CN112608989A - 用于检测基因多态性的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于检测基因多态性的引物组、试剂盒及方法,该引物组包括:用于检测ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点、CYP2C9*3基因的rs1057910位点以及CYP2D6*10基因的rs1065852位点的引物对。利用该引物组进行多重PCR检测时,通过一次PCR反应可以同时对上述至少一个基因的突变进行检测,使得基因检测通量提高。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,特别涉及用于检测基因多态性的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
ADRB1基因、AGTR1基因、CYP2C9基因以及CYP2D6基因可影响降压药物的代谢,因此,通过对上述基因进行检测可间接确定降压药物的给药计量。
目前,可针对ADRB1基因、AGTR1基因、CYP2C9基因以及CYP2D6基因进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测试验,以进行基因多态性情况的检测。
但是,每个PCR反应只能针对上述一个基因的一个外显子进行基因多态性检测,基因多态性的检测通量低。
发明内容
本发明提供了用于检测基因多态性的引物组、试剂盒及方法,能够提高基因多态性的检测通量。
由于ADRB1基因、AGTR1基因、CYP2C9基因以及CYP2D6基因可影响降压药物的代谢,因此,本发明针对上述基因设计了引物组,具体包括:下述4个引物对中的至少一个引物对;
用于检测ADRB1基因的rs1801253位点的引物对,其中,该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;其中,利用上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2来扩增ADRB1基因的rs1801253位点时,相应扩增产物的片段长度为468bp。
用于检测AGTR1基因的rs5186位点的引物对,其中,该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.4所示;其中,利用上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4来扩增AGTR1基因的rs5186位点时,相应扩增产物的片段长度为276bp。
用于检测CYP2C9*3基因的rs1057910位点的引物对,其中,该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;其中,利用上游引物SEQ ID NO.5和下游引物SEQ ID NO.6来扩增CYP2C9*3基因的rs1057910位点时,相应扩增产物的片段长度为691bp。
用于检测CYP2D6*10基因的rs1065852位点的引物对,其中,该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。其中,利用上游引物SEQ ID NO.7和下游引物SEQ ID NO.8来扩增CYP2D6*10基因的rs1065852位点时,相应扩增产物的片段长度为550bp。
通过上述引物对组成的引物组,可提高ADRB1基因、AGTR1基因、CYP2C9基因以及CYP2D6基因多态性检测的准确性,并且还可以最大程度提高检测通量。
多重PCR是在常规PCR基础上发展的一种新型扩增技术,即可在一个反应体系中加入两对及两对以上的引物,同时扩增多个核酸片段。多重PCR在微生物、遗传病、肿瘤、药物基因组学有着重要的应用。
基于上述内容,本发明还提供了用于检测基因多态性的试剂盒,包括:如上述至少一个引物对组成的引物组。
需要说明的是,该试剂盒中还可以包括用于检测ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点、CYP2C9*3基因的rs1057910位点以及CYP2D6*10基因的rs1065852位点中的至少一个位点扩增反应体系。该扩增反应体系中还可以包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、4种dNTP的混合物和超纯水;其中,DNA聚合酶的用量为0.5~6U,每种dNTP的终浓度均为30~500μM,4个引物对中的每条引物的终浓度为10-500nM。所述DNA聚合酶包括:Taq聚合酶、KOD FX聚合酶、Pfu聚合酶或Phusion聚合酶。
基于此,本发明还提供了一种基因多态性的检测方法,具体包括:
首先设计上述的引物组,或者移取上述试剂盒中的引物组;
然后从待测样本中提取基因组DNA作为扩增模板;
再配制包含所述引物组和所述扩增模板的多重PCR反应体系;
再对所述多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应,得到PCR产物;
最后根据所述PCR产物,确定所述待测样本的ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点、CYP2C9*3基因的rs1057910位点以及CYP2D6*10基因的rs1065852位点的基因型。
具体地,当利用试剂盒中的引物组进行PCR扩增反应时,配制包含所述引物组和所述扩增模板的多重PCR反应体系则包括:
