CN111394441B - 用于维生素a相关基因扩增的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于维生素A相关基因扩增的引物组、试剂盒及方法，该引物组包括10个引物对，这10个引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1‑20所示。利用该引物组扩增维生素A相关基因时，可通过单管一次反应同时对维生素A相关基因BCO1、RBP4、PKD1L2、PNPLA3和TTR进行扩增。

Description

用于维生素A相关基因扩增的引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及用于维生素A相关基因扩增的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

维生素A是儿童时期不可或缺的微量营养素，它不仅参与人体正常视觉的维持，而且在特异性及非特异性免疫、生长发育、细胞增殖分化、造血及调节代谢等方面发挥着广泛的调控作用。

基因缺陷导致维生素的吸收利用能力低下是出现维生素缺乏的重要原因，维生素的吸收利用能力低下可以由大量摄取所需维生素来代偿。而在不知道自身的维生素吸收利用能力低下的情况下，往往不能针对性补充需要的维生素，而反复出现维生素缺乏的症状。如光线昏暗的时候出现眼睛适应慢、嘴唇和皮肤容易干燥、手部长倒刺等不良特征，都可能是由于维生素缺乏导致的。长期处于维生素缺乏状态会导致不可逆的伤害或更严重疾病。

多重PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)是在常规PCR基础上发展的一种新型扩增技术，即可在一个反应体系中加入两对及两对以上的引物，同时扩增多个核酸片段。多重PCR的检测通量高于常规PCR，因此，有必要提出用于扩增维生素A相关基因的引物组。

发明内容

本发明提供了用于维生素A相关基因扩增的引物组、试剂盒及方法，能够扩增维生素A相关基因。

为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

详细地，维生素A相关基因有BCO1、RBP4、PKD1L2、PNPLA3、TTR，共可对应有15个多态性位点，这15个多态性位点可见下述表1。基于表1所示出的各个维生素A相关基因的相应多态性位点，来设计特异性扩增基因多态性位点区域的上下游引物。

表1

第一方面，本发明提供了用于维生素A相关基因扩增的引物组，包括下述10个引物对：第一引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示；第二引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.4所示；第三引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.6所示；第四引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.8所示；第五引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.10所示；第六引物对，用于扩增维生素A相关基因RBP4，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.11所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ IDNO.12所示；第七引物对，用于扩增维生素A相关基因RBP4，上游引物的核苷酸序列由SEQ IDNO.13所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.14所示；第八引物对，用于扩增维生素A相关基因PKD1L2，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.15所示，下游引物的核苷酸序列由SEQID NO.16所示；第九引物对，用于扩增维生素A相关基因PNPLA3，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.17所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.18所示；第十引物对，用于扩增维生素A相关基因TTR，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.19所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.20所示。

详细地，引物组包括10个引物对，检测通量较大。使用该引物组进行多重PCR扩增反应时，维生素A相关基因BCO1、RBP4、PKD1L2、PNPLA3、TTR同时在一个扩增体系中进行扩增，即同时扩增包含表1中所示出的15个多态性位点的维生素A相关基因。

详细地，所述第一引物对扩增维生素A相关基因BCO1的扩增片段的长度为239bp；所述第二引物对扩增维生素A相关基因BCO1的扩增片段的长度为725bp；所述第三引物对扩增维生素A相关基因BCO1的扩增片段的长度为355bp；所述第四引物对扩增维生素A相关基因BCO1的扩增片段的长度为401bp；所述第五引物对扩增维生素A相关基因BCO1的扩增片段的长度为539bp；所述第六引物对扩增维生素A相关基因RBP4的扩增片段的长度为292bp；所述第七引物对扩增维生素A相关基因RBP4的扩增片段的长度为444bp；所述第八引物对扩增维生素A相关基因PKD1L2的扩增片段的长度为199bp；所述第九引物对扩增维生素A相关基因PNPLA3的扩增片段的长度为155bp；所述第十引物对扩增维生素A相关基因TTR的扩增片段的长度为614bp。

如此，利用上述引物组进行多重PCR扩增后，可产生不同长度的DNA片段，以便于后续可电泳分辨不同长度的片段。进而可对不同片段长度的DNA片段进行切胶回收，以便进行序列的测定。

