CN111793676A - 一种基因多态性检测的方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种基因多态性检测的方法、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基因多态性检测的方法及其应用。本发明所述基因多态性检测的方法针对检测靶序列设计上游引物、下游引物、标签引物和标记探针，采用对称扩增+标签引物的方式进行扩增检测。采用本发明方法可同时检测覆盖区域上的已知、未知等多个不同类型的突变，能够有效降低不同引物体系间的扩增效率差异问题，还能有效解决高GC模板扩增问题。

Description

一种基因多态性检测的方法、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基因多态性检测的方法及应用。
背景技术
目前用于基因突变检测的方法主要有以下几种：高分辨率熔解曲线、PCR荧光探针、基因芯片、测序等。四种主要的基因检测方法，都是基于PCR扩增技术衍生而来，测序法是该领域检测的金标准，既能检测已知位点，又能检测未知位点，测序检测过程包含PCR扩增、测序，操作繁琐，检测时间一般长达4～5个小时，而且操作过程中需要打开PCR反应管，容易带来PCR产物的污染；PCR荧光探针在进行基因突变检测，操作相对简单，但仅能识别和检测已知的突变位点，对于该未知区域未知的突变或未设计包含的突变情况无法检出；基因芯片检测过程包含PCR扩增、探针杂交，操作繁琐，检测时间一般长达4～5个小时，而且操作过程中需要打开PCR反应管，容易带来PCR产物的污染；高分辨率熔解曲线分型法的特征是利用多态性位点的碱基不同而带来的Tm值差别，通过识别不同的Tm值而进行检测，往往野生型和突变型位点的Tm值差别不到1℃，所以需要精准识别温度的设备，这类设备比较少，而且属于进口，价格昂贵。
除此之外，市场上还有一种传统PCR-熔解曲线技术，其技术原理多是采用上游引物及下游引物通过不对称扩增的方式获得单链产物，随后探针与单链产物形成熔解曲线进行靶序列的信息分析，该技术在应用于多重PCR扩增时，同一反应孔中不同靶序列的扩增效率不一致，存在相互竞争抑制，使产生的不同靶序列单链产物拷贝数不一致，导致同一反应孔中不同靶序列的检测灵敏度明显不同，影响检测效果。
因此，有必要寻求一种新的检测方法，能在一定程度上识别固定区域内的已知和未知位点突变情况，且检测特异性强、设计简单、成本低廉，同时操作简便、结果客观准确。
有鉴于此，提出本发明。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的首要目的是提供一种基因多态性检测的方法及其应用。
本发明的第二目的是提供一种用于检测高血压用药相关基因多态性的方法、试剂盒及其应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种检测基因多态性方法，所述方法包含：
1)多重PCR引物和探针的设计；
2)PCR扩增；
3)熔解曲线分析。
在一些实施方式中，所述1)多重PCR引物和探针的设计是针对多个靶序列分别设计上游引物、下游引物、标签引物和标记探针；所述上游引物或者下游引物中的一条由A区和B区构成：所述A区为靠近3’端段序列与靶序列完全互补；所述B区为靠近5’端连接一段与靶序列不同源的人工核苷酸序列，成为B区；另外一条引物与靶序列完全互补。
在一些实施方式中，所述的标签引物与B区序列相同；优选的，所述标签引物GC含量30-50％，Tm值55-60℃；更优选的，针对多个靶序列的标签引物序列相同。。
在一些实施方式中，所述探针与PCR扩增的单链产物序列互补，探针方向与标签引物方向相反。
在一些优选的实施方式中，所述探针序列覆盖待检多态性位点区域，优选的与多态性位点纯合野生型序列相同或与之完全互补；
在另一些优选的实施方式中，所述探针序列长度为20-30bp，Tm值45-75℃；
在另一些优选的实施方式中，所述的探针为TaqMan探针，探针5’端标记荧光基团，选自FAM、HEX、VIC、ROX、CY5等，3’端标记BHQ2；更优选的，不同靶序列的探针5’端标记不同的荧光基团，荧光基团与淬灭基团距离16-20个碱基。
在一些实施方式中，所述2)PCR扩增为对称PCR扩增。
在一些优选的实施方式中，所述上游引物和下游引物的终浓度相同，标签引物终浓度是上游引物及下游引物的3-30倍。
在一些优选的实施方式中，PCR扩增中使用的聚合酶缺乏5’-3’端外切酶活性，避免水解探针。
在一些实施方式中，所述3)熔解曲线分析是按1％速率进行升温使探针与PCR扩增的单链产物逐渐解链，形成熔解曲线。
在一些实施方式中，所述基因多态性为高血压相关基因多态性。
在一些优选的实施方式中，所述高血压相关基因多态性包括CYP2C9*3(rs1057910)/AGTR1(rs1801253)、ACE(rs4646994)和CYP2D6*10(rs1065852)/ADRB1(rs1801253)。
在一些优选的实施方式中，针对CYP2C9*3(rs1057910)/AGTR1(rs1801253)的引物探针组包括：CYP2C9*3上游引物，序列为SEQ ID NO.1；下游引物，序列为SEQ ID NO.2；TaqMan探针，序列为SEQ ID NO.3；AGTR1上游引物，序列为SEQ ID NO.4；下游引物，序列为SEQ ID NO.5；TaqMan探针，序列为SEQ ID NO.6；标签引物，序列为SEQ ID NO.7。
SEQ ID NO.1-7具体序列如下：
CYP2C9*3上游引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATGCAGGAAGAGATTGAACGTG-3ˊSEQ IDNO.1
CYP2C9*3下游引物5`-GTCACAGGTCACTGCATG-3ˊSEQ ID NO.2
CYP2C9*3探针5`-FAM-TGGTGGGGAGAAGGTCAATGT-BHQ2-3ˊSEQ ID NO.3
AGTR1上游引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATGAAGAAGGAGCAAGAGAACATTC-3ˊSEQ IDNO.4
AGTR1下游引物5`-CTTTAGAAAAGTCGGTTCAGTC-3ˊSEQ ID NO.5
AGTR1探针5`-ROX-TCACTACCATATGAGCCTTAGCTA-BHQ2-3ˊSEQ ID NO.6
