CN109082460B - 应用于snp分型的非竞争性探针设计方法、检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种应用于SNP分型的非竞争性探针设计方法、检测方法及应用,所述非竞争性探针设计方法设计对应待测SNP位点的引物探针组合,其中一条探针对应检测含有靶点位点的基因片段,另一条探针检测不含有靶点位点的基因片段,通过两条探针荧光的比例直接获取SNP基因型,把常规的竞争性的SNP检测转变为非竞争性的SNP检测,大大降低筛选的工作量。
Description
技术领域
本发明涉及生物基因检测领域,特别涉及一种应用于SNP分型的非竞争性探针设计方法、检测方法及应用。
背景技术
SNP--Single Nucleotide Polymorphism,即单核苷酸多态性,是由单个核苷酸碱基的改变而导致的核苷酸多态性。一般而言,普通的SNP位点有两种等位基因,在人类基因组中平均每1000个碱基左右就有一个SNP多态性位点的出现。而SNP位点会影响基因的功能,从而导致生物的性状发生变化,严重的话甚至会导致遗传疾病致病。所以目前对于单核苷酸多态性的研究受到了药物基因组学、诊断学和生物医学研究等多领域的高度重视。
目前,针对SNP检测的方法主要有TaqMan探针法,分子信标法、SCORPION探针法、SUNRISE探针法、ARMS(扩增阻碍突变系统)以及KASP法(等位基因特异性PCR),其上具体的方法内容不展开详细说明。具体说明常见的两种针对SNP情况进行数字PCR技术检测的方法:
1、针对常规的SNP检测:这种情况适用于检测特异性核苷酸片段,在检测过程过需要一对引物和两条探针(野生型探针以及突变型探针),其中所述引物扩增目标基因,野生型探针对应于检测正常基因片段,突变型探针对应检测发生变异的特异性基因片段,从而通过检测得到的荧光信号比例定量检测特异性核苷酸片段。也就是常常采用野生型探针和突变型探针同时存在的情况下,对样品的基因型进行检测。
2、针对基因位点突变的SNP检测:这种情况适用于检测由于SNP位点突变而引起的基因分型,为了避免检测过程中产生的假阳性现象,在检测过程中需要两对引物以及两条探针,其中一对引物对应扩增包括有内参基因的基因片段,对应的探针检测该内参基因;另一对引物对应扩增包括有突变位点的基因片段,对应的探针检测该突变位点。也就是说常常采用同一个体系内包含有靶点的引物和突变型的探针以及内参基因的引物和探针。
而在其上提及的两种检测情况存在一些缺陷:1、竞争型探针对特异性要求很高,从而导致竞争型探针开发起来比较困难,往往需要大量的筛选工作,进而耗费大量的时间和金钱。2、针对基因位点突变的检测,数字PCR平台采用的方法当中如果某个样品的内参基因异常就会造成突变率检测错误,进而导致检测失败,这种情况下,检测的效果取决于内参基因的稳定性。另外,两对引物和两对探针的组合也大大地加大了检测工作的强度。
发明内容
本发明提供一种应用于SNP分型的非竞争性探针设计方法、检测方法及应用,所述非竞争性探针设计方法针对需要检测的目标DNA设计一对引物和两条探针,其中一条探针对应于检测位点,另一条探针对应于非检测位点,从而降低探针设计的难度,在检测基因位点突变时,也不需要额外的内参基因,自身基因即可作为阴性对照。
本发明为实现上述目的,采用以下的技术方案:
1、模板DNA提取:
采用DNA提取试剂盒进行细胞基因组DNA的提取,其中被提取的DNA中包含待测SNP位点,定义所述待测SNP位点所在位置为靶区域。
2、目标片段扩增:
2.1:PCR扩增体系成分包括:
【设计引物探针组合:上游引物;下游引物;非检测位点探针;检测位点探针】
【扩增试剂组合:2X PCR mix】
其中所述2X PCR mix采购自南京诺唯赞生物(货号:Q113-02),成分包括:dNTP/dUTP Mix,Mg2+,AceTaq DNA Polymerase(化学修饰热启动Taq酶),Heat-labile UDG(尿嘧啶-DNA糖基化酶)。
其中设计引物探针组合依据以下的标准进行设计:
其中上游引物与所述靶区域上游端的一条DNA模板链互补,所述下游引物与所述靶区域下游端的另一条DNA模板链互补。
所述非检测位点探针的核苷酸序列对应所述靶区域内非待检测SNP位点所在位置的核苷酸序列,其中所述非检测位点的5’末端具有第一报告荧光基团,3’末端具有淬灭基团。
所述检测位点探针的核苷酸序列对应所述靶区域内待测SNP位点所在位置的核苷酸序列,具体而言,所述检测位点探针的核苷酸序列互补于所述待测SNP位点所在位置的核苷酸序列,其中所述检测位点的5’末端具有第二报告荧光基团,3’末端具有淬灭基团,其中所述第一报告荧光基团不同于所述第二报告荧光基团。