需要说明的是，电泳检测结果通常允许存在一定程度的误差，只要扩增产物的片段长度与相应的理论片段长度的差值不大于一定阈值(如20bp)，即可认为扩增出的PCR产物的片段长度正确，进而可对PCR产物进行测序。

结合上述内容，请参考表1，对上述10个引物对分别作以下说明：

第一引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1的rs11645428位点(在表1中的编号为1)和rs12926540位点(在表1中的编号为2)的上下游引物，相应扩增片段长度为239bp，其序列分别为：

上游引物序列BCO1-1F：

GATGGAAGTGCCTGGAAGTTAGC

下游引物序列BCO1-1R：

GGAAATAACAGCAGGGGAATGAGG。

第二引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1的rs119478057位点(在表1中的编号为3)和rs12923433(在表1中的编号为4)的上下游引物，相应扩增片段长度为725bp，其序列分别为：

上游引物序列BCO1-2F：

CTGCAGAGTGAGGGTCATTATT

下游引物序列BCO1-2R：

GTACTGTGGCAGGGATCTTAAA。

第三引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1的rs12934922位点(在表1中的编号为5)的上下游引物，相应扩增片段长度为355bp，其序列分别为：

上游引物序列BCO1-3F：

AGCTTTGGAGTCACCGAGAAC

下游引物序列BCO1-3R：

GGACAGCCTCATCCAATAACTC。

第四引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1的rs7501331位点(在表1中的编号为6)的上下游引物，相应扩增片段长度为401bp，其序列分别为：

上游引物序列BCO1-4F：

GGATAAGGCAGGCTCAGAGTAAG

下游引物序列BCO1-4R：

CCTAAACTCAGGACAAGAGGATGC。

第五引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1的rs6564851位点(在表1中的编号为7)的上下游引物，相应扩增片段长度为539bp，其序列分别为：

上游引物序列BCO1-5F：

CTAATCCTCCACAGCATCACCAAG

下游引物序列BCO1-5R：

GTCTGGGCTATATGGTCCCTTTG。

第六引物对，用于扩增维生素A相关基因RBP4的rs10882272位点(在表1中的编号为8)的上下游引物，相应扩增片段长度为292bp，其序列分别为：

上游引物序列RBP4-1F：

CTGTCTGGTTCACCACTGTATTC

下游引物序列RBP4-1R：

TTGGACTCGCAAGGGTTTAGG。

第七引物对，用于扩增维生素A相关基因RBP4的rs121918584位点(在表1中的编号为9)、rs121918585位点(在表1中的编号为10)、rs794726862位点(在表1中的编号为11)和rs794726861位点(在表1中的编号为12)的上下游引物，相应扩增片段长度为444bp，其序列分别为：

