CN111363805A - 用于检测维生素d代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测维生素d代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测维生素D代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法，该引物组包括上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1‑20所示的10种引物对。利用该引物组扩增维生素D代谢基因时，可通过一次反应同时对维生素D代谢基因CYP24A1、CYP27B1和VDR的多个外显子、内含子区域进行扩增，从而可同时检测维生素D代谢基因CYP24A1、CYP27B1和VDR的多个高频突变位点。

Description

用于检测维生素D代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及用于检测维生素D代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
维生素D(Vitamin D)是一类脂溶性的维生素，是一种能维护身体健康的多功能激素，在控制体内钙磷水平和骨骼钙化上具有重要作用，而且对于骨外系统，包括心血管系统、免疫系统、神经系统、糖代谢、细胞增殖分化等方面，都具有十分重要的作用。
维生素D可以通过饮食和阳光照射而获得。维生素D本身并不具有活性形式，它需经过两步羟基化才能成为具有生物活性的物质，在人体内发挥调节血钙和血磷的功能。维生素D的吸收、转运和分解过程十分复杂，涉及到多个基因的参与。首先血液中维生素D结合蛋白(DBP)将从食物和皮肤内合成的维生素D运输至肝脏。在肝脏中，由细胞色素P450家族成员CYP2R1基因编码25-羟化酶，维生素D3经该酶催化，即C-25发生羟基化，生成25(OH)D3。其中，25(OH)D3有下述两条路径。
路径1：CYP24A1编码的24-羟化酶使25(OH)D3发生羟基化，生成24,25(OH)2D3，通过胆汁入肠随粪便排出。若人体内的CYP24A1发生突变，会造成维生素D的分解发生羟基化障碍，导致血钙在体内积聚而无法排出。
路径2：25(OH)D3被DBP转运至肾脏，在CYP27B1编码的1α-羟化酶的作用下，生成1,25(OH)2D3。若机体内的CYP27B1发生突变，会造成维生素D合成受阻，导致血钙和血磷减少。
一方面，肾脏中的1,25(OH)2D3与维生素受体VDR和视黄酸X受体结合成的二聚体特异性结合，由DBP转运至骨组织，维持骨矿质化平衡。另一方面，24-羟化酶使1,25(OH)2D3第25碳上发生羟基化，生成1,24,25(OH)3D3，通过胆汁入肠以排泄的方式将其排至体外。
VDR是一种核激素受体配体诱导转录因子，主要存在于成骨细胞、破骨细胞、骨髓干细胞、肾小管上皮细胞、甲状旁腺细胞等中，它们的下游靶点主要参与钙磷的调节。基因突变可使VDR受体的锌指结构稳定性减弱，从而使VDR与1,25(OH)2D3的亲和力减弱，或不能与1,25(OH)2D3特异结合，导致受VDR受体调控的基因的启动子激活失败，进而使机体钙磷失衡。
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)已被广泛应用于医学、遗传学、微生物学乃至整个生命科学中。多重PCR是在常规PCR基础上发展的一种新型扩增技术，即可在一个反应体系中加入两对及两对以上的引物，同时扩增多个核酸片段。多重PCR在微生物、遗传病、肿瘤药物基因组学有着重要的应用。多重PCR的检测通量高于常规PCR，因此，有必要提出用于检测维生素D代谢基因突变的引物组。
发明内容
本发明提供了用于检测维生素D代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法，能够检测维生素D代谢基因。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
详细地，维生素D代谢基因CYP24A1、CYP27B1和VDR，共可包括22种高频突变位点，具体突变位点可见下述表1。基于表1所示出的各个基因的高频突变位点，来设计特异性扩增高频突变位点所在外显子或内含子区域的上下游引物。
表1
Figure BDA0002476697980000031
第一方面，本发明提供了用于检测维生素D代谢基因突变的引物组，包括下述10种引物对：第一引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1的第2号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示；第二引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1的第7号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ IDNO.3所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.4所示；第三引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1的第9号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.6所示；第四引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1的第1号外显子和第1号内含子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.8所示；第五引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1的第2-4号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ IDNO.10所示；第六引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1的第5-6号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.11所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.12所示；第七引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1的第7号内含子以及第7-8号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.13所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.14所示；第八引物对，用于扩增维生素D代谢基因VDR的第1号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.15所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.16所示；第九引物对，用于扩增维生素D代谢基因VDR的第2号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.17所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.18所示；第十引物对，用于扩增维生素D代谢基因VDR的第6号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.19所示，下游引物的核苷酸序列由SEQID NO.20所示。
详细地，引物组包括10种引物对，检测通量较大。使用该引物组进行多重PCR扩增反应时，维生素D代谢基因CYP24A1、CYP27B1和VDR同时在一个扩增体系中进行扩增，即同时扩增包含表1中所示出维生素D代谢基因的22种高频突变位点。
结合上述内容，请参考表1，对上述10种引物对分别作以下说明：
第一引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1的第2号外显子区域，该外显子涉及c.428_430delAAG p.E143del和c.443T>C p.L148P位点，相应扩增片段长度为384bp，其序列分别为：
上游引物序列MP-VD-1F：CAGGTGGAGTACCACAAGAAGT
下游引物序列MP-VD-1R：TTTCCGTGGACCGACTCTAATC。
其中，对于相应扩增产物来说，用于测序的引物为上游引物MP-VD-1F。
第二引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1的第7号外显子区域，该外显子涉及c.943G>T p.Glu315*位点，相应扩增片段长度为281bp，其序列分别为：
上游引物序列MP-VD-2F：GCAAGAAGGAGTTTGGACTGAGGT
下游引物序列MP-VD-2R：GGCAGACCGTTCATTTAGCAAACTC。
其中，对于相应扩增产物来说，用于测序的引物为上游引物MP-VD-2F。
第三引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1的第9号外显子区域，该外显子涉及c.1186C>T p.R396W位点，相应扩增片段长度为876bp，其序列分别为：
上游引物序列MP-VD-3F：GCCTCTTTGAGTATGCACTTGG
下游引物序列MP-VD-3R：GCAGTTGAAGCTCTGCTAATCG。
其中，对于相应扩增产物来说，用于测序的引物为上游引物MP-VD-3F。
第四引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1的第1号外显子和第1号内含子区域，第1号外显子涉及c.171_171delG位点，第1号内含子涉及c.195+2T>G位点区域，相应扩增片段长度为446bp，其序列分别为：
上游引物序列MP-VD-4F：CAAGTACGCCTCCAGAGTGTTC
下游引物序列MP-VD-4R：TCCCGCGCACTTGTACTTTATC。
其中，对于相应扩增产物来说，用于测序的引物为上游引物MP-VD-4F。
第五引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1的第2-4号外显子区域，第2号外显子涉及c.305G>A p.G102E位点，第3号外显子涉及c.574A>G p.K192E位点，第4号外显子涉及c.590G>A p.G197D位点，相应扩增片段长度为1237bp，其序列分别为：
上游引物序列MP-VD-5F：GTATCCAAGTGTCCGCTGTGTC
下游引物序列MP-VD-5R：CTCGACCTGTGCCTTACCAAAT。
其中，用于c.574A>G p.K192E位点所在的第3号外显子区域和c.590G>A p.G197D位点所在的第4号外显子区域测序的引物为上游引物MP-1237-CX-01-F；用于c.305G>Ap.G102E位点所在的第2号外显子区域测序的引物为MP-1237-CX-02-R。其序列分别为：
MP-1237-CX-01-F：GGAACCCTGAACAACGTAGTCT
MP-1237-CX-02-R：AACCTGAGTGTGGGTGAAGCAG。
第六引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1的第5-6号外显子区域，第5号外显子涉及c.934_935delAC位点，第6号外显子涉及c.1022_1037del16位点，相应扩增片段长度为631bp，其序列分别为：
上游引物序列MP-VD-6F：GAGCGAGGTATTCACGTGCCTT
下游引物序列MP-VD-6R：AGCCCTTCCTTGGCATTTCCTC。
其中，对于相应扩增产物来说，用于测序的引物为上游引物MP-VD-6F。
