CN109486921A - 一种增加多重pcr引物兼容性的方法 - Google Patents

一种增加多重pcr引物兼容性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增加多重PCR引物兼容性的方法，属于生物检测领域。本发明针对每个靶基因设计一对特异性引物Fs、Rs以及通用引物Fg、Rg；先采用带有通用引物标签的特异性引物Fg+Fs、Rg+Rs进行富集扩增；然后采用通用引物标签Fg、Rg进行指数扩增；最后根据检测平台采取探针杂交或非探针杂交方式进行检测。此方法通过控制每一步PCR扩增使用的各反应组分浓度，如引物浓度、Mg2+浓度等，控制PCR扩增的反应条件，如：退火温度、退火时间等来实现多靶标基因的特异、灵敏扩增。本发明特异性强，可以保证不同病原体核酸的扩增效率相似，避免了传统多重PCR扩增的偏斜性；在进行检测时就不需要进行变性以解链。

Description

一种增加多重PCR引物兼容性的方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种增加多重PCR引物兼容性的方法。
背景技术
分子诊断市场是以PCR(聚合酶链式反应)技术为唯一基础的技术延伸，这项诺贝尔获奖技术为生物诊断技术领域做出了革命性的贡献。PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。但在这项革命性的诊断技术应用在临床检测过程中，大多基于PCR技术开发的分子诊断产品只能使用一对引物扩增一个DNA靶点，也就是说：一种试剂盒只能检测一个指标。这样使得PCR检测技术的开发应用进入了瓶颈。
很多感染类疾病病原体众多，比如每年夏季流行的儿童手足口病，手足口病是由肠道病毒感染引起的，临床表现以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹为主要特征的一种急性常见传染病。引起手足口病的病原体主要为肠道属的柯萨奇病毒A组的2、4、5、7、9、10、16型，柯萨奇病毒B组的1、2、3、4、5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)和肠道病毒71型。不同型别肠道病毒感染导致的手足口病情也各不相同。与其他肠道病毒相比，EV71型引起的手足口病重症感染的比例较大，重症患儿病死率可达10％至25％。在对这类疾病病原体进行鉴别检测时，若应用普通PCR技术需要进行多轮检测，操作繁复，耗时较长，不能满足社会要求，尤其是在疾病爆发期，需要检测的样本众多，该方法更显得效率低下。因此，我们需要更加快速、高效的检测方法。于是众多的生物技术公司将研发的重点投向了多重PCR技术，即通过一次检测过程可以实现多个指标的检测。
在传统的多重扩增方法中，用多对引物同时扩增多条靶序列是有问题的，因为每条不同的靶序列都具有各自的最佳扩增条件，很难将其统一，即便统一，每条靶序列也存在扩增效率不同，从而导致低浓度/滴度病原体不被扩增，不被检测，而出现假阴性结果。此外，经标记的引物在高浓度使用时容易产生二聚体，从而在扩增结果中造成高的背景。同时，我们还要考虑同时检测不同的扩增子，要么就使不同扩增子大小不一以便凝胶电泳，要么就让它们带上不同荧光染料以便区分。
授权公告号为“CN 1898395 B”申请号为200480037162.7的中国发明专利公开了基于引物的核酸的多重扩增的方法和试剂盒，其说明书公开了一种多重扩增的方法，该方法针对每一个靶基因设计两对特异性引物(一对内引物、一对外引物)和一对通用引物，其中内引物5’端带有通用引物，类似于巢式PCR。扩增时将所有引物全部加入到反应体系中，通过降低内引物、外引物的使用浓度，增加退火时间来进行扩增。
上述方法存在如下缺陷：
1、引物设计难度较大。上述多重扩增方法针对每个靶基因都需要设计两对特异性引物，那么进行三重PCR扩增就需要设计六对特异性引物，以此类推。这些引物既不能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合，设计难度加大。尤其对于某些基因来说，同源性较低，引物设计难度更大。
2、易导致扩增偏斜性。运用该方法进行扩增时将所有引物全部加入到反应体系中，引物间相互干扰较大，同时资源竞争更加激烈，更容易导致扩增偏斜性。
3、扩增时间长。该扩增方法的内引物、外引物使用浓度很低，这也就需要增加退火时间以保证其有效的特异性结合，这也就导致了扩增时间的延长。通常进行这样一个完整的PCR扩增需要4.5-5个小时。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，解决现有技术多重PCR扩增引物设计难度大、易导致扩增偏斜性、扩增时间长的问题，本发明提供了一种增加多重PCR引物兼容性的方法(Multiple Primer Compatible PCR,Mpc-PCR)。