利用试剂盒中的扩增反应体系、引物组以及提取的扩增模板配制多重PCR反应体系。
具体地,待测样本的ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点、CYP2C9*3基因的rs1057910位点以及CYP2D6*10基因的rs1065852位点的基因型,具体可以根据下述步骤确定:
利用电泳检测所述PCR产物,获得所述PCR产物的扩增片段的大小;
当所述PCR产物的扩增片段的大小正确时,对所述PCR产物进行核苷酸序列测定,获得所述待测样本的ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点、CYP2C9*3基因的rs1057910位点以及CYP2D6*10基因的rs1065852位点的基因型。
具体地,可用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨不同长度的DNA片段。
具体地,所述多重PCR反应体系还包括:DNA聚合酶、PCR缓冲液、4种dNTP的混合物和超纯水;
其中,DNA聚合酶的用量为0.5~6U,每种dNTP的终浓度均为30~500μM,4个引物对中的每条引物的终浓度为10-500nM。
可以理解的是,PCR缓冲液即为与DNA聚合酶相对应的缓冲液,比如,当DNA聚合酶为Taq聚合酶时,PCR缓冲液即与Taq聚合酶相对应的缓冲液。其中,PCR缓冲液的浓缩程度可选用2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×或10×。
其中,针对DNA聚合酶的用量来说,0.5~6U是指0.5U至6U范围内的任一值,比如,0.5U、1U、1.5U、2U、2.5U、3U、3.5U、4U、4.5U、5U、5.5U以及6U。
针对每种dNTP的终浓度来说,30~500μM是指30M至500M范围内的任一值,比如,30μM、50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM以及500μM。
针对每条引物的终浓度来说,10-500nM是指10nM至500nM范围内的任一值,比如,10nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM以及500nM。
具体地,所述DNA聚合酶包括:Taq聚合酶、KOD FX聚合酶、Pfu聚合酶或Phusion聚合酶。
举例来说,选用KOD FX作为DNA聚合酶,且选用2×的浓缩的PCR缓冲液时,为配置上述多重PCR反应体系,该体系中各个组分的用量可以为:DNA聚合酶0.5~3μl、PCR缓冲液18~30μl、各种dNTP的混合物1~10μl、4个引物对的混合物1-10μl、DNA 5~500ng,以及适量超纯水,以补水至50μl。以及可以为按照相同比例配置的其他体积大小。
具体地,在本发明一实施例中,所述PCR反应体系的反应条件如表1:
表1
表1中还示出了PCR产物的保存条件为2~8℃。
针对预变性温度来说,90~98℃是指90℃至98℃范围内的任一值,比如,90℃、92℃、94℃、96℃以及98℃。
针对预变性时间来说,30~400s是指30s至400s范围内的任一值,比如,30s、40s、50s、100s、150s、200s、250s、300s、350s以及400s。
针对变性温度来说,92~98℃是指92℃至98℃范围内的任一值,比如,92℃、94℃、96℃以及98℃。
针对变性时间来说,5~300s是指5s至300s范围内的任一值,比如,5s、10s、50s、100s、150s、200s、250s以及300s。
针对退火温度来说,52~68℃是指52℃是指68℃范围内的任一值,比如,52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃以及66℃。
针对退火时间来说,10~90s是指10s至90s范围内的任一值,比如,10s、15s、20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s以及90s。
针对延伸温度和终延伸温度来说,68~72℃是指68℃至72℃范围内的任一值,比如,68℃、69℃、70℃以及72℃。
针对延伸时间来说,10~300s是指10s至300s范围内的任一值,比如,10s、50s、100s、150s、200s、250s以及300s。
针对终延伸时间来说,0~1800s是指0s至1800s范围内的任一值,比如,0s、10s、50s、100s、200s、300s、400s、500s、600s、700s、800s、900s、1000s、1100s、1200s、1300s、1400s、1500s、1600s、1700s以及1800s。
需要说明的是,该基因多态性的检测方法为非诊断目的的方法。
具体地,从待测样本中提取基因组DNA的方式,包括:通过手工提取或试剂盒提取,再对提取DNA进行提取处理,得到基因组DNA。
具体地,待测样本为含有基因组DNA的血液、细胞、组织或口腔拭子的样本。
同现有技术相比,本发明至少可以具有以下有益效果:
(1)扩增结果判读直观准确:本发明提供的各条引物,可以保证将各引物对的扩增产物大小充分区分,各扩增片段之间不会相互作用产生非特异性产物或二聚体,确保了结果的准确性。
(2)提高检测通量:普通PCR每个反应只针对一个引物对扩增产生一个核酸片段,而本发明的多重PCR可以同时扩增出至少两个核酸片段,通过单管一次反应可以对ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点、CYP2C9*3基因的rs1057910位点以及CYP2D6*10基因的rs1065852位点中的多个热点突变位点进行检测。
