人口健康服务基因位点认证规程》，对与心血管疾病发病遗传风险相关基因位点的支持文献、分子生物学机理研究、中国人群适用性等进行综合分析评估后，血管紧张素转换酶基因(ACE)上rs4646994号SNP位点、血管紧张素II-1型受体基因(AGTR1)上rs5186号SNP位点、G蛋白3亚单位基因(GNB3)上rs5443号SNP位点、内皮型一氧化氮合成酶(NOS3)上rs1799983号SNP位点通过国家生物基因检测技术应用评估认证中心认定，可用于检测评估心血管疾病发病遗传风险。
通过评估被检者心血管疾病的发病遗传风险对被检者进行心血管健康的评估，并根据被检者心血管疾病发病遗传风险相关的这4个SNP位点的基因型，制定符合被检者遗传体质的健康管理计划。
基于ACE、AGTR1、GNB3、NOS3基因上这4个SNP位点的多态性可用来评估个体心血管疾病发病遗传风险的基础上，本发明提供一种检测个体心血管疾病发病遗传风险的试剂盒。
该试剂盒包括：
检测ACE基因上rs4646994号SNP多态性基因型的电泳检测引物对。所述的电泳检测引物对具有SEQ IDNO：1和2所示序列。电泳检测引物对可用常规的合成技术进行合成。
检测AGTR1基因上rs5186号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对。所述的特异性引物对具有SEQ ID NO：3和4所示序列，所述的特异性荧光探针对指具有SEQ ID NO：9和10所示序列的Taqman探针对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成，特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。
检测GNB3基因上rs5443号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对。所述的特异性引物对具有SEQ ID NO：5和6所示序列，所述的特异性荧光探针对指具有SEQ ID NO：11和12所示序列的Taqman探针对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成，特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。
检测NOS3基因上rs1799983号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对。所述的特异性引物对具有SEQ ID NO：7和8所示序列，所述的特异性荧光探针对指具有SEQ ID NO：13和14所示序列的Taqman探针对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成，特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液、去离子水等)；
荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水等)。
本发明试剂盒的组分和含量包括：
1.荧光定量PCR反应套装
10X荧光定量PCR反应缓冲液3μl，
25mM dNTP混合液0.3μl，
25mM MgCl2溶液1.8μl，
5units/μl Taq DNA聚合酶0.075μl，
20μM特异性引物对每条引物各0.225μl，
10μM特异性荧光探针对每条探针各0.25μl，
去离子水15.975μl。
2.电泳检测套装
10X PCR反应缓冲液2.5μl，
25mM dNTP混合液0.2μl，
25mM MgCl2溶液1.5μl，
5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，
20μM ACE基因电泳检测引物对每条引物各0.25μl，
去离子水19.175μl，
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1.检测试剂盒的使用
步骤1：DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2：电泳检测分型
使用检测试剂盒中的电泳检测套装，其中，含有下列引物对：
有义引物：5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’(SEQ ID NO：1)
反义引物：5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’(SEQ ID NO：2)
反应的体系为总体积25μl，包含浓度为12.5ng/μl的DNA模板1μl、10XPCR反应缓冲液2.5μl，25mMdNTP混合液0.2μl，25mM MgCl2溶液1.5μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，20μM ACE基因电泳检测引物对每条引物各0.25μl，去离子水19.175μl。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟。
然后利用电泳技术，进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带数量。
步骤3：荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，其中，含有下列引物对和荧光探针对：
有义引物1：5’-TGCAGCACTTCAC-3’(SEQ ID NO：3)
反义引物1：5’-TCCTTCAATTCTGA-3’(SEQ ID NO：4)
有义引物2：5’-AGAGCATCATCTGCGGCAT-3’(SEQ ID NO：5)
反义引物2：5’-GGCGGCCACTGAGGG-3’(SEQ ID NO：6)
有义引物3：5’-CCCTGCTGCTGC-3’(SEQ ID NO：7)
反义引物3：5’-GGGGCAGAAGGAA-3’(SEQ ID NO：8)
带VIC荧光基团探针1：5’-TGAGCaTTAGCTACT-3’(SEQ ID NO：9)
带FAM荧光基团探针1：5’-TGAGCcTTAGCTAC-3’(SEQ ID NO：10)
带VIC荧光基团探针2：5’-ACGTCcGTGGCC-3’(SEQ ID NO：11)
带FAM荧光基团探针2：5’-ACGTCtGTGGCCT-3’(SEQ ID NO：12)
带VIC荧光基团探针3：5’-AgCCCCCAGAAC-3’(SEQ ID NO：13)
带FAM荧光基团探针3：5’-GAtCCCCCAGAAC-3’(SEQ ID NO：14)
有义引物1，反义引物1、带VIC荧光基团探针1、带FAM荧光基团探针1特异地针对检测AGTR1基因上rs5186号SNP位点多态性；
有义引物2，反义引物2、带VIC荧光基团探针2、带FAM荧光基团探针2特异地针对检测GNB3基因上rs5443号SNP位点多态性；
有义引物3，反义引物3、带VIC荧光基团探针3、带FAM荧光基团探针3特异地针对检测NOS3基因上rs1799983号SNP位点多态性；