在本发明的实施例中,第一报告荧光基团和第二报告荧光基团包括但不限于5-羧基荧光素(5-FAM),6-羧基荧光素(6-FAM),2’4’,1,4-四氯荧光素(TET),2’4’5’7’,1,4-六氯荧光素(HEX)和2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE),6-羧基-X-罗丹明(ROX),6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA),NED,VIC,Alexa染料,Atto染料,Dyomic染料和Thilyt染料。
在本发明的具体实施例中,所述第一报告荧光基团为FAM,第二报告荧光基团为VIC,通过VIC/FAM直接获取突变率。
所述淬灭基团选自但不限于TAMRA、BHQ、IOWA Black(IDT)、QSY淬灭剂和Dabsyl和Dabcel磺酸盐/羧酸盐淬灭剂。或者,淬灭基团连接有小沟结合物(MGB)基团,所述MGB基团选自但不限于:CC1065类似物,偏端霉素,纺锤霉素,内尼多,多卡米星,喷他脒,4.6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和DPI3。
2.2扩增条件:95℃预变性10min,[95℃变性15s,60℃退火1min]X40;优选退火温度是55-65℃。
2.3扩增的操作步骤:
将被提取的DNA放置到PCR扩增体系中,在设定的扩增条件下进行扩增。
3、结果读取分析:
读取第一报告荧光基团和第二报告荧光基团对应的荧光信号,获取对应的荧光信号的比例,获取对应的基因分型。
本发明提供的一种应用于SNP分型的非竞争性探针设计方法、检测方法及应用,具有以下的有益效果:
1.把常规的竞争性的SNP检测转变为非竞争性的SNP检测,筛选的工作量大大降低;
2.避免了选择的内参基因出现异常,造成检测结果错误;
3.数字PCR的阈值划分需要同时把FAM、VIC、FAM+VIC划分(固态芯片还需要ROX矫正通道),而本发明只用到FAM和FAM+VIC两个通道(固态芯片还需要ROX矫正通道),检测结果不存在单独的VIC信号。
4.VIC/FAM结果直接就是突变率,而无须进行转化。
附图说明
图1到图3是根据本发明的一实施例的MTHFR基因677位点在常规PCR扩增方法中得到的测序示意图。
图4到图7是根据本发明的一实施例的MTHFR基因677位点在进行数字PCR扩增方法中得到的荧光示意图。
图8到图10是根据本发明的一实施例的AMELX/AMELY基因SNP位点在进行数字PCR扩增方法中得到的荧光示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本领域技术人员应理解的是,在本发明的揭露中,术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系,其仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此上述术语不能理解为对本发明的限制。
可以理解的是,术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”,即在一个实施例中,一个元件的数量可以为一个,而在另外的实施例中,该元件的数量可以为多个,术语“一”不能理解为对数量的限制。
具体实施例1:
以检测MTHFR基因677位点为例进行说明,MTHFR(亚甲基四氢叶酸还原酶)是同型半胱氨酸的关键酶之一,其677位点有三种基因分型:野生型CC/杂合突变型CT/纯合突变型TT。
MTHFR的作用代谢并清除同型半胱氨酸,同型半胱氨酸是一种有毒的氨基酸,损害内皮的细胞壁。通过检测MTHFR基因677位点的临床意义表现为:寻找可能存在的遗传性易栓倾向,补充叶酸、维生素B6和B12,避免复发性流产和血栓的形成。
选用的样本来于:口腔脱落细胞,其中所述口腔脱落细胞选自普通人群,通过棉签刮拭单侧口腔20次;
DNA提取:采用天根生化DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA,严格按照此试剂盒说明书进行操作提取基因组DNA;
待检测SNP:rs180113位点在参考基因组中的位置及侧翼序列(参考基因组版本为hμMan GRCh38/hg38,参见下表1:
表1;
