CN113684267B - 无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品及其制备和应用 - Google Patents

无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品及其制备和应用，所述参考品包括配对阳性参考品和配对阴性参考品，还可以包括配对检测限参考品；本发明的制备方法模拟细胞游离DNA制备方法，采用基因编辑的手段获得携带微缺失或微重复的细胞系，使用正常细胞系制备的cfDNA与携带微缺失或微重复的细胞系制备的cfDNA按一定比例混合，再与无DNA的血浆混合制成。本发明的参考品背景明确、模拟临床样品、成本低、可再生，适用于各种检测方法的三体综合征和微缺失或微重复综合征无创产前筛查，可用于不同测序方法及测序平台的质控检测，为胎儿游离DNA浓度的准确定值及不同综合征的风险评估提供了参考。

Description

无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品及其制备和应用
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别涉及一种无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品及其制备和应用。
背景技术
现今，高龄孕妇数量增加使胎儿的染色体异常风险更高。随着基因检测技术的应用越来越广泛，无创产前筛查(Non-invasive prenatal screening，NIPS)成为了预防出生缺陷的重要手段。2020年美国妇产科医师学会发布了一套新的指南，建议对所有孕妇进行无创产前基因检测。NIPS通过采集孕妇静脉血，提取胎儿游离DNA(Cell-free fetal DNA，cffDNA)，采用高通量测序技术，基于全基因组大规模平行鸟枪、目标区域鸟枪法、基因芯片及核苷酸多态性的原理，结合生物信息分析，得出胎儿患染色体异常的风险，对于胎儿21-三体、18-三体和13-三体综合症具有高灵敏度和高特异性，目前已经大规模运用于临床常规筛查。但是人群发病率较高的染色体微缺失和微重复综合征(Microdeletion andmicroduplication syndromes，MMS)却没有纳入无创产前的筛查范围。染色体微缺失或微重复综合征(MMS)是由微小的、经传统细胞遗传学分析难以发现的染色体畸变而导致的具有复杂临床表现的遗传性疾病。染色体微缺失又称为微小片段缺失，是指染色体上缺失的片段，一般小于10Mb。染色体微缺失或微重复综合征常见临床表型为生长发育异常、智力发育迟缓、特殊面容、内脏器官畸形、内分泌异常、精神行为改变等。例如迪格奥尔格综合征是由于染色体22q11区段缺失导致，该综合征在新生儿中的发病率为1/4000～1/1000，比18三体综合征1/7000～1/3500的发病率还高，却不在NIPS的筛查范围内，许多类似的微缺失或微重复综合征(MMS)亟待被纳入检测，无创产前筛查在标准化和规范化检测的前提下需要升级筛查范围。
随着技术的进步，NIPS不仅仅可以检测21-三体综合征(唐氏综合征)、18-三体综合征(爱德华氏综合征)、13-三体综合征(帕陶氏综合征)，还可以通过技术优化扩展到检测染色体微缺失或微重复综合征，目前检测试剂盒在研发测试、注册申报和日常质控中均需要参考品，但目前国内相关领域的参考品尚未涵盖染色体微缺失和微重复综合征，且其制作及应用也缺乏规范化和产业化，极大制约了出生缺陷基因检测试剂的研发和注册工作，同时也影响行业内检测的准确性。目前，仅有针对21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征的无创产前筛查的质控品，且其原料大部分来源于流产组织和正常未孕女性的血浆，其中流产组织具有无法再生、异质性较大及较难获得等缺陷，而正常未孕女性的血浆除了上述缺陷还具有背景复杂的问题，因此无法适用于除大规模平行鸟枪法以外的检测方法，这些缺陷制约着参考品标准化及产业化，甚至影响到NIPS筛查范围的升级。因此目前亟需一种背景明确、模拟临床样品、低成本、可再生及普适性的染色体微缺失或微重复参考品。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品及其制备和应用。所述参考品包括配对阳性参考品和配对阴性参考品，还可以包括配对检测限参考品；本发明的制备方法模拟细胞游离DNA(Cell free DNA，cfDNA)制备方法，采用基因编辑的手段获得携带微缺失或微重复的细胞系，使用正常细胞系制备的cfDNA与携带微缺失或微重复的细胞系制备的cfDNA按一定比例混合，再与无DNA的血浆混合制成。
本发明提供一种无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品，所述参考品包括配对阳性参考品和配对阴性参考品；还可以包括试剂盒中常见的水、dNTP等组分，因此不限定参考品中只包含配对阳性参考品和配对阴性参考品。
所述配对阳性参考品由经过基因编辑且已验证缺失或重复区域的细胞系的cfDNA、第一正常细胞系的cfDNA、无DNA的血浆混合而成；所述配对阴性参考品由第一正常细胞系的cfDNA、第二正常细胞系的cfDNA、无DNA的血浆混合而成；所述缺失或重复区域为发生微缺失或微重复的区域；所述经过基因编辑且已验证缺失或重复区域的细胞系的cfDNA为cfDNA1，所述第一正常细胞系的cfDNA为cfDNA2，所述第二正常细胞系的cfDNA为cfDNA3；所述第一正常细胞系是所述第二正常细胞系的母亲细胞系。
进一步的，所述第一正常细胞系为AG09387，所述第二正常细胞系为AG09389。
