CN111471753A - 一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法，包括：确定基因检测的目标基因和位点；制备特异性多重PCR引物或基因芯片；提取DNA数据，通过多重PCR扩增和基因芯片检测的结合或者多重PCR扩增和高通量测序法的结合对DNA数据进行检测；对DNA数据进行生物信息分析，获取目标位点的基因型；采用复合随机森林算法构建风险评估模型并进行计算，获得不同基因型、表型和疾病的风险评分，从而获得检测和评估报告，对患者进行遗传咨询和健康指导。排除了假基因等非特异性扩增，检测结果的特异性高；所有基因和位点都经过严格验证，权威，降低了检测和评估成本，方便受检者就检，节约医疗资源，降低社会成本。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体地说涉及一种评估女性生育遗传风险和指导健康管理的基因检测方法。
背景技术
生育评估也称医学生育力评估，主要是对有意生育的育龄夫妇的病史、职业、饮食、居住环境、女性的排卵情况、输卵管功能及卵巢功能和男性精液情况等进行系统多项的评估。
目前医院的女性生育力评估主要包括卵巢功能评估、子宫输卵管检查、子宫形态检查、免疫检查和性激素指标等。目前针对女性生育的评估很少有全面的遗传基因方面的检测。
有研究表明，肥胖、卵巢功能、甲状腺功能、糖尿病和叶酸吸收能力等均会影响女性的生育力。肥胖的人往往激素分泌低于正常水平或激素受体不敏感，因此导致女性的性欲下降。值得注意的是，如果是中度或者是重度的肥胖患者，对性功能也会有影响。这是由于肥胖所产生的过多的脂肪蓄积在体内，使得身体内所分泌的性激素被脂肪所阻断无法让其发挥正常的功能，进而导致肥胖的人性欲下降，比正常人拉低许多。肥胖还会造成女性的内分泌紊乱，女性的正常排卵是需要性激素来刺激合成才能正常的运转。而性激素由于脂肪阻断一方面致使内分泌紊乱，另一方面改变了分泌以及合成的正常规律，从而影响了排卵周期导致生育受到影响。肥胖的妇女往往还容易患多囊卵巢综合征，该综合征以雄激素水平较高为特征，导致妇女月经渐少甚至导致闭经，并且面部青春痘过多，伴有身体的体毛过多等症状，体内的雄性激素过多而导致卵泡发育不成熟，进而影响了正常卵的排放。卵巢功能早衰(POF)是指卵巢功能衰竭所导致的40岁之前即闭经的现象。特点是原发或继发闭经伴随血促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，并伴有不同程度的一系列低雌激素症状如：潮热多汗、面部潮红、性欲低下等。妇女的平均自然绝经年龄为50～52岁，绝经年龄存在着种族和地区分布的差异，但其绝对值相差不大。Coulam等总结1858例妇女的自然闭经情况，小于40岁的POF发生率为1％，小于30岁的POF发生率为1‰。原发闭经中POF占10％～28％，继发闭经中POF占4％～18％。徐苓等发现北京地区妇女POF发生率为1.8％。由此可见，POF在临床上并不少见。POF患者至少有6个月的闭经史和卵泡刺激素血浆水平升高(超过40mIU/ml)；该疾病可能是由于滤泡池过早枯竭，滤泡闭锁，卵泡生长停滞或卵巢发育不全。甲状腺是人体重要的内分泌器官,其功能亢进或减退均会影响女性生育能力。甲状腺功能异常可影响女性血清促性腺激素和性激素水平。甲状腺激素可直接作用于卵巢,其过多或过少均可影响卵泡发育,损害卵巢储备力。甲状腺激素对输卵管功能的影响尚不明确。已有证据显示甲状腺激素可直接参与调节子宫内膜生理功能,影响子宫内膜容受性。甲状腺疾病可能影响宫腔对妊娠的承受能力,增加产科并发症和不良妊娠结局的发生。糖尿病患者由于体内胰岛素水平异常和/或血糖控制不佳，可导致下丘脑-垂体-卵巢轴激素分泌失调、卵泡募集及卵子发育异常，从而使其生殖系统功能受损。胰岛素缺乏型的糖尿病患者，胰岛素水平低下可导致下丘脑亲吻素(kisspeptin)蛋白表达下降。由于kisspeptin具有刺激促性腺激素释放激素(GnRH)分泌的作用，因此胰岛素缺乏可致使GnRH分泌减少，进一步导致促卵泡生成素/促黄体生成素(FSH/LH)分泌均不足，造成低促性腺激素型性腺功能减退。补充外源性胰岛素可纠正这一激素水平异常。糖尿病患者需皮下注射胰岛素者，由于外源性胰岛素直接进入体循环未经过肝的清除效应，外周组织的胰岛素水平要比生理状态下高。另外有部分2型糖尿病或糖耐量异常患者因胰岛素抵抗导致内源性胰岛素水平过高。以上两种原因造成的体内外源性胰岛素水平过高，首先可促进卵泡膜细胞分泌睾酮和雄烯二酮导致高雄激素血症；其次胰岛素和FSH的共同作用可刺激颗粒细胞分泌雌激素，促进卵泡募集和生长，出现多囊卵巢的表现。与非糖尿病的多囊卵巢综合症不同，胰岛素可协同促性腺素的作用而促进卵泡成熟。糖尿病会导致卵巢储备下降及卵子凋亡，糖尿病控制不佳导致血糖升高，一方面高血糖导致晚期糖基化终末产物及其受体增加，上述物质可影响卵子发育，造成卵子凋亡及卵巢储备功能下降。另一方面，糖毒性加重胰岛素抵抗，使内源性胰岛素分泌过多或外源性胰岛素用量增加，从而使卵巢暴露于高胰岛素的环境中。
现有技术中还没有根据受检者唾液、口腔拭子、末梢血或外周血等的基因检测结果综合评估女性受检者生育遗传背景，并根据评估结果，从单基因遗传病的突变基因、卵巢功能早衰易感基因、糖脂代谢疾病(糖尿病、甲状腺疾病和肥胖等)易感基因、营养物质吸收代谢相关的单核苷酸多态性基因位点等方面，结合受检者临床表现，通过基于机器学习的人工智能算法对患者输出整体的生育遗传风险评估报告，以综合判断生育相关疾病的发病风险情况，进行全面精准的健康管理建议。
发明内容
为了克服现有技术中这部分的缺失及不足，本发明提供一种评估女性生育相关因素的遗传背景，如卵子生成和发育、糖脂代谢、营养代谢、运动等，结合基于机器学习的人工智能算法对生育遗传背景相关疾病的发病风险进行评估，并指导健康管理的基因检测方法和算法模型，即一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法，包括如下步骤：
步骤1，确定基因检测的目标基因和位点；
步骤2，制备特异性多重PCR引物或基因芯片，提取DNA，通过多重PCR扩增和基因芯片检测，或通过多重PCR靶向特异性扩增和第二代测序技术的结合对样本所述DNA进行检测；
步骤3，对所述DNA的测序数据进行生物信息分析，获取所有目标位点的基因型；
步骤4，采用复合随机森林算法(Composite Random Forest Algorithm,CRFA)构建风险评估模型并进行计算，获得不同基因型、表型和疾病的风险评分，从而获得检测和评估报告，对患者进行遗传咨询和健康指导。
优选的，所述步骤1采用复合随机森林算法风险评分算法，根据文献资料和高通量测序实验结果确定基因检测的目标基因和位点。
