CN111363806A - 用于检测维生素b12代谢基因突变的引物组及其应用方法 - Google Patents

用于检测维生素b12代谢基因突变的引物组及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测维生素B12代谢基因突变的引物组及其应用方法，该引物组，包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.44中22个引物对的至少两个引物对。本方案能够提高维生素B12代谢基因检测的检测通量。

Description

用于检测维生素B12代谢基因突变的引物组及其应用方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及用于检测维生素B12代谢基因突变的引物组及其应用方法。
背景技术
维生素B12是所有人体组织必不可少的营养素，是食物释放能量的关键。维生素B12的吸收代谢过程十分复杂，影响维生素B12吸收的突变位点也很多，目前，与维生素B12代谢相关的TCN1基因、GIF基因、CUBN基因、AMN基因、TCN2基因以及CD320基因中的致病突变位点主要有49个。
目前，可针对维生素B12代谢基因的热点突变位点分别设计聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)检测实验，以进行基因突变情况的检测。
但是，由于常规PCR反应只针对一个维生素B12代谢基因的一个或少数几个突变位点，故检测通量低。
发明内容
为了解决上述缺陷，本发明实施例提供了用于检测维生素B12代谢基因突变的引物组及其应用方法，能够提高维生素B12代谢基因突变检测的检测通量。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
多重PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展的一种新型扩增技术，可在一个反应体系中加入两对及以上的引物，同时扩增多个核酸片段。多重PCR在微生物、遗传病、肿瘤药物基因组学有着重要的应用。基于此，针对维生素B12代谢相关的TCN1、GIF、CUBN、AMN、TCN2、CD320六个基因中热点突变致病位点设计特异性扩增基因突变位点区域的上下游引物。
第一方面，本发明提供了用于检测维生素B12代谢基因突变的引物组，包括：下述22个引物对中的至少两个引物对；
第一引物对用于检测TCN1基因的c.372T>C、c.270DelG和c.217C>T基因位点的突变情况，第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的，利用第一引物对扩增c.372T>C、c.270DelG和c.217C>T位点时，相应扩增产物的片段长度为1558bp；
第二引物对用于检测GIF基因的c.68A>G、c.79+1G>A、c.80-1G>A、c.137C>T、c.161delA、c.183_186delGAAT、c.256+2T>G、c.290T>C、c.431_438delAGAAGAAC以及c.435_437delGAA位点的突变情况，第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，利用第二引物对扩增c.68A>G、c.79+1G>A、c.80-1G>A、c.137C>T、c.161delA、c.183_186delGAAT、c.256+2T>G、c.290T>C、c.431_438delAGAAGAAC以及c.435_437delGAA位点时，相应扩增产物的片段长度为3098bp；
第三引物对用于检测GIF基因的c.659T>C和c.685G>A位点突变情况，第三引物对上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，利用第三引物对扩增c.659T>C和c.685G>A位点时，相应扩增产物的片段长度为436bp；
第四引物对用于检测GIF基因的c.974_975insG和c.1073+5G>A位点突变情况，第四引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，利用第四引物对扩增c.974_975insG和c.1073+5G>A位点时，相应扩增产物的片段长度为329bp；
第五引物对用于检测GIF基因的c.1175_1176insT位点突变情况，第五引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，利用第五引物对扩增c.1175_1176insT位点时，相应扩增产物的片段长度为590bp；
第六引物对用于检测GIF基因的c.1222G>A位点的突变情况，第六引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，利用第六引物对扩增c.1222G>A位点时，相应扩增产物的片段长度为655bp；
第七引物对用于检测AMN基因的c.43+1G>T基因位点和c.122C>T基因位点的突变情况，第七引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，利用第七引物对扩增c.43+1G>T基因位点和c.122C>T基因位点时，相应扩增产物的片段长度为1332bp；
第八引物对用于检测AMN基因的c.208-2A>G和c.514-34G>A位点的突变情况，第八引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示，利用第八引物对扩增c.208-2A>G和c.514-34G>A位点时，相应扩增产物的片段长度为1191bp；
第九引物对用于检测AMN基因的c.701G>T基因位点、c.742C>T基因位点、c.977_978insCCCG基因位点、c.1006+34_48del15bp基因位点、c.1014_1021delCCTCGGCG基因位点、c.967_(1169+15)del296bp基因位点、c.1118_1119insCGCT基因位点以及c.1314_1315delCA基因位点的突变情况，第九引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，利用第九引物对扩增c.701G>T基因位点、c.742C>T基因位点、c.977_978insCCCG基因位点、c.1006+34_48del15bp基因位点、c.1014_1021delCCTCGGCG基因位点、c.967_(1169+15)del296bp基因位点、c.1118_1119insCGCT基因位点以及c.1314_1315delCA基因位点时，相应扩增产物的片段长度为1478bp；