进一步的，所述配对阳性参考品由配对阳性参考品1～6组成，配对阳性参考品1的所述cfDNA1由细胞系BJ1001片段化所得；配对阳性参考品2的所述cfDNA1由细胞系BJ1002片段化所得；配对阳性参考品3的所述cfDNA1由细胞系BJ1003片段化所得；配对阳性参考品4的所述cfDNA1由细胞系BJ1004片段化所得；配对阳性参考品5的所述cfDNA1由细胞系BJ1005片段化所得；配对阳性参考品6的所述cfDNA1由细胞系BJ1006片段化所得；所述细胞系BJ1001携带迪格奥尔格综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1002携带天使综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1003携带染色体1p36缺失综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1004携带史密斯马吉利综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1005携带染色体9p缺失综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1006携带染色体18p缺失综合征对应基因组上的缺失或重复区域。
进一步的，所述cfDNA1和所述cfDNA2按照质量比例1:9混合，所述cfDNA1和所述cfDNA2混合后，按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中；所述cfDNA3和所述cfDNA2按照质量比例1:9混合，所述cfDNA3和所述cfDNA2混合后，按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中。
本发明还提供一种无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品，所述参考品包括配对阳性参考品、配对阴性参考品、配对检测限参考品；
所述配对检测限参考品由高浓度配对检测限参考品、中浓度配对检测限参考品、低浓度配对检测限参考品组成。
进一步的，所述高浓度配对检测限参考品、所述中浓度配对检测限参考品和所述低浓度配对检测限参考品分别由所述cfDNA1和所述cfDNA2按照高、中、低的质量比例混合，所述cfDNA1和所述cfDNA2混合后，混入无DNA的血浆中；所述高浓度配对检测限参考品还含有高浓度配对检测限阴性参考品，所述中浓度配对检测限参考品还含有中浓度配对检测限阴性参考品，所述低浓度配对检测限参考品还含有低浓度配对检测限阴性参考品，所述高浓度配对检测限阴性参考品、所述中浓度配对检测限阴性参考品和所述低浓度配对检测限阴性参考品均由所述cfDNA3和所述cfDNA2分别按照高、中、低的质量比例混合后，混入无DNA的血浆中。
进一步的，所述高浓度配对检测限参考品由高浓度配对检测限参考品1～6组成，高浓度配对检测限参考品1的所述cfDNA1由细胞系BJ1001片段化所得；高浓度配对检测限参考品2的所述cfDNA1由细胞系BJ1002片段化所得；高浓度配对检测限参考品3的所述cfDNA1由细胞系BJ1003片段化所得；高浓度配对检测限参考品4的所述cfDNA1由细胞系BJ1004片段化所得；高浓度配对检测限参考品5的所述cfDNA1由细胞系BJ1005片段化所得；高浓度配对检测限参考品6的所述cfDNA1由细胞系BJ1006片段化所得；
所述中浓度配对检测限参考品由中浓度配对检测限参考品1～6组成，中浓度配对检测限参考品1的所述cfDNA1由细胞系BJ1001片段化所得；中浓度配对检测限参考品2的所述cfDNA1由细胞系BJ1002片段化所得；中浓度配对检测限参考品3的所述cfDNA1由细胞系BJ1003片段化所得；中浓度配对检测限参考品4的所述cfDNA1由细胞系BJ1004片段化所得；中浓度配对检测限参考品5的所述cfDNA1由细胞系BJ1005片段化所得；中浓度配对检测限参考品6的所述cfDNA1由细胞系BJ1006片段化所得；
所述低浓度配对检测限参考品由低浓度配对检测限参考品1～6组成，低浓度配对检测限参考品1的所述cfDNA1由细胞系BJ1001片段化所得；低浓度配对检测限参考品2的所述cfDNA1由细胞系BJ1002片段化所得；低浓度配对检测限参考品3的所述cfDNA1由细胞系BJ1003片段化所得；低浓度配对检测限参考品4的所述cfDNA1由细胞系BJ1004片段化所得；低浓度配对检测限参考品5的所述cfDNA1由细胞系BJ1005片段化所得；低浓度配对检测限参考品6的所述cfDNA1由细胞系BJ1006片段化所得。
进一步的，所述高浓度配对检测限参考品、所述中浓度配对检测限参考品和所述低浓度配对检测限参考品分别由所述cfDNA1和所述cfDNA2按照质量比例8：92、5：95、3.5：96.5混合，分别混合后分别按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中；所述高浓度配对检测限阴性参考品、所述中浓度配对检测限阴性参考品和所述低浓度配对检测限阴性参考品分别由所述cfDNA3和所述cfDNA2按照质量比例8：92、5：95、3.5：96.5混合，分别混合后分别按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中。
本发明还提供一种无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品的制备方法，包括如下步骤：
S1：筛选细胞系；
选择如下2个细胞系：AG09389、AG09387；
S2：对所述细胞系AG09389进行基因编辑，获得具有相应片段缺失的6个基因编辑细胞系；
所述基因编辑细胞系为BJ1001、BJ1002、BJ1003、BJ1004、BJ1005、BJ1006；所述细胞系BJ1001的编辑靶点为迪格奥尔格综合征的异常区域，所述细胞系BJ1002的编辑靶点为天使综合征的异常区域，所述细胞系BJ1003的编辑靶点为染色体1p36缺失综合征的异常区域，所述细胞系BJ1004的编辑靶点为史密斯马吉利综合征的异常区域，所述细胞系BJ1005的编辑靶点为染色体9p缺失综合征的异常区域，所述细胞系BJ1006的编辑靶点为染色体18p缺失综合征的异常区域；
S3：细胞系鉴定；
对8个细胞系BJ1001、BJ1002、BJ1003、BJ1004、BJ1005、BJ1006、AG09389和AG09387进行染色体微阵列分析；
S4：使用酶切法获得步骤S3所述8个细胞系的cfDNA；
S5：制备无DNA的血浆；使用DNase I和加热处理；
S6：胎儿游离DNA浓度引物探针筛选；
S7：将cfDNA与无DNA的血浆混合制备所述配对参考品；
S8：使用微滴式数字PCR对所述配对参考品进行质检。