图中下划线对应的为待测MTHFR 677位点(rs1801133)所在位置。
对应的引物探针信息如下表2:
表2:
编号 | 碱基序列 | 备注 |
SEQ1 | CCCCCAAAGCAGAGGACTC | 上游引物 |
SEQ2 | GCGAACTCCAGCACTCCACC | 下游引物 |
SEQ3 | VIC-TGAAATCGACTCCCGCA-MGB | 检测位点探针 |
SEQ4 | FAM-ATCATCACGCAGCTTTT-MGB | 非检测位点探针 |
表2当中,检测位点探针中下划线的碱基为对应互补待测MTHFR 677位点(rs1801133)的碱基。
引物探针的序列通过FastPCR软件设计,选择。
对应的检测位点探针通过primer express软件设计,选择。
对应的非检测位点探针通过primer express软件设计,选择。
一、进行常规PCR扩增:
表3:
表3中,2X PCR mix采购自南京诺唯赞生物(货号:Q113-02),成分包括:dNTP/dUTPMix,Mg2+,AceTaq DNA Polymerase,Heat-labile UDG。
扩增条件:
95℃10min,[95℃15s,60℃1min]X40。程序运行结束后,寄送至上海生工进行测序。扩增设备是ABI7500。
结果分析:
得到的测序结果如图1到3所示,其中图1对应CC基因型,图2对应TT基因型,图3对应CT基因型。通过常规的PCR技术获取不同基因型MTHFR基因。
二、进行数字PCR扩增:
表4:
PCR扩增条件:
95℃10min,[95℃15s,60℃1min]X40。程序运行结束后,采用iscanner25生物芯片分析仪分析芯片结果,得到FAM和VIC的浓度数值。
数字PCR分析结果:数字PCR得到的结果如图4到图8所示:
其中图4对应的是NTC空白组的拷贝数示意图,图5对应的CC基因型的拷贝数示意图,图6对应的是TT基因型的拷贝数示意图,图7对应的是CT基因型额度拷贝数示意图。
拷贝数分析:
表5:
具体实施例2:
以检测女性AMELX基因同源的男性AMELY基因的SNP位点进行说明,该位点有两种基因分型:男性基因型CT型和女性基因型CC型。
选用的样本来于:口腔脱落细胞,其中所述口腔脱落细胞选自公司员工,使用棉签刮拭单侧口腔20次;
DNA提取:采用天根生化DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA,严格按照此试剂盒说明书进行操作提取基因组DNA;
待检测SNP位点在参考基因组中的位置及侧翼序列(参考基因组版本为hμManGRCh38/hg38,参见下表6:
表6
对应的引物探针序列如表7:
表7:
编号 | 碱基序列 | 备注 |
SEQ 5 | GGATGGCTGCACCACCAAATC | XY染色体共同引物 |
SEQ 6 | CTGGCACCACTGGGATGTG | XY染色体共同引物 |
SEQ 7 | FAM--TGTCCCAACAGCACC-MGB | XY染色体共同探针 |
SEQ 8 | VIC--CTGCAGCCTCATCACC-MGB | X染色体探针 |
表7当中,检测位点探针中下划线的碱基为待测X染色体的碱基。
引物探针的序列通过FastPCR软件设计,选择。
对应的检测位点探针通过primer express软件设计,选择。
对应的非检测位点探针通过primer express软件设计,选择。
一、进行数字PCR扩增:
表8
试剂名称 | 体积 | 终浓度 |
2XPCR mix | 7.5uL | 1X |
50X High ROX | 0.3uL | 1X |
上游引物(100μM) | 0.15uL | 1000nM |
下游引物(100μM) | 0.15uL | 1000nM |
FAM探针(25μM) | 0.3uL | 500nM |
VIC探针(25μM) | 0.3uL | 500nM |
基因组DNA | 5uL | |
补足ddH<sub>2</sub>O至 | 15uL |
PCR扩增条件:
95℃10min,[95℃15s,60℃1min]X40。程序运行结束后,采用iscanner25生物芯片分析仪分析芯片结果,得到FAM和VIC的浓度数值。
数字PCR分析结果:
数字PCR得到的结果如图8到图10所示;其中图8对应的是NTC空白组的拷贝数示意图,图9对应的CC基因型女性的拷贝数示意图,图10对应的是CT基因型男性的拷贝数示意图。
拷贝数分析如表9所示:
表9
