CN105969879A - 一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法 - Google Patents

一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法。一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组，包括：突变型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；野生型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明可用于高通量鉴定高油酸自交后代中aa基因型，解决现有自交后代数量较大无法鉴定的问题，其能够准确快速的获得自交后代中FAD2A所有基因型AA，aa和Aa，及时剔除AA基因型，显著提高高油酸花生育种的效率。

Description

一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测 方法
技术领域
本发明涉及一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法，属于农业生物工程技术领域。
背景技术
花生是重要的油料作物之一，油酸和亚油酸是其油脂中的主要成分。油酸分子中只含有一个双价不饱和键，稳定性高，加热时所产生的有害物少；亚油酸分子中含有两个双价不饱和键，与油酸相比，亚油酸更容易被氧化，稳定性差。因此，花生籽粒油脂中油酸和亚油酸的比例是衡量油脂品质的重要指标，油酸亚油酸比值高的油品货价寿命长，商品质量稳定、保质期长。而且油酸有益于人类心、脑、肾和血管的健康，食用油酸可以增加人体内的高密度脂蛋白的浓度，降低中低密度脂蛋白的浓度，在保证人体对胆固醇需求的同时，防止胆固醇过量(Davis et al.,2008)，因此，高油酸花生越来越受到人们的青睐，高油酸花生品种的选育工作也越来越受到人们的重视。
1987年，美国科研人员首次鉴定了高油酸花生突变体F435，其油酸亚油酸比值高达40:1(Norden et al.，1987)，并以此突变体为材料培育出了一系列高油酸花生品种，如SunOleic95R，其油酸含量高达85％，超过了橄榄油的油酸含量。研究发现，花生高油酸特性由2个主效基因控制，Jung等从普通花生及高油酸花生突变体(以SunOleic95R为父本杂交获得)中分离了这两个基因：AhFAD2A和AhFAD2B。这两个基因均编码△12-脱氢酶，主要作用是催化油酸在碳12位去饱和产生亚油酸，是控制油酸和亚油酸含量的关键酶。在普通花生中这两个基因编码区同源性为99％，二者只有11个碱基的差别，翻译产物在4个位置上有不同的氨基酸残基。研究表明，AhFAD2A来源于花生野生种A基因组，AhFAD2B来源于花生野生种B基因组，无论AhFAD2B还是AhFAD2A都不是种子特异表达的基因，两个基因之一正常表达，其油酸水平即可稳定在正常水平(Jung et al.2000a；2000b)。研究表明，在高油酸花生突变体F435中FAD2B442bp处有一单核苷酸“A”插入，其插入导致移码突变，从而产生无活性蛋白质；在FAD2A 448bp处有单个核苷酸G到A的替换，结果是AhFAD2A编码的△12-脱氢酶活性降低。基于高油酸突变体F435中FAD2的序列变化，发展了一些鉴定FAD2基因型的方法。如CAPS(2007；2009)，PCR产物测序法(Wang et al.,2010)，荧光定量PCR法(2010；2011)，AS-PCR法(Chen et al.,2010)。上述检测方法或操作复杂，或成本太高，或效率太低，因此，开发一种高通量，低成本，高准确率的检测方法，将其应用到花生高油酸育种过程中显得十分必要。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法，该方法具有通量高，成本低，准确率高的特点，为分子标记辅助选择高油酸杂交后代提供了新的技术手段。
术语说明：
FAM：6-羧基荧光素，一种常用的荧光基团，用于标记核苷酸和核酸，激发光波长495nm，发射光波长521nm，颜色呈绿色。
HEX：六氯-6-甲基荧光素，激发光波长535nm，发射光波长556nm，颜色呈粉红色。
本发明的技术方案如下：
一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组，包括：
突变型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
野生型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
根据本发明优选的，所述的突变型特异引物还包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的5’端连接有与荧光基团序列相同的Allele-1tail序列；进一步优选的，所述Allele-1tail序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为与FAM荧光基团序列相同的片段；
所述突变型特异引物由22个碱基组成，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该序列为AhFAD2A基因突变型开放读码框区自5’端448-469位碱基的反向互补序列；在突变型特异引物的5’端连接了Allele-1tail，这条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5’端分别标记了FAM荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