进一步的，所述步骤S2中基因编辑设计的sgRNA序列如下表所示：
编辑后细胞序号 sgRNA1(5’-3’) sgRNA2(5’-3’)
BJ1001 CCAGCCCCCTGGCAGAGTGC AAACCCAGGCAATACCACTT
BJ1002 GATATTTCCTGCTGTTTACT CCCAGCACTTTGGGAGGCCA
BJ1003 CCGGGTAATCCAGCACCCTG CAAAGGTGTTTTGCTGGAAA
BJ1004 ACCCAACTCTGCCAGCGTAG ATACAGGTACTTTGATGAGG
BJ1005 ATTTGAGGGCATCAAGATAA ACGATTATTAATTAAGTACC
BJ1006 CAATAACTGTTTCTCAACAC TTTATGAATTTAGGGGTAGA
进一步的，所述步骤S5中具体包括如下步骤：
购买阴性血浆，根据0.1U/μL的比例在阴性血浆中加入DNase I，37℃反应30min，然后再将血浆在75℃加热10min使酶发生不可逆失活后制备得到无DNA的血浆。
进一步的，所述步骤S6中所述筛选到的引物和探针序列如下表所示：
本发明还提供所述的无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品的应用，所述应用选自如下任意一种或多种：
(1)制备基于大规模平行鸟枪法测序的无创产前筛查的产品的应用；
(2)制备基于核苷酸多态性原理和基因芯片的微缺失或微重复综合征无创产前筛查的产品的应用；
(3)制备利用不同测序方法及测序平台的质控检测产品的应用；
(4)制备胎儿游离DNA浓度的准确定值及微缺失或微重复综合征的风险评估的产品的应用。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.本发明的参考品采用无DNA的背景血浆作为参考品基质，背景明确。
2.本发明的参考品模拟真实临床样品cfDNA形式，包含无DNA血浆为基质的配对阳性、配对阴性和配对检测限参考品；对DNA使用酶切方法进行片段化，并按一定比例与模拟健康女性的cfDNA进行混合，该参考品能够很好地模拟临床样品不同胎儿游离DNA浓度的检测样本形式。
3.本发明的参考品采用细胞原料，基因标编辑后片段化获得cfDNA，并按一定比例与模拟健康女性的cfDNA进行混合，之后混合无DNA的背景血浆制备成参考品，使用微滴式数字PCR对胎儿游离DNA浓度进行准确定值，因此本发明参考品的原料可再生，不需要从流产组织或未孕女性中获得原料，也节约了成本。
4.本发明使用可再生及具有亲缘关系的细胞原料，使得参考品不仅适用于基于大规模平行鸟枪法测序的无创产前筛查，而且适用于基于核苷酸多态性原理和基因芯片等方法的微缺失或微重复综合征无创产前筛查，适用于市面上利用不同测序方法及测序平台的质控检测，具有普适性。
5.本发明的无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品的制备及应用，能有效帮助行业进行规范化及标准化的升级，同时也为胎儿游离DNA浓度的准确定值及不同综合征的风险评估提供了参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的无创产前筛查微缺失或微重复参考品的制备流程图。
图2为本发明具体实施方式提出的酶切法cfDNA片段分布。
图3为本发明实施例2中配对阳性参考品与配对阴性参考品胎儿游离DNA浓度实测值。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品，所述参考品包括以下几个组分：配对阳性参考品和配对阴性参考品，还可以包括配对检测限参考品。
(1)配对阳性参考品由经过基因编辑且已验证缺失或重复区域的细胞系的cfDNA和细胞系AG09387的cfDNA按照质量比例1:9混合后，按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中；所述配对阴性参考品由细胞系AG09389的cfDNA和细胞系AG09387的cfDNA按照质量比例1:9混合后，按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中；所述经过基因编辑且已验证缺失或重复区域的细胞系的cfDNA为cfDNA1，所述细胞系AG09387的cfDNA为cfDNA2，所述细胞系AG09389的cfDNA为cfDNA3。
配对阳性参考品由配对阳性参考品1～6组成，配对阳性参考品1的cfDNA1由细胞系BJ1001片段化所得；配对阳性参考品2的cfDNA1由细胞系BJ1002片段化所得；配对阳性参考品3的cfDNA1由细胞系BJ1003片段化所得；配对阳性参考品4的cfDNA1由细胞系BJ1004片段化所得；配对阳性参考品5的cfDNA1由细胞系BJ1005片段化所得；配对阳性参考品6的cfDNA1由细胞系BJ1006片段化所得；所述细胞系BJ1001、BJ1002、BJ1003、BJ1004、BJ1005、BJ1006均由细胞系AG09389基因编辑并经过染色体微阵列分析验证，所述细胞系BJ1001携带迪格奥尔格综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1002携带天使综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1003携带染色体1p36缺失综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1004携带史密斯马吉利综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1005携带染色体9p缺失综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1006携带染色体18p缺失综合征对应基因组上的缺失或重复区域，细胞系AG09389代表正常细胞，不携带上述基因组上的缺失或重复区域。