优选的，所述步骤2所述提取DNA的数据以及所述多重PCR扩增的步骤包括：
步骤21，进行样本DNA提取，所述样本为血液或唾液；
步骤22，采用NanoReady分光光度计进行所述样品的定量检测；
步骤23，进行引物的制备，包括引物稀释以及多重PCR引物的混合合管制备；
步骤24，进行多重PCR扩增；
步骤25，进行电泳检测，获得电泳图谱；
步骤26，对DNA扩增产物进行纯化；
步骤27，采用测序快速DNA建库试剂进行文库制备；
步骤28，实施高通量测序或特定的基因芯片检测；
步骤29，将基因分型结果进行“格式化”或取对数的预处理，引入多基因变异风险评分算法(Polygenic Risk Score)；
步骤210，将表型数据，进行预处理和格式化，与基因型数据一起输入复合随机森林算法模型，经过对影响生育的因素进行逐一风险评分，综合各项结果输出整体评分结果。
优选的，所述步骤21包括：
步骤211，采用柱式法对血液样本进行提取，采用手动单管操作的方式，包括：
步骤2111，向离心管中加入一定量的血液后加入Proteinase K，混匀；
步骤2112，加入Buffer GL，振荡至彻底混匀；
步骤2113，在一定温度下孵育一定时间，所述孵育过程中颠倒混匀数次；或者在相同的温度下进行金属浴，一定转速下孵育相同的时间；
步骤2114，加入一定量的无水乙醇，颠倒混匀数次从而在短暂离心的作用下，使管壁和壁盖上的液体集中到管底；
步骤2115，将所述步骤2114所得的溶液全部加入已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液，分多次转入，一定转速下离心旋转1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
步骤2116，向所述吸附柱中加入一定量的Buffer GW1，所述Buffer GW1在使用前检查是否加入无水乙醇，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心旋转1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
步骤2117，向所述吸附柱中加入与所述Buffer GW1数量相同的Buffer GW2，在使用前检查是否加入无水乙醇，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
步骤2118，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心2分钟，将吸附柱置于一个新的离心管中，打开吸附柱的管盖，置于室温数分钟，以彻底晾干；
步骤2119，向所述吸附柱的中间部位悬空加入一定量的1×TE buffer或去离子水，室温放置数分钟，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心1分钟，收集DNA溶液，在-20℃保存所述DNA溶液；
以及步骤212，采用柱式法对唾液样本进行提取，采用手动单管操作的方式，包括：
步骤2121，向离心管中加入唾液样本或唾液/保存液混合液，加入一定量的Proteinase K，所述唾液/保存液混合液在提取前进行50℃水浴1小时或进行50℃空气温箱2小时；
步骤2122，加入一定量的Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，然后进行56℃水浴15-30分钟；
步骤2123，在微型离心机中进行短暂离心，以去除管盖内壁附着的水珠，加入一定量的无水乙醇，立即涡旋震荡充分混匀，然后再一次进行短暂离心，对形成的溶胶状产物进行剧烈震荡或涡旋处理；
步骤2124，将步骤2123中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，一次或多次转入，在与所述步骤2115相同或高于其的所述转速下离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
步骤2125，向吸附柱中加入一定量的Buffer GW1，使用前检查是否已加入无水乙醇，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
步骤2126，向吸附柱中加入一定量的Buffer GW2，使用前检查是否已加入无水乙醇，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
步骤2127，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心2分钟，将吸附柱置于一个新的离心管中，打开吸附柱的管盖，置于室温数分钟，以彻底晾干；
步骤2128，向吸附柱的中间部位悬空加入一定量的1×TE buffer或去离子水，室温放置数分钟，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心1分钟，收集DNA溶液，在-20℃保存所述DNA溶液。
优选的，所述步骤23包括：
步骤231，进行引物稀释，将设计合成的221对引物稀释为一定容积；
步骤232，进行多重PCR引物合管，将221对引物分为A、B两组，其中A组111对引物，B组110对引物；A组为取一离心管，加入一定量的双蒸水，111对引物中分别取1μl加入该离心管中，得到2pM混合引物，命名为SYL-A；B组为取一离心管，加入一定量的双蒸水，110对引物中分别取1μl加入该离心管中，得到2pM混合引物，命名为SYL-B。
优选的，所述步骤24包括：
步骤241，将HiFi HotStart ReadyMix、Prime(SYL-A or SYL-B)、Prime(SYL-A orSYL-B)、DNA模板和双蒸水，到0.2ml PCR管或八连排管中；
步骤242，进行如下PCR反应：
步骤2421，预变性：在温度95摄氏度下循环1次10分钟；
步骤2422，95摄氏度下进行30秒变性后，从60摄氏度降低到1摄氏度进行30秒退火，最后进行72摄氏度下的延伸45秒，所述步骤242重复10次；
步骤2423，在95摄氏度下进行30秒变性后，进行52摄氏度的退火30秒，此后进行72摄氏度的延伸45秒，所述步骤243重复30次；
步骤2424，进行最终延伸，在72摄氏度下最终延伸5分钟，循环1次；
步骤2425，在4摄氏度下进行PCR扩增后的保存。
优选的，所述步骤25包括：
步骤251，进行琼脂糖凝胶的制备，包括：称取一定量琼脂糖，加入到相应量的1×TAE中，置于微波炉中加热至完全溶解，取出摇匀，灯光下观察无白色细小晶体颗粒，冷却至60℃左右即可；
