CN105969879A - 一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法 - Google Patents

一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105969879A
CN105969879A CN201610442388.XA CN201610442388A CN105969879A CN 105969879 A CN105969879 A CN 105969879A CN 201610442388 A CN201610442388 A CN 201610442388A CN 105969879 A CN105969879 A CN 105969879A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
sequence
seq
nucleotide sequence
ahfad2a
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610442388.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105969879B (zh
Inventor
王兴军
赵术珍
翟晨光
景润春
赵传志
侯蕾
刘鑫
夏晗
李梦
李长生
苏惠
李爱芹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Golden Marker Beijing Biotech Co ltd
Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
China Golden Marker Beijing Biotech Co ltd
Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Golden Marker Beijing Biotech Co ltd, Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences filed Critical China Golden Marker Beijing Biotech Co ltd
Priority to CN201610442388.XA priority Critical patent/CN105969879B/zh
Publication of CN105969879A publication Critical patent/CN105969879A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105969879B publication Critical patent/CN105969879B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法。一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组，包括：突变型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；野生型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明可用于高通量鉴定高油酸自交后代中aa基因型，解决现有自交后代数量较大无法鉴定的问题，其能够准确快速的获得自交后代中FAD2A所有基因型AA，aa和Aa，及时剔除AA基因型，显著提高高油酸花生育种的效率。

Description

一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测 方法
技术领域
本发明涉及一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法，属于农业生物工程技术领域。
背景技术
花生是重要的油料作物之一，油酸和亚油酸是其油脂中的主要成分。油酸分子中只含有一个双价不饱和键，稳定性高，加热时所产生的有害物少；亚油酸分子中含有两个双价不饱和键，与油酸相比，亚油酸更容易被氧化，稳定性差。因此，花生籽粒油脂中油酸和亚油酸的比例是衡量油脂品质的重要指标，油酸亚油酸比值高的油品货价寿命长，商品质量稳定、保质期长。而且油酸有益于人类心、脑、肾和血管的健康，食用油酸可以增加人体内的高密度脂蛋白的浓度，降低中低密度脂蛋白的浓度，在保证人体对胆固醇需求的同时，防止胆固醇过量(Davis et al.,2008)，因此，高油酸花生越来越受到人们的青睐，高油酸花生品种的选育工作也越来越受到人们的重视。
1987年，美国科研人员首次鉴定了高油酸花生突变体F435，其油酸亚油酸比值高达40:1(Norden et al.，1987)，并以此突变体为材料培育出了一系列高油酸花生品种，如SunOleic95R，其油酸含量高达85％，超过了橄榄油的油酸含量。研究发现，花生高油酸特性由2个主效基因控制，Jung等从普通花生及高油酸花生突变体(以SunOleic95R为父本杂交获得)中分离了这两个基因：AhFAD2A和AhFAD2B。这两个基因均编码△12-脱氢酶，主要作用是催化油酸在碳12位去饱和产生亚油酸，是控制油酸和亚油酸含量的关键酶。在普通花生中这两个基因编码区同源性为99％，二者只有11个碱基的差别，翻译产物在4个位置上有不同的氨基酸残基。研究表明，AhFAD2A来源于花生野生种A基因组，AhFAD2B来源于花生野生种B基因组，无论AhFAD2B还是AhFAD2A都不是种子特异表达的基因，两个基因之一正常表达，其油酸水平即可稳定在正常水平(Jung et al.2000a；2000b)。研究表明，在高油酸花生突变体F435中FAD2B442bp处有一单核苷酸“A”插入，其插入导致移码突变，从而产生无活性蛋白质；在FAD2A 448bp处有单个核苷酸G到A的替换，结果是AhFAD2A编码的△12-脱氢酶活性降低。基于高油酸突变体F435中FAD2的序列变化，发展了一些鉴定FAD2基因型的方法。如CAPS(2007；2009)，PCR产物测序法(Wang et al.,2010)，荧光定量PCR法(2010；2011)，AS-PCR法(Chen et al.,2010)。上述检测方法或操作复杂，或成本太高，或效率太低，因此，开发一种高通量，低成本，高准确率的检测方法，将其应用到花生高油酸育种过程中显得十分必要。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法，该方法具有通量高，成本低，准确率高的特点，为分子标记辅助选择高油酸杂交后代提供了新的技术手段。