第七引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1的第7号内含子以及第7-8号外显子区域，第7号外显子涉及c.1165C>T p.R389C和c.1215T>Cp.N405N位点，第7号内含子涉及c.1215+2T>A位点，第8号外显子涉及c.1321C>T p.H441Y、c.1319-1325dup7(CCCACCC)和c.1376G>T p.R459L位点，相应扩增片段长度为1472bp，其序列分别为：
上游引物序列MP-VD-7F：TAGTGGATGGAAGCAGGGAGATAG
下游引物序列MP-VD-7R：CCTCAGGCCATCCAGCATTATTAG。
其中，用于c.1321C>T(CAC>TAC)p.H441Y、c.1319_1325dupCCCACCC(Phe443Profs*24)和c.1376G>T p.R459L位点所在的第8号外显子区域测序的引物为MP-1472-CX-01-F；用于c.1165C>T p.R389C和c.1215T>C位点所在的第7号外显子区域以及c.1215+2T>A位点所在的第7号内含子区域测序的引物为MP-1472-CX-02-R。其序列分别为：
MP-1472-CX-01-F：GGAGATCCTTCCAAAAGTAGC
MP-1472-CX-02-R：GCTACTTTTGGAAGGATCTCC。
第八引物对，用于扩增维生素D代谢基因VDR的第1号外显子区域，该外显子涉及c.137G>A p.Gly46Asp和c.2T>C p.Met1Thr/rs2228570位点，相应扩增片段长度为1028bp，其序列分别为：
上游引物序列MP-VD-8F：GACTCACATGACTCAGAAGGAC
下游引物序列MP-VD-8R：GAAGATACCACTCACCAAGACC。
其中，对于相应扩增产物来说，用于测序的引物的序列为：
MP-1028-CX-02-F：AATCATGTATGAGGGCTCCGAAG。
第九引物对，用于扩增维生素D代谢基因VDR的第2号外显子区域，该外显子涉及c.230A>G p.Gln77Arg位点，相应扩增片段长度为529bp，其序列分别为：
上游引物序列MP-VD-9F：CAGAAGACAGGTCTCCGTGATG
下游引物序列MP-VD-9R：CCAGGAGTAGAAGGGACTCTTG。
其中，对于相应扩增产物来说，用于测序的引物为MP-VD-9F。
第十引物对，用于扩增维生素D代谢基因VDR的第6号外显子区域，该外显子涉及c.821G>T p.R274L和c.885C>A p.Y295*位点，相应扩增片段长度为741bp，其序列分别为：
上游引物序列MP-VD-10F：GCAAGCTCCTCGATGAAAG
下游引物序列MP-VD-10R：GTAGGTATTTCCTTATCTGTGTCTC。
其中，对于相应扩增产物来说，用于测序的引物为MP-VD-10F。
如此，利用上述引物组进行多重PCR扩增后，可产生不同长度的DNA片段，以便于后续可电泳分辨不同长度的片段。进而可对不同片段长度的DNA片段进行切胶回收，以便进行序列的测定。其中，序列测定所用的各个引物可参考上述内容。
第二方面，本发明提供了用于检测维生素D代谢基因突变的试剂盒，包括本发明提供的用于检测维生素D代谢基因突变的任一引物组。
进一步地，该试剂盒还包括PCR反应试剂；
所述PCR反应试剂包括DNA聚合酶、所述DNA聚合酶对应的PCR缓冲液、4种脱氧核糖核苷三磷酸dNTP的混合物和超纯水。
具体地，DNA聚合酶的用量为0.5-5U，以在保证脱氧核苷酸能够加到扩增模板上的同时，避免DNA聚合酶过量造成浪费、抑制PCR反应。
具体地，每种dNTP的终浓度为50-500μM，所述引物组中每条引物的终浓度为20-300nM，且所述的每种引物的使用浓度均为10μM。
针对DNA聚合酶的用量来说，0.5-5U是指在0.5U到5U范围内的任一用量值，比如，0.5U、1U、1.5U、2U、2.5U、3U、3.5U、4U、4.5U以及5U。
针对每种dNTP的终浓度来说，50-500μM是指50μM到500μM范围内的任一浓度，比如，50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM以及500μM。
针对引物组中每条引物的终浓度来说，20-300nM是指20nM到300nM范围内的任一浓度，比如，20nM、50nM、80nM、120nM、150nM、180nM、210nM、240nM、270nM以及300nM。
具体地，所述DNA聚合酶，包括：LA Taq聚合酶、KOD FX聚合酶、KOD Plus聚合酶或者r Taq聚合酶。PCR缓冲液即为与所选的DNA聚合酶相对应的浓缩缓冲液。其中，PCR缓冲液的浓缩程度可选用2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×或10×。
举例来说，选用KOD FX这一DNA聚合酶，且选用2×的浓缩缓冲液时，为配制上述多重PCR反应体系，体系中各个组分的用量可以为：DNA聚合酶0.5～3μl、PCR缓冲液10～30μl、各种dNTP的混合物5～25μl、10个引物对的混合物5-15μl、DNA 5～1000ng，以及适量超纯水，以补水至50μl，以及可以为按照相同比例配制的其他体积大小。
第三方面，本发明提供了维生素D代谢基因突变的检测方法，包括：利用本发明提供的用于检测维生素D代谢基因突变的任一引物组，或，利用本发明提供的用于检测维生素D代谢基因突变的任一试剂盒，检测维生素D代谢基因。
详细地，上述维生素D代谢基因突变检测方法可以包括以下步骤：
步骤1：从待测样本中提取DNA，作为扩增模板。
具体地，从待测样本中提取DNA的方式，包括：手工提取或试剂盒提取，再对提取DNA进行提取处理，得到DNA。
具体地，待测样本为含有人类DNA的血液、细胞、组织或口腔拭子的样本。
步骤2：配制包含本发明提供的用于扩增维生素D代谢基因突变的引物组和所述扩增模板的多重PCR反应体系。
步骤3：对所述多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物。