本发明的技术方案为：
一种增加多重PCR引物兼容性的方法，针对每个靶基因设计一对特异性引物Fs、Rs以及通用引物Fg、Rg；先采用带有通用引物标签的特异性引物Fg+Fs、Rg+Rs进行富集扩增；然后采用通用引物标签Fg、Rg进行指数扩增。采集指数扩增产物的荧光信号进行检测。
作为优选方案，每个特异性引物Fs、Rs的5’端都带有通用引物Fg、Rg标签。
作为优选方案，所有特异性引物Fs、Rs的5’端所带的通用引物Fg、Rg的核酸序列均相同。
作为优选方案，特异性引物Fs、Rs的长度为20-25bp。
作为优选方案，通用引物Fg、Rg的长度为15-20bp。
进一步地，通用引物Fg、Rg与任何已知GenBank中收录的序列都不具有同源性。从而使通用引物与所有的靶基因序列都不互补，不会产生特异性结合。
作为优选方案，富集扩增包括两轮扩增过程，富集扩增的第一轮扩增以提取的样本核酸DNA或RNA为模板，特异性引物Fs、Rs与提取的样本核酸模板特异性结合，获得5’端带有通用引物标签的PCR扩增产物；富集扩增的第二轮扩增以第一轮扩增产生的5’端带有通用引物标签的PCR扩增产物为模板，产生5’端、3’端均带有通用引物标签的PCR产物。
进一步地，所述富集扩增的第一轮扩增条件为退火温度55-60℃，退火时间60-120s，进行6-10个循环。富集扩增的第一轮扩增，以较低的退火温度、较长的退火时间进行扩增，起到引入标签或者选择性扩增的作用。
作为优选方案，所述富集扩增的第二轮扩增条件为退火温度65-70℃，退火时间30-60s，进行10-20个循环。富集扩增的第二轮扩增以较高的退火温度、较长的退火时间进行扩增，该轮与第一轮相比，提高了退火温度，带有通用引物标签的特异性引物Fg+Fs、Rg+Rs长度约为35-45bp，具有足够的热稳定性，可以在这样高的退火温度下与模板特异性结合，产生5’端、3’端均带有通用引物标签的PCR产物。富集扩增产生了足够的扩增产物来作为指数扩增的基础。
作为优选方案，指数扩增以富集扩增纯化后的产物为模板，以退火温度50-55℃、退火时间30-40s进行30-40个循环。
作为优选方案，富集扩增的PCR产物通过凝胶纯化或者磁珠纯化后并回收，回收产物作为指数扩增的模板
作为优选方案，富集扩增阶段将针对所有靶基因的带有通用引物标签的特异性引物Fg+Fs、Rg+Rs全部加入到反应体系中，反应各组分使用浓度如下：每种靶基因正、反向引物Fg+Fs、Rg+Rs的终浓度为0.05-0.15μM，反应体系中正向或者反向引物引物总浓度不高于10μM；dNTP终浓度为0.3-1.5mM；Mg2+终浓度为2.5-5mM；Taq DNA聚合酶每50μL反应体系2-10units。
作为优选方案，指数扩增阶段各组分浓度如下：正向通用引物Fg的终浓度为0.1-0.3μM、反向通用引物Rg的终浓度为0.15-1μM；dNTP终浓度为0.2-0.5mM；Mg2+终浓度为2-3mM；Taq DNA聚合酶每50μL反应体系1.25-2units。
作为优选方案，反向通用引物Rg进行荧光标记。
作为优选方案，反向通用引物Rg采用链霉亲和素、FluorX、CY3、CY5进行荧光标记。
作为优选方案，富集扩增阶段，正向特异性引物Fg+Fs、反向特异性引物Rg+Rs的使用浓度相等。
作为优选方案，指数扩增阶段，反向通用引物Rg的浓度高于正向通用引物Fg的浓度。这样会产生大量的单链扩增产物，后续检测时，不需要解链，而且检测灵敏度高。
随着Rg：Fg使用浓度比例的提高，我们可以观察到检测灵敏性的增加。具体应用过程中引物浓度的使用比例，本领域技术人员可以根据本发明原理结合实际情况进行优化调整以达到最佳检测效果。
作为优选方案，指数扩增完毕后，根据检测平台原理不同而选择探针杂交或非探针杂交方式在多重检测平台上进行检测。
进一步地，所述多重检测平台包括但不限于毛细管电泳、多重实时荧光定量PCR技术平台或者液相芯片xMAP技术平台。
本发明方法通过控制每一步PCR扩增使用的各反应组分浓度，如引物浓度、Mg2+浓度等，控制PCR扩增的反应条件，如：退火温度、退火时间等来实现多靶标基因的特异、灵敏扩增。本发明方法特异性强，指数扩增的模板为富集扩增产物，这些模板都被引入了通用引物标签，这样PCR扩增时就可以同样的引物、同样的扩增条件进行，可以保证不同病原体核酸的扩增效率相似，避免了传统多重PCR扩增的偏斜性；且本发明大大降低了多重PCR扩增的引物设计难度，反应条件的优化难度，使多重PCR扩增简单易行。