术语说明：
FAM：6-羧基荧光素，一种常用的荧光基团，用于标记核苷酸和核酸，激发光波长495nm，发射光波长521nm，颜色呈绿色。
HEX：六氯-6-甲基荧光素，激发光波长535nm，发射光波长556nm，颜色呈粉红色。
本发明的技术方案如下：
一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组，包括：
突变型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
野生型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
根据本发明优选的，所述的突变型特异引物还包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的5’端连接有与荧光基团序列相同的Allele-1tail序列；进一步优选的，所述Allele-1tail序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为与FAM荧光基团序列相同的片段；
所述突变型特异引物由22个碱基组成，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该序列为AhFAD2A基因突变型开放读码框区自5’端448-469位碱基的反向互补序列；在突变型特异引物的5’端连接了Allele-1tail，这条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5’端分别标记了FAM荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
根据本发明优选的，所述的野生型特异引物还包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的5’端连接有与荧光基团序列相同的Allele-2tail序列；进一步优选的，所述Allele-2tail序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列为与HEX荧光基团序列相同的片段；
所述野生型特异引物由22个碱基组成，核苷酸序列SEQ ID No.2所示，该序列为AhFAD2A基因野生型开放读码框区自5’端448-469位碱基的反向互补序列；在突变型特异引物的5’端连接了Allele-2tail，这条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5’端分别标记了HEX荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
由于花生AhFAD2A和AhFAD2B基因之间重复序列的干扰，KASP标记很难区分具有同源性很高AhFAD2A和AhFAD2B基因间的SNP，根据KASP竞争性PCR的原理，本发明充分利用通用引物SEQ ID No.3，将3’末端碱基设计在AhFAD2A和AhFAD2B的A和B基因组之间SNP位点，用于区分A和B基因组，用特异性引物来区分要检测的特异性功能位点。序列表中SEQ IDNo.3由18个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因开放阅读框区自5’端415-432位碱基序列。
利用上述引物组高通量筛选AhFAD2A基因等位变异的方法，步骤如下：
(1)提取待筛选样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物组进行高通量实时荧光定量PCR，制得PCR产物；
(3)对步骤(2)制得的PCR产物进行荧光检测分析，当检测到仅有FAM探针的荧光时，则第448位为碱基A纯合，即突变体基因型，记为aa；当检测到仅有HEX探针的荧光时，则448位为碱基G，即野生型，记为AA；当同时检测到有FAM探针和HEX探针的荧光时，则448碱基为杂合子，记为Aa。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的实时荧光定量PCR的反应体系为3μL，组分如下：
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的高通量实时荧光定量PCR的反应程序为：
94℃预变性15min；
第一步扩增反应：94℃预变性20s；65℃～55℃60s，10个循环，每个循环降低1℃；
第二步扩增反应：94℃预变性20s；55℃60s，35个循环。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的高通量实时荧光定量PCR中，DNA模板稀释及转板在TECAN液体自动化工作站上进行；反应体系中反应物的添加混合通过MeridianTM液体处理工作站加入至384PCR反应板中；PCR反应、检测荧光强度、读取数据均在HydrocycleTMPCR水浴中完成。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的荧光检测分析，荧光信号读取采用Omega F荧光阅读仪；数据结果采集、分析采用LGC公司Kraken软件进行。LGC公司Kraken软件进行可高通量检测AhFAD2A基因G碱基到A碱基的置换。