步骤4：电泳检测所述PCR产物，分辨所述PCR产物中各个扩增片段的大小。
详细地，可用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨不同长度的片段。
步骤5：对各个扩增片段进行切胶回收，以备用送检作序列测定。
需要说明的是，上述应用方法为非诊断目的的方法。
进一步地，所述扩增维生素D代谢基因的PCR反应试剂包括DNA聚合酶、所述DNA聚合酶对应的PCR缓冲液、4种脱氧核糖核苷三磷酸dNTP的混合物和超纯水；
具体地，DNA聚合酶的用量为0.5-5U，每种dNTP的终浓度为50-500μM，所述引物组中每条引物的终浓度为20-300nM，且所述的每种引物的使用浓度均为10μM。
具体地，所述PCR反应试剂包括：DNA聚合酶0.5～3μl、PCR缓冲液10～30μl、各种dNTP的混合物5～25μl、10个引物对的混合物5-15μl、DNA5～1000ng，以及适量超纯水，以补水至50μl，且所述引物组中每种引物对的使用浓度均为10μM。
详细地，反应体系可以等比例的放大或缩小。此外，更换其他DNA聚合酶系时，经过适当比例调整也可以达到扩增目的。
进一步地，所述维生素D代谢基因扩增的PCR反应程序包括：①90-96℃1-10min；②90-98℃5-40s，50-68℃10-60s，67-72℃10s-5min，共25-45个循环；③68-72℃0-30min；④2-10℃保存。
举例来说，对于90-96℃，可以为90℃、92℃、94℃或96℃，对于1-10min，可以为1min、3min、6min、9min或10min；对于90-98℃，可以为90℃、92℃、94℃、96℃或98℃，对于5-40s，可以为5s、10s、15s、20s、25s、30s、35s或40s；对于50-68℃，可以为50℃、53℃、56℃、59℃、62℃、66℃或68℃，对于10-60s，可以为10s、20s、30s、40s、50s或60s；对于67-72℃，可以为67℃、69℃、71℃或72℃，对于10s-5min，可以为10s、30s、1min、2min、3min、4min或5min；对于20-45个循环，可以为20个、25个、30个、35个、40个或45个；对于68-72℃，可以为68℃、70℃或72℃，对于0-30min，可以为0min、5min、10min、15min、20min、25min或30min；对于2-10℃，可以为2℃、4℃、6℃、8℃或10℃。
本发明提供了用于检测维生素D代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法，该引物组包括10种引物对，可通过一次反应对维生素D代谢基因CYP24A1、CYP27B1和VDR进行基因突变检测。与普通PCR相比，普通PCR每个反应通常只针对一个或几个位点，或只针对一个外显子或一个核酸片段，本发明对维生素D代谢基因进行扩增时，可以通过一次反应对3个维生素D代谢基因的共计22种高频突变位点进行扩增，且可同时检测90多例样本。此外，本发明对维生素D代谢基因进行扩增时，相应减少了DNA聚合酶、dNTP等试剂和耗材的使用量，可大幅度降低检测成本。可见，本发明用于维生素D代谢基因突变检测时，不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图2是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对c.943G>T位点的部分；
图3是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对c.428_430delAAG位点的部分；
图4是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对c.1186C>T位点的部分；
图5是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对c.2T>C p.Met1Thr/rs2228570位点的部分；
图6是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对c.2T>C p.Met1Thr/rs2228570位点的部分；
图7是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对c.2T>C p.Met1Thr/rs2228570位点的部分。
具体实施方式
非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
设计并合成引物组，包括以下步骤：
步骤1.1：根据维生素D代谢基因CYP24A1、CYP27B1和VDR这3个目的基因所对应的共22种高频突变位点及其上下游序列，设计特异性扩增维生素D代谢基因高频突变位点所在外显子或内含子区域的上下游引物。
其中，这22种高频突变位点如上述表1所示。
对于设计引物，采用Primer Quest和Primer Premier 5.0对引物进行设计及二聚体、茎环错配分析，在包含突变位点的两端设计引物，各对引物的退火温度基本保持一致。
由于小的序列变化导致引物扩增效率显著降低、特异性变差，本发明实施例分别针对不同位点来设计多重PCR引物组。在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和位点包含情况，本发明实施例选取了如下述表2所示的扩增效果相对最佳的扩增用引物组。该引物组覆盖了CYP24A1、CYP27B1和VDR这3个基因及其中的共计22种高频突变位点及其上下游序列。
表2
序列编号 引物名称 5’-3’
SEQ ID NO.1 MP-VD-1F CAGGTGGAGTACCACAAGAAGT
SEQ ID NO.2 MP-VD-1R TTTCCGTGGACCGACTCTAATC
SEQ ID NO.3 MP-VD-2F GCAAGAAGGAGTTTGGACTGAGGT
SEQ ID NO.4 MP-VD-2R GGCAGACCGTTCATTTAGCAAACTC