根据本发明优选的，所述的野生型特异引物还包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的5’端连接有与荧光基团序列相同的Allele-2tail序列；进一步优选的，所述Allele-2tail序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列为与HEX荧光基团序列相同的片段；
所述野生型特异引物由22个碱基组成，核苷酸序列SEQ ID No.2所示，该序列为AhFAD2A基因野生型开放读码框区自5’端448-469位碱基的反向互补序列；在突变型特异引物的5’端连接了Allele-2tail，这条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5’端分别标记了HEX荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
由于花生AhFAD2A和AhFAD2B基因之间重复序列的干扰，KASP标记很难区分具有同源性很高AhFAD2A和AhFAD2B基因间的SNP，根据KASP竞争性PCR的原理，本发明充分利用通用引物SEQ ID No.3，将3’末端碱基设计在AhFAD2A和AhFAD2B的A和B基因组之间SNP位点，用于区分A和B基因组，用特异性引物来区分要检测的特异性功能位点。序列表中SEQ IDNo.3由18个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因开放阅读框区自5’端415-432位碱基序列。
利用上述引物组高通量筛选AhFAD2A基因等位变异的方法，步骤如下：
(1)提取待筛选样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物组进行高通量实时荧光定量PCR，制得PCR产物；
(3)对步骤(2)制得的PCR产物进行荧光检测分析，当检测到仅有FAM探针的荧光时，则第448位为碱基A纯合，即突变体基因型，记为aa；当检测到仅有HEX探针的荧光时，则448位为碱基G，即野生型，记为AA；当同时检测到有FAM探针和HEX探针的荧光时，则448碱基为杂合子，记为Aa。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的实时荧光定量PCR的反应体系为3μL，组分如下：
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的高通量实时荧光定量PCR的反应程序为：
94℃预变性15min；
第一步扩增反应：94℃预变性20s；65℃～55℃60s，10个循环，每个循环降低1℃；
第二步扩增反应：94℃预变性20s；55℃60s，35个循环。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的高通量实时荧光定量PCR中，DNA模板稀释及转板在TECAN液体自动化工作站上进行；反应体系中反应物的添加混合通过MeridianTM液体处理工作站加入至384PCR反应板中；PCR反应、检测荧光强度、读取数据均在HydrocycleTMPCR水浴中完成。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的荧光检测分析，荧光信号读取采用Omega F荧光阅读仪；数据结果采集、分析采用LGC公司Kraken软件进行。LGC公司Kraken软件进行可高通量检测AhFAD2A基因G碱基到A碱基的置换。
有益效果
1、本发明开发了针对FAD2A突变位点(448bp处G:C→A:T突变)的引物组及高通量检测方法，一次检测样本量最高可达5376(384×14)个，该检测方法具有通量高，成本低，结果稳定的优点；与PCR产物测序法、CAPS方法比较，该方法操作简单，检测成本低；用CAPS结果验证显示，该方法结果可靠；
2、本发明可用于高通量检测杂交F1及回交育种中的Aa基因型后代；通过对杂交后代的检测，选择基因型为Aa的后代，能极大提高目标性状选择的准确性，减少后期选育的工作量；
3、本发明可用于高通量鉴定高油酸自交后代中aa基因型，解决现有自交后代数量较大无法鉴定的问题，其能够准确快速的获得自交后代中FAD2A所有基因型AA，aa和Aa，及时剔除AA基因型，显著提高高油酸花生育种的效率。
附图说明
图1为实施例2中部分KASP法检测样品中AhFAD2A基因各基因型点簇分布图；
图2为实施例3中CAPS法检测AhFAD2A各基因型的电泳照片；
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
下述实施例中所有方法如无特殊说明均为常规方法。
所述引物均由Lifetech公司合成。
实施例1.供试花生样品基因组DNA的提取
按TIANGEN公司提供的植物基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP-305)说明书中的记载提取供试花生样品基因组DNA，具体步骤如下：
①在液氮中研磨100mg新鲜或20℃冷冻的样品材料(注：样品要快速、充分研磨为粉末)；
②将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL，65℃预热的缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1wt％)，迅速颠倒混匀后，将离心管在65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；
③加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min；注：若提取富含多糖或淀粉的植物组织，可在第③步前，用酚:氯仿(体积比1:1)进行等体积抽提；
④将所得上层水相转入一个新的离心管，加入700μL的缓冲液GP2，充分混匀；
⑤将混匀的液体转入吸附柱CB3，12,000rpm离心30s，弃掉废液；
⑥向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前检查是否己加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，弃掉废液；