上游引物序列RBP4-2F：

CTGTCATCCTTCTCACAGTTCTC

下游引物序列RBP4-2R：

GAGCTGACTACTCACTTCCTTTC。

第八引物对，用于扩增维生素A相关基因PKD1L2的rs6420424位点(在表1中的编号为13)的上下游引物，相应扩增片段长度为199bp，其序列分别为：

上游引物序列PKD1L2-F：

GTCTCTTAGCACACAGAGATCAGC

下游引物序列PKD1L2-R：

GGCAGCAGATGAGACCTACTTT。

第九引物对，用于扩增维生素A相关基因PNPLA3的rs738409位点(在表1中的编号为14)的上下游引物，相应扩增片段长度为155bp，其序列分别为：

上游引物序列PNPLA3-F：

TTGTTGCCCTGCTCACTTGGA

下游引物序列PNPLA3-R：

CTCTGAAGGAAGGAGGGATAAGG。

第十引物对，用于扩增维生素A相关基因rs1667255(在表1中的编号为15)的上下游引物，相应扩增片段长度为614bp，其序列分别为：

上游引物序列TTR-F：

GTGGATGCCCTGAGACTATGA

下游引物序列TTR-R：

CCTGCGATTGATGTGGGAGAA。

第二方面，本发明提供了用于维生素A相关基因扩增的试剂盒，包括本发明提供的用于维生素A相关基因扩增的任一引物组。

进一步地，所述引物组中任意两种引物对的摩尔比均在0.1-10∶0.1-10范围中。

举例来说，对于0.1-10这一范围，具体取值可以为0.1、0.3、0.5、1、2、5、7或10。

各引物对以上述比例混合时，各引物对的扩增效率基本一致。各引物对的扩增效率基本一致时，相应PCR扩增产物的电泳图中各引物对所对应的条带亮度基本一致。

进一步地，所述引物组中每种引物的终浓度均在20-300nM范围中；

所述试剂盒的PCR反应体系的体积在10-100μl范围中；

所述PCR反应体系中的PCR反应试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)；

其中，DNA聚合酶的用量在0.5-5.0U范围中，dNTPs中每种dNTP的终浓度均在200-500μM范围中；

其中，所述PCR反应体系适用于扩增10ng-2μg的模板DNA。

举例来说，每种引物的终浓度可以为20nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM或300nM；PCR反应体系的体积可以为10μl、20μl、30μl、50μl、70μl、90μl或100μl；DNA聚合酶的用量可以为0.5U、1U、2U、3U、4U或5U；每种dNTP的终浓度均可以为200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM或500μM；模板DNA的用量可以为10ng、20ng、50ng、100ng、300ng、500ng、1μg、1.5μg或2μg。

详细地，PCR缓冲液通常可以为2×PCR buffer、10×PCR buffer等。其中，PCR缓冲液的选用，可根据选用的DNA聚合酶而作相应改变。

进一步地，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等。

详细地，反应体系可以等比例的放大或缩小。此外，更换其他DNA聚合酶系时，经过适当比例调整也可以达到扩增目的。第三方面，本发明提供了维生素A相关基因扩增方法，包括：利用本发明提供的用于维生素A相关基因扩增的任一引物组，或，利用本发明提供的用于维生素A相关基因扩增的任一试剂盒，扩增维生素A相关基因。

详细地，上述维生素A相关基因扩增方法可以包括以下步骤：

步骤1：从待测样本中提取模板DNA，作为扩增模板；

步骤2：配制包含本发明提供的用于扩增维生素A相关基因的任一引物组和所述扩增模板的多重PCR反应体系；

步骤3：对所述多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物。

详细地，步骤1中，模板DNA为人类基因组DNA，可以选用手工提取或商品化试剂盒提取方法，对待测样本进行提取处理得到人类基因组DNA；所述待测样本为含有人类基因组DNA的人类的血液、细胞、组织或口腔拭子样本等生物学样本。

详细地，在得到PCR产物后，可以电泳检测所述PCR产物，以分辨所述PCR产物中各个扩增片段的大小；之后可对各个扩增片段进行切胶回收，以备用送检作序列测定。

详细地，可用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨不同长度的片段。

进一步地，所述维生素A相关基因扩增的PCR反应程序包括：94-98℃变性2-10min；94-98℃变性10-90s，55-68℃退火10-90s，68-72℃延伸30-300s，共25-40个循环；68-72℃延伸5-20min。

举例来说，对于94-98℃，可以为94℃、96℃或98℃，对于2-10min，可以为2min、3min、6min、9min或10min；对于94-98℃，可以为94℃、95℃、97℃或98℃，对于10-90s，可以为10s、30s、50s、70s或90s；对于55-68℃，可以为55℃、57℃、59℃、62℃、66℃或68℃；对于68-72℃，可以为68℃、69℃、70℃、71℃或72℃，对于30s-5min，可以为30s、1min、2min、3min、4min或5min；对于20-40个，可以为20个、25个、30个、35个或40个；对于68-72℃，可以为68℃、70℃或72℃，对于5-20min，可以为5min、10min、15min或20min。

进一步地，所述引物组中任意两种引物对的摩尔比均在0.1-10∶0.1-10范围中。

进一步地，所述维生素A相关基因扩增的扩增模板包括：基因组DNA10ng-2μg；

所述引物组中每种引物的终浓度均在20-300nM范围中；

所述维生素A相关基因扩增的PCR反应体系的体积在10-100μl范围中；

所述PCR反应体系中的PCR反应试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs；

其中，DNA聚合酶的用量在0.5-5.0U范围中，dNTPs中每种dNTP的终浓度均在200-500μM范围中。

第四方面，本发明提供的用于维生素A相关基因扩增的任一引物组，或，本发明提供的用于维生素A相关基因扩增的任一试剂盒，在检测维生素A相关基因中的应用。

本发明提供了用于维生素A相关基因扩增的引物组、试剂盒及方法，该引物组包括10个引物对，可通过单管一次反应，至少对维生素A相关基因BCO1、RBP4、PKD1L2、PNPLA3和TTR的共计15个多态性位点进行扩增。