(2)配对检测限参考品由高浓度配对检测限参考品、中浓度配对检测限参考品、低浓度配对检测限参考品组成。所述高浓度配对检测限参考品、所述中浓度配对检测限参考品和所述低浓度配对检测限参考品分别由所述cfDNA1和所述cfDNA2按照质量比例8：92、5：95、3.5：96.5混合，所述cfDNA1和所述cfDNA2混合后，按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中；所述高浓度配对检测限参考品还含有高浓度配对检测限阴性参考品，所述中浓度配对检测限参考品还含有中浓度配对检测限阴性参考品，所述低浓度配对检测限参考品还含有低浓度配对检测限阴性参考品，所述高浓度配对检测限阴性参考品、所述中浓度配对检测限阴性参考品和所述低浓度配对检测限阴性参考品均由cfDNA3和cfDNA2分别按照质量比例8：92、5：95、3.5：96.5混合后，按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中。
所述高浓度配对检测限参考品由高浓度配对检测限参考品1～6组成，高浓度配对检测限参考品1的所述cfDNA1由细胞系BJ1001片段化所得；高浓度配对检测限参考品2的所述cfDNA1由细胞系BJ1002片段化所得；高浓度配对检测限参考品3的所述cfDNA1由细胞系BJ1003片段化所得；高浓度配对检测限参考品4的所述cfDNA1由细胞系BJ1004片段化所得；高浓度配对检测限参考品5的所述cfDNA1由细胞系BJ1005片段化所得；高浓度配对检测限参考品6的所述cfDNA1由细胞系BJ1006片段化所得。
所述中浓度配对检测限参考品由中浓度配对检测限参考品1～6组成，中浓度配对检测限参考品1的所述cfDNA1由细胞系BJ1001片段化所得；中浓度配对检测限参考品2的所述cfDNA1由细胞系BJ1002片段化所得；中浓度配对检测限参考品3的所述cfDNA1由细胞系BJ1003片段化所得；中浓度配对检测限参考品4的所述cfDNA1由细胞系BJ1004片段化所得；中浓度配对检测限参考品5的所述cfDNA1由细胞系BJ1005片段化所得；中浓度配对检测限参考品6的所述cfDNA1由细胞系BJ1006片段化所得。
所述低浓度配对检测限参考品由低浓度配对检测限参考品1～6组成，低浓度配对检测限参考品1的所述cfDNA1由细胞系BJ1001片段化所得；低浓度配对检测限参考品2的所述cfDNA1由细胞系BJ1002片段化所得；低浓度配对检测限参考品3的所述cfDNA1由细胞系BJ1003片段化所得；低浓度配对检测限参考品4的所述cfDNA1由细胞系BJ1004片段化所得；低浓度配对检测限参考品5的所述cfDNA1由细胞系BJ1005片段化所得；低浓度配对检测限参考品6的所述cfDNA1由细胞系BJ1006片段化所得。
人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后，其DNA会以游离的形式存在于血液中，称为游离DNA(cfDNA)，胚胎在发育过程中也会有细胞脱落破碎，其DNA进入孕妇血液中，称为胎儿游离DNA(cffDNA)。cffDNA主要来源于胎盘合体滋养层细胞，以小片段DNA形式存在，通常长度＜313bp。所以在孕妇的血液中会同时存在孕妇本身产生的cfDNA和来自胎儿的cffDNA。
本发明还提供了一种无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品的制备方法，本发明的制备方法模拟细胞游离DNA制备方法，采用基因编辑的手段获得携带微缺失或微重复的细胞系，使用正常细胞系制备的cfDNA与携带微缺失或微重复的细胞系制备的cfDNA按一定比例混合，再与无DNA的血浆混合制成。能够模拟临床胎儿游离DNA(cffDNA)浓度并使其呈现梯度变化。正常cffDNA浓度范围为5～15％。所述的携带微缺失或微重复的细胞系，指经过基因编辑和经过染色体微阵列分析及验证的细胞系。
包括如下步骤，流程如图1所示：
S1：筛选细胞系；
选择如下2个细胞系：AG09389、AG09387；
S2：对所述细胞系AG09389进行基因编辑，获得具有相应片段缺失的6个基因编辑细胞系；
所述基因编辑细胞系为BJ1001、BJ1002、BJ1003、BJ1004、BJ1005、BJ1006；所述细胞系BJ1001的编辑靶点为迪格奥尔格综合征的异常区域，所述细胞系BJ1002的编辑靶点为天使综合征的异常区域，所述细胞系BJ1003的编辑靶点为染色体1p36缺失综合征的异常区域，所述细胞系BJ1004的编辑靶点为史密斯马吉利综合征的异常区域，所述细胞系BJ1005的编辑靶点为染色体9p缺失综合征的异常区域，所述细胞系BJ1006的编辑靶点为染色体18p缺失综合征的异常区域；
S3：细胞系鉴定；
对8个细胞系BJ1001、BJ1002、BJ1003、BJ1004、BJ1005、BJ1006、AG09389和AG09387进行染色体微阵列分析；
S4：使用酶切法获得步骤S3所述的8个细胞系的cfDNA；
S5：制备无DNA的血浆；使用DNase I和加热处理；
S6：胎儿游离DNA浓度引物探针筛选；
S7：将cfDNA与无DNA的血浆混合制备配对阳性参考品和配对阴性参考品、配对检测限参考品。
S8：使用微滴式数字PCR对胎儿游离DNA浓度进行定值，对参考品的效果进行检测。
具体的，使用的所有细胞系均购自Coriell医学研究所，其中正常男性细胞系与正常女性细胞系具有母子亲缘关系，使用的2种细胞系的信息如下：
Coriell编号 综合征 性别 亲缘关系
AG09389 正常男性 男性 儿子
AG09387 正常女性 女性 母亲
一、对上述AG09389这一正常男性的细胞系进行基因编辑，获得具有相应片段缺失的6个编辑细胞系(编号为BJ1001～BJ1006)，具体方法如下：
1.在基因组两个断点处分别设计两条特异的sgRNA(sgRNA1和sgRNA2)，以及用于检测编辑效率的引物，如下表所示：
其中，BJ1001的编辑靶点为迪格奥尔格综合征的异常区域，BJ1002的编辑靶点为天使综合征的异常区域，BJ1003的编辑靶点为染色体1p36缺失综合征的异常区域，BJ1004的编辑靶点为史密斯马吉利综合征的异常区域，BJ1005的编辑靶点为染色体9p缺失综合征的异常区域，BJ1006的编辑靶点为染色体18p缺失综合征的异常区域。基因编辑后，细胞系BJ1001携带迪格奥尔格综合征对应基因组上的缺失或重复区域，细胞系BJ1002携带天使综合征对应基因组上的缺失或重复区域，细胞系BJ1003携带染色体1p36缺失综合征对应基因组上的缺失或重复区域，细胞系BJ1004携带史密斯马吉利综合征对应基因组上的缺失或重复区域，细胞系BJ1005携带染色体9p缺失综合征对应基因组上的缺失或重复区域，细胞系BJ1006携带染色体18p缺失综合征对应基因组上的缺失或重复区域。