⑦向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前检查是否己加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，倒掉废液；
⑧重复步骤⑦；
⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中无水乙醇的残留会影响后续的酶反应实验；
⑩将吸附柱CB3放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量50～200μL洗脱缓冲液TE(pH值在7.0～8.5之间)，室温放置2-5min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液；
最后用紫外分光光度计检测DNA的含量及纯度，结果显示所测样品A260/280介于1.8～2.0之间，表明所提取的DNA纯度较高。
实施例2.用于检测AhFAD2A基因448位G>A置换突变的引物设计
AhFAD2A基因基因组序列开放读码框第448位碱基序列存在从野生型核苷酸G置换为突变型核苷酸A的突变，突变结果是导致编码的蛋白活性降低。根据上述突变位点的位置，设计KASP等位基因差异引物，如表1所示，使AhFAD2A基因的差异序列位于引物的3’末端，而5’端分别连接了Allele-1tail和Allele-2tail，这两条加尾序列与LGC公司MasterMix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5’端分别标记了FAM和HEX荧光基团。根据AhFAD2A基因组序列开放读码框序列，设计通用引物，如表1所示。
表1
表1中SEQ ID No.1由22个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因突变型开放读码框自5’端448-469位碱基的反向互补序列，在突变型特异引物的5’端连接了Allele-1tail，这条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5’端分别标记了FAM荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
表1中SEQ ID No.2由22个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因野生型开放读码框区自5’端448-469位碱基的反向互补序列，在突变型特异引物的5’端连接了Allele-2tail，这条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5’端分别标记了HEX荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
表1中SEQ ID No.3由18个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因开放阅读框区自5’端415-432位碱基序列。由于花生AhFAD2A和AhFAD2B基因之间重复序列的干扰，KASP标记很难区分具有同源性很高的AhFAD2A和AhFAD2B基因的SNP，根据KASP竞争性PCR的原理，本发明充分利用通用引物SEQ ID No.3，将3’末端碱基设计在AhFAD2A和AhFAD2B的A和B基因组之间SNP位点，用于区分A和B基因组，用特异性引物来区分要检测的特异性功能位点。
实施例3.花生AhFAD2A基因突变位点的检测
采用实施例2中根据AhFAD2A基因等位差异设计的引物组对供试花生材料包括普通油酸花生(基因型AABB)为母本与高油酸花生(基因型aabb)为父本杂交的F1代杂种、F2代分离群体进行检测，同时以CAPS和PCR产物测序法验证的AA，aa和Aa基因型样品为阳性对照，以无模板为阴性对照，具体方法如下:
3.1PCR反应体系：
采用实施例1所述的方法对样品进行基因组DNA的提取，提取获得的基因组DNA作为模板，利用实施例2所述的突变型特异引物、野生型特异引物、通用引物和LGC试剂盒产品Master Mix荧光探针配制反应体系，检测AhFAD2A基因开放读码框第448位碱基序列G>A等位差异。
DNA模板稀释及转板在TECAN液体自动化工作站上进行，在MeridianTM液体处理工作站上将DNA和PCR mix加入384PCR反应板中，在HydrocycleTM PCR水浴中完成PCR反应；PCR总反应体系为3μL，组分如下：
加样完毕后，低速离心、封膜。
3.2PCR扩增反应条件:
94℃预变性15min；
第一步扩增反应：94℃预变性20s；65℃～55℃60s，10个循环，每个循环降低1℃；
第二步扩增反应：94℃预变性20s；55℃60s，35个循环。
PCR扩增结束后，当反应温度降至40℃以下，读取数据，数据读取使用LGC公司Kraken软件进行。
3.3数据分析
对于AhFAD2A基因第448位碱基等位差异检测，使用两对荧光探针(分别识别等位基因引物5'端的加尾序列)，标有FAM的探针与突变型等位基因(a)完全匹配，标有HEX的荧光探针与野生型等位基因完全匹配(A)。
对步骤3.2的检测结果进行分析，分析使用LGC公司Kraken软件进行，当检测到仅有FAM探针的荧光时，则第448位为A碱基纯合，即突变基因型，记为aa；当检测到仅有HEX探针的荧光时，则第448位G碱基纯合，即野生基因型，记为AA；当检测到有HEX探针和FAM探针的荧光时，则第448位为杂合子，记为Aa。
对等位基因鉴定分析实验进行设计时，分别以无模板对照、确定仅含有野生型等位基因A、突变型等位基因a、含野生型、突变型等位基因(Aa)的杂合花生品种为标准。未知样本将分为以下3类:①野生型：样本中只含有纯合基因AA；②突变型：样本中只含有纯合基因aa；③杂合子：样品中同时含有等位基因A和等位基因a。