步骤252，进行灌胶：向冷却到60℃左右的琼脂糖溶液中加入Goldview，摇匀，轻轻倒入安装好凝胶托盘的制胶器中，然后立即在特定位置插入25齿的梳子，待琼脂糖凝胶凝固后，拔出梳子，将琼脂糖凝胶置于电泳槽中；
步骤253，加样：将一定量扩增产物和Lading Buffer加入新的PCR管或八连排管中，混合均匀，用微量移液器将上述混合液加到点样孔中，记录样品的点样次序；
步骤254，进行电泳：盖上电泳槽上盖，安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调整电压后进行电泳，当条带移到距凝胶前沿2-3cm时，停止电泳；
步骤255，取出凝胶，在凝胶成像系统下观察，并保存和记录电泳图谱。
优选的，所述步骤26的所述纯化采用DNA纯化试剂盒。
优选的，所述步骤27对于样本要求为：5ng-1μg打断的双链DNA，溶于EB，即10mMTris-HCl pH 8.0或去离子水中，DNA纯度要求为OD260/OD280＝1.8～2.0，所述步骤27包括：
步骤271，进行DNA末端修复反应，包括：
步骤2711，向PCR管中加入以下试剂：10×End Repair Reaction Buffer、Endprep Enzyme Mix、Fragmented DNA以及RNase-free Water；
步骤2712，用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心，使所有组分收集到管底；
步骤2713，将所述PCR管置于PCR仪中，热盖打开进行反应程；
步骤272，进行接头连接，将所述步骤271的产物末端，连接特定的接头，包括：
步骤2721，将Adaptor用去离子水稀释10倍；
步骤2722，在步骤271的PCR管中配制如下反应体系：T4 DNA ligase buffer、T4DNA ligase以及稀释后的Adaptor；
步骤2723，使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；
步骤2724，将PCR管置于PCR仪中，进行接头连接反应；
步骤273，连接产物磁珠纯化，使用磁珠对所述步骤272的产物进行纯化。纯化除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物，包括：
步骤2731，涡旋振荡CMPure，使其彻底混匀为均一溶液；
步骤2732，将Adaptor连接反应液转移至一新的离心管中；
步骤2733，加入1倍样本体积的CMPure，吸打混匀后在室温静置5分钟；
步骤2734，短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清，小心吸取上清溶液并将其弃除；
步骤2735，继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入一定量新鲜配制的80％乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清溶液；
步骤2736，重复步骤2735，总计漂洗两次；
步骤2737，保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥；
步骤2738，将离心管从磁力架上取下，加入一定量自备EB或去离子水，涡旋振荡并用移液器反复吹吸混匀，使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟；
步骤2739，进行短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清，将洗脱液转移至一个新的PCR管中；
步骤274，进行文库扩增，对纯化后的接头连接产物进行PCR扩增富集，包括：
步骤2741，将如下试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用，所述试剂包括：2×High-Fidelity Mix，Primer mix以及所述步骤262的产物Adapter Ligated DNA；
步骤2742，在无菌PCR管中配制所述试剂形成的PCR扩增反应体系；
步骤2743，使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；
步骤2744，将PCR管置于PCR仪中，设置如下所示反应程序，进行PCR扩增，包括：第一过程：98摄氏度下循环1分钟；第二过程：98摄氏度10秒钟扩增，60摄氏度30秒钟扩增，第二过程循环7-9次；第三过程72摄氏度30秒钟；第四过程：72摄氏度5分钟，循环1次；第五过程：保持4摄氏度；
步骤275，扩增产物磁珠纯化或分选，采用如所述步骤273进行纯化操作，使用DNASelection Beads，0.9×，Beads:DNA＝0.9:1的纯化文库扩增产物；
步骤276，通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价和文库质量控制，其中所述浓度检测使用：基于双链DNA荧光染料的方法或基于qPCR绝对定量的方法；所述文库长度分布检测通过基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
优选的，所述步骤28中所述高通量测序采用上机进行测序，按照样品填写相应信息，所述测序策略为Illumina Hiseq/NovaSeq PE150，测序深度为3000×。
优选的，所述多基因变异风险评分算法(Polygenic Risk Score)，公式如下：
其中，PT,j表示P值的阈值；i表示符合该阈值下SNP的数量，i＝1,2,3……m；βi表示SNP的效应值，在基因组关联分析(GWAS)中，如果表型为线性数据，则该值为β；如果表型数据是二元分类数据，该值为ood ratio(OR)；Gi，j表示SNP的基因型，并别用{0,1,2}表示。
优选的，所述步骤210包括：将年龄、身高、体重、BMI、基础内分泌、AMH、既往病史、生育疾病家族史、血糖、血脂、胰岛素水平、治疗史的表型数据，进行预处理和格式化，与所测序获得的基因型数据一起输入复合随机森林算法模型，经过对卵巢早衰、卵巢老化、雌激素敏感性、卵子生成、卵子成熟障碍、肥胖、糖脂代谢异常的影响生育的因素逐一进行风险评分，综合各项结果输出整体评分结果。
本发明的有益效果：
1、结果特异性强。本发明排除了假基因等非特异性扩增，因此，检测结果的特异性高。
2、权威。本发明选取的位点来源于国际文献资料和本实验室算法模型评分实验结果，所有基因和位点都经过严格、有序的筛选和验证，且靶位点会随着样本数量增多和文献报道累积进行“自我学习”和“优化”。