2.采用化学合成的方法，合成上述的sgRNA。将对应的sgRNA分别与Cas9蛋白按照1：1.5(质量比)混合，室温放置10min，分别组成核糖核蛋白复合物RNP1与RNP2。将RNP1与RNP2及1μg的重组质粒，与0.5×106细胞混合，并采用电穿孔的方法进行转染。
3.转染后24h后，进行单细胞克隆筛选：
(1)离心收集细胞，并将细胞打散成单细胞悬液。
(2)按照倍比稀释的方法，对细胞准确计数，用培养基将活细胞稀释至5个/mL，并将细胞充分混匀。
(3)取10mL细胞悬液，均匀分到一块96孔板中，每孔0.1mL。
4.将细胞放至细胞培养箱中培养，待细胞克隆形成时，标记有克隆的孔，取部分细胞作为扩增模板，分别使用引物对Primer-1F/Primer-2R对克隆进行扩增及sanger测序验证；剩余细胞扩大培养，备用。
5.根据PCR扩增及sanger测序结果，挑选序列正确的克隆，并将对应的细胞进行扩大培养，并保存。
二、细胞系鉴定
扩大培养并提取基因组DNA后(genomic DNA，gDNA)使用Affymetrix CytoScan HD基因芯片对基因编辑获得的6个细胞系(BJ1001～BJ1006)以及2个正常细胞系(AG09389和AG09387)进行染色体微阵列分析(CMA)，验证结果如下表所示：
由上表可知，2个正常细胞系(AG09389和AG09387)没有突变，而基因编辑获得的6个细胞系(BJ1001～BJ1006)均含有各对应基因组上的缺失或重复区域。此处需要特别指出，购自Coriell医学研究所的绝大多数细胞系都是不健康的细胞系，因此2个正常细胞系需要选择不携带本发明提到各种综合征且具有母子亲缘关系的细胞系，且经过CMA验证的确不携带本发明提到各种综合征的正常细胞系。基于此前提，由这2个正常细胞系中的一个进行后续基因编辑以及跟另一正常细胞系的cfDNA混合制备出的配对阳性参考品才能够对胎儿游离DNA浓度进行准确定值，才能制备出表现良好的微缺失或微重复配对参考品，选择其他的具有母子亲缘关系的不携带本发明提到各种综合征的正常细胞系也可以实现本发明的技术效果。
上述经过CMA验证的细胞系经过扩大培养，收集细胞沉淀以备进行片段化处理。
三、模拟cfDNA片段化处理：
1.取1×104待处理细胞于1.5mL EP管内，在离心机中4℃，3000rpm离心5min；
2.吸弃上清，然后加入1mL 4℃预冷的1×PBS(pH＝7.4)重悬细胞；
3.将重悬后的细胞放入离心机中，于4℃，3000rpm离心5min。
4.吸弃上清，加入200μL 0.5％Triton X-100，混匀后置于室温放置10min；
5.将EP管置于离心机，3000rpm离心5min；
6.吸弃上清，加入1mL PBS溶液，用移液器反复吹打将细胞沉淀打散。将EP管置于离心机，3000rpm离心5min；
7.离心结束后，吸弃上清，加入微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease，MNase)MNase酶，重悬细胞，并将细胞悬液转移至200μL EP管。迅速将离心管置于PCR仪中，37℃孵育15min；
8.孵育完成后，向EP管中加入6μL 0.5M EDTA混匀，终止酶反应；
9.加入100μL 10％SDS和10μL Proteinase K(20mg/mL)。
10.将离心管置于60℃，孵育30min。
11.在孵育过程中，将Magmax cell free试剂盒取出，吸取1mL Lysis/BindingSolution至15mL离心管，向其中加入30μL磁珠，混匀。
12.将步骤10中孵育结束的粗提液放至4℃，冷却后取100μL加入到步骤11的离心管中，并补充900μL蒸馏水，涡旋振荡10min，充分混匀。剩余粗提液按照与此相同的方法进行操作。
13.取一支新的1.5mL离心管，插入磁力架中，吸取1mL步骤12中的混合液到离心管中，静置5min或直至溶液变得澄清，吸弃上清(不要碰到磁珠)。
14.重复步骤13，至完成转移所有溶液，吸净离心管中残留的液体。此时，磁珠吸附于磁力架侧。
15.将离心管从磁力架上取下，加入1mL Wash Solution重悬磁珠。将离心管放回磁力架，静置5min或直至溶液变得澄清，吸弃上清(不要碰到磁珠)。
16.将离心管从磁力架上取下，加入1mL 80％乙醇溶液重悬磁珠。将离心管放回磁力架，静置5min或直至溶液变得澄清，吸弃上清(不要碰到磁珠)。
17.保持离心管于磁力架上，室温干燥3～5min。取下离心管，向管中加入50μL水，重悬磁珠。
18.将离心管放回磁力架，静置5min或直至溶液变得澄清，小心吸取清液至新的离心管。
19.使用Qubit dsDNA BR测定提取的DNA的浓度，使用Agilent TapeStation 4150检测DNA片段的大小，制得的cfDNA的片段分布如图2所示，主带大小为：144～176bp，片段大小与真实临床样品cfDNA相似，说明cfDNA成功制备。
四、无背景DNA血浆处理
阴性血浆购置于瑞亚力公司的阴性血浆(货号CPD-R)，根据0.1U/μL的比例加入DNase I(货号AG12001)在37℃反应30min，然后再将血浆在75℃加热10min使酶发生不可逆失活后形成本发明参考品的基质。DNase I处理和加热步骤保证了血浆中的DNA全部降解，制成无DNA的背景血浆。下表展示在处理前后分别使用MagMAXTM Cell-Free DNA IsolationKit(货号A29319)对血浆进行提取后使用dsDNA HS Assay Kit(货号Q32852)进行DNA浓度检测的结果：
平均浓度(ng/μl) 换算浓度(ng/mL)
处理前 1.34 66
处理后 / /
根据上表的结果显示，经过处理后的血浆已经无法提取出可被试剂盒检测的cfDNA。
实施例1胎儿游离DNA浓度引物探针筛选