标签引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATG-3ˊSEQ ID NO.7。
在一些优选的实施方式中，所述针对ACE(rs4646994)的引物探针组包括：ACE上游引物，序列为SEQ ID NO.8；下游引物，序列为SEQ ID NO.9；TaqMan探针，序列为SEQ IDNO.10；标签引物，序列为SEQ ID NO.7。
所述SEQ ID NO.8-10具体序列如下：
ACE上游引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATGGCTGGAGAGCCACTCCC-3ˊSEQ ID NO.8
ACE下游引物5`-TCAGATCTGGTAGGGGTTTGA-3ˊSEQ ID NO.9
ACE探针5`-FAM-GCCTATACAGTCACTTGTATGTG-BHQ2-3ˊSEQ ID NO.10。
在一些优选的实施方式中，所述针对CYP2D6*10(rs1065852)/ADRB1(rs1801253)的引物探针组包括：
CYP2D6*10上游引物，序列为SEQ ID NO.11；下游引物，序列为SEQ ID NO.12；TaqMan探针，序列为SEQ ID NO.13；ADRB1(rs1801253)上游引物，序列为SEQ ID NO.14；下游引物，序列为SEQ ID NO.15；TaqMan探针，序列为SEQ ID NO.16；标签引物，序列为SEQ IDNO.7。
所述SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.16具体序列如下：
CYP2D6*10上游引物5`-CAGTATGGTGTGTTCTGGAAGT-3ˊSEQ ID NO.11
CYP2D6*10下游引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATGCATTTGGTAGTGAGGCAG-3ˊSEQ IDNO.12
CYP2D6*10探针5`-FAM-AGGGGGCCTGGTGAGTAG-BHQ2-3ˊSEQ ID NO.13
ADRB1上游引物5`-TCTTCGTCTTCTTCAACTGGC-3ˊSEQ ID NO.14
ADRB1下游引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATGTCTCCGTGGGTCGCG-3ˊSEQ ID NO.15
ADRB1探针5`-ROX-CAAGGCCTTCCAGCGACTGC-BHQ2-3ˊSEQ ID NO.16。
在一些实施方式中，上述所述上游引物和下游引物的终浓度相同，标签引物终浓度是上游引物及下游引物的3-30倍。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括4)结果判读及分析。
在一些实施方式中，所述结果判读及分析为：①阳性质控品FAM、ROX荧光通路有特异性双熔解峰，阴性质控品无熔解峰，检测数据有效；②用扩增CYP2C9*3、AGTR1的PCR混合液中FAM荧光信号判断CYP2C9*3的多态性，单熔解峰Tm值在55.42-58.52时，判断结果为CYP2C9*3纯合野生型；双熔解峰Tm值分别在55.42-58.52和47.92-51.67时，判断结果为CYP2C9*3杂合型；单熔解峰Tm值在47.92-51.67时，判断结果为CYP2C9*3纯合突变型；ROX荧光信号判断AGTR1的多态性，单熔解峰Tm值在56.23-60.52时，判断结果为AGTR1纯合野生型；双熔解峰Tm值分别在56.23-60.52和65.90-68.61时，判断结果为AGTR1杂合型；单熔解峰Tm值在65.90-68.61时，判断结果为AGTR1纯合突变型；③用扩增ACE的PCR混合液中FAM荧光信号判断ACE的多态性，单熔解峰Tm值在60.89-64.92时，判断结果为ACE纯合野生型；双熔解峰Tm值分别在60.89-64.92和49.32-53.94时，判断结果为ACE杂合型；单熔解峰Tm值在49.32-53.94时，判断结果为ACE纯合突变型；④用扩增CYP2D6*10、ADRB1的PCR混合液中FAM荧光信号判断CYP2D6*10的多态性，单熔解峰Tm值在56.80-62.01时，判断结果为CYP2D6*10纯合野生型；双熔解峰Tm值分别在56.80-62.01和65.02-67.51时，判断结果为CYP2D6*10杂合型；单熔解峰Tm值在65.02-67.51时，判断结果为CYP2D6*10纯合突变型；ROX荧光信号判断ADRB1的多态性，单熔解峰Tm值在57.42-60.19时，判断结果为ADRB1纯合野生型；双熔解峰Tm值分别在57.42-60.19和68.12-70.61时，判断结果为ADRB1杂合型；单熔解峰Tm值在68.12-70.61时，判断结果为ADRB1纯合突变型。
本发明还提供一种引物探针组合物，其特征在于，所述组合物包含针对多个多态性靶序列的上游引物、下游引物、标签引物、标记探针；
所述上游引物或者下游引物中的一条由A区和B区构成：所述A区为靠近3’端段序列与靶序列完全互补；所述B区为靠近5’端连接一段与靶序列不同源的人工核苷酸序列，成为B区；另外一条引物与靶序列完全互补。
在一些实施方式中，所述的标签引物与B区序列相同；
在一些优选的实施方式中，所述标签引物GC含量30-50％，Tm值55-60℃；优选的，针对多个靶序列的标签引物序列相同。
在一些实施方式中，所述探针与PCR扩增的单链产物序列互补，探针方向与标签引物方向相反；
在一些优选的实施方式中，所述的探针为TaqMan探针，5’端标记荧光基团，选自FAM、HEX、VIC、ROX、CY5等，3’端标记BHQ2；更优选的，不同靶序列的探针5’端标记不同的荧光基团。
在一些实施方式中，所述上游引物和下游引物的终浓度相同，标签引物终浓度是上游引物及下游引物的3-30倍。
在一些实施方式中，所述组合物进一步包含聚合酶，所述聚合酶缺乏5’-3’端外切酶活性，避免水解探针。
在一些优选的实施方式中，所述引物探针是针对高血压相关基因多态性CYP2C9*3(rs1057910)/AGTR1(rs1801253)、ACE(rs4646994)和CYP2D6*10(rs1065852)/ADRB1(rs1801253)。