3、准确。本发明采用的一代测序技术、二代测序技术和高通量的基因芯片技术是目前国际上公认的基因检测方法，得到行业普遍认可；所采用的复合随机森林算法模型在临床数据和基因型数据分析中表现出优异的准确率和复现率。
4、实惠。采用适宜技术，结合机器学习的算法模型，有效降低了检测和评估成本，方便有需求的受检者就检。
5、可以对高龄未婚未育女性、有生育困难家族史的女性人群进行精准的风险评估，有利于卵巢早衰、卵子发育障碍和不明原因不孕不育等生育困难问题的预防和解决，节约医疗资源，降低社会成本。
根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。
附图说明
附图1为根据本发明第一和第二实施例的评估女性生育遗传背景，指导健康管理的基因检测方法和人工智能评估的流程图；
附图2为根据本发明第一和第二实施例的评估女性生育遗传背景，指导健康管理的基因检测方法和人工智能评估的复合随机森林算法模型示意图。
具体实施方式
参见图1-2，本实施例中评估女性生育遗传背景和指导健康管理的基因检测方法和人工智能算法模型，即基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法包括如下步骤：
步骤1，确定基因检测的目标基因和位点；
步骤2，制备特异性多重PCR引物或基因芯片；提取DNA数据，通过多重PCR扩增和基因芯片检测的结合或者多重PCR扩增和高通量测序法的结合对所述DNA数据进行检测；
步骤3，对所述DNA数据进行生物信息分析，获取目标位点的基因型；
步骤4，采用基于多基因风险评分(Polygenetic Risk Score，PRS)和复合随机森林算法的人工智能风险评估模型进行计算，获得不同基因型和相关疾病的风险评分，从而获得检测报告，对患者进行遗传咨询。
第一实施例：步骤2中采用多重PCR+高通量测序法，完整的测试过程如下。
1、样本提取
1.1柱式法血液DNA提取
操作步骤(手动单管操作)：
1.1.1.向1.5ml的离心管中加入200μl的血液，之后加入20μl Proteinase K，混匀。
注意：1)冷冻抗凝血液需提前在室温(15-30℃)下放置，融化混匀。
2)如血液体积小于200μl时，加入Buffer GR补足至200μl，再进行下一步实验。
1.1.2.加入200μl Buffer GL，振荡至彻底混匀。
1.1.3.56℃孵育10分钟，期间颠倒混匀数次(或金属浴56℃，1600转孵育10分钟)。
1.1.4.加入200μl无水乙醇，颠倒混匀数次。短暂离心，使管壁和壁盖上的液体集中到管底。
1.1.5.将步骤1.1.4所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin ColumnsDM)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
1.1.6.向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
1.1.7.向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
1.1.8.12,000rpm离心2分钟，将吸附柱置于一个新的1.5ml离心管中，打开吸附柱的管盖至于室温数分钟，以彻底晾干。
1.1.9.向吸附柱的中间部位悬空加入50μl 1×TE buffer或去离子水，室温放置数分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
1.2柱式法唾液DNA提取试剂
操作步骤(手动单管操作)：
1.2.1.向1.5ml的离心管中加入唾液样本或唾液/保存液混合液400μl，加入40μlProteinase K。
注意：加入保存液的唾液混合物需在提取前50℃水浴1小时或50℃空气温箱2小时。
1.2.2.加入400μl Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，56℃水浴15-30分钟。
1.2.3.短暂离心以去除管盖内壁的水珠。加入400μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。短暂离心。
注意：1)加入Buffer GL和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。
2)加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。
3)GL和无水乙醇后可能形成溶胶状产物，此时推荐进行剧烈震荡或涡旋处理。
1.2.4.上一个步骤中所得溶液全部加入到已装入收集管(Collection Tube)的吸附柱(Spin Column DM)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm(～13,400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
1.2.5.向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
1.2.6.向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
1.2.7.12000rpm离心2分钟，将吸附柱置于一个新的1.5ml离心管中，打开吸附柱的管盖至于室温数分钟，以彻底晾干。
1.2.8.向吸附柱的中间部位悬空加入50μl 1×TE buffer或去离子水，室温放置数分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
2、定量：NanoReady分光光度计操作规程
仪器使用前，先检查仪器与电脑的连接线是否正常连接，然后再打开电脑和仪器电源。
用干净的无尘纸擦拭干净上下基座，放下基座臂。
打开电脑桌面NanoReady软件，单击右上角“连接”按钮，将仪器与电脑进行连接。
参数选择：类型选择“DNA”，勾选基线校正340nm。
用干净的无尘纸擦拭干净上下基座，取2μl缓冲溶液加到检测基座上，放下基座臂，并点击“空白检测”，直到曲线在±0.05范围之内。
用干净的无尘纸擦拭干净上下基座，取2μl缓冲溶液加到检测基座上，放下基座臂，点击“检测”，进行检测，曲线在±0.05范围之内，即可进行样本检测，如不在上述范围，需返回第5部重新进行“空白检测”。
用干净的无尘纸擦拭干净上下基座，取2μl样本加到检测基座上，放下基座臂，并点击“检测”，记录检测数据。
样品测完后，用干净的无尘纸擦拭干净上下基座，重复步骤7的操作，这样仪器就可以进行下一个样品的检测。
当检测完毕后，用干净的吸纸把小冒上的样品擦干净。这样就可以避免样品在基座上的残留。