SEQ ID NO.5 MP-VD-3F GCCTCTTTGAGTATGCACTTGG
SEQ ID NO.6 MP-VD-3R GCAGTTGAAGCTCTGCTAATCG
SEQ ID NO.7 MP-VD-4F CAAGTACGCCTCCAGAGTGTTC
SEQ ID NO.8 MP-VD-4R TCCCGCGCACTTGTACTTTATC
SEQ ID NO.9 MP-VD-5F GTATCCAAGTGTCCGCTGTGTC
SEQ ID NO.10 MP-VD-5R CTCGACCTGTGCCTTACCAAAT
SEQ ID NO.11 MP-VD-6F GAGCGAGGTATTCACGTGCCTT
SEQ ID NO.12 MP-VD-6R AGCCCTTCCTTGGCATTTCCTC
SEQ ID NO.13 MP-VD-7F TAGTGGATGGAAGCAGGGAGATAG
SEQ ID NO.14 MP-VD-7R CCTCAGGCCATCCAGCATTATTAG
SEQ ID NO.15 MP-VD-8F GACTCACATGACTCAGAAGGAC
SEQ ID NO.16 MP-VD-8R GAAGATACCACTCACCAAGACC
SEQ ID NO.17 MP-VD-9F CAGAAGACAGGTCTCCGTGATG
SEQ ID NO.18 MP-VD-9R CCAGGAGTAGAAGGGACTCTTG
SEQ ID NO.19 MP-VD-10F GCAAGCTCCTCGATGAAAG
SEQ ID NO.20 MP-VD-10R GTAGGTATTTCCTTATCTGTGTCTC
步骤1.2：合成步骤1.1中设计好的扩增用引物组。
步骤1.3：根据维生素D代谢基因CYP24A1、CYP27B1和VDR这3个目的基因所对应的共22种高频突变位点及其上下游序列，以及根据设计的扩增用引物，设计测序用引物。
设计的测序用引物如下述表3所示。
表3
序列编号 引物名称 5’-3’
SEQ ID NO.1 MP-VD-1F CAGGTGGAGTACCACAAGAAGT
SEQ ID NO.3 MP-VD-2F GCAAGAAGGAGTTTGGACTGAGGT
SEQ ID NO.5 MP-VD-3F GCCTCTTTGAGTATGCACTTGG
SEQ ID NO.7 MP-VD-4F CAAGTACGCCTCCAGAGTGTTC
SEQ ID NO.21 MP-1237-CX-01-F GGAACCCTGAACAACGTAGTCT
SEQ ID NO.22 MP-1237-CX-02-R AACCTGAGTGTGGGTGAAGCAG
SEQ ID NO.11 MP-VD-6F GAGCGAGGTATTCACGTGCCTT
SEQ ID NO.23 MP-1472-CX-01-F GGAGATCCTTCCAAAAGTAGC
SEQ ID NO.24 MP-1472-CX-02-R GCTACTTTTGGAAGGATCTCC
SEQ ID NO.25 MP-1028-CX-02-F AATCATGTATGAGGGCTCCGAAG
SEQ ID NO.17 MP-VD-9F CAGAAGACAGGTCTCCGTGATG
SEQ ID NO.19 MP-VD-10F GCAAGCTCCTCGATGAAAG
步骤1.4：合成步骤1.3中设计好的测序用引物组。
实施例2
从待测样本中提取DNA，包括如下步骤：
步骤2.1：待测样本可以为：用口腔拭子从人体收集口腔脱落细胞，或从人体采集的新鲜外周血等含有人类DNA的生物样本。
步骤2.2：具体地，采用天根口腔拭子DNA提取试剂盒(DP322)，或，采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，从样本中提取DNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度，保存DNA。
实施例3
扩增维生素D代谢基因突变的方法，包括以下步骤：
步骤3.1：以步骤2.2中所得的DNA为扩增模板，并采用步骤1.2中合成的扩增用引物组，来配制多重PCR反应体系。
本发明实施例采用东洋纺(TOYOBO)公司KOD FX酶系(货号：KFX-101)中的DNA聚合酶及缓冲液为基本原料，在酶系说明书中扩增体系的基础上，通过调整引物浓度、dNTP浓度、缓冲液浓度、酶用量，来配制多重PCR扩增体系。这一反应体系的具体组成如下述表4所示。当然，反应体系等比例放大/缩小均在本发明实施例的保护范围内；更换其他DNA聚合酶系，经过适当比例调整也可以达到扩增目的。
表4
试剂成分 体积
2×PCR buffer for FX 24μl
2mM dNTP 11μl
Primer Mix(每种引物对10μM) 7μl
KOD FX(1U/μl) 1μl
基因组DNA 20ng
水 补至50μl
表4中，Primer Mix即10种引物对的混合物。
步骤3.2：按照下述表5所示的多重PCR反应条件，设置PCR仪器的程序。
表5
Figure BDA0002476697980000141
步骤3.3：利用程序设好的PCR仪器，对步骤3.1中配制的多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物。
多重PCR扩增反应结束后，电泳检测PCR产物，分辨及验证PCR产物中的各个扩增片段。
实施例4
电泳检测，包括以下步骤：
步骤4.1：琼脂糖凝胶电泳检测步骤3.3中得到的PCR产物。
琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，图1中所示出的LXJ、LCF、RJJ等主要用于区分不同的待测样本，图1的最左侧列展示了标尺条，最右侧列展示了空白对照组的PCR产物的电泳结果，中间各列展示了不同样本的PCR产物的电泳检测结果。
请参考图1，根据各个PCR产物亮带所在位置与左侧标尺条的对比，可以识别出各个产物亮带所对应的是哪一引物对所对应的扩增产物，进而获知各个产物亮带所对应的是哪一或哪些位点所对应的扩增产物。