3个SNP位点分别进行3次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积10μl，包含浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl 25mM dNTP混合液、0.6μl 25mM MgCl2溶液、0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物和反义引物各0.225μl、10μM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μl，去离子水5.325μl。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、2分钟，95℃、10分钟，进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤4：基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对4个SNP位点进行基因型分析。
熟悉电泳检测技术的本领域技术人员能够通过辨识电泳图上DNA条带的位置和数量来确定所检测的SNP位点的基因型。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.对人们进行个体心血管健康评估和管理的服务
步骤1：DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
步骤2：基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的ACE基因上rs4646994号SNP位点进行PCR扩增和电泳检测，对AGTR1基因上rs5186号SNP位点、GNB3基因上rs5443号SNP位点、NOS3基因上rs1799983号SNP位点进行荧光定量PCR检测，确定这4个SNP位点的基因型。
步骤3：个体心血管疾病发病遗传风险的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具个体心血管疾病发病遗传风险的分析报告单。报告中详细说明了被检测者心血管疾病发病遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体心血管疾病发病遗传风险分析报告单。
步骤4：个体心血管健康评估和管理
由医师向被检者详细说明心血管疾病发病遗传风险相关的这4个SNP位点的基因型，以及被检者的心血管健康遗传体质，制定符合被检者遗传体质的健康管理计划。
序列表
<110>上海主健生物工程有限公司
<120>遗传信息及健康评估管理
<160>14
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
CTGGAGACCA CTCCCATCCT TTCT 24
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
GATGTGGCCA TCACATTCGT CAGAT 25
<210>3
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
TGCAGCACTT CAC 13
<210>4
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
TCCTTCAATT CTGA 14
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
AGAGCATCAT CTGCGGCAT 19
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
GGCGGCCACT GAGGG 15
<210>7
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
CCCTGCTGCT GC 12
<210>8
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
GGGGCAGAAG GAA 13
<210>9
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>9
TGAGCaTTAG CTACT 15
<210>10
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>10
TGAGCcTTAG CTAC 14
<210>11
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>11
ACGTCcGTGG CC 12
<210>12
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>12
ACGTCtGTGG CCT 13
<210>13
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>13
AgCCCCCAGA AC 12
<210>14
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>14
GAtCCCCCAG AAC 13
Claims (5)
1.一种检测个体心血管疾病遗传风险和健康评估和管理的试剂盒，其特征在于：包括检测血管紧张素转换酶基因(ACE)上rs4646994号SNP多态性基因型的电泳检测引物对、检测血管紧张素II-1型受体基因(AGTR1)上rs5186号SNP位点、G蛋白3亚单位基因基因(GNB3)上rs5443号SNP位点、内皮型一氧化氮合成酶(NOS3)上rs1799983号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、PCR反应缓冲液、去离子水等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的电泳检测引物对具有SEQ ID NO：1和2所示序列。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物对是指具有SEQ ID NO：3和4、5和6、7和8所示序列的引物对。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性荧光探针对是指具有SEQ ID NO：9和10、11和12、13和14所示序列的Taqman探针对。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括：
1)荧光定量PCR反应套装：10X荧光定量PCR反应缓冲液3μl，25mM dNTP混合液0.3μl，25mM MgCl2溶液1.8μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.075μl，20μM特异性引物对每条引物各0.225μl，10μM特异性荧光探针对每条探针各0.25μl，去离子水15.975μl。
2)电泳检测套装：10X PCR反应缓冲液2.5μl，25mM dNTP混合液0.2μl，25mM MgCl2溶液1.5μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，20μM特异性引物对每条引物各0.25μl，去离子水19.175μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
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| Publication Number | Publication Date |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090128 |