在一些更优选的实施方式中，所述组合物中引物和探针序列如SEQ ID NO.1-16所示。
在一些实施方式中，上述上游引物和下游引物的终浓度相同，标签引物终浓度是上游引物及下游引物的3-30倍。
在一些优选的实施方式中，所述CYP2C9*3位点标签引物与上、下游引物最佳比为10：1，所述AGTR1位点标签引物与上、下游引物最佳比为10：1，所述ACE位点标签引物与上、下游引物最佳比为3：1，所述CYP2D6*10位点标签引物与上、下游引物最佳比为30：1，所述ADRB1位点标签引物与上、下游引物最佳比为30：1。
本发明还提供一种用于检测高血压相关基因多态性的引物探针组合物，其特征在于，所述引物和探针序列如SEQ ID NO.1-16所示；
在一些实施方式中，上述引物探针组合物中的上游引物和下游引物的终浓度相同，标签引物终浓度是上游引物及下游引物的3-30倍；
在一些优选的实施方式中，所述CYP2C9*3位点标签引物与上、下游引物最佳比为10：1，所述AGTR1位点标签引物与上、下游引物最佳比为10：1，所述ACE位点标签引物与上、下游引物最佳比为3：1，所述CYP2D6*10位点标签引物与上、下游引物最佳比为30：1，所述ADRB1位点标签引物与上、下游引物最佳比为30：1。
本发明还提供一种用于检测基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含上述任一所述的引物探针组合物，以及常规PCR反应成分和阴阳性质控品。
在一些实施方式中，上述检测基因多态性的试剂盒为用于检测高血压相关基因多态性的试剂盒。
示例性的，一个具体的检测高血压相关基因多态性的试剂盒，其包括CYP2C9*3(rs1057910)/AGTR1(rs1801253)反应液、ACE(rs4646994)反应液、CYP2D6*10(rs1065852)/ADRB1(rs1801253)反应液，阴性质控品、阳性质控品。
所述的CYP2C9*3(rs1057910)/AGTR1(rs1801253)反应液，PCR混合液包括的引物探针组为CYP2C9*3上游引物，序列为SEQ ID NO.1、下游引物，序列为SEQ ID NO.2、TaqMan探针，序列为SEQ ID NO.3；AGTR1上游引物，序列为SEQ ID NO.4、下游引物，序列为SEQ IDNO.5、TaqMan探针，序列为SEQ ID NO.6；标签引物，序列为SEQ ID NO.7、PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、Taq酶；
所述的ACE(rs4646994)反应液，PCR混合液包括的引物探针组为上游引物，序列为SEQ ID NO.8、下游引物，序列为SEQ ID NO.9、TaqMan探针，序列为SEQ ID NO.10、标签引物，序列为SEQ ID NO.7、PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、Taq酶；
所述的CYP2D6*10(rs1065852)/ADRB1(rs1801253)反应液，PCR混合液包括的引物探针组为CYP2D6*10上游引物，序列为SEQ ID NO.11、下游引物，序列为SEQ ID NO.12、TaqMan探针，序列为SEQ ID NO.13；ADRB1(rs1801253)上游引物，序列为SEQ ID NO.14、下游引物，序列为SEQ ID NO.15、TaqMan探针，序列为SEQ ID NO.16；标签引物，序列为SEQ IDNO.7、PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、Taq酶。
在一些实施方式中，上述的用于基因多态性扩增的上游引物和下游引物终浓度一致，介于150-300nM；
在一些实施方式中，上述的基因多态性扩增的标签引物，浓度介于0.45-9μM；
在一些实施方式中，上述的基因多态性扩增的标签引物，GC含量30-50％，Tm值55-60℃；
在一些实施方式中，上述的试剂盒中Taq酶为无5’-3’端外切酶活性；
在一些实施方式中，上述的阴性质控品由Tris-Hcl缓冲液组成。所述的阳性质控品由CYP2C9*3质粒，AGTR1质粒，ACE质粒，CYP2D6*10质粒，ADRB1质粒组成，具体的，CYP2C9*3质粒由其野生型靶序列和突变型靶序列人工连接而成，AGTR1质粒由其野生型靶序列和突变型靶序列人工连接而成，ACE质粒由其野生型靶序列和突变型靶序列人工连接而成，CYP2D6*10质粒由其野生型靶序列和突变型靶序列人工连接而成，ADRB1质粒由其野生型靶序列和突变型靶序列人工连接而成，保证每个质粒野生型序列拷贝数和突变型序列拷贝数完全一致，避免定量及配制过程中带来的拷贝数人为误差。
本发明还提供一种上述所述试剂盒的在检测基因多态性中的应用。
本发明还提供一种上述试剂盒的检测方法，具体包含如下步骤：
⑴样本处理：采用血液基因组DNA提取试剂盒提取人外周血基因组DNA作为待测样本；
⑵检测体系配制：向反应管中加入18μl PCR混合液和2μl待测样本，同时设置阴性质控体系和阳性质控体系，反应管放入荧光定量PCR仪中；
⑶反应参数设置：98℃2分钟预变性，1个循环；98℃15秒变性，56℃35秒收集荧光信号，72℃30秒，50个循环；98℃30秒，40℃2分装，80℃30秒，1个循环，40℃至80℃升温速率为1％，全程收集荧光信号；荧光信号采集通路设置FAM、ROX。
⑷结果判读及分析：①阳性质控品FAM、ROX荧光通路有特异性双熔解峰，阴性质控品无熔解峰，检测数据有效；②用扩增CYP2C9*3、AGTR1的PCR混合液中FAM荧光信号判断CYP2C9*3的多态性，单熔解峰Tm值在55.42-58.52时，判断结果为CYP2C9*3纯合野生型；双熔解峰Tm值分别在55.42-58.52和47.92-51.67时，判断结果为CYP2C9*3杂合型；单熔解峰Tm值在47.92-51.67时，判断结果为CYP2C9*3纯合突变型；ROX荧光信号判断AGTR1的多态性，单熔解峰Tm值在56.23-60.52时，判断结果为AGTR1纯合野生型；双熔解峰Tm值分别在56.23-60.52和65.90-68.61时，判断结果为AGTR1杂合型；单熔解峰Tm值在65.90-68.61时，判断结果为AGTR1纯合突变型；③用扩增ACE的PCR混合液中FAM荧光信号判断ACE的多态性，单熔解峰Tm值在60.89-64.92时，判断结果为ACE纯合野生型；双熔解峰Tm值分别在60.89-64.92和49.32-53.94时，判断结果为ACE杂合型；单熔解峰Tm值在49.32-53.94时，判断结果为ACE纯合突变型；④用扩增CYP2D6*10、ADRB1的PCR混合液中FAM荧光信号判断CYP2D6*10的多态性，单熔解峰Tm值在56.80-62.01时，判断结果为CYP2D6*10纯合野生型；双熔解峰Tm值分别在56.80-62.01和65.02-67.51时，判断结果为CYP2D6*10杂合型；单熔解峰Tm值在65.02-67.51时，判断结果为CYP2D6*10纯合突变型；ROX荧光信号判断ADRB1的多态性，单熔解峰Tm值在57.42-60.19时，判断结果为ADRB1纯合野生型；双熔解峰Tm值分别在57.42-60.19和68.12-70.61时，判断结果为ADRB1杂合型；单熔解峰Tm值在68.12-70.61时，判断结果为ADRB1纯合突变型。