请参考图1，图1中自上向下的10条亮带，通常是分别对应于如上所述的第七引物对、第五引物对、第八引物对、第三引物对、第十引物对、第六引物对、第九引物对、第四引物对、第一引物对、第二引物对的PCR扩增产物。
请参考图1，根据空白组的电泳结果可知，环境因素对待测样本的电泳检测结果无不良影响。根据各个待测样本的电泳结果可知，存在的10个亮带分别对应于根据维生素D代谢基因CYP24A1、CYP27B1和VDR的22种高频突变位点所设计出的10种引物对，分别为这10种引物对所对应的PCR扩增产物，亮带数量、各亮带所对应扩增片段的大小均与理论保持一致；10个亮带清晰且间隔明显，不同亮带间无重叠、无拖影等，亮带效果良好。如此，可以说明利用步骤1.1中设计的引物组进行PCR扩增时，仅生成了预期的目标产物，而未生成其他无关产物，引物组设计合理。
步骤4.2：分辨各个PCR扩增产物片段，并验证各个PCR扩增产物片段的大小正确后，对不同片段的PCR扩增产物进行切胶回收，以备作序列测定。
实施例5
序列测定，包括以下步骤：
步骤5.1：提供步骤1.4中合成的测序用引物组，并将步骤4.2中切胶回收到的不同片段的PCR扩增产物，送至测序公司(北京诺赛基因组研究中心有限公司)进行序列测定，得到.ab1格式的测序结果。
步骤5.2：通过Chromas序列分析软件分析步骤5.1中得到的测序结果，获得维生素D代谢基因CYP24A1、CYP27B1和VDR这3个目的基因中，22种高频突变位点的基因突变情况。
部分测序结果如图2-7所示。
请参考图2，测序图谱中波峰与波谷清晰，峰与峰之间距离均匀，底部没有杂峰干扰，说明测序引物测得的效果良好。同时，图2示出了c.943G>T位点及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图2中的框线部分，可知c.943处的碱基为G，而不是T，即在该位点处未发生基因突变。
请参考图3，测序图谱中波峰与波谷清晰，峰与峰之间距离均匀，底部没有杂峰干扰，说明测序引物测得的效果良好。同时，图3示出了c.428_430delAAG位点及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图3中的框线部分，可知c.428_430处的碱基为AAG，未缺失，即在该位点处未发生基因突变。
请参考图4，测序图谱中波峰与波谷清晰，峰与峰之间距离均匀，底部没有杂峰干扰，说明测序引物测得的效果良好。同时，图4示出了c.1186C>T位点及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图4中的框线部分，可知c.1186处的碱基为C，而不是T，即在该位点处未发生基因突变。
请参考图5，测序图谱中波峰与波谷清晰，峰与峰之间距离均匀，底部没有杂峰干扰，说明测序引物测得的效果良好。同时，图5示出了c.2T>C p.Met1Thr/rs2228570位点及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图5中的框线部分，可知c.2处既有碱基为C的峰也有碱基为T的峰，即在该位点处发生杂合基因突变。
请参考图6，测序图谱中波峰与波谷清晰，峰与峰之间距离均匀，底部没有杂峰干扰，说明测序引物测得的效果良好。同时，图6示出了c.2T>C p.Met1Thr/rs2228570位点及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图6中的框线部分，可知c.2处仅有碱基为T的峰而无碱基为C的峰，即在该位点处未发生基因突变。
请参考图7，测序图谱中波峰与波谷清晰，峰与峰之间距离均匀，底部没有杂峰干扰，说明测序引物测得的效果良好。同时，图7示出了c.2T>Cp.Met1Thr/rs2228570位点及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图7中的框线部分，可知c.2处仅有碱基为C的峰而无碱基为T的峰，即在该位点处发生纯合基因突变。
此外，通过比较普通PCR测序方法和本发明实施例提供的这一多重PCR测序方法，发现两种方法所获得的结果一致，本发明实施例所提供的检测方案具有较好的特异性和适用性。
实施例6
一种试剂盒，该试剂盒包括PCR反应试剂和引物组。该PCR反应试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和超纯水，具体成分如上述表4所示；该引物组包括如上述表2中所示出的10种引物对，具体成分如上述表4。该试剂盒适用于扩增5-1000ng的DNA。
该试剂盒可用于对维生素D代谢基因的检测应用中。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京和合医学诊断技术股份有限公司
<120> 用于检测维生素D代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法
<130> 2020.01.06
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1第2号外显子区域的上游引物
<400> 1
caggtggagt accacaagaa gt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1第2号外显子区域的下游引物
<400> 2
tttccgtgga ccgactctaa tc 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1第7号外显子区域的上游引物
<400> 3
gcaagaagga gtttggactg aggt 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1第7号外显子区域的下游引物
<400> 4
ggcagaccgt tcatttagca aactc 25
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1第9号外显子区域的上游引物