检测结束后，用干净的无尘纸擦拭干净上下基座，取2μl无菌水加到检测基座上，放下基座臂。清洗基座臂。
断开连接，关机。先关闭软件，再关闭电脑电源。
3、引物制备
3.1引物稀释
按照《Oligo合成报告单》提供的信息将221对引物稀释为600pM。例如：
引物FOXL2-c.560-F为每管8.35nmol，则加水量为83.51/6＝13.92μl
3.2多重PCR引物合管
将221对引物分为A、B两组(A组111对引物，B组110对引物)
A组：取一1.5ml离心管，加78μl双蒸水，111对(222管)600P引物中分别取1μl加入该1.5ml离心管中，得到2pM混合引物，命名为SYL-A；
B组：取一1.5ml离心管，加80μl双蒸水，110对(220管)600P引物中分别取1μl加入该1.5ml离心管中，得到2pM混合引物，命名为SYL-B。
4、多重PCR扩增
4.1、将如表1所示组分加到0.2ml PCR管或八连排管中：
表1多重PCR扩增过程中的组分
4.2、PCR反应程序，如表2所示
表2 PCR反应程序列表
5、电泳检测
5.1、琼脂糖凝胶的制备
称取1.5g琼脂糖，加入到100ml 1×TAE中，置于微波炉中加热至完全溶解，取出摇匀，灯光下观察无白色细小晶体颗粒(加热时间不宜过长，以防溶液蒸发使凝胶浓度改变)，冷却至60℃左右即可。
本实施例所用琼脂糖凝胶浓度为1.5％，如需改变浓度，则配制n％的琼脂糖凝胶，即向100ml 1×TAE中加入n g琼脂糖，按上述方法加热溶解即可。
5.2、灌胶
向冷却到60℃左右的琼脂糖溶液中加入Goldview(8μl)，摇匀，轻轻倒入安装好凝胶托盘的制胶器中，然后立即在特定位置插入25齿的梳子。(灌胶过程应迅速，以防琼脂糖凝胶凝固造成灌胶失败，所制得的琼脂糖凝胶不能有气泡，如灌胶过程中产生气泡，则小心震动制胶器或用移液器吸头将气泡戳破)待琼脂糖凝胶凝固后，拔出梳子。将琼脂糖凝胶置于电泳槽中，注意正负极方向不要放反，槽内缓冲液为1×TAE，缓冲液要没过胶面，点样孔充满液体，然后进行下一步操作。
5.3加样
将5μl扩增产物和1μl Lading Buffer加入新的0.2ml PCR管或八连排管中，混合均匀，用微量移液器将上述混合液加到点样孔中，记录样品的点样次序
5.4电泳
盖上电泳槽上盖，安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至95V，电泳30-40分钟，当条带移到距凝胶前沿2-3cm时，停止电泳。
5.5观察
取出凝胶，在凝胶成像系统下观察，并保存和记录电泳图谱。
6、扩增产物纯化
采用康为世纪DNA纯化试剂盒纯化DNA扩增产物。
7、文库制备
使用二代测序快速DNA建库试剂盒
样本要求：5ng-1μg打断的双链DNA，溶于EB(10mM Tris-HCl pH 8.0)或去离子水中。
DNA纯度要求：OD260/OD280＝1.8～2.0
7.1、DNA末端修复反应
1)、向200μl PCR管中加入以下试剂，如表3所示
表3 DNA末端修复反应所需要的试剂
2)、用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心，使所有组分收集到管底。
3)、将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开，反应程序如下：
| 温度 | 时间 |
| 12℃ | 15分钟 |
| 37℃ | 15分钟 |
| 72℃ | 20分钟 |
| 4℃ | 保持 |
7.2、接头连接(Adapter Ligation)
使用二代测序多样本接头引物试剂盒Ⅰ和试剂盒Ⅱ
该步骤将6.1步骤的产物末端，连接特定的测序接头。
1)、将Adaptor用去离子水稀释10倍至1.5μM
2)、将表中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
3)、于7.1步骤PCR管中配制下面表中所示反应体系，如表4所示。
表4 PCR接头连接反应体系
4)、使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
5)、将PCR管置于PCR仪中，进行接头连接反应。接头连接反应流程如表5所示。
表5接头连接反应流程
7.3、连接产物磁珠纯化(Post Ligation Clean Up)
该步骤使用磁珠对7.2步骤的产物进行纯化。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。
1)、涡旋振荡CMPure 20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
2)、将Adaptor连接反应液转移至一新的1.5ml离心管中。
3)、加入1倍样本体积(83.5μl)的CMPure，吸打混匀后，室温静置5分钟。
4)、短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)，小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意：不要弃除磁珠。
5)、继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新鲜配制的80％乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
6)、重复步骤5，总计漂洗两次。
7)、保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
8)、将离心管从磁力架上取下，加入26-28μl EB(自备)或去离子水，吸打混匀使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。
9)、短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟)，将23μl洗脱液转移至一个新的PCR管中。
7.4、文库扩增(Library Amplification)
该步骤将对纯化后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1)、将下表中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
2)、于无菌PCR管中配制下表所示反应体系，如表6
表6 PCR扩增反应体系
3)、使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
4)、将PCR管置于PCR仪中，设置下表所示反应程序，进行PCR扩增。
表7所示为PCR扩增反应流程。