相比于现有技术，本发明有益的技术效果至少包括如下几方面：
1)本发明方法采用对称扩增+标签引物的方式，特别对多重PCR扩增，在PCR后半程，不同的靶序列由同样的标签引物进行扩增，有效降低了不同引物体系间的扩增效率差异问题；另外，本发明方法中标签引物序列可以相同，不因体系中基因种类的不同而不同，操作简单，节省成本。
2)本发明方法采用一条标记探针可同时检测覆盖区域上的已知、未知等多个不同类型的突变。本发明探针序列不针对引物区序列，与多态性位点纯合野生型序列相同或互补，当探针覆盖区域有碱基突变存在，探针Tm值会随之下降，且Tm值的变化随碱基突变的数量、突变类型、突变位置不同而不同，实现未知突变的有效检测。
3)本发明有效解决高GC模板扩增问题，本发明的标签引物的GC含量可人为设计成理想的状态，在PCR后半程，标签引物参与扩增时解决了高GC含量引物的变性退火难的问题。
4)本发明采用熔解曲线Tm值的分析方法，观察标记探针信号下的熔解曲线及Tm值即可判断突变情况，不同荧光通道下的溶解曲线互不干扰，因此同一反应体系中可检测多个突变序列。
5)本发明通过对高血压相关基因多态性的引物探针进行优化设计和筛选，确立一套适于高血压相关基因多态性检测分析的体系，能够有效应用于医学检测领域，弥补现有技术不足。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1、本发明设计原理图；
图2、针对CYP2C9*3位点的对称扩增结合标签引物多重PCR扩增体系和不对称扩增多重PCR体系对比图；
图3、针对AGTR1位点的对称扩增结合标签引物多重PCR扩增体系和不对称扩增多重PCR体系对比图；
图4、针对ACE位点的对称扩增结合标签引物多重PCR扩增体系比不对称扩增多重PCR体系对比图；
图5、针对CYP2D6*10位点的对称扩增结合标签引物多重PCR扩增体系比不对称扩增多重PCR体系的对比图；
图6、针对ADRB1位点的对称扩增结合标签引物多重PCR扩增体系比不对称扩增多重PCR体系的对比图；
图7、CYP2C9*3位点对称PCR扩增图，标签引物与上、下游引物最佳比为10：1时荧光信号值最高；
图8、AGTR1位点对称PCR扩增图，标签引物与上、下游引物最佳比为10：1时荧光信号值最高；
图9、ACE位点对称PCR扩增图，标签引物与上、下游引物最佳比为3：1时荧光信号值最高；
图10、CYP2D6*10位点对称PCR扩增图，标签引物与上、下游引物最佳比为30：1，时荧光信号值最高
见图11、ADRB1位点对称PCR扩增图，标签引物与上、下游引物最佳比为30：1时荧光信号值最高。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语
在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
本发明中的术语“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链的核酸。或者，单链核酸可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。
本文所使用的术语“互补”涉及核苷酸碱基G、A、T、C和U之间的氢键碱基配对，以使得当两种给定的多核苷酸或多核苷酸序列彼此退火时，在DNA中A与T配对、G与C配对，在RNA中G与C配对、A与U配对。
本发明所述的“对称PCR扩增”是指：在PCR扩增体系中上、下游引物含量相同的方式对靶序列进行扩增。在本发明的一些实施方式中涉及“对称PCR扩增”：在PCR结合熔解曲线分析用于基因检测的方法中，PCR扩增必须产生单链产物，通过“对称PCR扩增”获得双链PCR产物，然后用人工设计的标签引物对双链PCR产物进行单向扩增，获得单链产物。
本发明所述的“不对称PCR扩增”是指：在PCR扩增体系中上、下游引物含量不同的方式对靶序列进行扩增。在本发明的一些实施方式中涉及“不对称PCR扩增”：在PCR结合熔解曲线分析用于基因检测的方法中，PCR扩增必须产生单链产物，通过“不对称PCR扩增”获得PCR产物，然后由高含量引物对产物扩增获得单链产物。
实施例1多重PCR引物、探针体系的设计和筛选
1.引物的设计、合成及筛选，具体步骤如下：
1)针对CYP2C9*3(rs1057910)、AGTR1(rs1801253)、ACE(rs4646994)、CYP2D6*10(rs1065852)、ADRB1(rs1801253)多态性区域，分别设计上游、下游引物各三组，Tm值为55-60℃，序列如表1：
表1、初筛引物序列
Figure BDA0002594882200000091
Figure BDA0002594882200000101
2)配制筛选反应液，各引物分别与SYBR PreMix、去离子水配制PCR反应液，以各多态性位点5000拷贝/μL纯合野生型为模板，反应参数设置如下：
表2、反应参数
Figure BDA0002594882200000102
Figure BDA0002594882200000111
3)统计各引物组的扩增Ct值及分析其扩增特异性，具体见下表：
表3、引物组扩增数据统计
多态性位点 引物组 Ct值 特异性分析
CYP2C9*3 1 23.52 SYBR熔解曲线分析，产生特异性熔解峰
2 24.74 SYBR熔解曲线分析，产生特异性熔解峰
3 23.66 SYBR熔解曲线分析，产生多熔解峰
AGTR1 1 23.91 SYBR熔解曲线分析，产生特异性熔解峰