至少可以具有以下特点：

(1)检测成本低，检测时间短，方便快捷，易于普及。可以采用单管多重PCR扩增反应结合sanger测序的方法，至少可以同时检测5个基因的15个多态性位点，操作起来非常简便。通过扩增体系及程序优化有效的缩短了扩增时间，整个检测流程3-4h便可以完成。另外，由于引物无需标记荧光，大大节约了检测成本，加上无需昂贵、复杂的设备，任何检测机构均可开展。

(2)提高检测通量。普通PCR每个反应只检测一个核酸片段，而多重PCR可以同时检测多个核酸片段，通过一次1管多重PCR扩增反应，至少可以对维生素A相关基因的5个基因的15个多态性位点进行检测。可以同时检测90多例样本，不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。

(3)扩增结果判读直观准确。基于特定的引物设计、扩增体系、扩增程序，可以将各对引物的扩增产物大小充分区分，各扩增片段之间不会相互作用产生非特异性产物或二聚体，确保了结果的准确性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图2是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中，针对BCO1基因多态性位点rs7501331(C>T)的部分；

图3是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中，针对PKD1L2基因多态性位点rs6420424(G>A)的部分；

图4是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中，针对BCO1基因多态性位点rs6564851(T>G)的部分。

具体实施方式

非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

设计并合成引物组，包括以下步骤：

步骤1.1：根据维生素A相关基因BCO1、RBP4、PKD1L2、PNPLA3、TTR这5个目的基因所对应的共15个多态性位点的上下游序列，设计特异性扩增基因多态性位点区域的上下游引物。

根据文献调研选择维生素A相关的上述5个基因的15个多态性位点，这15个多态性位点如上述表1所示。通过NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国生物技术信息中心)查找各位点的DNA序列，设计并合成最佳的扩增引物，保证各扩增片段之间不会相互作用产生非特异性产物或二聚体。然后，根据需要稀释到所需的浓度10μM。

对于设计引物，采用Primer Quest和Primer Premier 5.0对引物进行设计及二聚体、茎环错配分析，在包含多态性位点的两端设计引物，各对引物的退火温度基本保持一致。

由于小的序列变化可能导致引物扩增效率显著降低、特异性变差，本发明实施例分别针对不同位点来设计特异性的多重PCR引物组。在经过预实验筛选及多次优化后，综合产物片段长度和位点包含情况，本发明实施例选取了如下述表2所示的扩增效果相对最佳的引物组。该引物组至少覆盖了BCO1、RBP4、PKD1L2、PNPLA3、TTR这5个基因及其中的共计15个多态性位点。

请结合表1和表2，表2中的BCO1-1F和BCO1-1R这一引物对可扩增表1中所示的SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)位点：rs11645428(在表1中的编号为1)和rs12926540(在表1中的编号为2)；表2中的BCO1-2F和BCO1-2R这一引物对可扩增表1中所示的SNP位点：rs119478057(在表1中的编号为3)；表2中的BCO1-3F和BCO1-3R这一引物对可扩增表1中所示的SNP位点：rs12934922(在表1中的编号为5)；表2中的BCO1-4F和BCO1-4R这一引物对可扩增表1中所示的SNP位点：rs7501331(在表1中的编号为6)；表2中的BCO1-5F和BCO1-5R这一引物对可扩增表1中所示的SNP位点：rs6564851(在表1中的编号为7)；表2中的RBP4-1F和RBP4-1R这一引物对可扩增表1中所示的SNP位点：rs10882272(在表1中的编号为8)；表2中的RBP4-2F和RBP4-2R这一引物对可扩增表1中所示的SNP位点：rs121918584(在表1中的编号为9)、rs121918585(在表1中的编号为10)、rs794726862(在表1中的编号为11)和rs794726861(在表1中的编号为12)；表2中的PKD1L2-F和PKD1L2-R这一引物对可扩增表1中所示的SNP位点：rs6420424(在表1中的编号为13)；表2中的PNPLA3-F和PNPLA3-R这一引物对可扩增表1中所示的SNP位点：rs738409(在表1中的编号为14)；表2中的TTR-F和TTR-R这一引物对可扩增表1中所示的SNP位点：rs1667255(在表1中的编号为15)。