有益效果
1、本发明开发了针对FAD2A突变位点(448bp处G:C→A:T突变)的引物组及高通量检测方法，一次检测样本量最高可达5376(384×14)个，该检测方法具有通量高，成本低，结果稳定的优点；与PCR产物测序法、CAPS方法比较，该方法操作简单，检测成本低；用CAPS结果验证显示，该方法结果可靠；
2、本发明可用于高通量检测杂交F1及回交育种中的Aa基因型后代；通过对杂交后代的检测，选择基因型为Aa的后代，能极大提高目标性状选择的准确性，减少后期选育的工作量；
3、本发明可用于高通量鉴定高油酸自交后代中aa基因型，解决现有自交后代数量较大无法鉴定的问题，其能够准确快速的获得自交后代中FAD2A所有基因型AA，aa和Aa，及时剔除AA基因型，显著提高高油酸花生育种的效率。
附图说明
图1为实施例2中部分KASP法检测样品中AhFAD2A基因各基因型点簇分布图；
图2为实施例3中CAPS法检测AhFAD2A各基因型的电泳照片；
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
下述实施例中所有方法如无特殊说明均为常规方法。
所述引物均由Lifetech公司合成。
实施例1.供试花生样品基因组DNA的提取
按TIANGEN公司提供的植物基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP-305)说明书中的记载提取供试花生样品基因组DNA，具体步骤如下：
①在液氮中研磨100mg新鲜或20℃冷冻的样品材料(注：样品要快速、充分研磨为粉末)；
②将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL，65℃预热的缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1wt％)，迅速颠倒混匀后，将离心管在65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；
③加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min；注：若提取富含多糖或淀粉的植物组织，可在第③步前，用酚:氯仿(体积比1:1)进行等体积抽提；
④将所得上层水相转入一个新的离心管，加入700μL的缓冲液GP2，充分混匀；
⑤将混匀的液体转入吸附柱CB3，12,000rpm离心30s，弃掉废液；
⑥向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前检查是否己加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，弃掉废液；
⑦向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前检查是否己加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，倒掉废液；
⑧重复步骤⑦；
⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中无水乙醇的残留会影响后续的酶反应实验；
⑩将吸附柱CB3放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量50～200μL洗脱缓冲液TE(pH值在7.0～8.5之间)，室温放置2-5min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液；
最后用紫外分光光度计检测DNA的含量及纯度，结果显示所测样品A260/280介于1.8～2.0之间，表明所提取的DNA纯度较高。
实施例2.用于检测AhFAD2A基因448位G>A置换突变的引物设计
AhFAD2A基因基因组序列开放读码框第448位碱基序列存在从野生型核苷酸G置换为突变型核苷酸A的突变，突变结果是导致编码的蛋白活性降低。根据上述突变位点的位置，设计KASP等位基因差异引物，如表1所示，使AhFAD2A基因的差异序列位于引物的3’末端，而5’端分别连接了Allele-1tail和Allele-2tail，这两条加尾序列与LGC公司MasterMix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5’端分别标记了FAM和HEX荧光基团。根据AhFAD2A基因组序列开放读码框序列，设计通用引物，如表1所示。
表1
表1中SEQ ID No.1由22个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因突变型开放读码框自5’端448-469位碱基的反向互补序列，在突变型特异引物的5’端连接了Allele-1tail，这条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5’端分别标记了FAM荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
表1中SEQ ID No.2由22个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因野生型开放读码框区自5’端448-469位碱基的反向互补序列，在突变型特异引物的5’端连接了Allele-2tail，这条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5’端分别标记了HEX荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
表1中SEQ ID No.3由18个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因开放阅读框区自5’端415-432位碱基序列。由于花生AhFAD2A和AhFAD2B基因之间重复序列的干扰，KASP标记很难区分具有同源性很高的AhFAD2A和AhFAD2B基因的SNP，根据KASP竞争性PCR的原理，本发明充分利用通用引物SEQ ID No.3，将3’末端碱基设计在AhFAD2A和AhFAD2B的A和B基因组之间SNP位点，用于区分A和B基因组，用特异性引物来区分要检测的特异性功能位点。