本发明的有益效果为：
1、富集扩增的第一轮PCR扩增中基因特异性引物以低于正常PCR扩增的使用浓度加入，并控制引物总浓度，这样可以避免引物浓度过高而导致引物二聚体的产生，并可以降低扩增背景。富集扩增的第一轮扩增时以较低的退火温度(55-60℃)、较长的退火时间(60-120s)进行，可以保证所有的基因特异性引物都能与模板特异性结合并扩增，增加了不同引物的兼容性。富集扩增的第二轮扩增由于增加了退火温度(65-70℃)，只有带有通用引物标签的特异性引物(Fg+Fs、Rg+Rs)长度约为35-45bp，具有足够的热稳定性，可以在这样高的退火温度下与模板特异性结合。同时，进行富集扩增的第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增两轮特异性扩增，进一步增加了PCR扩增的特异性。
同时，反应各组分包括dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶的使用浓度都在实验合理的范围内相应提高，可有效避免资源竞争，降低扩增偏斜性。
2、富集扩增完成后以凝胶纯化或磁珠纯化的方式进行PCR扩增产物回收，去除了没有参加反应的引物、dNTP、酶等，也消除了这些因素对指数扩增的影响。
指数扩增的模板为上述经磁珠纯化后的PCR扩增回收产物，这些模板都被引入了通用引物标签，这样PCR扩增时就可以同样的引物、同样的扩增条件进行，可以保证不同病原体核酸的扩增效率相似，避免了传统多重PCR扩增的偏斜性。
上述扩增的偏斜性是指，当扩增样本中存在两种或两种以上的病原体核酸，而这多种病原体的滴度/浓度不同，那么在进行普通多重PCR时，高滴度/浓度的病原体核酸优先被扩增，低滴度/浓度的病原体核酸后被扩增或者不被扩增，即不同滴度/浓度的病原体核酸扩增效率不同，存在扩增偏斜性，这样有可能导致假阴性结果。
3、本发明提供的Mpc-PCR扩增方法产生的PCR扩增产物可以与多重检测平台相结合来进一步进行结果的检测。此处所述多重检测平台包括但不限于毛细管电泳、多重实时荧光定量PCR技术平台和液相芯片xMAP技术平台。由于指数扩增中正反向通用引物的使用比例不同而产生了大量的单链PCR扩增产物，在进行检测时就不需要进行变性以解链。
4、由于针对每个靶基因只设计一对特异性引物，且特异性引物使用浓度较高，与授权公告号为“CN 1898395 B”申请号为200480037162.7的中国发明专利公开的技术方案相比大大降低了引物设计难度，同时缩短了扩增时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明增加多重PCR引物兼容性的方法的原理图；
图2为EV-U、EV71、CA16三重荧光定量扩增曲线图；
图3为CA6、CA10、CA16三重荧光定量扩增曲线图。
具体实施方式
下述实施例主要针对引起儿童手足口病的肠道病毒检测。每年夏季流行的儿童手足口病是由肠道病毒感染引起的，临床表现以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹为主要特征的一种急性常见传染病。引起手足口病的病原体主要为肠道属的柯萨奇病毒A组的2、4、5、6、7、9、10、16型，柯萨奇病毒B组的1、2、3、4、5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)和肠道病毒71型。其中较为常见的为柯萨奇病毒A组4、6、10、16型，肠道病毒71型。我们使用本发明提供的Mpc-PCR引物设计原理，针对上述引起手足口病的常见肠道病毒：柯萨奇病毒A组4、6、10、16型和肠道病毒71型设计引物、探针。
表1检测病原体列表
序号 病毒名称 英文缩写 靶基因
1 肠道病毒通用型 EV-U 5’-UTR
2 肠道病毒71型 EV71 VP1
3 柯萨奇病毒A组4型 CA4 VP1
4 柯萨奇病毒A组6型 CA6 VP1
5 柯萨奇病毒A组10型 CA10 VP1
6 柯萨奇病毒A组16型 CA16 VP1
针对上述检测病原体，我们从GenBank中调取所有的靶基因序列，比对分析，设计的引物探针序列如下：
表2引物、探针列表
选取临床检测中CA4、CA6、CA10、CA16、EV71确认阳性的患者粪便标本各2例，共计10例标本进行核酸RNA提取。可使用商业化试剂盒来提取RNA，如使用QIAGEN Viral RNAMini Extraction Kit(CAT：52904)提取病毒RNA，提取步骤为本领域技术人员所熟知，在此不多加赘述。