表2

表2中，F用于表征扩增用上游引物，R用于表征扩增用下游引物。

步骤1.2：合成步骤1.1中设计好的引物组。

实施例2

从待测样本中提取基因组DNA，包括如下步骤：

步骤2.1：用口腔拭子收集口腔脱落细胞或新鲜外周血样本。

步骤2.2：采用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)，或，采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，从样本中提取基因组DNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度，保存基因组DNA。

实施例3

维生素A相关基因扩增方法，包括以下步骤：

步骤3.1：以步骤2.2中所得的基因组DNA为扩增模板，并采用步骤1.2中合成的引物组，来配制多重PCR反应体系。

扩增试剂为购买的商品化扩增试剂，包括PCR Buffer、dNTP、Mg²⁺、DNA聚合酶等；采用东洋纺(TOYOBO)公司KOD FX Neo酶系(货号：KFX-201)。在酶系说明书中扩增体系的基础上，通过调整引物浓度、dNTP浓度、缓冲液浓度、酶用量，来配制多重PCR扩增体系。

多重PCR反应体系的具体组成如下述表3所示。当然，反应体系等比例放大/缩小均在本发明实施例的保护范围内；更换其他DNA聚合酶系，经过适当比例调整也可以达到扩增目的。

表3

试剂成分	体积
		2*PCR反应缓冲液	25μl
2mM dNTP	10μl
		Primer Mix(10μM)	10μl
DNA聚合酶	2μl
		基因组DNA	2μl
ddH2O	1μl
		Total	50μl

表3中，Primer Mix即引物组。

对应于上述表3，根据表1所列的位点，该反应体系至少可将5个基因的15个多态性位点汇总到1管以进行多重PCR扩增，其中，引物组合浓度配比为：

BCO1-1：BCO1-2：BCO1-3：BCO1-4：BCO1-5：RBP4-1：RBP4-2：PKD1L2：PNPLA3：TTR＝5：4：10：5：5：4：6：4：5：2。

对应于上述表3，DNA用量为50-100ng。

步骤3.2：按照下述表4所示的多重PCR反应条件，设置PCR仪器的程序。

根据选取的扩增酶系，对退火及延伸的温度及时间进行优化，保证5个基因共15位点在琼脂糖凝胶电泳的结果中均有明亮且单一的条带，并且扩增时间较短。确定出的最优的PCR扩增程序见下述表4。

表4

步骤3.3：利用程序设好的PCR仪器，对步骤3.1中配制的多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物。

多重PCR扩增反应结束后，电泳检测PCR产物，分辨及验证PCR产物中的各个扩增片段。

实施例4

电泳检测，包括以下步骤：

步骤4.1：琼脂糖凝胶电泳检测步骤3.3中得到的PCR产物。

预先配制3％的琼脂糖凝胶，取步骤3.3中得到的PCR扩增产物5ul点样于凝胶上，电压120V，电泳40min后，于凝胶成像仪上观察PCR产物片段的大小，并拍摄清晰照片保存。

琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，图1中所示出的1、2、3、4，主要用于区分不同的待测样本，图1的最左侧列展示了标尺条，最右侧列展示了空白对照组的PCR产物的电泳结果，中间各列展示了不同样本的PCR产物的电泳检测结果。

请参考图1，根据各个PCR产物亮带所在位置与左侧标尺条的对比，可以识别出各个产物亮带所对应的是哪一引物对所对应的扩增产物，进而获知各个产物亮带所对应的是哪一或哪些多态性位点所对应的扩增产物。