2 25.92 SYBR熔解曲线分析，产生特异性熔解峰
3 24.44 SYBR熔解曲线分析，产生多熔解峰
ACE 1 22.87 SYBR熔解曲线分析，产生特异性熔解峰
2 25.63 SYBR熔解曲线分析，产生多熔解峰
3 25.77 SYBR熔解曲线分析，产生特异性熔解峰
CYP2D6*10 1 24.84 SYBR熔解曲线分析，产生特异性熔解峰
2 25.63 SYBR熔解曲线分析，产生多熔解峰
3 26.45 SYBR熔解曲线分析，产生特异性熔解峰
ADRB1 1 24.31 SYBR熔解曲线分析，产生特异性熔解峰
2 25.64 SYBR熔解曲线分析，产生特异性熔解峰
3 24.38 SYBR熔解曲线分析，产生多熔解峰
结合各引物组的扩增Ct及SYBR熔解曲线分析，优选扩增Ct靠前，且无特异性扩增的引物组作为后备引物组，优选的引物组如下：
表4、优选的引物组序列
Figure BDA0002594882200000112
Figure BDA0002594882200000121
2.探针的设计、合成及筛选，具体步骤如下：
1)针对CYP2C9*3(rs1057910)、AGTR1(rs1801253)、ACE(rs4646994)、CYP2D6*10(rs1065852)、ADRB1(rs1801253)多态性区域，分别设计探针各三组，分别为SNP靠近探针5’端1/3处、中间、靠近3’端1/3处，Tm值为45-75℃，序列如表5：
表5、初筛探针序列
Figure BDA0002594882200000122
2)配制筛选反应液，表4中引物组、表5中探针组分别与PreMix、去离子水配制PCR反应液，体系中上、下游引物含量为200nM，探针为300nM，以各多态性位点5000拷贝/μL纯合野生型为模板，反应参数设置如下：
表6、反应参数
Figure BDA0002594882200000123
Figure BDA0002594882200000131
4)统计各探针组的扩增Ct值及分析，具体见下表7：
表7、探针组扩增数据统计
Figure BDA0002594882200000132
结合各探针组的扩增Ct分析，优选扩增Ct靠前的探针组作为后备探针组，Ct值靠前表明探针与模板结合能力更好，对熔解曲线的形成有较大益处，同时对探针序列进行分析，多态性位点靠近探针3’端的位置优于5’端，优选的探针组如下：
表8、优选的探针组序列
Figure BDA0002594882200000133
Figure BDA0002594882200000141
3.对称扩增结合标签引物多重PCR体系与不对称扩增多重PCR体系的对比筛选
1)基于表4，针对高血压用药相关基因多态性的靶序列进行本发明的上游引物、标签引物设计，上游引物进行5’端加长，使其均有2部分组成，A区和B区，靠近3’端为A区，靠近5’端为B区，A区与靶序列完全互补，B区为人工设计非同源性序列。
本发明的探针序列经过前期多态性位点的位置区段选择、探针序列长度优化、SNP位点优化、探针TM值选择等，经性能验证获得匹配本发明体系的最优探针序列。
本发明最终优化设计得到的引物和探针序列如表9：
表9、CYP2C9*3、AGTR1、ACE、CYP2D6*10、ADRB1位点引物探针序列
Figure BDA0002594882200000142
Figure BDA0002594882200000151
2)配制反应体系，CYP2C9*3位点引物探针与AGTR1位点引物探针配制成1个反应液(表10)，ACE位点引物探针配制成1个反应液(表11)，CYP2D6*10位点引物探针与ADRB1位点引物探针配制成1个反应液(表12)，具体如下：
表10、CYP2C9*3位点和AGTR1位点PCR反应体系
Figure BDA0002594882200000152
Figure BDA0002594882200000161
表11、ACE位点反应体系
不对称扩增多重体系 对称扩增结合标签引物体系
ACE上游引物 2μM 200nM
ACE下游引物 200nM 200nM
ACE探针 300nM 300nM
标签引物 0 2μM
Buffer 1× 1×
Taq酶 1U 1U
dNTP 0.2mM 0.2mM
水 补充至18μL 补充至18μL
模板 2μL 2μL
表12、CYP2D6*10位点和ADRB1位点反应体系
不对称扩增多重体系 对称扩增结合标签引物体系
CYP2D6*10上游引物 2μM 200nM
CYP2D6*10下游引物 200nM 200nM
CYP2D6*10探针 300nM 300nM
ADRB1上游引物 2μM 200nM
ADRB1下游引物 200nM 200nM
ADRB1探针 300nM 300nM
标签引物 0 2μM
Buffer 1× 1×
Taq酶 1U 1U
dNTP 0.2mM 0.2mM
水 补充至18μL 补充至18μL
模板 2μL 2μL
3)根据表13设置反应程序
表13、反应程序
Figure BDA0002594882200000171
4)结果分析
CYP2C9*3位点对称扩增结合标签引物多重PCR扩增体系比不对称扩增多重PCR体系信号值更高，见图2；
AGTR1位点对称扩增结合标签引物多重PCR扩增体系比不对称扩增多重PCR体系信号值更高，见图3；
ACE位点对称扩增结合标签引物多重PCR扩增体系比不对称扩增多重PCR体系信号值更高，见图4；
CYP2D6*10位点对称扩增结合标签引物多重PCR扩增体系比不对称扩增多重PCR体系信号值更高，见图5；
ADRB1位点对称扩增结合标签引物多重PCR扩增体系比不对称扩增多重PCR体系信号值更高，见图6。
可见基于本发明的对称扩增效果显著优于传统不对称扩增，证明了本发明方法学的优势。
4.标签引物与上游引物及下游引物终浓度倍数优化
1)使用对称扩增结合标签引物多重PCR扩增体系，固定所有位点的上游引物、下游引物、探针及其它PCR成分使用量，调整标签引物的使用量，具体见表14：
表14、上游引物、下游引物、探针、标签引物终浓度
终浓度 终浓度 终浓度
上游引物 200nM 200nM 200nM
下游引物 200nM 200nM 200nM
探针 300nM 300nM 300nM
标签引物 600nM 2μM 6μM
2)CYP2C9*3位点和AGTR1位点根据表14引物探针终浓度比例并与其它PCR成分配制PCR反应体系，ACE位点根据表14引物探针终浓度比例并与其它PCR成分配制PCR反应体系，CYP2D6*10位点和ADRB1位点根据表14引物探针终浓度比例并与其它PCR成分配制PCR反应体系，配制完成后按照18μl/孔分装至八联管中；