(3)降低成本:本发明可以将多重PCR反应体系由多个体系/程序缩减至一个体系/程序,故减少了DNA聚合酶、dNTP等试剂和耗材的使用量,可大幅度降低检测成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果;
图2是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对ADRB1基因的rs1801253位点的部分核苷酸碱基序列;
图3是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对AGTR1基因的rs5186位点的部分核苷酸碱基序列。
具体实施方式
非特殊说明,本发明实施所采用的试剂均为市售商品,本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
实施例1:设计并合成引物组
步骤1.1:基于ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点、CYP2C9*3基因的rs1057910位点、CYP2D6*10基因的rs1065852位点及其上下游核酸序列设计特异性扩增的上下游引物。
对于设计的引物,采用Primer Quest和Primer Premier 5.0对引物进行设计及二聚体、茎环错配分析,在包含待测位点的两端设计引物,4对引物的退火温度基本保持一致。
本实施例所提供的引物组覆盖了ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点、CYP2C9*3基因的rs1057910位点、CYP2D6*10基因的rs1065852位点及其上下游核酸序列。由于小的序列变化会导致引物扩增效率显著降低、特异性变差,故分别针对不同位点分别设计多重PCR引物组,并在经过预实验筛选后,综合产物片段长度和位点包含情况,选取了如下述表2所示的扩增效果最佳的引物组。
表2
步骤1.2:合成步骤1.1中设计好的引物组。
实施例2:从待测样本中提取DNA
步骤2.1:用口腔拭子收集口腔脱落细胞或用采血管收集新鲜外周血样本。
步骤2.2:采用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322),或,采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304),从样本中提取DNA,并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度,保存测试结果在预设范围内的DNA。
实施例3:利用步骤1.2合成的引物组和步骤2.2中的保存的DNA配制多重PCR反应体系
步骤3.1:以步骤2.2中所保存的基因组DNA为扩增模板,并采用步骤1.2中合成的引物组,配制多重PCR反应体系。
本实施例采用东洋纺(TOYOBO)公司KOD FX酶系(货号:KFX-101)中DNA聚合酶及缓冲液为基本原料,在酶系说明书中扩增体系的基础上,通过调整引物浓度、dNTP浓度、缓冲液浓度、酶用量,来配制多重PCR扩增体系,这一反应体系的具体组成如下述表3所示。
表3
试剂成分 | 体积 |
2×PCR buffer for FX | 26μl |
2mM dNTP | 4μl |
Primer Mix(每种引物1.25μM) | 4μl |
KOD FX(1U/μl) | 1μl |
DNA | 1μl |
超纯水 | 补至体系的总体积为50μl |
需要说明的是,反应体系等比例放大/缩小均在本发明实施例的保护范围内;更换其他DNA聚合酶系,经过适当比例调整也可以达到扩增目的。
步骤3.2:按照下述表4所示的多重PCR反应条件,设置PCR仪器的程序,并对步骤3.1中配制的多重PCR反应体系,进行多重PCR扩增反应,得到PCR产物。
表4
需要说明的是,得到的PCR产物可在4℃条件下保存待用。
实施例4:电泳检测
步骤4.1:琼脂糖凝胶电泳检测步骤3.2中得到的PCR产物,获得PCR产物片段的大小。
检测结果如图1所示,其中,图1中所示出的1、2、3用于表征不同的待测样本,图1的最左侧列展示了用于表征片段长度的标尺条,图1的最右侧列展示了空白对照组的PCR产物的电泳结果。
请参考图1,根据各个产物亮带所在位置与左侧标尺条的对比,可以识别出各个产物亮带所对应的是哪一基因的扩增产物。比如,自上向下的4条亮带,通常是分别对应于CYP2C9*3基因的rs1057910位点、CYP2D6*10基因的rs1065852位点、ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点及其上下游核酸序列的PCR扩增产物。
根据空白组的电泳结果可知,环境因素对待测样本的电泳检测结果无不良影响。根据各个待测样本的电泳结果可知,存在的4个亮带分别对应于CYP2C9*3基因的rs1057910位点、CYP2D6*10基因的rs1065852位点、ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点及其上下游核酸序列的PCR扩增产物,亮带数量与理论保持一致;4个亮带清晰且间隔明显,不同亮带间无重叠、无拖影等,亮带效果良好。如此,可以说明利用步骤1.1中设计的PCR扩增引物组进行PCR扩增时,仅生成了预期的目标产物,而未生成其他无关产物,引物组设计合理。
步骤4.2:验证PCR产物片段的大小正确后,可针对PCR产物进行序列测定。