<400> 5
gcctctttga gtatgcactt gg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1第9号外显子区域的下游引物
<400> 6
gcagttgaag ctctgctaat cg 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1第1号外显子和第1号内含子区域的上游引物
<400> 7
caagtacgcc tccagagtgt tc 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1第1号外显子和第1号内含子区域的下游引物
<400> 8
tcccgcgcac ttgtacttta tc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1第2-4号外显子区域的上游引物
<400> 9
gtatccaagt gtccgctgtg tc 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1第2-4号外显子区域的下游引物
<400> 10
ctcgacctgt gccttaccaa at 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1第5-6号外显子区域的上游引物
<400> 11
gagcgaggta ttcacgtgcc tt 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1第5-6号外显子区域的下游引物
<400> 12
agcccttcct tggcatttcc tc 22
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1第7号内含子以及第7-8号外显子区域的上游引物
<400> 13
tagtggatgg aagcagggag atag 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1第7号内含子以及第7-8号外显子区域的下游引物
<400> 14
cctcaggcca tccagcatta ttag 24
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因VDR第1号外显子区域的上游引物
<400> 15
gactcacatg actcagaagg ac 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因VDR第1号外显子区域的下游引物
<400> 16
gaagatacca ctcaccaaga cc 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因VDR第2号外显子区域的上游引物
<400> 17
cagaagacag gtctccgtga tg 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因VDR第2号外显子区域的下游引物
<400> 18
ccaggagtag aagggactct tg 22
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因VDR第6号外显子区域的上游引物
<400> 19
gcaagctcct cgatgaaag 19
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增维生素D代谢基因VDR第6号外显子区域的下游引物
<400> 20
gtaggtattt ccttatctgt gtctc 25
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于维生素D代谢基因CYP27B1第2-4号外显子区域测序的上游引物
<400> 21
ggaaccctga acaacgtagt ct 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于维生素D代谢基因CYP27B1第2-4号外显子区域测序的下游引物
<400> 22
aacctgagtg tgggtgaagc ag 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于维生素D代谢基因CYP27B1第7号内含子以及第7-8号外显子区域测序的上游引物
<400> 23
ggagatcctt ccaaaagtag c 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于检测维生素D代谢基因CYP27B1第7号内含子以及第7-8号外显子区域测序的下游引物
<400> 24
gctacttttg gaaggatctc c 21
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于维生素D代谢基因VDR第1号外显子区域测序的上游引物
<400> 25
aatcatgtat gagggctccg aag 23

Claims (8)

1.用于检测维生素D代谢基因突变的引物组，其特征在于，包括下述10种引物对：
第一引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1的第2号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示；
第二引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1的第7号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.4所示；
第三引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP24A1的第9号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.6所示；