1.根据染色体微阵列(CMA)分析的结果，筛选出两对具有亲缘关系的AG09389和AG09387中具有核苷酸多态性的位点，该位点的dbSNP的代码为RS12128905，其中AG09389的基因型为A，而AG09387的基因型为G，上述细胞系提取的gDNA经过Sanger测序验证后进行引物探针设计，获得微滴式数字PCR引物探针，如下表所示：
引物和探针序列(5’-3’)
正向引物 GCCTCAGCCTCCCGAGTAG
反向引物 GGCCGACATGGTGAAACC
母代探针 CAGGCCAGCGTAA
子代探针 TACAGGCCAGCATAA
2.进行微滴式数字PCR检测的步骤如下：
①配置反应的预混液如下：
Stock Con. Final Con. 1x Volume(μL)
dPCR supermix 2x 1x 10
Primer mix 40x(36μM) 1x 0.5
Probe mix 40x(10μM) 1x 0.5
H2O - - 8
DNA template 20～100ng - 1
Final Volume 20
②微滴发生：将上述配置的预混液加入到微滴发生卡的中层孔位中，微滴生成油加入到卡的下排孔位中，在微滴生成卡的两侧套上橡胶皮套，将微滴生成卡移除操作间放置于微滴生成仪内，并关闭盖子，等待微滴生成完成；
③微滴转移：用移液枪将生成的微滴转移到PCR反应板内，将枪头的位置保持在一定倾斜度角防止卡的底部阻塞枪头；
④封膜：当所有样品的微滴转移完成以后，放置一片铝膜置于PCR反应板的表面，用热封仪进行封膜；
⑤PCR：将PCR反应板放置于PCR仪上，并关紧盖子，仪器升降温速度调到2～3℃/s，按照如下程序运行：
⑥信号收集：当PCR程序完成，将PCR反应板转移到微滴读取仪上，在电脑上，打开“QuantaSoft”软件，并选择包含样品的孔，在相应的位置进行设置；
⑦数据分析：当数据读取完成以后，打开要分析的实验数据，选择“Analyze”对结果进行分析。
由于BJ1001～BJ1006细胞系由AG09389编辑而来，因此BJ1001～BJ1006同样携带该位点，上述引物探针对将作为配对参考品的胎儿游离DNA浓度检测使用，通过微滴式数字PCR方法可以准确检测参考品中胎儿游离DNA浓度，可用于评价高通量测序法判定的胎儿游离DNA浓度是否准确。
实施例2配对阳性参考品与配对阴性参考品
基于上述方法得到的经过基因编辑且已验证缺失或重复区域的模拟片段化cfDNA，将该模拟片段化的cfDNA根据检测的浓度与AG09387模拟片段化的cfDNA按照质量比例1：9混合，再按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中，形成配对阳性参考品。而阴性参考品则使用AG09389模拟片段化的cfDNA按照质量比例10％混入AG09387模拟片段化的cfDNA中，然后再按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中。1：9的混合比例是为了使胎儿游离DNA浓度的模拟范围与临床实际样品接近。
以上配对阳性参考品及阴性参考品的组成如下表所示：
所述配对阳性参考品与配对阴性参考品必须满足微缺失或微重复携带者与未携带者具有直系亲缘关系。即AG09387细胞系为AG09389的母亲细胞系，使用母婴配对细胞系，采用酶切法的方法制得cfDNA，能很好地模拟临床样本的状态并普遍适用于目前国内外无创产前筛查对三体综合征及微缺失或微重复的检测。
其中配对阳性参考品1针对迪格奥尔格综合征，配对阳性参考品2针对天使综合征，配对阳性参考品3针对染色体1p36缺失综合征，配对阳性参考品4针对史密斯马吉利综合征，配对阳性参考品5针对染色体9p缺失综合征，配对阳性参考品6针对染色体18p缺失综合征，配对阴性参考品作为对照。上述各配对参考品针对不同的微缺失或微重复疾病分开使用。
以上配对阳性参考品与配对阴性参考品胎儿游离DNA浓度使用数字PCR检测的结果，如下表所示，图3以图表的形式展示结果，根据检测结果，实测值变异系数较小，说明使用该方法检测胎儿游离DNA浓度能够对胎儿游离DNA浓度进行准确定值，能够稳定反映参考品中胎儿游离DNA浓度。
根据上述配制方法配制的配对阳性参考品1～6及配对阴性参考品，选取四家市面主流的检测厂商进行不同综合征的风险值检测，结果如下表所示：
上述结果表明，配对阴阳性参考品在不同厂商的检测均能表现符合预期的结果，表明该参考品性能良好。其中“+”表示可以检出对应参考品所携带的微缺失或微重复综合征，“-”表示不能检出对应参考品所携带的微缺失或微重复综合征。
实施例3配对检测限参考品
基于上述方法得到经过基因编辑且已验证缺失或重复区域的模拟片段化的cfDNA，将该模拟片段化的cfDNA根据检测的浓度与AG09387模拟片段化的cfDNA按照质量比例8：92、5：95和3.5：96.5分别混合，再按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中，制成配对检测限参考品。8：92的混合比例为高浓度配对检测限参考品，5：95的混合比例为中浓度配对检测限参考品，3.5：96.5的混合比例为低浓度配对检测限参考品。其中高中低三种浓度的配对检测限参考品均配有一个配对检测限阴性参考品，分别为AG09389的cfDNA与AG09387的cfDNA按照质量比例8：92、5：95和3.5：96.5混合而成。模拟片段化cfDNA1含量为3.5～8％是为模拟不同比例的胎儿游离DNA浓度，针对不同厂家的不同检测限设定的，能够适用于市面上各种主流测序平台。同样的，每个浓度的配对检测限参考品1针对迪格奥尔格综合征，配对检测限参考品2针对天使综合征，配对检测限参考品3针对染色体1p36缺失综合征，配对检测限参考品4针对史密斯马吉利综合征，配对检测限参考品5针对染色体9p缺失综合征，配对检测限参考品6针对染色体18p缺失综合征，配对检测限阴性参考品为阴性对照。
以上检测限参考品胎儿游离DNA浓度使用数字PCR检测的结果为下表所示，根据检测结果，实测值变异系数较小，说明使用该方法检测胎儿游离DNA浓度能够对胎儿游离DNA浓度进行准确定值，能够稳定反映参考品中胎儿游离DNA浓度。
根据上述配制方法配制的高、中、低浓度配对检测限参考品，选取四家市面主流的检测厂商进行不同综合征的风险值检测，结果如下表所示：
上述结果表明，高、中、低浓度配对检测限性参考品在不同厂商的检测均能表现符合预期的结果，表明该参考品性能良好。其中“+”表示可以检出对应参考品所携带的微缺失或微重复综合征，“-”表示不能检出对应参考品所携带的微缺失或微重复综合征。