表3样本编号
吸取1-10号样本RNA各5μl进行混合，混合方式如下：样本1/3/5/7/9号样本RNA进行混合，命名为001号样本；样本1/3/5/9号样本RNA进行混合，命名为002号样本；样本1/3/5/7号样本RNA进行混合，命名为003号样本；样本2/6/8/10号样本RNA进行混合，命名为004号样本；样本4/6/8/10号样本RNA进行混合，命名为005号样本；样本2/4/8/10号样本RNA进行混合，命名为006号样本。
理论上以上述混合方式得到的样本所包含的病原体指标如下：
表4样本包含病原体指标
样本编号 包含的病原体指标
001 EV-U、EV71、CA4、CA6、CA10、CA16
002 EV-U、EV71、CA4、CA6、CA10
003 EV-U、CA4、CA6、CA10、CA16
004 EV-U、EV71、CA4、CA10、CA16
005 EV-U、EV71、CA6、CA10、CA16
006 EV-U、EV71、CA4、CA6、CA16
选择两种多重检测平台—多重实时荧光定量PCR技术平台和液相芯片xMAP技术平台来进行多重扩增产物检测结果的确认。
实施例1
本实施例应用多重实时荧光定量PCR技术平台进行检测。考虑到多重实时荧光定量PCR技术平台本身的通道限制，本实施例采用所有的引物进行多重扩增，检测时只选择其中三种指标进行检测。
以表4所述001/002/003号样本为模板，同时增加一个阴性对照(以DEPC水为模板)，以表2所述针对所有病原体的特异性引物及通用引物为扩增引物，按照本发明Mpc-PCR所提供的扩增方法进行多重扩增，以EV-U、EV71、CA16的探针为检测探针(其中EV-U检测探针5’进行FAM荧光标记，3’端进行BHQ-1荧光标记；EV71检测探针5’进行HEX荧光标记，3’端进行BHQ-1荧光标记；CA16检测探针5’进行Cy5荧光标记，3’端进行BHQ-2荧光标记)，以多重荧光定量PCR技术平台为检测平台进行检测。
本实施例按照如下步骤进行：
1.第一步PCR扩增
在PCR管中加入下列物质：5×RT-PCR Buffer 5.0μL，dNTP Mix终浓度0.3mM，每种Fg+Fs、Rg+Rs终浓度0.05μM，RNase抑制剂0.25μL，Mg2+终浓度2.5mM，酶混合物(反转录酶、Taq酶混合物)1unit，样本3μL，加入DEPC水补足体积至25μL。
按照如下扩增条件进行扩增，得到PCR扩增产物1：
50℃反转录35min；95℃热启动酶活化15min；94℃变性15sec，55℃退火50sec，72℃延伸30sec，进行10个循环；94℃变性15sec，65℃退火50sec，72℃延伸30sec，进行20个循环；4℃保存。
2.PCR产物回收
将上述PCR扩增产物1用凝胶回收或磁珠进行纯化回收，凝胶回收方法为本领域技术人员所熟知，此处不多加赘述。
磁珠纯化具体步骤为：
1)取出磁珠振荡混匀5min，取出45μl/个样本的量放于室温10min；
2)将上述PCR扩增产物1各取出20μl，向每个样本中加入30μl H2O，混匀，向室温平衡完毕的磁珠中加入45μl稀释的PCR扩增产物，用枪吸吹约10次混匀，放于室温2min；
3)开盖放于磁力架上1min，液体变得澄清即可吸出液体，加入125μl 85％的乙醇，1min后洗出弃掉，磁珠放于室温8min晾干；
4)加上30μl dd H2O回溶。
3.第二步PCR扩增
在PCR管中加入下列物质：5×PCR Buffer 5.0μL，dNTP Mix终浓度0.2mM，Fg终浓度0.1μM、Rg终浓度0.2μM，EV-U探针终浓度0.2μM，EV-71探针终浓度0.1μM，CA16探针终浓度0.2μM，Mg2+终浓度2mM，Taq酶0.7unit，PCR扩增产物1回收产物5μL，加入DEPC水补足体积至25μL。
检测通道设置如下：EV-U—FAM通道采集荧光信号；EV71—JOE/VIC通道采集荧光信号；CA16—CY5通道采集荧光信号。
按照如下扩增条件进行扩增，并收集荧光信号：95℃热启动酶活化15min；94℃变性15sec，60℃退火延伸40sec(此阶段结束时采集荧光信号)，进行40个循环。
4.检测结果
表5实施例1检测结果
CT值小于35表示该指标阳性，CT值大于38或Undetermined表示该指标阴性，CT值大于35小于38为检测灰度区间，需重新检测。
上述检测结果显示：样本001为EV-U、EV71、CA16阳性，样本002为EV-U、EV71阳性，样本003为EV-U、CA16阳性，与样本实际情况相符。