值得一提的是,在NTC样品组的检测过程中,理论上应该是没有VIC信号的,而此处显示的信号对应的是少量非特异性的扩增阳性,可忽略不计。
由上可知,通过本发明的非竞争性检测方法可以准确地检测到不同的基因型,通过两种荧光信号的比例就可以轻松获取突变率。比如在本发明的实施例中只用到FAM和FAM+VIC两个通道,检测结果不存在单独的VIC信号,提高检测效率的同时保证检测的准确度。
本发明不局限于以上提到的最佳实施例,任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品,但不论在其形状或结构上作任何变化,凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案,均落在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种应用于SNP分型的检测方法,用于非疾病诊断目的,其特征在于,包括:
模板DNA获取:采用DNA提取试剂盒进行细胞基因组DNA的提取,其中被提取的DNA中包含待测SNP位点,定义所述待测SNP位点所在位置为靶区域;
扩增:将被提取的 DNA 放置到 PCR 扩增体系内进行扩增;
其中 PCR 扩增体系成分包括:
上游引物,其中所述上游引物的核苷酸序列与所述靶区域上游端的一条DNA 模板链互补;
下游引物,其中所述下游引物的核苷酸序列与所述靶区域下游端的另一条 DNA 模板链互补;
非检测位点探针,其中所述非检测位点探针的核苷酸序列互补所述靶区域内非待检测SNP 位点所在位置的核苷酸序列,其中所述非检测位点的 5’末端具有第一报告荧光基团,3’末端具有淬灭基团;
检测位点探针,其中所述检测位点探针的核苷酸序列对应所述靶区域内待测SNP 位点所在位置的核苷酸序列,其中所述检测位点的 5’末端具有第二报告荧光基团,3’末端具有淬灭基团,所述第一报告荧光基团不同于所述第二报告荧光基团;
扩增试剂组合: 2X PCR mix;
信号读取:获取第一报告荧光基团对应的第一荧光信号和第二报告荧光基团对应的第二荧光信号,读取第一荧光信号和第二荧光信号的比例获取基因分型结果。
2.根据权利要求 1 所述的一种应用于 SNP 分型的检测方法,其特征在于,退火温度是 55-65℃。
3.根据权利要求1 所述的一种应用于 SNP 分型的检测方法,其特征在于,所述 2XPCR mix 成分包括:dNTP/dUTP Mix,Mg2+,化学修饰热启动 Taq 酶,尿嘧啶-DNA 糖基化酶。
4.根据权利要求 1 所述的一种应用于 SNP 分型的检测方法,其特征在于,被应用于检测rs1801133 位点和 AMELX、AMELY 基因 SNP 位点。
5.根据权利要求4所述的一种应用于 SNP 分型的检测方法,其特征在于,当被应用于检测 rs1801133 位点时,所述上游引物序列为:CCCCCAAAGCAGAGGACT,所述下游引物序列为:GCGAACTCCAGCACTCCACC,所述检测位点探针序列为:VIC-TGAAATCGACTCCCGCA-MGB,所述非检测位点探针序列为:FAM-ATCATCACGCAGCTTTT-MGB。
6.根据权利要求4所述的一种应用于 SNP 分型的检测方法,其特征在于,当被应用于检测和 AMELX、AMELY 基因 SNP 位点时,XY 染色体共同引物序列为:GGATGGCTGCACCACCAAATC,CTGGCACCACTGGGATGTG,XY 染色体共同探针序列为: FAM--TGTCCCAACAGCACC-MGB,X 染色体探针序列为 VIC--CTGCAGCCTCATCACC-MGB。
7.根据权利要求1所述的一种应用于 SNP 分型的检测方法,其特征在于,所述第一报告荧光基团以及所述第二报告荧光基团包括但不限于FAM, TET,HEX,JOE, ROX,TAMRA,NED,VIC,Alexa染料,Atto染料,Dyomic染料和Thilyt染料。
8.根据权利要求7所述的一种应用于 SNP 分型的检测方法,其特征在于,其中所述第一报告荧光基团为FAM,所述第二报告荧光基团为VIC。
9.根据权利要求7 所述的一种应用于 SNP 分型的检测方法,其特征在于,所述淬灭基团包括但不限于TAMRA、BHQ、IOWA Black(IDT)、QSY淬灭剂和Dabsyl和Dabcel磺酸盐/羧酸盐淬灭剂,或者,所述淬灭基团连接有MGB 基团。
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