综上，本发明公开了一种无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品及其制备和应用，所述参考品包括配对阳性参考品和配对阴性参考品，还可以包括配对检测限参考品；其中配对阳性参考品1针对迪格奥尔格综合征，配对阳性参考品2针对天使综合征，配对阳性参考品3针对染色体1p36缺失综合征，配对阳性参考品4针对史密斯马吉利综合征，配对阳性参考品5针对染色体9p缺失综合征，配对阳性参考品6针对染色体18p缺失综合征，配对阴性参考品作为对照。上述各配对参考品针对不同的微缺失或微重复疾病分开使用。配对检测限参考品能够确保混合符合预期，以此最大程度模拟临床样品的复杂性及检验检测系统的特异性及灵敏性。本发明的配对阳性参考品和配对阴性参考品可以单独使用，也可以搭配配对检测限参考品使用，能够更好的模拟临床样品的复杂性及检验检测系统的特异性及灵敏性。
本发明的制备方法模拟细胞游离DNA制备方法，采用基因编辑的手段获得携带微缺失或微重复的细胞系，使用正常细胞系制备的cfDNA与携带微缺失或微重复的细胞系制备的cfDNA按一定比例混合，再与无DNA的血浆混合制成。本发明的参考品采用无DNA的背景血浆作为参考品基质，背景明确。能够模拟真实临床样品cfDNA形式，包含无DNA血浆为基质的配对阳性、配对阴性和配对检测限参考品；对DNA使用酶切方法进行片段化，并按一定比例与模拟健康女性的cfDNA进行混合，该参考品能够很好地模拟临床样品不同胎儿游离DNA浓度的检测样本形式。本发明的参考品采用细胞原料，基因标编辑后片段化获得cfDNA，并按一定比例与模拟健康女性的cfDNA进行混合，之后混合无DNA的背景血浆制备成参考品，使用微滴式数字PCR对胎儿游离DNA浓度进行准确定值，因此本发明参考品的原料可再生，不需要从流产组织或未孕女性中获得原料，也节约了成本。本发明使用可再生及具有亲缘关系的细胞原料，使得本发明的参考品不仅适用于基于大规模平行鸟枪法测序的无创产前筛查，而且适用于基于核苷酸多态性原理和基因芯片等方法的微缺失或微重复综合征无创产前筛查，适用于市面上利用不同测序方法及测序平台的质控检测，具有普适性。本发明的无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品的制备及应用，能有效帮助行业进行规范化及标准化的升级，同时也为胎儿游离DNA浓度的准确定值及不同综合征的风险评估提供了参考。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品，其特征在于，所述参考品包括配对阳性参考品和配对阴性参考品；
所述配对阳性参考品由经过基因编辑且已验证缺失或重复区域的细胞系的cfDNA、第一正常细胞系的cfDNA、无DNA的血浆混合而成；所述配对阴性参考品由第一正常细胞系的cfDNA、第二正常细胞系的cfDNA、无DNA的血浆混合而成；所述缺失或重复区域为发生微缺失或微重复的区域；所述经过基因编辑且已验证缺失或重复区域的细胞系的cfDNA为cfDNA1，所述第一正常细胞系的cfDNA为cfDNA2，所述第二正常细胞系的cfDNA为cfDNA3；所述第一正常细胞系是所述第二正常细胞系的母亲细胞系；
所述配对阳性参考品由配对阳性参考品1～6组成，配对阳性参考品1的所述cfDNA1由细胞系BJ1001片段化所得；配对阳性参考品2的所述cfDNA1由细胞系BJ1002片段化所得；配对阳性参考品3的所述cfDNA1由细胞系BJ1003片段化所得；配对阳性参考品4的所述cfDNA1由细胞系BJ1004片段化所得；配对阳性参考品5的所述cfDNA1由细胞系BJ1005片段化所得；配对阳性参考品6的所述cfDNA1由细胞系BJ1006片段化所得；所述细胞系BJ1001携带迪格奥尔格综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1002携带天使综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1003携带染色体1p36缺失综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1004携带史密斯马吉利综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1005携带染色体9p缺失综合征对应基因组上的缺失或重复区域，所述细胞系BJ1006携带染色体18p缺失综合征对应基因组上的缺失或重复区域。
2.根据权利要求1所述的配对参考品，其特征在于，所述第一正常细胞系为AG09387，所述第二正常细胞系为AG09389。
3.根据权利要求1所述的配对参考品，其特征在于，所述cfDNA1和所述cfDNA2按照质量比例1:9混合，所述cfDNA1和所述cfDNA2混合后，按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中；所述cfDNA3和所述cfDNA2按照质量比例1:9混合，所述cfDNA3和所述cfDNA2混合后，按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中。
4.根据权利要求1所述的配对参考品，其特征在于，所述参考品还包括配对检测限参考品；
所述配对检测限参考品由高浓度配对检测限参考品、中浓度配对检测限参考品、低浓度配对检测限参考品组成。
5.根据权利要求4所述的配对参考品，其特征在于，所述高浓度配对检测限参考品、所述中浓度配对检测限参考品和所述低浓度配对检测限参考品分别由所述cfDNA1和所述cfDNA2按照高、中、低的质量比例混合，所述cfDNA1和所述cfDNA2混合后，混入无DNA的血浆中；所述高浓度配对检测限参考品还含有高浓度配对检测限阴性参考品，所述中浓度配对检测限参考品还含有中浓度配对检测限阴性参考品，所述低浓度配对检测限参考品还含有低浓度配对检测限阴性参考品，所述高浓度配对检测限阴性参考品、所述中浓度配对检测限阴性参考品和所述低浓度配对检测限阴性参考品均由所述cfDNA3和所述cfDNA2分别按照高、中、低的质量比例混合后，混入无DNA的血浆中。