EV-U、EV71、CA16三重荧光定量扩增曲线图如图2所示，由图2可以看出，阳性指标扩增曲线呈现典型的S型曲线，阴性对照没有起峰，说明扩增特异性较好；不同样本的扩增曲线倾斜程度基本一致，平行度较好，说明不同样本的扩增效率一致，间接说明不同引物的工作效率一致，不存在扩增偏斜性。
实施例2
以表4所述002/005/006号样本RNA为模板，同时增加一个阴性对照(以DEPC水为模板)，以表2所述所有病原体的特异性引物及通用引物为扩增引物进行多重扩增，以表2中CA6、CA10、CA16的探针为检测探针(其中CA6检测探针5’进行FAM荧光标记，3’端进行BHQ-1荧光标记；CA10检测探针5’进行HEX荧光标记，3’端进行BHQ-1荧光标记；CA16检测探针5’进行Cy5荧光标记，3’端进行BHQ-2荧光标记)，以多重荧光定量PCR技术平台为检测平台进行检测。
本实施例按照如下步骤进行：
1.第一步PCR扩增
在PCR管中加入下列物质：5×RT-PCR Buffer 5.0μL，dNTP Mix终浓度0.4mM，每种Fg+Fs、Rg+Rs终浓度0.15μM，RNase抑制剂0.25μL，Mg2+终浓度3mM，酶混合物(反转录酶、Taq酶混合物)2units，样本3μL，加入DEPC水补足体积至25μL。
按照如下扩增条件进行扩增，得到PCR扩增产物1：
50℃反转录35min；95℃热启动酶活化15min；94℃变性15sec，55℃退火45sec，72℃延伸30sec，进行6个循环；94℃变性15sec，65℃退火45sec，72℃延伸30sec，进行15个循环；4℃保存。
2.PCR产物回收
将上述PCR扩增产物1用凝胶回收或磁珠纯化进行纯化回收，具体步骤参照实施例一步骤2。
3.第二步PCR扩增
在PCR管中加入下列物质：5×PCR Buffer 5.0μL，dNTP Mix终浓度0.2mM，Fg终浓度0.15μM、Rg终浓度0.45μM，CA6探针终浓度0.08μM，CA10探针终浓度0.1μM，CA16探针终浓度0.2μM，Mg2+终浓度2mM，Taq酶0.7unit，PCR扩增产物1回收产物5μL，加入DEPC水补足体积至25μL。
检测通道设置如下：CA6—FAM通道采集荧光信号；CA10—JOE/VIC通道采集荧光信号；CA16—CY5通道采集荧光信号。
按照如下扩增条件进行扩增，并收集荧光信号：95℃热启动酶活化15min；94℃变性15sec，60℃退火延伸40sec(此阶段结束时采集荧光信号)，进行40个循环。
4.检测结果
表6实施例2检测结果
CT值小于35表示该指标阳性，CT值大于38或Undetermined表示该指标阴性，CT值大于35小于38为检测灰度区间，需重新检测。
上述检测结果显示：样本002为CA6、CA10阳性，样本005为CA6、CA10、CA16阳性，样本006为CA6、CA16阳性，与样本实际情况相符。
CA6、CA10、CA16三重荧光定量扩增曲线图如图3所示，由图3可以看出，阳性指标扩增曲线呈现典型的S型曲线，阴性对照没有起峰，说明扩增特异性较好；不同样本的扩增曲线倾斜程度基本一致，平行度较好，说明不同样本的扩增效率一致，间接说明不同引物的工作效率一致，不存在扩增偏斜性。
实施例3
为了检验本检测方法的灵敏度，本实施例以表4所述001/002/003/004/005/006号样本RNA为模板，同时增加一个阴性对照(以DEPC水为模板)进行检测。对于每样本RNA而言，制备五个梯度：100、10-1、10-2、10-3、10-4。在另一组对比实验中，通用引物Rg：Fg使用比例提高，以观测其检测灵敏度的变化。
以表2所述所有病原体的特异性引物及通用引物为扩增引物进行多重扩增(其中反向通用引物Rg合成时5’端标记上生物素标记)，以表2所述所有病原体的特异性探针为检测探针，以液相芯片技术平台为检测平台进行检测。
液相芯片技术的原理是把微小的乳胶颗粒分别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的核酸(互补链)或蛋白(如包被抗体)分别以共价方式吸附到不同颜色的荧光微球上。应用时，先把针对不同检测物的不同颜色的荧光微球混合，再加入被检测物(被检测物可以是血清中的抗原抗体、或酶等，也可以是PCR产物)。在悬液中荧光微球与病人标本特异性地结合(杂交仅需十分钟)，并加上荧光标记。然后，荧光微球被微量液体传送系统排成单列通过两束激光，一束判定颗粒的颜色从而决定被测物的特异性(定性)；另一束测定微粒上的荧光标记强度从而给被测物定量。所得到的数据经电脑处理后可以直接用来判断结果。
按照如下步骤进行检测：
1.第一步PCR扩增