3)在各反应液中加入各位点杂合型基因组DNA样本，并根据表13设置反应程序；
4)结果分析
CYP2C9*3位点标签引物与上、下游引物最佳比为10：1，此时荧光信号值最高，见图7；
AGTR1位点标签引物与上、下游引物最佳比为10：1，此时荧光信号值最高，见图8；
ACE位点标签引物与上、下游引物最佳比为3：1，此时荧光信号值最高，见图9；
CYP2D6*10位点标签引物与上、下游引物最佳比为30：1，此时荧光信号值最高，见图10；
ADRB1位点标签引物与上、下游引物最佳比为30：1，此时荧光信号值最高，见图11。
实施例2引物探针制备及试剂盒组装
1.本申请引物、探针的合成
根据实施例1中筛选到的引物探针送第三方合成公司进行合成，具体序列如下：
CYP2C9*3上游引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATGCAGGAAGAGATTGAACGTG-3ˊ(SEQ IDNO.1)；
CYP2C9*3下游引物5`-GTCACAGGTCACTGCATG-3ˊ(SEQ ID NO.2)；
CYP2C9*3探针5`-FAM-TGGTGGGGAGAAGGTCAATGT-BHQ2-3ˊ(SEQ ID NO.3)；
AGTR1上游引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATGAAGAAGGAGCAAGAGAACATTC-3ˊ(SEQ IDNO.4)；
AGTR1下游引物5`-CTTTAGAAAAGTCGGTTCAGTC-3ˊ(SEQ ID NO.5)；
AGTR1探针5`-ROX-TCACTACCATATGAGCCTTAGCTA-BHQ2-3ˊ(SEQ ID NO.6)；
标签引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATG-3ˊ(SEQ ID NO7)；
ACE上游引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATGGCTGGAGAGCCACTCCC-3ˊ(SEQ ID NO.8)；
ACE下游引物5`-TCAGATCTGGTAGGGGTTTGA-3ˊ(SEQ ID NO.9)；
ACE探针5`-FAM-GCCTATACAGTCACTTGTATGTG-BHQ2-3ˊ(SEQ ID NO.10)；
CYP2D6*10上游引物5`-CAGTATGGTGTGTTCTGGAAGT-3ˊ(SEQ ID NO.11)；
CYP2D6*10下游引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATGCATTTGGTAGTGAGGCAG-3ˊ(SEQ IDNO.12)；
CYP2D6*10探针5`-FAM-AGGGGGCCTGGTGAGTAG-BHQ2-3ˊ(SEQ ID NO.13)；
ADRB1上游引物5`-TCTTCGTCTTCTTCAACTGGC-3ˊ(SEQ ID NO.14)；
ADRB1下游引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATGTCTCCGTGGGTCGCG-3ˊ(SEQ IDNO.15)；
ADRB1探针5`-ROX-CAAGGCCTTCCAGCGACTGC-BHQ2-3ˊ(SEQ ID NO.6)。
2.用于基因多态性检测的PCR反应液配制
1)根据实施例1中CYP2C9*3和AGTR1位点优化的引物比例，配制CYP2C9*3位点和AGTR1位点的检测PCR体系，具体见表15：
表15、CYP2C9*3和AGTR1位点配制PCR体系
物料名称 终浓度及含量
CYP2C9*3上游引物 200nM
CYP2C9*3下游引物 200nM
CYP2C9*3探针 300nM
AGTR1上游引物 200nM
AGTR1下游引物 200nM
AGTR1探针 300nM
标签引物 2μM
Buffer 1×
Taq酶 1U
dNTP 0.2mM
水 补充至18μL
2)根据实施例1中ACE位点优化的引物比例，配制ACE位点的检测PCR体系，具体见表16：
表16、ACE位点配制PCR体系
终浓度及含量
ACE上游引物 200nM
ACE下游引物 200nM
ACE探针 300nM
标签引物 600nM
Buffer 1×
Taq酶 1U
dNTP 0.2mM
水 补充至18μL
3)根据实施例1中CYP2D6*10和ADRB1位点优化的引物比例，配制CYP2D6*10位点和ADRB1位点的检测PCR体系，具体见表17：
表17、CYP2D6*10和ADRB1位点配制PCR体系
终浓度及含量
CYP2D6*10上游引物 200nM
CYP2D6*10下游引物 200nM
CYP2D6*10探针 300nM
ADRB1上游引物 200nM
ADRB1下游引物 200nM
ADRB1探针 300nM
标签引物 6μM
Buffer 1×
Taq酶 1U
dNTP 0.2mM
水 补充至18μL
1.阴性质控品的配制，阴性质控品由Tris-Hcl(pH8.0)常规缓冲液制备而成
2.阳性质控品的配制，具体见表18：
表18、阳性质控品配制表
名称 拷贝数
CYP2C9*3质粒 5000拷贝
AGTR1质粒 5000拷贝
ACE质粒 5000拷贝
CYP2D6*10质粒 5000拷贝
ADRB1质粒 5000拷贝
3.试剂盒组装
试剂盒组成包括：用于CYP2C9*3和AGTR1位点基因多态性检测的PCR反应液、用于ACE位点基因多态性检测的PCR反应液、CYP2D6*10和ADRB1位点基因多态性检测的PCR反应液、阴性质控品、阳性质控品，具体见表19：
表19、试剂盒组成
名称 体积
CYP2C9*3和AGTR1 PCR反应液 450μL
ACE PCR反应液 450μL
CYP2D6*10和ADRB1 PCR反应液 450μL
阴性质控品 100μL
阳性质控品 200μL
实施例3灵敏度测试
使用实施例2中制备的试剂盒，定义为试剂盒a，同时制备试剂盒b(试剂盒b以WXRQ公司技术为基础，采用不对成扩增的方式，即上游引物和下游引物在体系中的终浓度不一致，由较高浓度的引物产生单链产物，体系中无标签引物，配制方式与实施例1，表4中的不对称多重扩增体系相当)进行对比测试，具体测试步骤如下：