为验证本发明的可行性和准确性，实验室选取50个未知基因型样本进行CAPS法检测，确定其基因型后对这些样品进行KASP检测，用以验证KASP-PCR检测方法的准确率。检测结果如表2所示，从表中可以看出，KASP检测结果与CAPS法验证的结果一致率达到96％。因此，本发明建立的AhFAD2A SNP基因分型的KASP高通量检测体系，能够有效降低高油酸花生育种成本，缩短育种时间，提高育种效率。
表2
基因型 CAPS KASP
AA 24 24
Aa 16 16
aa 10 8
不确定 0 2
对比例用于检测AhFAD2A基因448位G>A置换突变的引物设计
表3中SEQ ID No.1由22个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因突变型开放读码框自5’端448-469位碱基的反向互补序列，在突变型特异引物的5’端连接了Allele-1tail，这条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5’端分别标记了FAM荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
表3中SEQ ID No.2由22个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因野生型开放读码框区自5’端448-469位碱基的反向互补序列，在突变型特异引物的5’端连接了Allele-2tail，这条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5’端分别标记了HEX荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
表3中SEQ ID No.6由17个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因开放阅读框区自5’端415-431位碱基序列。本对比例中通用引物SEQ ID No.6为设计引物时基于同一设计思路的另外一组引物，该组引物中，通用引物3’末端碱基设计未包含AhFAD2A和AhFAD2B的A和B基因组之间SNP位点。
表3
为验证本发明的创造性，实验室选取70个已知基因型样本利用对比例中的引物组进行检测，其中有11个出现错误。准确率为84.3％，远低于本发明实施例2中引物组96％的准确率。因此，本发明建立的AhFAD2A SNP基因分型的KASP高通量检测体系及引物组具有显著的技术效果。

Claims (10)

1.一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组，其特征在于，包括：
突变型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
野生型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.如权利要求1所述的的引物组，其特征在于，所述的突变型特异引物还包括SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列的5’端连接有与荧光基团序列相同的Allele-1tail序列。
3.如权利要求2所述的的引物组，其特征在于，所述Allele-1tail序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.如权利要求1所述的的引物组，其特征在于，所述的野生型特异引物还包括SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列的5’端连接有与荧光基团序列相同的Allele-2tail序列。
5.如权利要求4所述的的引物组，其特征在于，所述Allele-2tail序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
6.一种高通量筛选AhFAD2A基因等位变异的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)提取待筛选样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物组进行高通量实时荧光定量PCR，制得PCR产物；
(3)对步骤(2)制得的PCR产物进行荧光检测分析，当检测到仅有FAM探针的荧光时，则第448位为碱基A纯合，即突变体基因型，记为aa；当检测到仅有HEX探针的荧光时，则448位为碱基G，即野生型，记为AA；当同时检测到有FAM探针和HEX探针的荧光时，则448碱基为杂合子，记为Aa。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的实时荧光定量PCR的反应体系为3μL，组分如下：
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的高通量实时荧光定量PCR的反应程序为：
94℃预变性15min；
第一步扩增反应：94℃预变性20s；65℃～55℃60s，10个循环，每个循环降低1℃；
第二步扩增反应：94℃预变性20s；55℃60s，35个循环。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的高通量实时荧光定量PCR中，DNA模板稀释及转板在TECAN液体自动化工作站上进行；反应体系中反应物的添加混合通过MeridianTM液体处理工作站加入至384PCR反应板中；PCR反应、检测荧光强度、读取数据均在HydrocycleTM PCR水浴中完成。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的荧光检测分析，荧光信号读取采用Omega F荧光阅读仪；数据结果采集、分析采用LGC公司Kraken软件进行。
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