表7 PCR扩增反应流程
7.5、扩增产物磁珠纯化或分选(Post Amplification Clean Up/SizeSelection)
同7.3.1步骤中纯化操作步骤。使用
DNA Selection Beads(0.9×，Beads:DNA＝0.9:1)纯化文库扩增产物。如需分选，操作方法同7.3.2双轮分选步骤(纯化步骤省略)。
7.6、文库质量控制
通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价。
1)、通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2)、文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如
等；基于qPCR绝对定量的方法。
3)、文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如
等。
4)、优选的，本实施例采用qPCR方法进行文库浓度检测：
等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库)，可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
5)、文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
7、高通量测序
上机进行测序，按照其样品接收单填写相应信息(测序策略：IlluminaHiseq/NovaSeq平台，PE150；测序深度为3000×)。
8、测序数据生物信息分析，PRS算法评分。
9、复合随机森林算法模型分析，算法分析步骤如下：
1)假设存在优秀的数据集D＝{Xi1,Xi2,Xi3，……，Xin，Yi}(i∈[1,m])；
2)构建基于多重决策树分类学习器，就每个样本进行抽样，如下：
Dj＝{Xi1,Xi2,Xi3，……，Xik,Yi}(i∈[1,m]),其中K<<m，按照此规则生成决策树，并且记录每个决策树的结果hj(x)；
3)按照此公式建立训练数据T次级模式，
其中，δ(x)是一系列算法，包括绝对多数投票、相对多数投票和加权投票法等。
10、输出评估结果。
第二实施例：步骤2中采用多重PCR结合基因芯片法。
其中步骤1-6与第一实施例类似，将步骤7由高通量测序基因分型方法变更为采用基因及位点信息、引物信息进行基因芯片的测序，测序数据分析后根据基因图谱进行风险评估。
基因芯片是一个封闭的检测系统，用于快速高通量的获取基因分型信息，而二代测序是一个开放的发现系统，可以发现目前人类未报道的新基因信息，因此对于实施例二我们采用已经经过验证的基因和位点以及引物信息，测序的成本和操作复杂度会高于多重PCR结合高通量基因芯片的方式，二代测序的时效性难以克服，无法快速获得大量已知临床意义基因分型，而本实施例的多重PCR扩增技术结合高通量的基因芯片检测，可以灵活操作且方便较快采集到所需的基因型数据，检测成本较低。
采用本实施例一和实施例二的方法获得如表8所示的部分基因及位点以及表9所示的部分基因位点的引物信息，因此获得了如下特点的技术方案：
1、结果特异性强。本发明排除了假基因等非特异性扩增，因此，检测结果的特异性高。
2、权威。本发明选取的位点来源于国际文献资料和本实验室算法模型评分实验结果，所有基因和位点都经过严格、有序的筛选和验证，且靶位点会随着样本数量增多和文献报道累积进行“自我学习”和“优化”。
3、准确。本发明采用的一代测序技术、二代测序技术和高通量的基因芯片技术是目前国际上公认的基因检测方法，得到行业普遍认可；所采用的复合随机森林算法模型在临床数据和基因型数据分析中表现出优异的准确率和复现率。
4、实惠。采用适宜技术，结合机器学习的算法模型，有效降低了检测和评估成本，方便有需求的受检者就检。
5、可以对高龄未婚未育女性、有生育困难家族史的女性人群进行精准的风险评估，有利于卵巢早衰、卵子发育障碍和不明原因不孕不育等生育困难问题的预防和解决，节约医疗资源，降低社会成本。
虽然本发明已经参考特定的说明性实施例进行了描述，但是不会受到这些实施例的限定，而受到较为全面的附加权利要求的限定。在一些情况下，本领域技术人员可能会理解本发明，且在不偏离本发明的保护范围和精神的情况下，对本发明的实施例进行改动和修改。这些情况也在本发明的权利要求书范围内。
表8部分基因及位点
表9部分基因位点的引物信息
Claims (12)
1.一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1，确定基因检测的目标基因和位点；
步骤2，制备特异性多重PCR引物或基因芯片；提取DNA数据，通过多重PCR扩增和基因芯片检测的结合，或通过多重PCR靶向特异性扩增和第二代测序技术的结合对样本所述DNA数据进行检测；
步骤3，对所述DNA的测序数据进行生物信息分析，获取所有目标位点的基因型；
步骤4，采用复合随机森林算法(Composite Random Forest Algorithm,CRFA)构建风险评估模型并进行计算，获得不同基因型、表型和疾病的风险评分，从而获得检测和评估报告，对患者进行遗传咨询和健康指导。
2.根据权利要求1所述的一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法，其特征在于：所述步骤1采用复合随机森林算法风险评分算法，根据文献资料和高通量测序实验结果确定基因检测的目标基因和位点。
3.根据权利要求1所述的一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法，其特征在于：所述步骤2所述提取DNA的数据以及所述多重PCR扩增的步骤包括：
步骤21，进行样本DNA提取，所述样本为血液或唾液；
步骤22，采用NanoReady分光光度计进行所述样品的定量检测；
步骤23，进行引物的制备，包括引物稀释以及多重PCR引物的混合合管制备；
步骤24，进行多重PCR扩增；
步骤25，进行电泳检测，获得电泳图谱；
步骤26，对DNA扩增产物进行纯化；
步骤27，采用测序快速DNA建库试剂进行文库制备；
步骤28，实施高通量测序或特定的基因芯片检测；
步骤29，将基因分型结果进行“格式化”或取对数的预处理，引入多基因变异风险评分算法(Polygenic Risk Score)；
步骤210，将表型数据，进行预处理和格式化，与基因型数据一起输入复合随机森林算法模型，经过对影响生育的因素进行逐一风险评分，综合各项结果输出整体评分结果。
4.根据权利要求3所述的一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法，其特征在于：所述步骤21包括：