步骤一、制备灵敏度模板，包括CYP2C9*3杂合型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl；AGTR1杂合型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl；ACE杂合型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl；CYP2D6*10杂合型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl；ADRB1杂合型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl；
步骤二、根据说明书配制试剂盒a、试剂盒b，加入模板，每个反应孔20个重复，混合均匀，置于荧光定量PCR仪设备中；
步骤三、反应参数的设置，具体如下表：
表20、反应参数设置
Figure BDA0002594882200000221
步骤四、检测结果分析见下表
表21、灵敏度检测结果
Figure BDA0002594882200000222
结果表明，采用本研究制备的试剂盒a在检测更低浓度的模板时，比试剂盒b有更高的检出率，表明试剂盒a所涉及的对称PCR扩增结合熔解曲线技术比传统不对称PCR扩增结合熔解曲线技术的灵敏度更高。
实施例4样本检测
使用实施例2中制备的检测试剂盒检测50例待测样本静脉全血，具体检测步骤如下：步骤一、样本处理：外购全血基因组DNA提取试剂盒对50例样本进行核酸DNA提取，OD260/280介于1.8～2.0，OD260/230在1.8～2.2，浓度大于5ng/μl；
步骤二、检测试剂配制：将实施例2中制备的PCR混合液平衡至室温，颠倒混匀，分别取18μl的PCR混合液至PCR反应管中，然后加入步骤一中纯化的2μl核酸DNA样本、2μl阴性质控品、2μl阳性质控品，混合均匀，置于荧光定量PCR仪设备中；
步骤三、反应参数的设置，具体如下：
表22、PCR反应参数
Figure BDA0002594882200000231
步骤四、检测结果分析：
1.结果判读标准见下表：
表23、结果判读标准
Figure BDA0002594882200000232
Figure BDA0002594882200000241
2.根据结果判读标准分析50例样本分析结果，见下表：
表24、50例样本检测结果
纯合野生型 杂合型 纯合突变型
CYP2C9*3 41 7 2
AGTR1 36 11 3
ACE 21 15 14
CYP2D6*10 32 11 7
ADRB1 20 13 17
3.如下是50例样本第三方测序结果，作为结果参照。
表25、50例样本的第三方测序结果
Figure BDA0002594882200000242
Figure BDA0002594882200000251
可见，本申请的方法与第三方测序结果对比，上述50例待测样本分析结果，符合率为100％。以上结果表明：本发明所设计的试剂盒，其结果准确可靠，特异性强，达到了测序检测效果；同时该方法操作简便、结果分析简单。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京安智因生物技术有限公司
<120> 一种基因多态性检测的方法、试剂盒及其应用
<130> 2020
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaagatcgga gtcaccgtat gcaggaagag attgaacgtg 40
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<213> 人工序列
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ctttagaaaa gtcggttcag tc 22
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<213> 人工序列
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
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<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
caaggccttc cagcgactgc 20

Claims (16)

1.一种检测基因多态性方法，其特征在于，所述方法包含：
1)多重PCR引物和探针设计，
2)PCR扩增，
3)熔解曲线分析；
所述1)多重PCR引物和探针设计是针对多个靶序列分别设计上游引物、下游引物、标签引物和标记探针；
所述上游引物或者下游引物中的一条由A区和B区构成：所述A区为靠近3’端序列与靶序列完全互补；所述B区为靠近5’端连接一段与靶序列不同源的人工核苷酸序列；另外一条引物与靶序列完全互补；
所述标签引物与B区序列相同；
所述探针与PCR扩增的单链产物序列互补，探针方向与标签引物方向相反；
所述2)PCR扩增为对称PCR扩增。
2.权利要求1所述检测基因多态性方法，其特征在于，所述标签引物GC含量30-50％，Tm值55-60℃；优选的，针对多个靶序列的标签引物序列相同。
3.权利要求1-2任一所述检测基因多态性方法，其特征在于，所述探针序列与多态性位点纯合野生型序列相同或与之完全互补，探针序列长度为20-30bp，Tm值为45-75℃；优选的，探针5’端标记荧光基团，选自FAM、HEX、VIC、ROX或CY5，3’端标记BHQ2。
4.权利要求1-3任一所述检测基因多态性方法，其特征在于，所述2)PCR扩增中，上游引物和下游引物的终浓度相同，标签引物终浓度是上游引物及下游引物的3-30倍；更优选的，PCR扩增中使用的聚合酶缺乏5’-3’端外切酶活性，避免水解探针。
5.权利要求1-4任一所述检测基因多态性方法，其特征在于，所述3)熔解曲线分析按1％速率进行升温使探针与PCR扩增的单链产物逐渐解链，形成熔解曲线。
6.权利要求1-5任一所述检测基因多态性方法，其特征在于，所述基因多态性为高血压相关基因多态性；优选的，所述高血压相关基因多态性的检测位点包括CYP2C9*3(rs1057910)/AGTR1(rs1801253)、ACE(rs4646994)和CYP2D6*10(rs1065852)/ADRB1(rs1801253)；更优选的，针对所述检测位点的引物和探针序列如SEQ ID NO.1-16所示。