第十引物对用于检测CUBN基因的c.434G>A和c.489G>A位点的突变情况，第十引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，利用第十引物对扩增c.434G>A和c.489G>A位点时，相应扩增产物的片段长度为388bp；
第十一引物对用于检测CUBN基因的c.758C>T位点的突变情况，第十一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，利用第十一引物对扩增c.758C>T位点时，相应扩增产物的片段长度为262bp；
第十二引物对用于检测CUBN基因的c.1010C>T位点的突变情况，第十二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，利用第十二引物对扩增c.1010C>T位点时，相应扩增产物的片段长度为161bp；
第十三引物对用于检测CUBN基因的c.1230+1G>A和c.1530G>A位点的突变情况，第十三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.26所示，利用第十三引物对扩增c.1230+1G>A和c.1530G>A位点时，相应扩增产物的片段长度为2056bp；
第十四引物对用于检测CUBN基因的c.1838delG位点的突变情况，第十四引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，利用第十四引物对扩增c.1838delG位点时，相应扩增产物的片段长度为433bp；
第十五引物对用于检测CUBN基因的c.2188C>T位点的突变情况，第十五引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示，利用第十五引物对扩增c.2188C>T位点时，相应扩增产物的片段长度为538bp；
第十六引物对用于检测CUBN基因的c.2594G>A和c.2614_2615delGA位点的突变情况，第十六引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示，利用第十六引物对扩增c.2594G>A和c.2614_2615delGA位点时，相应扩增产物的片段长度为683bp；
第十七引物对用于检测CUBN基因的c.3330-439C>G和c.3749C>T位点的突变情况，第十七引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，利用第十七引物对扩增c.3330-439C>G和c.3749C>T位点时，相应扩增产物的片段长度为2952bp；
第十八引物对用于检测CUBN基因的c.3890C>T位点的突变情况，第十八引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，利用第十八引物对扩增c.3890C>T位点时，相应扩增产物的片段长度为814bp；
第十九引物对用于检测CUBN基因的c.4115C>G位点的突变情况，第十九引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示，利用第十九引物对扩增c.4115C>G位点时，相应扩增产物的片段长度为795bp；
第二十引物对用于检测CUBN基因的c.8355delA位点的突变情况，第二十引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示，利用第二十引物对扩增c.8355delA位点时，相应扩增产物的片段长度为1013bp；
第二十一引物对用于检测TCN2基因的c.679C>T和c.776C>G位点的突变情况，第二十一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.42所示，利用第二十一引物对扩增c.679C>T和c.776C>G基因位点时，相应扩增产物的片段长度为976bp；
第二十二引物对用于检测CD320基因的c.262_264delGAG位点的突变情况，第二十二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.44所示，利用第二十二引物对扩增c.262_264delGAG位点时，相应扩增产物的片段长度为350bp。
通过上述至少两个引物对组成的引物组，可以相对最大程度的提高维生素B12代谢基因突变的检测通量。
如此，利用上述引物组进行多重PCR扩增后，可产生不同长度的DNA片段，以便于后续电泳分辨不同长度的片段，进而可对不同片段的DNA进行切胶回收，并进行序列的测定。
具体地，为了更准确的检测出维生素B12代谢相关的TCN1基因、GIF基因、CUBN基因、AMN基因、TCN2基因以及CD320基因中的49个致病突变位点的突变情况，当利用上述22个引物对检测维生素B12代谢相关的TCN1基因、GIF基因、CUBN基因、AMN基因、TCN2基因以及CD320基因中的49个致病突变位点时，可以将上述22个引物对分为两组(即，在进行PCR反应时每一组为一个PCR管)，例如下述两组：
第一组包括：第三引物对、第四引物对、第五引物对、第九引物对、第十引物对、第十一引物对、第十二引物对、第十六引物对、第十七引物对、第十九引物对和第二十一引物对。
第二组包括：第一引物对、第二引物对、第六引物对、第七引物对、第八引物对、第十三引物对、第十四引物对、第十五引物对、第十八引物对、第二十引物对和第二十二引物对。
需要说明的是，可以根据需求将上述两组中的引物对进行调整。另外，上述22个引物对还可以根据需求分为3组、4组或者更多组，其中，分组后的每组中的任意两个引物对片段长度之差不小于50bp，以便能够识别出每组中的引物对扩增出的产物的长度。
需要说明的是，SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.44中所示的至少一个引物对，可在制备用于检测维生素B12代谢相关的TCN1、GIF、CUBN、AMN、TCN2、CD320六个基因中热点突变致病位点的试剂或试剂盒中的应用。
第二方面，基于第一方面的内容，本发明提供了一种第一方面所述的用于检测维生素B12代谢基因突变的引物组的应用方法，包括：
设计权利要求1所述的引物组；
从待测样本中提取基因组DNA作为扩增模板；
配制包含所述引物组和所述扩增模板的多重聚合酶链式反应PCR反应体系；
对所述多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物；
根据所述PCR产物，确定所述待测样本的维生素B12代谢基因的热点突变位点的突变情况。
在本发明一个实施例中，所述根据所述PCR产物，确定所述待测样本的维生素B12代谢基因的热点突变位点的突变情况，包括：