请参考图1，图1中中间各列上均有10条亮带，自上向下的10条亮带，通常是分别对应于如上所述的第二引物对(即表2中的BCO1-2F和BCO1-2R)、第十引物对(即表2中的TTR-F和TTR-R)、第五引物对(即表2中的BCO1-5F和BCO1-5R)、第七引物对(即表2中的RBP4-2F和RBP4-2R)、第四引物对(即表2中的BCO1-4F和BCO1-4R)、第三引物对(即表2中的BCO1-3F和BCO1-3R)、第六引物对(即表2中的RBP4-1F和RBP4-1R)、第一引物对(即表2中的BCO1-1F和BCO1-1R)、第八引物对(即表2中的PKD1L2-F和PKD1L2-R)、第九引物对(即表2中的PNPLA3-F和PNPLA3-R)的PCR扩增产物。

请参考图1，根据空白组的电泳结果可知，环境因素对待测样本的电泳检测结果无不良影响。根据各个待测样本的电泳结果可知，存在的10个亮带分别对应于根据维生素A相关基因BCO1、RBP4、PKD1L2、PNPLA3、TTR的15个多态性位点所设计出的10个引物对，分别为这10个引物对所对应的PCR扩增产物，亮带数量、各亮带所对应扩增片段的大小均与理论保持一致；10个亮带清晰且间隔明显，不同亮带间无重叠、无拖影等，亮带效果良好。如此，可以说明利用步骤1.1中设计的引物组进行PCR扩增时，仅生成了预期的目标产物，而未生成其他无关产物，引物组设计合理。

步骤4.2：分辨各个PCR扩增产物片段，并验证各个PCR扩增产物片段的大小正确后，对不同片段的PCR扩增产物进行切胶回收，以备作序列测定。

实施例5

序列测定，包括以下步骤：

步骤5.1：将步骤4.2中切胶回收到的不同片段的PCR扩增产物，送至测序公司(北京诺赛基因组研究中心有限公司)进行序列测定，得到.ab1格式的测序结果。

步骤5.2：通过Chromas序列分析软件分析步骤5.1中得到的测序结果，获得维生素A相关基因BCO1、RBP4、PKD1L2、PNPLA3、TTR这5个目的基因中，15个多态性位点的基因变化情况。

部分测序结果如图2-4所示。

图2示出了BCO1基因多态性位点rs7501331(C>T)(在表1中的编号为6)处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图2中框线部分对应的测序峰图，可知在rs7501331位点处的基因型为CC，而不是TT纯合或者CT杂合突变基因型，即在该基因多态性位点处未发生基因突变。

图3示出了PKD1L2基因多态性位点rs6420424(G>A)(在表1中的编号为13)处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图3中框线部分对应的测序峰图，可知在rs6420424位点处出现G变成A的GA突变杂合子基因型，即在该基因位点处发生了杂合基因突变。

图4示出了BCO1基因多态性位点rs6564851(T>G)(在表1中的编号为7)处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图4中框线部分对应的测序峰图，可知在rs6564851位点处出现T变成G的TG突变纯合子基因型，即在该基因位点处发生了纯合基因突变。

此外，通过比较普通PCR测序方法和本发明实施例提供的这一多重PCR测序方法，发现两种方法所获得的结果一致，本发明实施例所提供的检测方案具有较好的特异性和适用性。

本发明实施例中，基于特定设计的引物组合，并结合Sanger测序技术，至少可以同时对5个维生素A相关基因BCO1、RBP4、PKD1L2、PNPLA3、TTR的共计15个多态性位点进行检测，具有结果准确、操作简便、成本低廉、扩增无干扰等优点。

实施例6

一种试剂盒，该试剂盒包括PCR反应试剂和引物组。该PCR反应试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和超纯水，具体成分如上述表3所示；该引物组包括如上述表2中所示出的10个引物对，具体成分如上述表3。该试剂盒适用于扩增50-100ng的基因组DNA。

该试剂盒可用于对维生素A相关基因的检测应用中。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京和合医学诊断技术股份有限公司

<120> 用于维生素A相关基因扩增的引物组、试剂盒及方法

<130> 2020.01.10

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因BCO1的上游引物

<400> 1

gatggaagtg cctggaagtt agc 23

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因BCO1的下游引物

<400> 2

ggaaataaca gcaggggaat gagg 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因BCO1的上游引物

<400> 3

ctgcagagtg agggtcatta tt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因BCO1的下游引物

