CN110438209A - 维生素d代谢相关基因突变位点的检测方法 - Google Patents
维生素d代谢相关基因突变位点的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110438209A CN110438209A CN201910335119.7A CN201910335119A CN110438209A CN 110438209 A CN110438209 A CN 110438209A CN 201910335119 A CN201910335119 A CN 201910335119A CN 110438209 A CN110438209 A CN 110438209A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- single base
- vitamin
- base extension
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物医学领域,解决了单向单碱基延伸难以对变异位点进行精确确定,公开了一种维生素D代谢相关基因突变位点的检测方法,通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段,然后再利用单碱基延伸技术对所述目标片段进行双向延伸,得到等待检测基因位点,最后通过核酸质谱分析等待检测基因位点精确测定目标DNA序列;其中,所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物对所述目标片段进行双向延伸;旨在通过双向单碱基延伸的技术,对维生素D吸收相关基因进行变异检查,从而为个体临床用药提供安全指导。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域,特别涉及一种维生素D代谢相关基因突变位点的检测方法。
背景技术
基因组学研究表明,维生素D在体内的吸收效果与VDR基因的表型密切相关。VDR基因的扩增片段分别为VDR-1、VDR-2以及VDR-3;因此,检测相关基因的变异情况,能有效帮助人们合理饮食,保证营养平衡。
目前市场上的相关核酸质谱检测技术均是采用单向单碱基延伸技术来进行的。而单向单碱基延伸难以对变异位点进行精确确定。
本发明旨在通过双向单碱基延伸的技术,对维生素D代谢相关基因进行变异检查,从而为个体临床用药提供安全指导。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足,提供一种维生素D代谢相关基因突变位点的检测方法和检测试剂盒。
本发明采用的技术方案是:一种维生素D代谢相关基因突变位点的检测方法,通过设计的目标位点特异性引物组的单管多重PCR扩增反应得到目标片段,然后再利用单碱基延伸技术对所述目标位点特异性引物组进行双向延伸,得到等待检测基因位点,最后通过核酸质谱分析等待检测基因位点精确测定目标DNA核苷酸序列;
其中,所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸。
优选地,所述目标位点特异性引物组包括:
用于扩增维生素D代谢相关基因VDR-1片段的特异性引物,该特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,该特异性引物的反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示;
用于扩增维生素D代谢相关基因VDR-2片段的特异性引物,该特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos.3所示,该特异性引物的反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示;
用于扩增维生素D代谢相关基因VDR-3片段的特异性引物,该特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,该特异性引物的反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。
优选地,所述单碱基延伸引物组包括:
用于扩增维生素D代谢相关基因VDR-1片段的单碱基延伸引物,该单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示;
用于扩增维生素D代谢相关基因VDR-2片段的单碱基延伸引物,单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示;
用于扩增维生素D代谢相关基因VDR-3片段的单碱基延伸引物,单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
优选地,所述单管多重PCR扩增的反应程序为:95℃2分钟,95℃30秒,56℃20秒,72℃60秒,45循环,72℃5分钟,4℃保存。
本发明的有益效果是:
通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段,然后再利用单碱基延伸技术,通过双向延伸,得到等待检测基因位点,最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA核苷酸序列;
本发明旨在通过双向单碱基延伸的技术,对维生素D代谢相关基因进行变异检查,从而为个体临床用药提供安全指导。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明的一种维生素D代谢相关基因突变位点的检测方法,包括以下步骤:
1)提取样本DNA,
1,将离心管中的样品10000rpm离心2min,去除上清液,留沉淀备用。
2、向上述离心管中加入350μl Buffer MCL(MCL缓冲液)和20μl Proteinase K(蛋白酶K),震荡混匀,65℃水浴20min,间或混匀。
3、水浴完成之后向离心管中加入350μl Buffer MA(MA缓冲液)和25μl SanMagBeads(吸附性磁珠),振荡或者颠倒混匀,室温静置3min,间或混匀。
4、将离心管置于磁力架上30s,待SanMag Beads完全吸至管壁之后,吸弃上清,从磁力架上取出离心管。
5、向离心管中加入700μl 70%乙醇,吸打或者点振混匀,将离心管置于磁力架上30s,吸弃上清,从磁力架上取出离心管。
6、重复步骤5一次,室温开盖干燥10min至管内无液体残留。
7、向离心管中加入50μl TE Buffer(TE缓冲液)(pH8.0),间或混匀。
8、取出离心管并置于磁力架上30s,待SanMag Beads完全吸至管壁上之后,小心吸取上清至新的离心管,即获得基因组DNA。
涉及到主要试剂耗材:DNA抽提试剂盒(上面用到的所有试剂都是这个试剂盒里面的)(Order NO.B518766)、移液器(步骤2、3、4、5、6、7、8)、枪头(步骤2、3、4、5、6、7、8)、小型离心机(步骤1)、磁力架(步骤4、5、8),涡旋震荡器(步骤2、3、5、6、7)。
2)设计出特异性引物,