步骤211，采用柱式法对血液样本进行提取，采用手动单管操作的方式，包括：
步骤2111，向离心管中加入一定量的血液后加入Proteinase K，混匀；
步骤2112，加入Buffer GL，振荡至彻底混匀；
步骤2113，在一定温度下孵育一定时间，所述孵育过程中颠倒混匀数次；或者在相同的温度下进行金属浴，一定转速下孵育相同的时间；
步骤2114，加入一定量的无水乙醇，颠倒混匀数次从而在短暂离心的作用下，使管壁和壁盖上的液体集中到管底；
步骤2115，将所述步骤2114所得的溶液全部加入已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液，分多次转入，一定转速下离心旋转1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
步骤2116，向所述吸附柱中加入一定量的Buffer GW1，所述Buffer GW1在使用前检查是否加入无水乙醇，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心旋转1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
步骤2117，向所述吸附柱中加入与所述Buffer GW1数量相同的Buffer GW2，在使用前检查是否加入无水乙醇，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
步骤2118，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心2分钟，将吸附柱置于一个新的离心管中，打开吸附柱的管盖，置于室温数分钟，以彻底晾干；
步骤2119，向所述吸附柱的中间部位悬空加入一定量的1×TE buffer或去离子水，室温放置数分钟，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心1分钟，收集DNA溶液，在-20℃保存所述DNA溶液；
以及步骤212，采用柱式法对唾液样本进行提取，采用手动单管操作的方式，包括：
步骤2121，向离心管中加入唾液样本或唾液/保存液混合液，加入一定量的ProteinaseK，所述唾液/保存液混合液在提取前进行50℃水浴1小时或进行50℃空气温箱2小时；
步骤2122，加入一定量的Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，然后进行56℃水浴15-30分钟；
步骤2123，在微型离心机中进行短暂离心，以去除管盖内壁附着的水珠，加入一定量的无水乙醇，立即涡旋震荡充分混匀，然后再一次进行短暂离心，对形成的溶胶状产物进行剧烈震荡或涡旋处理；
步骤2124，将步骤2123中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，一次或多次转入，在与所述步骤2115相同或高于其的所述转速下离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
步骤2125，向吸附柱中加入一定量的Buffer GW1，使用前检查是否已加入无水乙醇，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
步骤2126，向吸附柱中加入一定量的Buffer GW2，使用前检查是否已加入无水乙醇，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
步骤2127，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心2分钟，将吸附柱置于一个新的离心管中，打开吸附柱的管盖，置于室温数分钟，以彻底晾干；
步骤2128，向吸附柱的中间部位悬空加入一定量的1×TE buffer或去离子水，室温放置数分钟，在与所述步骤2115相同的所述转速下离心1分钟，收集DNA溶液，在-20℃保存所述DNA溶液。
5.根据权利要求3所述的一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法，其特征在于所述步骤23包括：
步骤231，进行引物稀释，将设计合成的221对引物稀释为一定容积；
步骤232，进行多重PCR引物合管，将221对引物分为A、B两组，其中A组111对引物，B组110对引物；A组为取一离心管，加入一定量的双蒸水，111对引物中分别取1μl加入该离心管中，得到2pM混合引物，命名为SYL-A；B组为取一离心管，加入一定量的双蒸水，110对引物中分别取1μl加入该离心管中，得到2pM混合引物，命名为SYL-B。
6.根据权利要求3所述的一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法，其特征在于所述步骤24包括：
步骤241，将KAPA HiFi HotStart ReadyMix、Prime(SYL-A or SYL-B)、Prime(SYL-Aor SYL-B)、DNA模板和双蒸水，到0.2ml PCR管或八连排管中；
步骤242，进行如下PCR反应：
步骤2421，预变性：在温度95摄氏度下循环1次10分钟；
步骤2422，95摄氏度下进行30秒变性后，从60摄氏度降低到1摄氏度进行30秒退火，最后进行72摄氏度下的延伸45秒，所述步骤242重复10次；
步骤2423，在95摄氏度下进行30秒变性后，进行52摄氏度的退火30秒，此后进行72摄氏度的延伸45秒，所述步骤243重复30次；
步骤2424，进行最终延伸，在72摄氏度下最终延伸5分钟，循环1次；
步骤2425，在4摄氏度下进行PCR扩增后的保存。
7.根据权利要求3所述的一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法，其特征在于所述步骤25包括：
步骤251，进行琼脂糖凝胶的制备，包括：称取一定量琼脂糖，加入到相应量的1×TAE中，置于微波炉中加热至完全溶解，取出摇匀，灯光下观察无白色细小晶体颗粒，冷却至60℃左右即可；
步骤252，进行灌胶：向冷却到60℃左右的琼脂糖溶液中加入Goldview，摇匀，轻轻倒入安装好凝胶托盘的制胶器中，然后立即在特定位置插入25齿的梳子，待琼脂糖凝胶凝固后，拔出梳子，将琼脂糖凝胶置于电泳槽中；
步骤253，加样：将一定量扩增产物和Lading Buffer加入新的PCR管或八连排管中，混合均匀，用微量移液器将上述混合液加到点样孔中，记录样品的点样次序；
步骤254，进行电泳：盖上电泳槽上盖，安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调整电压后进行电泳，当条带移到距凝胶前沿2-3cm时，停止电泳；