实施例3.花生AhFAD2A基因突变位点的检测
采用实施例2中根据AhFAD2A基因等位差异设计的引物组对供试花生材料包括普通油酸花生(基因型AABB)为母本与高油酸花生(基因型aabb)为父本杂交的F1代杂种、F2代分离群体进行检测，同时以CAPS和PCR产物测序法验证的AA，aa和Aa基因型样品为阳性对照，以无模板为阴性对照，具体方法如下:
3.1PCR反应体系：
采用实施例1所述的方法对样品进行基因组DNA的提取，提取获得的基因组DNA作为模板，利用实施例2所述的突变型特异引物、野生型特异引物、通用引物和LGC试剂盒产品Master Mix荧光探针配制反应体系，检测AhFAD2A基因开放读码框第448位碱基序列G>A等位差异。
DNA模板稀释及转板在TECAN液体自动化工作站上进行，在MeridianTM液体处理工作站上将DNA和PCR mix加入384PCR反应板中，在HydrocycleTM PCR水浴中完成PCR反应；PCR总反应体系为3μL，组分如下：
加样完毕后，低速离心、封膜。
3.2PCR扩增反应条件:
94℃预变性15min；
第一步扩增反应：94℃预变性20s；65℃～55℃60s，10个循环，每个循环降低1℃；
第二步扩增反应：94℃预变性20s；55℃60s，35个循环。
PCR扩增结束后，当反应温度降至40℃以下，读取数据，数据读取使用LGC公司Kraken软件进行。
3.3数据分析
对于AhFAD2A基因第448位碱基等位差异检测，使用两对荧光探针(分别识别等位基因引物5'端的加尾序列)，标有FAM的探针与突变型等位基因(a)完全匹配，标有HEX的荧光探针与野生型等位基因完全匹配(A)。
对步骤3.2的检测结果进行分析，分析使用LGC公司Kraken软件进行，当检测到仅有FAM探针的荧光时，则第448位为A碱基纯合，即突变基因型，记为aa；当检测到仅有HEX探针的荧光时，则第448位G碱基纯合，即野生基因型，记为AA；当检测到有HEX探针和FAM探针的荧光时，则第448位为杂合子，记为Aa。
对等位基因鉴定分析实验进行设计时，分别以无模板对照、确定仅含有野生型等位基因A、突变型等位基因a、含野生型、突变型等位基因(Aa)的杂合花生品种为标准。未知样本将分为以下3类:①野生型：样本中只含有纯合基因AA；②突变型：样本中只含有纯合基因aa；③杂合子：样品中同时含有等位基因A和等位基因a。
为验证本发明的可行性和准确性，实验室选取50个未知基因型样本进行CAPS法检测，确定其基因型后对这些样品进行KASP检测，用以验证KASP-PCR检测方法的准确率。检测结果如表2所示，从表中可以看出，KASP检测结果与CAPS法验证的结果一致率达到96％。因此，本发明建立的AhFAD2A SNP基因分型的KASP高通量检测体系，能够有效降低高油酸花生育种成本，缩短育种时间，提高育种效率。
表2
基因型 CAPS KASP
AA 24 24
Aa 16 16
aa 10 8
不确定 0 2
对比例用于检测AhFAD2A基因448位G>A置换突变的引物设计
表3中SEQ ID No.1由22个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因突变型开放读码框自5’端448-469位碱基的反向互补序列，在突变型特异引物的5’端连接了Allele-1tail，这条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5’端分别标记了FAM荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
表3中SEQ ID No.2由22个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因野生型开放读码框区自5’端448-469位碱基的反向互补序列，在突变型特异引物的5’端连接了Allele-2tail，这条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5’端分别标记了HEX荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
表3中SEQ ID No.6由17个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因开放阅读框区自5’端415-431位碱基序列。本对比例中通用引物SEQ ID No.6为设计引物时基于同一设计思路的另外一组引物，该组引物中，通用引物3’末端碱基设计未包含AhFAD2A和AhFAD2B的A和B基因组之间SNP位点。
表3
为验证本发明的创造性，实验室选取70个已知基因型样本利用对比例中的引物组进行检测，其中有11个出现错误。准确率为84.3％，远低于本发明实施例2中引物组96％的准确率。因此，本发明建立的AhFAD2A SNP基因分型的KASP高通量检测体系及引物组具有显著的技术效果。

Claims (10)

1.一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组，其特征在于，包括：
突变型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
野生型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.如权利要求1所述的的引物组，其特征在于，所述的突变型特异引物还包括SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列的5’端连接有与荧光基团序列相同的Allele-1tail序列。