在PCR管中加入下列物质：5×RT-PCR Buffer 5.0μL，dNTP Mix终浓度0.4mM，每种Fg+Fs、Rg+Rs终浓度0.15μM，RNase抑制剂0.25μL，Mg2+终浓度3mM，酶混合物(反转录酶、Taq酶混合物)2units，样本3μL，加入DEPC水补足体积至25μL。
按照如下扩增条件进行扩增，得到PCR扩增产物1：
50℃反转录35min；95℃热启动酶活化15min；94℃变性15sec，55℃退火60sec，72℃延伸30sec，进行6个循环；94℃变性15sec，65℃退火45sec，72℃延伸30sec，进行15个循环；4℃保存。
2.PCR产物回收
将上述PCR扩增产物1用凝胶回收或磁珠纯化进行纯化回收，具体步骤参照实施例一步骤2。
3.第二步PCR扩增
在PCR管中加入下列物质：5×PCR Buffer 5.0μL，dNTP Mix终浓度0.2mM，Fg终浓度0.15μM，Rg终浓度0.3μM，Mg2+终浓度2mM，Taq酶0.7unit，PCR扩增产物1回收产物5μL，加入DEPC水补足体积至25μL。
在另一组对比试验中，Fg终浓度0.15μM，Rg终浓度0.45μM，其余各组分条件保持一致。
按照如下扩增条件进行扩增：95℃热启动酶活化15min；94℃变性15sec，55℃退火35sec，72℃延伸30sec(此阶段结束时采集荧光信号)，进行30个循环；4℃保存。
4.微球偶联
1)分别选取6种不同荧光色(11、15、22、28、36、42号微球)羧基化微球，用漩涡震荡器振荡微球悬液，时间20s，使微球混合均匀。
2)分别取上述各号羧基微球大约2×103个，分别转移到离心管中，≥8000×g离心2min，沉淀羧基微球。
3)移走上清，加入100μl dH2O，用漩涡震荡器振荡20s重悬微球，≥8000×g离心2min，沉淀羧基微球。
4)移走上清，加入80μl、100mM、pH＝6.2的磷酸二氢钠盐溶液，用漩涡震荡器振荡20s重悬洗涤的羧基微球。
5)加入10μl、50mg/ml的Sulfo－NHS(用dH2O稀释)，用漩涡震荡器轻轻的振荡。
6)加入10μl、50mg/ml的EDC(用dH2O稀释)，用漩涡震荡器轻轻的振荡。室温孵育20min，每隔10min用漩涡震荡器轻振一次。≥8000×g离心2min，沉淀活化的羧基微球。
7)移走上清，加入250μl、50mM、pH＝5.0的MES，漩涡震荡器振荡20s，重悬活化的羧基微球。≥8000×g离心2min，沉淀洗涤后的羧基微球。
8)重复步骤7两次，用50mM、pH＝5.0的MES洗涤2次。
9)加入100μl、50mM、pH＝5.0的MES，用漩涡震荡器振荡20s。在混匀的微球中分别加入1nmol特异性探针(针对EV-U、CA4、CA6、CA10、CA16、EV71的特异性探针)，用50mM、pH＝5.0的MES定容至500μl，用漩涡震荡器混匀。
10)室温下放在摇床上(200rpm)孵育2h。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。
11)移走上清，加入300μl PBS-TBN，漩涡震荡器振荡30s。在室温下放在摇床(200rpm)上孵育30min。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。
12)移走上清，加入1ml PBS-TBN，漩涡震荡器振荡30s。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。
13)重复步骤12一次，用PBS-TBN洗涤2次。
14)加入500μl PBS-TBN，重悬偶联好和洗涤好的微球。
15)用细胞计数器计数微球的数量，换算出每种微球的浓度。
16)把偶联好的微球放在4℃避光保存，每种探针偶联的微球单独保存。
5.杂交检测
1)分别取出上述制备的针对每种病原体的偶联微球各500个，按等比例混合，分装在96孔板中，每一个孔中含有各种特异性探针的偶联微球各500个，加入步骤3的RT-PCR产物2μl；
2)52℃杂交30min；
3)加入链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)100μl，混匀，52℃孵育30min；
4)加入100μl PBS-TBN重悬微球，用于液相芯片进行检测；
5)液相芯片检测中，红色荧光定义微球的种类，确定待测样品的病原体类型，即定性；绿色荧光测定微球结合的SA-PE的平均荧光强度，根据荧光值，确定病原体含量，即定量。
6.检测结果
结果显示，随着模板稀释度加大，RNA量降低，检测的荧光强度值也随之降低，样本稀释10000倍后仍可检测到荧光信号，说明检测灵敏度较高。同时随着Rg：Fg使用比例的提高，检测的灵敏度有所增加。具体表现为荧光值的增加，尤其是当样本做10-4梯度稀释时，荧光值增加明显。
检测结果如表7、表8所示。
表7实施例3中Rg:Fg＝2:1时的检测结果
表8实施例3中Rg:Fg＝3:1时的检测结果
实施例4
为了观测本发明所述检测方法的重复性，我们以实施例三中001/002/003/004/005/006号样本为模板，同时增加一个阴性对照(以DEPC水为模板)，每一个样本做三个重复。以表2所述所有病原体的特异性引物及通用引物为扩增引物进行多重扩增(其中反向通用引物Rg合成时5’端标记上生物素标记)，以表2所述所有病原体的特异性探针为检测探针，以液相芯片技术平台为检测平台进行检测。
按照实施例3所述实验步骤进行检测，所有实施条件与实施例3相同。检测结果如表9所示。
表9实施例4检测结果
可见，检测数据批内变异系数(CV)＜10％，检测重复性较好。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东艾克韦生物技术有限公司
<120> 一种增加多重PCR引物兼容性的方法
<130> 2018
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgtctttct cgcttactgc acttggtgac gaagagacta ttg 43
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
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tggtctactc acttacagtc ggttacacgc acacggaaag tag 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acgtctttct cgcttactgc cactgcaagc agctgatata g 41
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgtctttct cgcttactgc gagattatgg cgtatctgca 40
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tggtctactc acttacagtc gtcgcactta caagtattcg 40
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<212> DNA
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tggtctactc acttacagtc gctcatgtaa gtcgactgc 39
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<212> DNA
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acgtctttct cgcttactgc acccatggga cgctctaata c 41
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acgtctttct cgcttactgc 20
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tcgctcagca cagctgagac gactct 26
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ctagagccat tctcatagat gccgtatga 29
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aggatactgc ccgagtcgat cacctgca 28
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acgactctca ctgcataagt tcccagcat 29
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<213> 人工序列
<400> 20
cctgaatgcg gctaatccta actg 24

Claims (15)

1.一种增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：针对每个靶基因设计一对特异性引物Fs、Rs以及通用引物Fg、Rg；先采用带有通用引物标签的特异性引物Fg+Fs、Rg+Rs进行富集扩增；然后采用通用引物标签Fg、Rg进行指数扩增。
2.如权利要求1所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：每个特异性引物Fs、Rs的5’ 端都带有通用引物Fg、Rg标签。
3.如权利要求1所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：所有特异性引物Fs、Rs的5’ 端所带的通用引物Fg、Rg的核酸序列均相同。
4.如权利要求1或2所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：特异性引物Fs、Rs的长度为20-25bp。
5.如权利要求1或2所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：通用引物Fg、Rg的长度为15-20bp。
6.如权利要求5所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：通用引物Fg、Rg与任何已知GenBank中收录的序列都不具有同源性。
7.如权利要求1所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：富集扩增包括两轮扩增过程，富集扩增的第一轮扩增以提取的样本核酸DNA或RNA为模板，特异性引物Fs、Rs与提取的样本核酸模板特异性结合，获得5’端带有通用引物标签的PCR扩增产物；富集扩增的第二轮扩增以第一轮扩增产生的5’端带有通用引物标签的PCR扩增产物为模板，产生5’端、3’端均带有通用引物标签的PCR产物。
8.如权利要求7所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：所述富集扩增的第一轮扩增条件为退火温度55-60℃，退火时间60-120s，进行6-10个循环。
9.如权利要求7所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：所述富集扩增的第二轮扩增条件为退火温度65-70℃，退火时间30-60s，进行10-20个循环。
10.如权利要求7所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：指数扩增以富集扩增纯化后的产物为模板，以退火温度50-55℃、退火时间30-40 s，进行30-40个循环。
11.如权利要求10所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：富集扩增的PCR产物通过凝胶纯化或者磁珠纯化后并回收，回收产物作为指数扩增的模板。
12.如权利要求8或9所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于，富集扩增阶段将针对所有靶基因的带有通用引物标签的特异性引物Fg+Fs、Rg+Rs全部加入到反应体系中，反应各组分使用浓度如下：每种靶基因正、反向引物Fg+Fs、Rg+Rs的终浓度为0.05-0.15μM，反应体系中正向或者反向引物引物总浓度不高于10 μM； dNTP终浓度为0.3-1.5 mM；Mg2+终浓度为2.5-5 mM；Taq DNA聚合酶每50μL反应体系2-10 units。
13.如权利要求10所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于，指数扩增阶段各组分浓度如下：正向通用引物Fg的终浓度为0.1-0.3 μM、反向通用引物Rg的终浓度为0.15-1 μM；dNTP终浓度为0.2-0.5 mM；Mg2+终浓度为2-3 mM；Taq DNA聚合酶每50μL反应体系1.25-2 units。
14.如权利要求11所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：富集扩增阶段，正向特异性引物Fg+Fs、反向特异性引物Rg+Rs的使用浓度相等。
15.如权利要求12所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：指数扩增阶段，反向通用引物Rg的浓度高于正向通用引物Fg的浓度。
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