<400> 4

gtactgtggc agggatctta aa 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因BCO1的上游引物

<400> 5

agctttggag tcaccgagaa 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因BCO1的下游引物

<400> 6

ggacagcctc atccaataac tc 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因BCO1的上游引物

<400> 7

ggataaggca ggctcagagt aag 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因BCO1的下游引物

<400> 8

cctaaactca ggacaagagg atgc 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因BCO1的上游引物

<400> 9

ctaatcctcc acagcatcac caag 24

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因BCO1的下游引物

<400> 10

gtctgggcta tatggtccct ttg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因RBP4的上游引物

<400> 11

ctgtctggtt caccactgta ttc 23

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因RBP4的下游引物

<400> 12

ttggactcgc aagggtttag g 21

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因RBP4的上游引物

<400> 13

ctgtcatcct tctcacagtt ctc 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因RBP4的下游引物

<400> 14

gagctgacta ctcacttcct ttc 23

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因PKD1L2的上游引物

<400> 15

gtctcttagc acacagagat cagc 24

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因PKD1L2的下游引物

<400> 16

ggcagcagat gagacctact tt 22

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因PNPLA3的上游引物

<400> 17

ttgttgccct gctcacttgg a 21

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因PNPLA3的下游引物

<400> 18

ctctgaagga aggagggata agg 23

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因TTR的上游引物

<400> 19

gtggatgccc tgagactatg a 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 用于扩增维生素A相关基因TTR的下游引物

<400> 20

cctgcgattg atgtgggaga a 21

Claims (7)

1.用于维生素A相关基因扩增的引物组，其特征在于，包括下述10个引物对：

第一引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示；

第二引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.4所示；

第三引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.6所示；

第四引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.8所示；

第五引物对，用于扩增维生素A相关基因BCO1，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.10所示；

第六引物对，用于扩增维生素A相关基因RBP4，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.11所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.12所示；

第七引物对，用于扩增维生素A相关基因RBP4，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.13所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.14所示；

第八引物对，用于扩增维生素A相关基因PKD1L2，上游引物的核苷酸序列由SEQ IDNO.15所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.16所示；

第九引物对，用于扩增维生素A相关基因PNPLA3，上游引物的核苷酸序列由SEQ IDNO.17所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.18所示；

第十引物对，用于扩增维生素A相关基因TTR，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.19所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.20所示；且任意两种引物对的摩尔比均在0.1-10∶0.1-10范围中。

2.用于维生素A相关基因扩增的试剂盒，其特征在于，包括：如权利要求1所述的用于维生素A相关基因扩增的引物组，所述引物组中每种引物的终浓度均在20-300nM范围中，还包括适用于扩增10ng-2μg的模板DNA，体积在10-100μl范围中的PCR反应体系。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系包括PCR缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs，且DNA聚合酶的用量在0.5-5.0U范围中，dNTPs中每种dNTP的终浓度均在200-500μM范围中。

4.非诊断目的的维生素A相关基因扩增方法，其特征在于，利用权利要求1中SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.20所示的引物对对待测样本进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物，电泳检测PCR产物用于分辨及验证PCR产物中的各个扩增片段；还包括对各个扩增片段进行序列测定及采用序列分析软件分析测序结果，且所述维生素A相关基因扩增的PCR反应程序包括：

94-98℃变性2-10min；94-98℃变性10-90s，55-68℃退火10-90s，68-72℃延伸30-300s，共25-40个循环；68-72℃延伸5-20min。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述引物组中任意两种引物对的摩尔比均在0.1-10∶0.1-10范围中。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述维生素A相关基因扩增的扩增模板包括：基因组DNA 10ng-2μg；

所述引物组中每种引物的终浓度均在20-300nM范围中；

所述维生素A相关基因扩增的PCR反应体系的体积在10-100μl范围中；

所述PCR反应体系中的PCR反应试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs；

其中，DNA聚合酶的用量在0.5-5.0U范围中，dNTPs中每种dNTP的终浓度均在200-500μM范围中。

7.权利要求1所述的用于维生素A相关基因扩增的引物组或权利要求2至3中任一所述的用于维生素A相关基因扩增的试剂盒在制备用于检测维生素A相关基因中的检测试剂中的应用。

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