3.如权利要求2所述的的引物组，其特征在于，所述Allele-1tail序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.如权利要求1所述的的引物组，其特征在于，所述的野生型特异引物还包括SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列的5’端连接有与荧光基团序列相同的Allele-2tail序列。
5.如权利要求4所述的的引物组，其特征在于，所述Allele-2tail序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
6.一种高通量筛选AhFAD2A基因等位变异的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)提取待筛选样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物组进行高通量实时荧光定量PCR，制得PCR产物；
(3)对步骤(2)制得的PCR产物进行荧光检测分析，当检测到仅有FAM探针的荧光时，则第448位为碱基A纯合，即突变体基因型，记为aa；当检测到仅有HEX探针的荧光时，则448位为碱基G，即野生型，记为AA；当同时检测到有FAM探针和HEX探针的荧光时，则448碱基为杂合子，记为Aa。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的实时荧光定量PCR的反应体系为3μL，组分如下：
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的高通量实时荧光定量PCR的反应程序为：
94℃预变性15min；
第一步扩增反应：94℃预变性20s；65℃～55℃60s，10个循环，每个循环降低1℃；
第二步扩增反应：94℃预变性20s；55℃60s，35个循环。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的高通量实时荧光定量PCR中，DNA模板稀释及转板在TECAN液体自动化工作站上进行；反应体系中反应物的添加混合通过MeridianTM液体处理工作站加入至384PCR反应板中；PCR反应、检测荧光强度、读取数据均在HydrocycleTM PCR水浴中完成。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的荧光检测分析，荧光信号读取采用Omega F荧光阅读仪；数据结果采集、分析采用LGC公司Kraken软件进行。
CN201610442388.XA 2016-06-17 2016-06-17 一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法 Active CN105969879B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610442388.XA CN105969879B (zh) 2016-06-17 2016-06-17 一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610442388.XA CN105969879B (zh) 2016-06-17 2016-06-17 一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105969879A true CN105969879A (zh) 2016-09-28
CN105969879B CN105969879B (zh) 2020-02-07

Family

ID=57021408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610442388.XA Active CN105969879B (zh) 2016-06-17 2016-06-17 一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105969879B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106868111A (zh) * 2017-01-13 2017-06-20 中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司 利用通用TaqMan探针检测SNP的方法和试剂盒
CN108120616A (zh) * 2017-12-20 2018-06-05 中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司 种子定位装置及种子自动切片采样设备
CN109371168A (zh) * 2018-11-01 2019-02-22 川北医学院 检测乙型肝炎病毒中松弛环状dna和共价闭合环状dna突变位点的新方法
CN109593876A (zh) * 2019-01-25 2019-04-09 河北省农林科学院粮油作物研究所 高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组及其应用
CN110205363A (zh) * 2019-05-24 2019-09-06 武汉大学 载脂蛋白e基因kasp分型检测试剂盒及其方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102199661A (zh) * 2011-03-11 2011-09-28 山东省花生研究所 花生δ12-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法
CN104328198A (zh) * 2014-11-14 2015-02-04 河南省农业科学院 检测高油酸花生fad2a和fad2b基因位点突变基因型的引物及其pcr检测方法