电泳检测所述PCR产物，获得所述PCR产物的扩增片段大小；
当所述PCR产物的扩增片段大小正确时，对所述PCR产物进行序列测定，获得所述待测样本的维生素B12代谢基因的热点突变位点的突变情况。
具体地，利用上述引物组进行多重PCR扩增后，可产生不同长度的DNA片段，当扩增出的PCR产物的长度正确时，则可对PCR产物进行测序。
具体地，可用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分辨不同长度的DNA片段。
需要说明的是，上述应用方法为非诊断目的的方法。
在本发明一个实施例中，所述多重PCR反应体系还包括：DNA聚合酶、所述DNA聚合酶对应的PCR缓冲液、4种脱氧核糖核苷三磷酸dNTP的混合物和超纯水。
具体地，DNA聚合酶的用量为0.5-5U，以在保证脱氧核苷酸能够加到扩增模板上的同时，避免DNA聚合酶过量造成浪费、抑制PCR反应。
具体地，4种dNTP的混合物的终浓度为200-1000μM，所述引物组中每条引物的终浓度为20-300nM。
针对DNA聚合酶的用量来说，0.5-5U是指在0.5U到5U范围内的任一用量值，比如，0.5U、1U、1.5U、2U、2.5U、3U、3.5U、4U、4.5U以及5U。
针对4种dNTP的混合物的终浓度来说，200-1000μM是指200μM到1000μM范围内的任一浓度，比如，200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM、500μM、550μM、600μM、650μM、700μM、750μM、800μM、850μM、900μM、950μM以及1000μM。
针对每条引物的终浓度来说，20-300nM是指20nM到300nM范围内的任一浓度，比如，20nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM以及300nM。
具体地，所述DNA聚合酶，包括：KOD FX聚合酶、KOD Plus聚合酶、LA Taq聚合酶和rTaq聚合酶中的任意一种或多种。PCR缓冲液即为与所选的DNA聚合酶相对应的浓缩缓冲液。其中，PCR缓冲液的浓缩程度可选用2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×或10×。
举例来说，选用KOD Plus这一DNA聚合酶，且选用5×的浓缩缓冲液时，为配制上述多重PCR反应体系，体系中各个组分的用量可以为：DNA聚合酶0.5～3μl、PCR缓冲液8～15μl、4种dNTP的混合物1～15μl、22个引物对的混合物1.5-15μl、DNA 5～1000ng，以及适量超纯水，以补水至50μl。以及可以为按照相同比例配制的其他体积大小。
在本发明一实施例中，所述PCR反应体系的反应条件如表1：
表1
Figure BDA0002476700110000081
需要说明的是，扩增出的PCR产物的保存条件为2～8℃。
针对PCR反应条件中预变性的温度来说，80～98℃是指80℃到98℃范围内的任一温度，比如，80℃、82℃、84℃、86℃、88℃、90℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃以及98℃。
针对PCR反应条件中预变性的时间来说，30～300s是指30s到5min内的任一时间，比如，0.5min、1min、1.5min、2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min以及5min。
针对PCR反应条件中变性反应的温度来说，90～98℃是指90℃到98℃范围内的任一温度，比如，90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97以及98℃。
针对PCR反应条件中变性的时间来说，5～60s是指5s到60s范围内的任一时间，比如，5s、8s、10s、14s、17s、20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、55s以及60s。
针对PCR反应条件中退火反应的温度来说，55～75℃是指55℃到75℃范围内的任一温度，比如，55℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74℃以及75℃。
针对PCR反应条件中退火反应的时间来说，10～60s是指10s到60s范围内的任一时间，比如，10s、15s、20s、25s、30s、32s、38s、40s、45s、50s、53s、56s以及60s。
针对PCR反应条件中延伸反应的温度来说，60～75℃是指60℃到75℃范围内的任一温度，比如，60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃以及75℃。
针对PCR反应条件中延伸反应的时间来说，5s～200s是指5s到200s内的任一时间，比如，5s、10s、15s、20s、30s、40s、50s、55s、60s、70s、80s、90s、100s、110s、120s、130s、140s、150s以及200s。
针对PCR反应条件中终延伸反应的温度来说，60～75℃指60℃到75℃范围内的任一温度，比如，60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃以及75℃。
针对PCR反应条件中终延伸反应的时间来说，0～20min是指0min到20min范围内的任一时间，比如，0min、5min、10min、15min以及20min。
具体地，从待测样本中提取基因组DNA的方式，包括：手工提取或试剂盒提取，再对提取DNA进行提取处理，得到基因组DNA。
具体地，待测样本为含有人类基因组DNA的血液、细胞、组织或口腔拭子的样本。
具体地，上述引物组或任一引物对，还可在制备用于检测维生素B12代谢基因突变热点突变位点的试剂或试剂盒中的应用。
同现有技术相比，本发明至少可以具有以下有益效果：
(1)降低成本：本发明可以将PCR反应体系由22个体系/程序缩减至2个体系/程序，故减少了DNA聚合酶、dNTP等试剂和耗材的使用量，可降低检测成本。
(2)提高检测通量：普通的PCR每个反应只针对一个维生素B12代谢基因的一个突变位点，而本发明可以基于多重PCR同时检测多个相关代谢基因或多个突变位点，如此，提高了检测效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图2是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对TCN1基因c.217C>T位点处及其上下游的核苷酸碱基序列；