实施例5:序列测定
步骤5.1:步骤4.2中验证PCR产物片段的大小正确后,将步骤3.2中得到的PCR产物进行序列测定,得到.ab1格式的测序结果。
步骤5.2:通过Chromas序列分析软件分析步骤5.1中得到的测序结果,获得CYP2C9*3基因的rs1057910位点、CYP2D6*10基因的rs1065852位点、ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点的基因型。
部分位点的测序结果如图2和图3所示。
图2示出了ADRB1基因的rs1801253位点处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图2中的框线部分,可知ADRB1基因的rs1801253位点的基因型为GC,即在该基因突变位点处发生基因突变。
图3示出了AGTR1基因的rs5186位点及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图3中的框线部分,可知AGTR1基因的rs5186位点的基因型为AA,即在该基因突变位点处未发生基因突变。
图2和图3中缺失的图形不影响本方案的技术内容。
需要说明的是,在本文中,诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个〃····〃”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是:以上所述仅为本发明的较佳实施例,仅用于说明本发明的技术方案,并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等,均包含在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.用于检测基因多态性的引物组,其特征在于,包括:下述4个引物对中的至少一个引物对;
用于检测ADRB1基因的rs1801253位点的引物对,其中,该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
用于检测AGTR1基因的rs5186位点的引物对,其中,该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.4所示;
用于检测CYP2C9*3基因的rs1057910位点的引物对,其中,该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;
用于检测CYP2D6*10基因的rs1065852位点的引物对,其中,该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.用于检测基因多态性的试剂盒,其特征在于,包括:如权利要求1所述的引物组。
3.基因多态性的检测方法,其特征在于,包括:
设计权利要求1所述的引物组,或,移取如权利要求2的试剂盒中的引物组;
从待测样本中提取基因组DNA作为扩增模板;
配制包含所述引物组和所述扩增模板的多重聚合酶链式反应PCR反应体系;
对所述多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应,得到PCR产物;
根据所述PCR产物,确定所述待测样本的ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点、CYP2C9*3基因的rs1057910位点以及CYP2D6*10基因的rs1065852位点的基因型。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,
所述根据所述PCR产物,确定所述待测样本的ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点、CYP2C9*3基因的rs1057910位点以及CYP2D6*10基因的rs1065852位点的基因型,包括:
利用电泳检测所述PCR产物,获得所述PCR产物的扩增片段的大小;
当所述PCR产物的扩增片段的大小正确时,对所述PCR产物进行核苷酸序列测定,获得所述待测样本的ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点、CYP2C9*3基因的rs1057910位点以及CYP2D6*10基因的rs1065852位点的基因型。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,
所述多重PCR反应体系还包括:DNA聚合酶、PCR缓冲液、4种dNTP的混合物和超纯水;
其中,DNA聚合酶的用量为0.5~6U,每种dNTP的终浓度均为30~500μM,4个引物对中的每条引物的终浓度为10-500nM。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,
所述DNA聚合酶包括:Taq聚合酶、KOD FX聚合酶、Pfu聚合酶或Phusion聚合酶。
7.根据权利要求3至6中任一所述的方法,其特征在于,
所述多重PCR反应体系的反应条件为:90~98℃条件下预变性30~400s;92~98℃条件下变性5~300s,52~68℃条件下退火10~90s,68~72℃条件下延伸10~300s,所述变性、所述退火和所述延伸循环25~45次;68~72℃条件下终延伸0~1800s。
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