7.一种用于基因多态性检测的引物探针组合物，其特征在于，所述组合物包含针对多个多态性靶序列的上游引物、下游引物、标签引物和标记探针；
所述上游引物或者下游引物中的一条由A区和B区构成：所述A区为靠近3’端段序列与靶序列完全互补；所述B区为靠近5’端连接一段与靶序列不同源的人工核苷酸序列，成为B区；另外一条引物与靶序列完全互补；
所述的标签引物与B区序列相同；
所述探针与PCR扩增的单链产物序列互补，探针方向与标签引物方向相反。
8.权利要求7所述的引物探针组合物，其特征在于，所述标签引物GC含量30-50％，Tm值55-60℃；优选的，针对多个靶序列的标签引物序列相同。
9.权利要求7-8任一所述的引物探针组合物，其特征在于，所述的探针序列与多态性位点纯合野生型序列相同或与之完全互补，探针序列长度为20-30bp，Tm值为45-75℃；优选的，探针5’端标记荧光基团，选自FAM、HEX、VIC、ROX或CY5，3’端标记BHQ2。
10.权利要求7-9任一所述的引物探针组合物，其特征在于，所述上游引物和下游引物的终浓度相同，标签引物终浓度是上游引物及下游引物的3-30倍。
11.权利要求10所述的引物探针组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含聚合酶，所述聚合酶缺乏5’-3’端外切酶活性，避免水解探针。
12.权利要求11所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物和探针序列如SEQ IDNO.1-16所示。
13.一种用于检测高血压相关基因多态性的引物探针组合物，其特征在于，所述引物和探针序列如SEQ ID NO.1-16所示。
14.一种用于检测基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求7-13任一所述的引物探针组合物，以及常规PCR反应成分和阴阳性质控品；优选的，所述基因多态性为高血压相关基因多态性。
15.权利要求14所述的用于检测基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中上游引物和下游引物终浓度分别介于150-300nM；标签引物浓度介于0.45-9μM。
16.权利要求14-15任一所述的用于检测基因多态性的试剂盒在检测高血压相关基因多态性的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112608989A (zh) * 2020-12-18 2021-04-06 成都和合医学检验所有限公司 用于检测基因多态性的引物组、试剂盒及方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103276094A (zh) * 2013-06-08 2013-09-04 瀚吉康生物科技（北京）有限公司 多重pcr检测方法及试剂盒
CN107385080A (zh) * 2017-08-31 2017-11-24 南京美宁康诚生物科技有限公司 一种儿童白血病相关融合基因多重pcr检测试剂盒及方法
CN108570498A (zh) * 2018-05-25 2018-09-25 山东维真生物科技有限公司 用于检测人类cyp2c9和vkorc1基因多态性的引物探针组合物、试剂盒及应用
CN109182481A (zh) * 2018-09-18 2019-01-11 常州市第人民医院 一种高通量检测多种靶基因的方法
CN109457024A (zh) * 2018-03-23 2019-03-12 杭州泰领生物技术有限公司 高血压基因多态性荧光pcr溶解曲线检测试剂盒及应用
CN109486921A (zh) * 2018-12-26 2019-03-19 山东艾克韦生物技术有限公司 一种增加多重pcr引物兼容性的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103276094A (zh) * 2013-06-08 2013-09-04 瀚吉康生物科技（北京）有限公司 多重pcr检测方法及试剂盒
CN107385080A (zh) * 2017-08-31 2017-11-24 南京美宁康诚生物科技有限公司 一种儿童白血病相关融合基因多重pcr检测试剂盒及方法
CN109457024A (zh) * 2018-03-23 2019-03-12 杭州泰领生物技术有限公司 高血压基因多态性荧光pcr溶解曲线检测试剂盒及应用
CN108570498A (zh) * 2018-05-25 2018-09-25 山东维真生物科技有限公司 用于检测人类cyp2c9和vkorc1基因多态性的引物探针组合物、试剂盒及应用
CN109182481A (zh) * 2018-09-18 2019-01-11 常州市第人民医院 一种高通量检测多种靶基因的方法
CN109486921A (zh) * 2018-12-26 2019-03-19 山东艾克韦生物技术有限公司 一种增加多重pcr引物兼容性的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YIQUN LIAO等: "Combination of fluorescence color and melting temperature as a two-dimensional label for homogeneous multiplex PCR detection", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
刘伟等: "《老年心血管急危重症诊疗学》", 30 June 2016, 吉林科学出版社 *
王小强等: "通用多重不对称PCR结合寡核苷酸芯片检测", 《食品科学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112608989A (zh) * 2020-12-18 2021-04-06 成都和合医学检验所有限公司 用于检测基因多态性的引物组、试剂盒及方法

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