图3是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对TCN1基因c.270DelG位点处及其上下游的核苷酸碱基序列；
图4是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对TCN1基因c.372T>C位点处及其上下游的核苷酸碱基序列。
具体实施方式
非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
设计并合成引物组
步骤1.1：根据维生素B12代谢相关的TCN1基因、GIF基因、CUBN基因、AMN基因、TCN2基因以及CD320基因的热点突变位点，设计特异性扩增基因序列的上下游引物。
对于设计引物，根据维生素B12代谢基因的热点突变位点，采用Primer Quest和Primer Premier 5.0对引物进行设计及二聚体、茎环错配分析，在包含突变位点的两端设计引物，其中，22对引物的退火温度基本保持一致。
本实施例所提供的22个引物对组成的引物组，覆盖维生素B12代谢相关的TCN1基因、GIF基因、CUBN基因、AMN基因、TCN2基因以及CD320基因的49个致病基因突变位点。分别针对不同位点/外显子分别设计多重PCR引物组，并在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和位点包含情况，选取了如下述表2所示的扩增效果最佳的引物组。将上述22个引物对分为两组，具体分组如下表2.1和表2.2所示：
表2.1
Figure BDA0002476700110000111
Figure BDA0002476700110000121
表2.2
Figure BDA0002476700110000122
步骤1.2：合成步骤1.1中设计好的引物组。
实施例2
从待测样本中提取基因组DNA作为扩增模板
步骤2.1：待测样本为：EDTA全血、口腔拭子或干血纸片样本。
步骤2.2：具体地，采用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)，或，采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，从样本中提取基因组DNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度，保存基因组DNA。
实施例3
配制PCR反应体系
步骤3.1：以步骤2.2中所得的基因组DNA为扩增模板，并采用步骤1.2中合成的引物组，配制多重PCR反应体系。
本实施例采用东洋纺(TOYOBO)公司KOD FX酶系(货号：KFX-101)中DNA聚合酶及缓冲液为基本原料，在酶系说明书中扩增体系的基础上，通过调整引物浓度、dNTP浓度、缓冲液浓度、酶用量，来配制多重PCR扩增体系，这一反应体系的具体组成如下述表3所示。
可以理解的是，反应体系等比例放大/缩小均在本发明实施例的保护范围内；更换其他DNA聚合酶系，经过适当比例调整也可以达到扩增目的。
表3
试剂成分 体积/量
2×PCR buffer for KODFX 30μl
2mM dNTP 15μl
Primer Mix 10μl
KOD FX(2.5U/μl) 2μl
扩增模板 1000ng
超纯水 补水至50μl
各引物等摩尔混合，引物总浓度是50μM；DNA模板量可调整，本实施例中基因组DNA可采用1000ng。
步骤3.2：按照下述表4所示的多重PCR反应条件，设置PCR仪器的程序，并对步骤3.1中配制的多重PCR反应体系，进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物。
表4
Figure BDA0002476700110000141
需要说明的是，本实施例得到的PCR产物在2℃条件下保存待用。
实施例4
电泳检测
步骤4.1：琼脂糖凝胶电泳检测步骤3.2中得到的PCR产物，获得PCR产物片段的大小。
检测结果如图1所示，图1中所示的SLP、PH、JYX和“空”字样的标识主要用于区分不同的待测样本，“第一组”和“第二组”指示测试时所用表2.1和表2.2中示出的引物组。图1的最左侧列展示了标尺条，第一组和第二组的最右侧列(即，“空”字样标识)展示了空白对照组的PCR产物的电泳结果，中间各列展示了不同样本的PCR产物的电泳结果。
根据图1中各个PCR产物亮带所在位置与左侧标尺条的对比，可以识别出各个PCR产物亮带分别对应的是哪一外显子引物对扩增出的的扩增产物。
比如，图1的第一组自上向下的3条亮带中，分别为：
第一条包括c.3330-439C>G位点和c.3749C>T位点；
第二条包括c.701G>T位点、c.742C>T位点、c.977_978insCCCG位点、c.1006+34_48del15bp位点、c.1014_1021delCCTCGGCG位点、c.967_(1169+15)del296bp位点、c.1118_1119insCGCT位点以及c.1314_1315delCA位点；
第三条包括c.679C>T位点和c.776C>G位点。
请参考图1，根据空白组的电泳结果可知，环境因素对待测样本的电泳检测结果无不良影响。根据各个待测样本的电泳结果可知，第一组和第二组分别存在的11条亮带分别对应的PCR扩增产物，亮带数量与理论保持一致；11条亮带清晰且间隔明显，不同亮带间无重叠、无拖影等，亮带效果良好。
如此，可以说明利用步骤1.1中设计的PCR扩增引物组进行PCR扩增时，仅生成了预期的目标产物，而未生成其他无关产物，引物组设计合理。
实施例5
序列测定
步骤5.1：在确定步骤4.1获得的PCR产物片段大小正确后，将步骤3.3中得到的PCR产物送至测序公司进行序列测定，得到.ab1格式的测序结果。
步骤5.2：通过Chromas序列分析软件分析步骤5.1中得到的测序结果，获得维生素B12代谢基因的热点突变位点的突变情况。
部分测序结果如图2至图4所示。
请参考图2，图2示出了TCN1基因的c.217C>T位点处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图2中的框线部分，可知在TCN1基因的c.217C>T位碱基处野生型C并未突变成碱基T，即在该基因突变位点处未发生基因突变。
请参考图3，图3示出了TCN1基因的c.270DelG位点处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图3中的框线部分，可知在TCN1基因的c.270DelG位碱基处未缺失碱基G，因此，在该基因突变位点处未发生基因突变。