6.根据权利要求4～5任一项所述的配对参考品，其特征在于，所述高浓度配对检测限参考品由高浓度配对检测限参考品1～6组成，高浓度配对检测限参考品1的所述cfDNA1由细胞系BJ1001片段化所得；高浓度配对检测限参考品2的所述cfDNA1由细胞系BJ1002片段化所得；高浓度配对检测限参考品3的所述cfDNA1由细胞系BJ1003片段化所得；高浓度配对检测限参考品4的所述cfDNA1由细胞系BJ1004片段化所得；高浓度配对检测限参考品5的所述cfDNA1由细胞系BJ1005片段化所得；高浓度配对检测限参考品6的所述cfDNA1由细胞系BJ1006片段化所得；
所述中浓度配对检测限参考品由中浓度配对检测限参考品1～6组成，中浓度配对检测限参考品1的所述cfDNA1由细胞系BJ1001片段化所得；中浓度配对检测限参考品2的所述cfDNA1由细胞系BJ1002片段化所得；中浓度配对检测限参考品3的所述cfDNA1由细胞系BJ1003片段化所得；中浓度配对检测限参考品4的所述cfDNA1由细胞系BJ1004片段化所得；中浓度配对检测限参考品5的所述cfDNA1由细胞系BJ1005片段化所得；中浓度配对检测限参考品6的所述cfDNA1由细胞系BJ1006片段化所得；
所述低浓度配对检测限参考品由低浓度配对检测限参考品1～6组成，低浓度配对检测限参考品1的所述cfDNA1由细胞系BJ1001片段化所得；低浓度配对检测限参考品2的所述cfDNA1由细胞系BJ1002片段化所得；低浓度配对检测限参考品3的所述cfDNA1由细胞系BJ1003片段化所得；低浓度配对检测限参考品4的所述cfDNA1由细胞系BJ1004片段化所得；低浓度配对检测限参考品5的所述cfDNA1由细胞系BJ1005片段化所得；低浓度配对检测限参考品6的所述cfDNA1由细胞系BJ1006片段化所得。
7.根据权利要求4～6任一项所述的配对参考品，其特征在于，所述高浓度配对检测限参考品、所述中浓度配对检测限参考品和所述低浓度配对检测限参考品分别由所述cfDNA1和所述cfDNA2按照质量比例8：92、5：95、3.5：96.5混合，分别混合后分别按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中；所述高浓度配对检测限阴性参考品、所述中浓度配对检测限阴性参考品和所述低浓度配对检测限阴性参考品分别由所述cfDNA3和所述cfDNA2按照质量比例8：92、5：95、3.5：96.5混合，分别混合后分别按照20ng/mL的浓度混入无DNA的血浆中。
8.一种无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：筛选细胞系；
选择如下2个细胞系：AG09389、AG09387；
S2：对所述细胞系AG09389进行基因编辑，获得具有相应片段缺失的6个基因编辑细胞系；
所述基因编辑细胞系为BJ1001、BJ1002、BJ1003、BJ1004、BJ1005、BJ1006；所述细胞系BJ1001的编辑靶点为迪格奥尔格综合征的异常区域，所述细胞系BJ1002的编辑靶点为天使综合征的异常区域，所述细胞系BJ1003的编辑靶点为染色体1p36缺失综合征的异常区域，所述细胞系BJ1004的编辑靶点为史密斯马吉利综合征的异常区域，所述细胞系BJ1005的编辑靶点为染色体9p缺失综合征的异常区域，所述细胞系BJ1006的编辑靶点为染色体18p缺失综合征的异常区域；
S3：细胞系鉴定；
对8个细胞系BJ1001、BJ1002、BJ1003、BJ1004、BJ1005、BJ1006、AG09389和AG09387进行染色体微阵列分析；
S4：使用酶切法获得步骤S3所述8个细胞系的cfDNA；
S5：制备无DNA的血浆；使用DNase I和加热处理；
S6：胎儿游离DNA浓度引物探针筛选；
S7：将cfDNA与无DNA的血浆混合制备所述配对参考品；
S8：使用微滴式数字PCR对所述配对参考品进行质检。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中基因编辑设计的sgRNA序列如下表所示：
编辑后细胞序号 sgRNA1(5’-3’) sgRNA2(5’-3’) BJ1001 CCAGCCCCCTGGCAGAGTGC AAACCCAGGCAATACCACTT BJ1002 GATATTTCCTGCTGTTTACT CCCAGCACTTTGGGAGGCCA BJ1003 CCGGGTAATCCAGCACCCTG CAAAGGTGTTTTGCTGGAAA BJ1004 ACCCAACTCTGCCAGCGTAG ATACAGGTACTTTGATGAGG BJ1005 ATTTGAGGGCATCAAGATAA ACGATTATTAATTAAGTACC BJ1006 CAATAACTGTTTCTCAACAC TTTATGAATTTAGGGGTAGA
。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中具体包括如下步骤：
购买阴性血浆，根据0.1U/μL的比例在阴性血浆中加入DNase I，37℃反应30min，然后再将血浆在75℃加热10min使酶发生不可逆失活后制备得到无DNA的血浆。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中所述筛选到的引物和探针序列如下表所示：
引物和探针序列(5’-3’) 正向引物 GCCTCAGCCTCCCGAGTAG 反向引物 GGCCGACATGGTGAAACC 母代探针 CAGGCCAGCGTAA 子代探针 TACAGGCCAGCATAA
。
12.权利要求1～7任一项所述的无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品的应用，其特征在于，所述应用选自如下任意一种或多种：
(1)制备基于大规模平行鸟枪法测序的无创产前筛查的产品的应用；
(2)制备基于核苷酸多态性原理和基因芯片的微缺失或微重复综合征无创产前筛查的产品的应用；
(3)制备利用不同测序方法及测序平台的质控检测产品的应用；
(4)制备胎儿游离DNA浓度的准确定值及微缺失或微重复综合征的风险评估的产品的应用。
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