步骤255，取出凝胶，在凝胶成像系统下观察，并保存和记录电泳图谱。
8.根据权利要求3所述的一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法，其特征在于：所述步骤26的所述纯化采用DNA纯化试剂盒。
9.根据权利要求3所述的一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法，其特征在于：所述步骤27对于样本要求为：5ng-1μg打断的双链DNA，溶于EB，即10mM Tris-HCl pH 8.0或去离子水中，DNA纯度要求为OD260/OD280＝1.8～2.0，所述步骤27包括：
步骤271，进行DNA末端修复反应，包括：
步骤2711，向PCR管中加入以下试剂：10×End Repair Reaction Buffer、End prepEnzyme Mix、Fragmented DNA以及RNase-free Water；
步骤2712，用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心，使所有组分收集到管底；
步骤2713，将所述PCR管置于PCR仪中，热盖打开进行反应程；
步骤272，进行接头连接，将所述步骤261的产物末端，连接特定的
接头，包括：
步骤2721，将Adaptor用去离子水稀释10倍；
步骤2722，在步骤271的PCR管中配制如下反应体系：T4 DNA ligase buffer forillumina、T4 DNA ligase以及稀释后的Adaptor；
步骤2723，使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；
步骤2724，将PCR管置于PCR仪中，进行接头连接反应；
步骤273，连接产物磁珠纯化，使用磁珠对所述步骤272的产物进行纯化。纯化除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物，包括：
步骤2731，涡旋振荡CMPure，使其彻底混匀为均一溶液；
步骤2732，将Adaptor连接反应液转移至一新的离心管中；
步骤2733，加入1倍样本体积的CMPure，吸打混匀后在室温静置5分钟；
步骤2734，短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清，小心吸取上清溶液并将其弃除；
步骤2735，继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入一定量新鲜配制的80％乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清溶液；
步骤2736，重复步骤2735，总计漂洗两次；
步骤2737，保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥；
步骤2738，将离心管从磁力架上取下，加入一定量自备EB或去离子水，涡旋振荡并用移液器反复吹吸混匀，使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟；
步骤2739，进行短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清，将洗脱液转移至一个新的PCR管中；
步骤274，进行文库扩增，对纯化后的接头连接产物进行PCR扩增富集，包括：
步骤2741，将如下试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用，所述试剂包括：2×Super
ⅡHigh-Fidelity Mix，Primer mix以及所述步骤262的产物Adapter LigatedDNA；
步骤2742，在无菌PCR管中配制所述试剂形成的PCR扩增反应体系；
步骤2743，使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；
步骤2744，将PCR管置于PCR仪中，设置如下所示反应程序，进行PCR扩增，包括：第一过程：98摄氏度下循环1分钟；第二过程：98摄氏度10秒钟扩增，60摄氏度30秒钟扩增，第二过程循环7-9次；第三过程72摄氏度30秒钟；第四过程：72摄氏度5分钟，循环1次；第五过程：保持4摄氏度；
步骤275，扩增产物磁珠纯化或分选，采用如所述步骤273进行纯化操作，使用
DNA Selection Beads，0.9×，Beads:DNA＝0.9:1的纯化文库扩增产物；
步骤276，通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价和文库质量控制，其中所述浓度检测使用：基于双链DNA荧光染料的方法或基于qPCR绝对定量的方法；所述文库长度分布检测通过基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
10.根据权利要求3所述的一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法，其特征在于：所述步骤28中所述高通量测序采用上机进行测序，按照样品填写相应信息，所述测序策略为Illumina Hiseq/NovaSeq PE150，测序深度为3000×。
11.根据权利要求1所述的一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法，其特征在于所述多基因变异风险评分算法(Polygenic Risk Score)，公式如下：
其中，PT,j表示P值的阈值；i表示符合该阈值下SNP的数量，i＝1,2,3……m；βi表示SNP的效应值，在基因组关联分析(GWAS)中，如果表型为线性数据，则该值为β；如果表型数据是二元分类数据，该值为ood ratio(OR)；Gi，j表示SNP的基因型，并别用{0,1,2}表示。
12.根据权利要求1所述的一种基于风险评估模型的女性生育遗传风险基因检测方法，其特征在于所述步骤210包括：将年龄、身高、体重、BMI、基础内分泌、AMH、既往病史、生育疾病家族史、血糖、血脂、胰岛素水平、治疗史的表型数据，进行预处理和格式化，与所测序获得的基因型数据一起输入复合随机森林算法模型，经过对卵巢早衰、卵巢老化、雌激素敏感性、卵子生成、卵子成熟障碍、肥胖、糖脂代谢异常的影响生育的因素逐一进行风险评分，综合各项结果输出整体评分结果。
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