请参考图4，图4示出了TCN1基因的c.372T>C位点处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图4中的框线部分，可知在TCN1基因的c.372T>C位碱基处野生型T并未突变成碱基C，即在该基因突变位点处未发生基因突变。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京和合医学诊断技术股份有限公司
<120> 用于检测维生素B12代谢基因突变的引物组及其应用方法
<160> 44
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
ctctgccaca gaggtaagtg aag 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
gaagacaagg tagtctaggg tctc 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
gcaaatcgcg gtacctgtgg a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
cctctgatgt tcccagctcg 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
caggtactgt ttcacaggtt gttc 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
atctcaggtc atactagctg gac 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
gtacaaccaa ctctacccag caa 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
gattgaaagc tgctcaagcg c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
gctgccataa gctaggatct ca 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
atgcatgcct tgtacaagac cc 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
ctcaacccac tgctctttct ta 22
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
tggtagcatc acaggcattc 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
ggtccagtgg ggcaaagtc 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
agacggcgtg accttcttgc 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
tccagctcag ggacaggaca ct 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
gatgcctccg agaagcaagc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
gcttgcttct cggaggcatc 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
tactgagtaa ggccaccctg t 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 19
gtgcacggta acatgcgttt 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
gtgaacctct cctttcaatg gc 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
gcatggtctg gtctaaatgc tt 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 22
tggaagctgc actcgtctct 20
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 23
aataacggcg gctgttctgt g 21
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 24
tggagcacta gattccgtat tcct 24
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 25
catcacgagc caggagatca 20
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 26
gcactccgta cttagtaagc actc 24
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 27
gtgtggaggt atcctgactg gt 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 28
tgtgagcttc caggtaacac ca 22
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 29
gatgtcccac aacacatcaa ac 22
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 30
tgcctgcacc ttagtcatta g 21
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 31
gcaacggaac catctctcac at 22
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 32
tgtgctagat tcactgaacc agt 23
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 33
cagcagttac tcactggact ttga 24
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 34
ctaggcactg aacagcgagt at 22