CN105385778A (zh) * 2015-12-26 2016-03-09 山东省农业科学院生物技术研究中心 高通量检测花生AhFAD2B基因SNP基因分型的引物及方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102199661A (zh) * 2011-03-11 2011-09-28 山东省花生研究所 花生δ12-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法
CN104328198A (zh) * 2014-11-14 2015-02-04 河南省农业科学院 检测高油酸花生fad2a和fad2b基因位点突变基因型的引物及其pcr检测方法
CN105385778A (zh) * 2015-12-26 2016-03-09 山东省农业科学院生物技术研究中心 高通量检测花生AhFAD2B基因SNP基因分型的引物及方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MONDAL,S.: "Arachis hypogaea subsp. fastigiata cultivar TMV 2 oleyl PC desaturase (FAD2A) gene, partial cds", 《GENBANK》 *
黄冰艳等: "花生ahFAD2A等位基因表达变异与种子油酸积累关系", 《作物学报》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106868111A (zh) * 2017-01-13 2017-06-20 中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司 利用通用TaqMan探针检测SNP的方法和试剂盒
CN106868111B (zh) * 2017-01-13 2020-12-25 中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司 利用通用TaqMan探针检测SNP的方法和试剂盒
CN108120616A (zh) * 2017-12-20 2018-06-05 中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司 种子定位装置及种子自动切片采样设备
CN109371168A (zh) * 2018-11-01 2019-02-22 川北医学院 检测乙型肝炎病毒中松弛环状dna和共价闭合环状dna突变位点的新方法
CN109593876A (zh) * 2019-01-25 2019-04-09 河北省农林科学院粮油作物研究所 高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组及其应用
CN110205363A (zh) * 2019-05-24 2019-09-06 武汉大学 载脂蛋白e基因kasp分型检测试剂盒及其方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105969879B (zh) 2020-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105969879A (zh) 一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法
CN105506163B (zh) 一种鉴定控制白菜紫色性状形成的snp分子标记及其应用
CN106282394A (zh) 高通量检测玉米南方锈病抗性基因分型的方法及其试剂盒
CN105385778A (zh) 高通量检测花生AhFAD2B基因SNP基因分型的引物及方法
CN107385024A (zh) 水稻育性恢复基因辅助育种分子标记及其应用
CN107217106A (zh) 一种水稻稻米香味基因的snp功能分子标记及应用
CN108004345A (zh) 高通量检测小麦抗赤霉病基因分型的方法及其试剂盒
CN117802262B (zh) 一种与南瓜可溶性糖性状紧密连锁的snp分子标记及其应用
CN111778353B (zh) 用于鉴定普通小麦品种的snp分子标记以及snp分子标记检测方法
CN110846429A (zh) 一种玉米全基因组InDel芯片及其应用
CN106498078A (zh) 一种检测绵羊kitlg基因的单核苷酸多态性的方法及其应用
CN107338309A (zh) 一种水稻常用栽培品种香味基因badh2的SNP分子标记及应用
CN106755519B (zh) 基于数字pcr鉴定纯合型和杂合型转基因玉米双抗12-5的方法及应用
CN112289384A (zh) 一种柑橘全基因组kasp标记库的构建方法及应用
CN109852723A (zh) 一种与豇豆荚色基因紧密连锁的snp分子标记及其应用
CN106521004A (zh) 与萝卜核雄性不育基因连锁的Indel标记及其应用
CN106350601A (zh) 高通量检测玉米轴色基因分型的方法及其试剂盒
CN113699220A (zh) 一种以地域植物源鉴别蜂蜜及蜂蜜产地溯源的方法
CN109439741B (zh) 检测特发性癫痫病基因探针组合物、试剂盒及应用
CN106544438A (zh) 一种遗传标记在紫杏鉴定中的应用
CN115820881A (zh) 用于猫亲子鉴定的str标记位点扩增引物组、试剂盒及方法
CN108998556A (zh) 一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率的snp分子标记及其应用
CN105349659B (zh) 一套适于不结球白菜品种核酸指纹数据库构建的核心snp标记及其应用
CN108441572A (zh) 基于kasp技术的玉米叶绿体胞质类型的鉴定方法
CN114561487A (zh) 一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant