CN106868111B - 利用通用TaqMan探针检测SNP的方法和试剂盒 - Google Patents

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CN106868111B CN201710025277.3A CN201710025277A CN106868111B CN 106868111 B CN106868111 B CN 106868111B CN 201710025277 A CN201710025277 A CN 201710025277A CN 106868111 B CN106868111 B CN 106868111B
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Abstract

本发明涉及利用通用TaqMan探针检测SNP的方法和试剂盒。尤其是涉及包含由在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列构成的通用TaqMan探针，和由通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成的引物的试剂盒，以及利用所述试剂盒检测SNP的方法。

Description

利用通用TaqMan探针检测SNP的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及利用通用TaqMan探针检测SNP的方法和试剂盒。尤其是涉及包含由在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列构成的通用TaqMan探针，和由通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成的引物的试剂盒，以及利用所述试剂盒检测SNP的方法。
背景技术
目前常用于检测PCR产物，尤其是单核苷酸多态性(SNP)的方法主要涉及：
(1)
Figure BDA0001209524150000011
探针法(U.S.专利号：5,538,848)(CAST-PCR“Competitiveallele-specific TaqMan PCR”)，该方法通过在扩增反应中杂交和切割双标记的发荧光的探针来检测特异性PCR产物。需要设计一个或者两个引物，这样的引物在序列改变的位点退火能够区分相同基因的不同等位基因。发荧光的探针由用荧光报告染料和淬灭染料标记的寡核苷酸构成。PCR过程中，该TaqMan探针如果杂交到含有SNP的片段，该探针被DNA聚合酶的5’-外切酶活性切割，产生报告染料荧光强度的增加。TaqMan探针的供体和淬灭基团优选位于探针3’-和5’-末端，因为荧光团和淬灭基团之间的5’-3’水解只有在荧光团和淬灭基团不是彼此接近时才发生；
(2)分子信标法(molecular beacon)，该方法也是利用荧光相互作用检测和定量PCR产物，每个探针都具有5’荧光标记的末端和3’淬灭剂标记的末端(美国专利5,925,517和Tyagi和Kramer等人，Nature Biotech，14:303-309(1996))。而且，分子信标探针还包括大约5-7个碱基的短末端区段，彼此互补并且在溶液中结合在一起形成茎环结构，淬灭剂和荧光标记的末端接近，信号得以抑制；
(3)
Figure BDA0001209524150000012
探针法，该方法也提供了茎环检测系统，与分子信标类似，除了探针也具有作为扩增引物的连接的区段(Whitcombe等，(1999)Nat.Biotechnol.17:804-807；U.S.Pat.No.6,326,145)。这些探针在未杂交状态保持茎环构象，荧光淬灭。在退火后再次发生变性，探针区段与模板结合，从而打开茎环结构并且释放荧光；
(4)
Figure BDA0001209524150000021
探针法，与
Figure BDA0001209524150000022
探针类似，
Figure BDA0001209524150000023
探针包括与发夹探针连接的引物在扩增期间延伸，从而将内部淬灭标记物与5’-末端荧光团分离开(Nazarenko等，Nucleic Acids Research，25:2516-2521)；
(5)ARMS(扩增阻碍突变系统)，该系统包括PCR引物和诊断引物，其基本原理是，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物(见引物设计)，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来(US专利No.5595890(1997))；
(6)KASP法(等位基因特异性PCR)，该方法由英国LGC公司开发，涉及两个通用荧光探针，两个通用淬灭探针，通用荧光探针与通用淬灭探针形成双链的结构；通用反向引物；以及连接尾部序列的等位基因特异性正向引物；所述等位基因特异性引物所连接的尾部序列与通用荧光探针的序列互补；以及
(7)Exiqon和Roche开发了UNIVERSAL PROBELIBRARYTM(UPL)用于基因表达，该系统采用了一组165个短8-9碱基通用探针。这些短探针具有几个锁核酸(LNA)。与DNA杂交时具有很高的熔融温度，尽管很短。通用探针在5’末端也具有正常DNA碱基，因此能在PCR中被聚合酶的5’核酸酶活性切割。通用探针将可能的PCR引物位置限定在基因中。这165个通用探针组在大多数mRNA中具有足够的出现率，因此能够选择PCR引物，使得这165个通用序列中的至少一个能够位于两个引物之间。但是，检测分析并不是通用的，因为每个基因表达分析都需要两个靶-特异性引物。
上述(1)-(5)和(7)的方法都涉及设计等位基因特异性引物，而且涉及的探针也是等位基因特异性探针，尤其是
Figure BDA0001209524150000024
探针，虽然应用广泛，但是这些引物和探针的设计成本非常昂贵。
Figure BDA0001209524150000025
法和分子信标法都是用作内部探针，与一对侧接目标靶区域的相反引物一起使用。而且这些检测方法和系统都具有序列的特异性和检测灵敏度低，以及信号出现的速度慢的缺陷。KASP法虽然是目前广泛采用的利用通用探针的方法，但是通用荧光探针与通用淬灭探针形成双链，并且只能用于SNP的分型检测。
因此，亟待开发合成成本便宜、特异性和灵敏度高的利用通用(universal)引物和/或通用(universal)探针检测SNP，插入，缺失或突变的方法和试剂盒。
发明内容
第一方面，本发明涉及用于检测SNP，插入，缺失或突变的PCR引物组，所述引物组由以下引物构成：(1)第一正向引物，其由第一通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成，所述第一通用尾部序列(Tail)与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交；(2)第二正向引物，其由第二通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成，所述第二通用尾部序列(Tail)与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交；和(3)一条共用特异性反向引物，所述共用特异性反向引物是针对每条待扩增模板设计的特异性引物，但并非待检测SNP位点的等位基因特异性引物，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二级结构简单，在PCR扩增反应中不易出现非特异性扩增。
所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分别由5-60个寡核苷酸构成，或者由6-10个寡核苷酸构成，或者由11-15个寡核苷酸构成，或者由16-20个寡核苷酸构成，或者由21-25个寡核苷酸构成，或者由26-60个寡核苷酸构成，优选由15-25个寡核苷酸构成。
优选地，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列选自以下序列组：
(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQ ID NO:1)；
CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQ ID NO:2)；
(2)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQ ID NO:3)；
CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQ ID NO:4)；
(3)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO:5)；
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID NO:6)；和
(4)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQ ID NO:7)；
GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQ ID NO:8)。
所述严格条件可以包括：例如在PCR的工作条件下，温度为大约50到70℃，更优选为大约60到65℃，在最优选情况下，温度为大约65℃。
第二方面，本发明涉及用于检测SNP，插入，缺失或突变的通用TaqMan探针组，所述通用TaqMan探针组的组成如下：(1)第一通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列，所述第一通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第一通用尾部序列或者第一通用尾部序列的反向互补序列杂交；以及(2)第二通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列，所述第二通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第二通用尾部序列或者第二通用尾部序列的反向互补序列杂交，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二级结构简单，在PCR扩增反应中不易出现非特异性扩增。
所述严格条件可以包括：例如在PCR工作条件下，温度为大约50到70℃，更优选为大约60到65℃，在最优选情况下，温度为大约65℃。
所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分别由5-60个寡核苷酸构成，或者由6-10个寡核苷酸构成，或者由11-15个寡核苷酸构成，或者由16-20个寡核苷酸构成，或者由21-25个寡核苷酸构成，或者由26-60个寡核苷酸构成，优选由15-25个寡核苷酸构成。
优选地，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列选自以下序列组：
(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQ ID NO:1)；
CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQ ID NO:2)；
(2)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQ ID NO:3)；
CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQ ID NO:4)；
(3)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO:5)；
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID NO:6)；和
(4)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQ ID NO:7)；
GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQ ID NO:8)。
所述通用TaqMan探针组选自如下探针组：
(1)5’-FAM-GTGACCAAGTTCATGCT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-TCGGAGTCAACGGATT-MGB-NFQ-3’
(2)5’-FAM-GAACTTGGTCACCTT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CGTTGACTCCGACCTT-MGB-NFQ-3’和
(3)5’-FAM-ATCAACTTGGTGTCGTA-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CTTTCACTTCGTCGTT-MGB-NFQ-3’。
所述报告荧光团选自但不限于5-羧基荧光素(5-FAM)，6-羧基荧光素(6-FAM)，2’,4’,1,4-四氯荧光素(TET)，2’,4’,5’,7’,1,4-六氯荧光素(HEX)和2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)，6-羧基-X-罗丹明(ROX)，6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)，NED，VIC，Alexa染料，Atto染料，Dyomic染料和Thilyte染料。所述第一通用TaqMan探针和第二通用TaqMan探针的两个报告荧光基团分别为FAM荧光基团和VIC荧光基团。
所述淬灭基团选自但不限于TAMRA，BHQ，IOWA Black(IDT)，QSY淬灭剂和Dabsyl和Dabcel磺酸盐/羧酸盐淬灭剂。
或者，淬灭基团连接有小沟结合物(MGB)基团，所述MGB基团选自但不限于：CC1065类似物，偏端霉素，纺锤菌素，贝尼尔，多卡米星，喷他脒，4,6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和DPI3。优选地，所述MGB基团将寡核苷酸序列的熔融温度(Tm)提高大约3℃至10℃，足够高以使TaqMan探针和尾部序列结合，或TaqMan探针和尾部序列的反向互补序列结合，同时防止非特异性检测。
第三方面，本方法涉及用于检测基因组中的SNP，插入，缺失或突变的试剂盒，所述试剂盒包含如下成分或者由如下成分组成：(I)PCR引物组，所述引物组由以下引物构成：(1)第一正向引物，其由第一通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成，所述第一通用尾部序列(Tail)与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交；(2)第二正向引物，其由第二通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成，所述第二通用尾部序列(Tail)与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交；和(3)一条共用特异性反向引物，所述共用特异性反向引物是针对每条待扩增模板设计的特异性引物，但并非待检测SNP位点的等位基因特异性引物；和(II)通用TaqMan探针组，所述通用TaqMan探针组的组成如下：(1)第一通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列，所述第一通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第一通用尾部序列或者第一通用尾部序列的反向互补序列杂交；以及(2)第二通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列，所述第二通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第二通用尾部序列或者第二通用尾部序列的反向互补序列杂交；所述成分(I)和成分(II)分别在试剂盒中不同的盒中或同一盒中，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二级结构简单，在PCR扩增反应中不易出现非特异性扩增。
所述严格条件可以包括：例如在PCR工作条件下，温度为大约50到70℃，更优选为大约60到65℃，在最优选情况下，温度为大约65℃。
所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分别由5-60个寡核苷酸构成，或者由6-10个寡核苷酸构成，或者由11-15个寡核苷酸构成，或者由16-20个寡核苷酸构成，或者由21-25个寡核苷酸构成，或者由26-60个寡核苷酸构成，优选由15-25个寡核苷酸构成。
优选地，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列选自以下序列组：
(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQ ID NO:1)；
CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQ ID NO:2)；
(2)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQ ID NO:3)；
CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQ ID NO:4)；
(3)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO:5)；
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID NO:6)；和
(4)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQ ID NO:7)；
GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQ ID NO:8)。
所述通用TaqMan探针组选自如下探针组：
(1)5’-FAM-GTGACCAAGTTCATGCT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-TCGGAGTCAACGGATT-MGB-NFQ-3’
(2)5’-FAM-GAACTTGGTCACCTT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CGTTGACTCCGACCTT-MGB-NFQ-3’和
(3)5’-FAM-ATCAACTTGGTGTCGTA-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CTTTCACTTCGTCGTT-MGB-NFQ-3’。
所述报告荧光团选自但不限于5-羧基荧光素(5-FAM)，6-羧基荧光素(6-FAM)，2’,4’,1,4-四氯荧光素(TET)，2’,4’,5’,7’,1,4-六氯荧光素(HEX)和2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)，6-羧基-X-罗丹明(ROX)，6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)，NED，VIC，Alexa染料，Atto染料，Dyomic染料和Thilyte染料。所述第一通用TaqMan探针和第二通用TaqMan探针的两个报告荧光基团分别为FAM荧光基团和VIC荧光基团。
所述淬灭基团选自但不限于TAMRA，BHQ，IOWA Black(IDT)，QSY淬灭剂和Dabsyl和Dabcel磺酸盐/羧酸盐淬灭剂。
或者，淬灭基团连接有小沟结合物(MGB)基团，所述MGB基团选自但不限于：CC1065类似物，偏端霉素，纺锤菌素，贝尼尔，多卡米星，喷他脒，4,6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和DPI3。优选地，所述MGB基团将寡核苷酸序列的熔融温度(Tm)提高大约3℃至10℃，足够高以使TaqMan探针和尾部序列结合，或TaqMan探针和尾部序列的反向互补序列结合，同时防止非特异性检测。
所述基因组可以源自不同来源，所述来源选自但不限于：细菌，病毒，藻类，苔藓类，原生动物，真菌，植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，动物，尤其是啮齿类，灵长类动物，包括人。
第四方面，本发明涉及用于检测基因组中的SNP，插入，缺失或突变的方法，所述方法包括如下步骤：
(一)在PCR反应系统中提供如下成分：
(I)PCR引物组，所述引物组由以下引物构成：(1)第一正向引物，其由第一通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成，所述第一通用尾部序列(Tail)与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交；(2)第二正向引物，其由第二通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成，所述第二通用尾部序列(Tail)与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交；和(3)一条共用特异性反向引物，所述共用特异性反向引物是针对每条待扩增模板设计的特异性引物，但并非待检测SNP位点的等位基因特异性引物；和
(II)通用TaqMan探针组，所述通用TaqMan探针组的组成如下：(1)第一通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列，所述第一通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第一通用尾部序列或者第一通用尾部序列的反向互补序列杂交；以及(2)第二通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列，所述第二通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第二通用尾部序列或者第二通用尾部序列的反向互补序列杂交，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二级结构简单，在PCR扩增反应中不易出现非特异性扩增；
(二)在PCR反应系统中，通用TaqMan探针引起报告荧光强度改变的信号；以及
(三)检测所产生的信号。
所述严格条件可以包括：例如在PCR工作条件下，温度为大约50到70℃，更优选为大约60到65℃，在最优选情况下，温度为大约65℃。
所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分别由5-60个寡核苷酸构成，或者由6-10个寡核苷酸构成，或者由11-15个寡核苷酸构成，或者由16-20个寡核苷酸构成，或者由21-25个寡核苷酸构成，或者由26-60个寡核苷酸构成，优选由15-25个寡核苷酸构成。
优选地，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列选自以下序列：
(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQ ID NO:1)；
CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQ ID NO:2)；
(2)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQ ID NO:3)；
CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQ ID NO:4)；
(3)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO:5)；
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID NO:6)；和
(4)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQ ID NO:7)；
GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQ ID NO:8)。
所述通用TaqMan探针组选自如下探针组：
(1)5’-FAM-GTGACCAAGTTCATGCT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-TCGGAGTCAACGGATT-MGB-NFQ-3’
(2)5’-FAM-GAACTTGGTCACCTT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CGTTGACTCCGACCTT-MGB-NFQ-3’和
(3)5’-FAM-ATCAACTTGGTGTCGTA-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CTTTCACTTCGTCGTT-MGB-NFQ-3’。
所述报告荧光团选自但不限于5-羧基荧光素(5-FAM)，6-羧基荧光素(6-FAM)，2’,4’,1,4-四氯荧光素(TET)，2’,4’,5’,7’,1,4-六氯荧光素(HEX)和2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)，6-羧基-X-罗丹明(ROX)，6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)，NED，VIC，Alexa染料，Atto染料，Dyomic染料和Thilyte染料。所述第一通用TaqMan探针和第二通用TaqMan探针的两个荧光基团分别为FAM荧光基团和VIC荧光基团。
所述淬灭基团选自但不限于TAMRA，BHQ，IOWA Black(IDT)，QSY淬灭剂和Dabsyl和Dabcel磺酸盐/羧酸盐淬灭剂。
或者，淬灭基团连接有小沟结合物(MGB)基团，所述MGB基团选自但不限于：CC1065类似物，偏端霉素，纺锤菌素，贝尼尔，多卡米星，喷他脒，4,6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和DPI3。优选地，所述MGB基团将寡核苷酸序列的熔融温度(Tm)提高大约3℃至10℃。
所述基因组可以源自不同来源，所述来源选自但不限于：细菌，病毒，藻类，苔藓类，原生动物，真菌，植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，动物，尤其是啮齿类，灵长类动物，包括人。
第五方面，本发明涉及上述第三方面的试剂盒在检测基因组中的SNP，插入，缺失或突变中的应用。
所述基因组可以源自不同来源，所述来源选自但不限于：细菌，病毒，藻类，苔藓类，原生动物，真菌，植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，动物，尤其是啮齿类，灵长类动物，包括人。
“SNP”，即“单核苷酸多态性”是指基因组中单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性。
“等位基因特异性引物”是指能用于扩增包含单核苷酸的变异的等位基因靶核苷酸的特异性引物。
MGB(小沟结合物(Minor Groove Binders))，参见：US专利No.5,801,155(1995)；Wemmer，D.E.,和Dervan P.B.,Current Opinion in Structural Biology，7:355-361(1997)，MGB可以连接在寡核苷酸的两端或者一端。一个或者多个MGB也可以连接在寡核苷酸的内部。MGB与寡核苷酸一端的连接将提供最大程度的杂交稳定性，也就是提高熔融温度(Tm)，优选地MGB与寡核苷酸一端的连接将熔融温度(Tm)提高大约3℃至6℃。因为MGB在完美匹配的DNA双链的小沟内匹配得最好，导致小沟内形状改变的错配将降低MGB与含有错配的区域的结合强度。因此，MGB稳定这样的杂交物的能力将降低，从而增加了MGB-寡核苷酸结合物将错配与完美匹配的双链的区分开来的能力。另一方面，如果错配存在于与MGB-寡核苷酸结合物互补的区域之外，对于相等长度的未结合的MGB-结合的寡核苷酸的区分能力预计应该是一样的。因为寡核苷酸探针区分单个碱基对错配的能力取决于其长度，越短的寡核苷酸越有效区分错配。
采用本发明限定的通用TaqMan探针和PCR引物组能够实现对SNP的正确分型以及对插入和缺失(InDels)的检测，实现对PCR产物的终点荧光检测和实时荧光检测，并且相比TaqMan探针法和KASP法具有如下优点：
Figure BDA0001209524150000111
Figure BDA0001209524150000121
附图说明：
图1图示了本发明的通用TaqMan探针与引物的通用尾部序列一致和反向互补情况下的PCR反应和基因分型示意图。
图2分别图示了Mix1、Mix2、Mix3、Mix4和Mix5的基因分型图。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。
实施例：
实验材料和方法：
(1)PCR反应引物和探针(参见下表1)：
表1
Figure BDA0001209524150000122
Figure BDA0001209524150000131
注1：引物下划线部分为Tail序列。
待检测SNP：A004914和A004920位点在参考基因组中的位置及侧翼序列(参考基因组为B73V2版本)，参见下表2：
表2
Figure BDA0001209524150000132
(2)反应需要的试剂：
Tris-HCl、KCl、Triton X-100、rox、DMSO和甘油购自Sigma；dNTPs、MgCl2和Taq酶购自Vazyme biotech co.,ltd.；通用TaqMan探针和引物由Thermo Fisher ScientificInc合成。
(3)PCR反应体系：
Mix1反应体系，每个PCR反应体系为3μl：
试剂 工作浓度
Tris‐HCl(pH8.4) 20mM
KCl 50mM
dNTPs 0.2mM
MgCl<sub>2</sub> 1.5mM
Taq酶 0.5U
Triton X‐100 0.2％
rox 0.6μM
Probe‐FAM‐MGB‐2 2.5μM
Probe‐VIC‐MGB‐2 2.5μM
DMSO 3.0％
甘油 5.0％
A004914‐FAM‐MGB‐2‐primerF 0.17μM
A004914‐VIC‐MGB‐2‐primerF 0.17μM
A004914‐Com‐primer 0.42μM
玉米基因组DNA 37.5ng
注：Mix1通用TaqMan探针与通用Tail序列反向互补
Mix2反应体系，每个PCR反应体系为3μl：
Figure BDA0001209524150000141
Figure BDA0001209524150000151
注：Mix2通用TaqMan探针与通用Tail序列方向一致
Mix3反应体系，每个PCR反应体系为3μl：
试剂 工作浓度
Tris‐HCl(pH8.4) 20mM
KCl 50mM
dNTPs 0.2mM
MgCl<sub>2</sub> 1.5mM
Taq酶 0.5U
Triton X‐100 0.2％
rox 0.6μM
Probe‐FAM‐MGB 2.5μM
Probe‐VIC‐MGB 2.5μM
DMSO 3.0％
甘油 5.0％
A004920‐FAM‐MGB‐2 0.17μM
A004920‐VIC‐MGB‐2 0.17μM
A004920‐Common 0.42μM
玉米基因组DNA 37.5ng
注：Mix3通用TaqMan探针与通用Tail序列方向一致
Mix4反应体系，每个PCR反应体系为3μl：
试剂 工作浓度
Tris‐HCl(pH8.4) 20mM
KCl 50mM
dNTPs 0.2mM
MgCl<sub>2</sub> 1.5mM
Taq酶 0.5U
Triton X‐100 0.2％
rox 0.6μM
Probe‐FAM‐MGB‐2 2.5μM
Probe‐VIC‐MGB‐2 2.5μM
DMSO 3.0％
甘油 5.0％
A004920‐FAM‐MGB‐2 0.17μM
A004920‐VIC‐MGB-2 0.17μM
A004920‐Common 0.42μM
玉米基因组DNA 37.5ng
注：Mix4通用TaqMan探针与通用Tail序列反向互补
Mix5反应体系，每个PCR反应体系为3μl：
Figure BDA0001209524150000161
Figure BDA0001209524150000171
注：Mix5通用TaqMan探针与通用Tail序列反向互补
(4)DNA样品：
DNA样品为来自中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司的已知基因分型明确的玉米样品。下表3显示了用于Mix1和Mix2的反应体系的玉米样品1-13和阴性对照(NTC)1-2：
表3
Figure BDA0001209524150000172
下表4显示了用于Mix3，Mix4和Mix5的反应体系的玉米样品14-27和阴性对照(NTC)1-2：
表4
Figure BDA0001209524150000173
(5)PCR反应程序：
95℃，15分钟；
循环1(10个循环)；
95℃，20s；
65-55℃，1分钟，每个循环减1℃；
循环2(35个循环)；
95℃，20s；
55℃，1分钟。
(6)PCR反应结束后，在TECAN M1000PRO荧光读板仪上进行荧光扫描，扫描参数如下表5所示：
表5
FAM VIC ROX
激发波长 485nm 510nm 570nm
激发带宽 5nm 5nm 5nm
发射波长 520nm 560nm 610nm
发射带宽 5nm 5nm 5nm
扫描结束后，使用LGC SNPline Kraken软件分析实验数据。
基因分型实验结果：
表6：Mix1和Mix2的分型结果：
Figure BDA0001209524150000181
表7：Mix3，Mix4和Mix5的分型结果：
Figure BDA0001209524150000182
Figure BDA0001209524150000191
参考图2中：
Mix1的基因分型图：1表示C:C纯合基因分型，VIC信号；2表示T:C杂合型；3表示T:T纯合基因分型，FAM信号；4表示NTC，无样品对照；
Mix2基因分型图：1表示T:T纯合基因分型，VIC信号；2表示T:C杂合型；3表示C:C纯合基因分型，FAM信号；4表示NTC，无样品对照；
Mix3基因分型图：1表示T:T纯合基因分型，VIC信号；2表示T:A杂合型；3表示A:A纯合基因分型，FAM信号；4表示NTC，无样品对照；
Mix4基因分型图：1表示A:A纯合基因分型，VIC信号；2表示T:A杂合型；3表示T:T纯合基因分型，FAM信号；4表示NTC，无样品对照；
Mix5基因分型图：1表示A:A纯合基因分型，VIC信号；2表示T:A杂合型；3表示T:T纯合基因分型，FAM信号；4表示NTC，无样品对照。
可以看出，Mix1-Mix5均实现了玉米基因组中SNP的正确分型，与实际分型完全一致。
SEQUENCE LISTING
<110> 中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司
<120> 利用通用TaqMan探针检测SNP的方法和试剂盒
<130> PM2145YJ66CN
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caaggtgacc aagttcaagg t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caaggtcgga gtcaacgctt a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctgaacttgg tcaccttagg t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccgttgactc cgaccttcgt a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctacgacacc aagttgatgc t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gaacgacgaa gtgaaaggat t 21

Claims (10)

1.用于检测基因组中的SNP或者插入或者缺失的试剂盒，所述试剂盒包含如下成分或者由如下成分组成：
（I）PCR引物组，所述引物组由以下引物构成：（1）第一正向引物，其由5’末端的第一通用尾部序列部分和3’末端的等位基因特异性序列部分构成；（2）第二正向引物，其由5’末端的第二通用尾部序列部分和3’末端的等位基因特异性序列部分构成；和（3）一条共用特异性反向引物，所述共用特异性反向引物是针对每条待扩增模板设计的特异性引物，但并非待检测SNP或者插入或者缺失的等位基因特异性引物，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列选自以下(a)至(d)组：
(a) CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT（SEQ ID NO: 1）；
CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA（SEQ ID NO: 2）；
(b) CTGAACTTGGTCACCTTAGGT（SEQ ID NO: 3）；
CCGTTGACTCCGACCTTCGTA（SEQ ID NO: 4）；
(c) GAAGGTGACCAAGTTCATGCT（SEQ ID NO: 5）；
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT（SEQ ID NO: 6）；和
(d) CTACGACACCAAGTTGATGCT（SEQ ID NO: 7）；
GAACGACGAAGTGAAAGGATT（SEQ ID NO: 8）；
和
（II）通用TaqMan探针组，所述通用TaqMan探针组的组成如下：（1）第一通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列；以及（2）第二通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列，所述通用TaqMan探针组选自如下探针组(e)至(g)：
(e) 5’-FAM-GTGACCAAGTTCATGCT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-TCGGAGTCAACGGATT-MGB-NFQ-3’；
(f) 5’-FAM-GAACTTGGTCACCTT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CGTTGACTCCGACCTT-MGB-NFQ-3’；和
(g) 5’-FAM-ATCAACTTGGTGTCGTA-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CTTTCACTTCGTCGTT-MGB-NFQ-3’；
所述成分（I）和成分（II）分别在试剂盒中不同的盒中或者在同一盒中。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述淬灭基团连接有小沟结合物MGB基团，所述小沟结合物MGB基团选自：CC 1065类似物，偏端霉素，纺锤菌素，贝尼尔，多卡米星，喷他脒，4,6-二氨基-2-苯基吲哚，吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和二氢环化吲哚卟啉三肽(DPI3)。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述小沟结合物MGB基团将寡核苷酸序列的熔融温度（Tm）提高3℃至10℃。
4.用于检测基因组中的SNP、插入或缺失的非诊断性方法，所述方法包括如下步骤：
（一）在PCR反应系统中提供如下成分：
（I）PCR引物组，所述引物组由以下引物构成：（1）第一正向引物，其由5’末端的第一通用尾部序列部分和3’末端的等位基因特异性序列部分构成；（2）第二正向引物，其由5’末端的第二通用尾部序列部分和3’末端的等位基因特异性序列部分构成；和（3）一条共用特异性反向引物，所述共用特异性反向引物是针对每条待扩增模板设计的特异性引物，但并非待检测SNP或者插入或者缺失的等位基因特异性引物，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列选自以下(a)至(d)组：
(a) CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT（SEQ ID NO: 1）；
CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA（SEQ ID NO: 2）；
(b) CTGAACTTGGTCACCTTAGGT（SEQ ID NO: 3）；
CCGTTGACTCCGACCTTCGTA（SEQ ID NO: 4）；
(c) GAAGGTGACCAAGTTCATGCT（SEQ ID NO: 5）；
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT（SEQ ID NO: 6）；和
(d) CTACGACACCAAGTTGATGCT（SEQ ID NO: 7）；
GAACGACGAAGTGAAAGGATT（SEQ ID NO: 8）；
和
（II）通用TaqMan探针组，所述通用TaqMan探针组的组成如下：（1）第一通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列；以及（2）第二通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列，所述通用TaqMan探针组选自如下探针组(e)至(g)：
(e) 5’-FAM-GTGACCAAGTTCATGCT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-TCGGAGTCAACGGATT-MGB-NFQ-3’；
(f) 5’-FAM-GAACTTGGTCACCTT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CGTTGACTCCGACCTT-MGB-NFQ-3’；和
(g) 5’-FAM-ATCAACTTGGTGTCGTA-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CTTTCACTTCGTCGTT-MGB-NFQ-3’；
其中，所述第一通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者在严格条件下与第一通用尾部序列的反向互补序列杂交，并且所述第二通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者在严格条件下与第二通用尾部序列的反向互补序列杂交；或者，所述第一通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全反向互补或者在严格条件下与第一通用尾部序列杂交，并且所述第二通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全反向互补或者在严格条件下与第二通用尾部序列杂交；
（二）在PCR反应系统中，通用TaqMan探针引起报告荧光强度改变的信号；以及
（三）检测所产生的信号。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述严格条件为：在PCR工作条件下温度为50到70℃。
6.根据权利要求5所述的方法，所述温度为60到65℃。
7.根据权利要求6所述的方法，所述温度为65℃。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述淬灭基团连接有小沟结合物MGB基团，所述小沟结合物MGB基团选自：CC 1065类似物，偏端霉素，纺锤菌素，贝尼尔，多卡米星，喷他脒，4,6-二氨基-2-苯基吲哚， 吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和二氢环化吲哚卟啉三肽。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述小沟结合物MGB基团将寡核苷酸序列的熔融温度（Tm）提高3℃至10℃。
10.（I）PCR引物组和（II）通用TaqMan探针组在制备用于检测基因组中的SNP、插入或缺失突变的试剂盒中的用途，其中，
所述（I）PCR引物组由以下引物构成：（1）第一正向引物，其由5’末端的第一通用尾部序列部分和3’末端的等位基因特异性序列部分构成；（2）第二正向引物，其由5’末端的第二通用尾部序列部分和3’末端的等位基因特异性序列部分构成；和（3）一条共用特异性反向引物，所述共用特异性反向引物是针对每条待扩增模板设计的特异性引物，但并非待检测SNP或者插入或者缺失的等位基因特异性引物，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列选自以下(a)至(d)组：
(a) CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT（SEQ ID NO: 1）；
CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA（SEQ ID NO: 2）；
(b) CTGAACTTGGTCACCTTAGGT（SEQ ID NO: 3）；
CCGTTGACTCCGACCTTCGTA（SEQ ID NO: 4）；
(c) GAAGGTGACCAAGTTCATGCT（SEQ ID NO: 5）；
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT（SEQ ID NO: 6）；和
(d) CTACGACACCAAGTTGATGCT（SEQ ID NO: 7）；
GAACGACGAAGTGAAAGGATT（SEQ ID NO: 8）；
和
所述（II）通用TaqMan探针组的组成如下：（1）第一通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列；以及（2）第二通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列，所述通用TaqMan探针组选自如下探针组(e)至(g)：
(e) 5’-FAM-GTGACCAAGTTCATGCT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-TCGGAGTCAACGGATT-MGB-NFQ-3’；
(f) 5’-FAM-GAACTTGGTCACCTT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CGTTGACTCCGACCTT-MGB-NFQ-3’；和
(g) 5’-FAM-ATCAACTTGGTGTCGTA-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CTTTCACTTCGTCGTT-MGB-NFQ-3’；
其中，所述第一通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者在严格条件下与第一通用尾部序列的反向互补序列杂交，并且所述第二通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者在严格条件下与第二通用尾部序列的反向互补序列杂交；
或者，所述第一通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全反向互补或者在严格条件下与第一通用尾部序列杂交，并且所述第二通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全反向互补或者在严格条件下与第二通用尾部序列杂交。
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