第四引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1的第1号外显子和第1号内含子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.8所示；
第五引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1的第2-4号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.10所示；
第六引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1的第5-6号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.11所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.12所示；
第七引物对，用于扩增维生素D代谢基因CYP27B1的第7号内含子以及第7-8号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.13所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.14所示；
第八引物对，用于扩增维生素D代谢基因VDR的第1号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.15所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.16所示；
第九引物对，用于扩增维生素D代谢基因VDR的第2号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.17所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.18所示；
第十引物对，用于扩增维生素D代谢基因VDR的第6号外显子区域，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.19所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.20所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测维生素D代谢基因突变的引物组，其特征在于，还包括：
第一测序引物，用于对所述第五引物对扩增出的产物片段进行测序，核苷酸序列由SEQID NO.21所示；
第二测序引物，也用于对所述第五引物对扩增出的产物片段进行测序，核苷酸序列由SEQ ID NO.22所示；
第三测序引物，用于对所述第七引物对扩增出的产物片段进行测序，核苷酸序列由SEQID NO.23所示；
第四测序引物，也用于对所述第七引物对扩增出的产物片段进行测序，核苷酸序列由SEQ ID NO.24所示；
第五测序引物，用于对所述第八引物对扩增出的产物片段进行测序，核苷酸序列由SEQID NO.25所示。
3.根据权利要求2所述的用于检测维生素D代谢基因突变的引物组，其特征在于，
所述第一引物对的上游引物，还用于对所述第一引物对扩增出的产物片段进行测序；
所述第二引物对的上游引物，还用于对所述第二引物对扩增出的产物片段进行测序；
所述第三引物对的上游引物，还用于对所述第三引物对扩增出的产物片段进行测序；
所述第四引物对的上游引物，还用于对所述第四引物对扩增出的产物片段进行测序；
所述第六引物对的上游引物，还用于对所述第六引物对扩增出的产物片段进行测序；
所述第九引物对的上游引物，还用于对所述第九引物对扩增出的产物片段进行测序；
所述第十引物对的上游引物，还用于对所述第十引物对扩增出的产物片段进行测序。
4.用于检测维生素D代谢基因突变的试剂盒，其特征在于，包括：如权利要求1至3中任一所述的用于检测维生素D代谢基因突变的引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应试剂；
所述PCR反应试剂包括DNA聚合酶、所述DNA聚合酶对应的PCR缓冲液、4种脱氧核糖核苷三磷酸dNTP的混合物和超纯水；
其中，所述DNA聚合酶，包括：LA Taq聚合酶、KOD FX聚合酶、KOD Plus聚合酶或者r Taq聚合酶；
其中，DNA聚合酶的用量为0.5-5U，每种dNTP的终浓度为50-500μM，所述引物组中每条引物的终浓度为20-300nM，且每种引物的使用浓度均为10μM；
其中，PCR缓冲液的浓缩程度可选用2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×或10×。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，
所述PCR反应试剂包括：PCR缓冲液10-30μl，各种dNTP的混合物5-25μl，DNA聚合酶0.5-3μl，10个引物对的混合物5-15μl，DNA 5～1000ng，以及适量超纯水，以补水至50μl，以及可以为按照相同比例配制的其他体积大小；
其中，所述10种引物对中每种引物对的使用浓度均为10μM。
7.维生素D代谢基因检测方法，其特征在于，利用如权利要求1至3中任一所述的用于检测维生素D代谢基因突变的引物组，或，利用如权利要求4至6中任一所述的用于检测维生素D代谢基因突变的试剂盒，检测维生素D代谢基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，扩增所述维生素D代谢基因的PCR反应程序包括：
90-96℃1-10min；90-98℃5-40s，50-68℃10-60s，67-72℃10s-5min，共25-45个循环；68-72℃0-30min；2-10℃保存。
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