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 35
aactagaggg agaacggagc c 21
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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ctaacttgac acatctccct tgatc 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 37
gcctactatt tccgtattct gagcc 25
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 38
tactcccacc ccaacttgca 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 39
tgttgccatc ccaaaccagg 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 40
gactcaggac ccattcacta cag 23
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 41
agttgcagag tgatcagcca 20
<210> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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ctgtactggg tatcacacaa gcg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 43
atcacagcca gtgactactg tg 22
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 44
cttcttatga cccacagacc ca 22

Claims (6)

1.用于检测维生素B12代谢基因突变的引物组，其特征在于，包括下述22个引物对中的至少两个引物对：
第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；
第七引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；
第八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；
第九引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示；
第十引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示；
第十一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示；
第十二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示；
第十三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示；
第十四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示；
第十五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示；
第十六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示；
第十七引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示；
第十八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示；
第十九引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示；
第二十引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示；
第二十一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示；
第二十二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示。
2.一种权利要求1所述的用于检测维生素B12代谢基因突变的引物组的应用方法，其特征在于，包括：
设计权利要求1所述的引物组；
从待测样本中提取基因组DNA作为扩增模板；
配制包含所述引物组和所述扩增模板的多重聚合酶链式反应PCR反应体系；
对所述多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物；
根据所述PCR产物，确定所述待测样本的维生素B12代谢基因的热点突变位点的突变情况。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述根据所述PCR产物，确定所述待测样本的维生素B12代谢基因的热点突变位点的突变情况，包括：
电泳检测所述PCR产物，获得所述PCR产物的扩增片段大小；
当所述PCR产物的扩增片段大小正确时，对所述PCR产物进行序列测定，获得所述待测样本的维生素B12代谢基因的热点突变位点的突变情况。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述多重PCR反应体系还包括：DNA聚合酶、所述DNA聚合酶对应的PCR缓冲液、4种脱氧核糖核苷三磷酸dNTP的混合物和超纯水；
其中，DNA聚合酶的用量为0.5-5U，4种dNTP的混合物的终浓度为200-1000μM，所述引物组中每条引物的终浓度为20-300nM。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述DNA聚合酶，包括：KOD FX聚合酶、KOD Plus聚合酶、LA Taq聚合酶和rTaq聚合酶中的任意一种或多种。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述PCR反应体系的反应条件包括：80～98℃，预变性30～300s；90～98℃，变性5～60s；55～75℃，退火10～60s；60～75℃，延伸5s～200s；变性、退火和延伸共循环25～40次；60～75℃，终延伸0～20min。
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