NCBI网站上查询并下载该基因核苷酸序列信息,在待测的位点的上下游选取20nt的特异性核苷酸序列作为扩增引物。设计原则是:包含待测位点的DNA片段长度100bp-300bp均可,避免发夹结构和重复核苷酸序列。设计完成以后,在引物5'端加入一段固定核苷酸序列ACGTTGGATG。
3)设计出单碱基延伸引物,
单碱基延伸引物的设计同样是在该基因核苷酸序列上设计,选择待测碱基位点上游和下游紧临的碱基,并根据质谱检测范围(4000道尔盾-9000道尔盾),设计引物长度,设计原则:引物扩增的第一个碱基即为待测碱基,而且避免发夹结构和重复核苷酸序列。
4)核酸质谱分析,
1、配制1μM(每个引物)PCR引物混合物,里面包含多重反应里每个SNP位点的forward(正向)和reverse(反向)引物。
2、以2ml、管配制PCR混液,DNA样本和对照不要加在其中。
3、加入2ul DNA样本,漩涡振荡器混匀,贴上封口膜。
4、将96孔板放上PCR仪进行以下热循环:95℃2分钟,95℃30秒,56℃30秒,72℃60秒,45个循环,72℃5分钟,4℃保温。
5、将各个位点的延伸引物稀释到100Um,计算在体系中的比例,配制iPLEX延伸引物混液。
6、在1.5mL管中配制iPLEX延伸混液。
7、每一个孔加入2μl iPLEX延伸混液并混好。
8、把板用膜封好,涡旋震荡和离心(4000rpm 5秒)。
9、将96孔板放上PCR仪进行以下热循环:
10、在样本板的每一个有样本的孔里加入41ul水然后离心。
11、将96孔板放入质谱仪,打开点样程序,进行自动点样操作。
12、打开飞行质谱软件,设置好参数,进行检测。
13、检测介绍后,在软件中自动生成结果,导出即可。
涉及到主要试剂耗材:96孔PCR板的离心机(步骤3、8、10)、涡旋震荡器(步骤3、8)、PCR仪(thermo)(步骤4、9)、MassARRAY质谱仪(agena)(步骤11、12、13)、PCR试剂盒(AgenaBioscience货号:11327)(步骤2)、单碱基延伸试剂盒(Agena Bioscience货号:10165)(步骤6)、移液器(步骤1、2、3、5、6、7、10)、枪头(步骤1、2、3、5、6、7、10)、96孔板(步骤2、3、4、7、8、9、10、11)、封口膜(步骤3、8)。
表1为特异性引物的核苷酸序列表;表2为单碱基延伸引物核苷酸序列表;
表1.特异性引物核苷酸序列表
表2.单碱基延伸引物核苷酸序列表
扩增片段 | 引物名称 | 核苷酸序列号 | 5'-3' |
VDR-1 | VDR-1-E | SEQ ID No.7 | GGATTGAGCAGTGAGG |
VDR-2 | VDR-2-E | SEQ ID No.8 | GCCTGAGTATTGGGAATG |
VDR-3 | VDR-3-E | SEQ ID No.9 | GGCTTCTTGCTGTTCTTACAGGGA |
序列表
<110> 杭州云鼎基因生物科技有限公司
<120> 维生素D代谢相关基因突变位点的检测方法和检测试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)VDR-1的正向引物
<400> 1
acgttggatg tgccgttgag tgtctgtgtg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)VDR-1的反向引物
<400> 2
acgttggatg tagagaagaa ggcacaggag 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)VDR-2的正向引物
<400> 3
acgttggatg agagcagagc ctgagtattg 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)VDR-2的反向引物
<400> 4
acgttggatg gaggaactag ataagcaggg 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)VDR-3的正向引物
<400> 5
acgttggatg tggcctgctt gctgttctta 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)VDR-3的反向引物
<400> 6
acgttggatg acgttccggt caaagtctcc 30
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)VDR-1的单碱基延伸引物
<400> 7
ggattgagca gtgagg 16
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)VDR-2的单碱基延伸引物
<400> 8
gcctgagtat tgggaatg 18
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)VDR-3的单碱基延伸引物
<400> 9
ggcttcttgc tgttcttaca ggga 24
Claims (4)
1.一种维生素D代谢相关基因突变位点的检测方法,其特征在于:通过设计的目标位点特异性引物组的单管多重PCR扩增反应得到目标片段,然后再利用单碱基延伸技术对所述目标位点特异性引物组进行双向延伸,得到等待检测基因位点,最后通过核酸质谱分析等待检测基因位点精确测定目标DNA核苷酸序列;
其中,所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸。
2.根据权利要求1所述的维生素D代谢相关基因突变位点的检测方法,其特征在于,所述目标位点特异性引物组包括:
用于扩增维生素D代谢相关基因VDR-1片段的特异性引物,该特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,该特异性引物的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;
用于扩增维生素D代谢相关基因VDR-2片段的特异性引物,该特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,该特异性引物的反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;
用于扩增维生素D代谢相关基因VDR-3片段的特异性引物,该特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,该特异性引物的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
3.根据权利要求1所述的人类维生素D代谢相关基因突变位点的检测方法,其特征在于,所述单碱基延伸引物组包括:
用于扩增维生素D代谢相关基因VDR-1片段的单碱基延伸引物,该单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示;
用于扩增维生素D代谢相关基因VDR-2片段的单碱基延伸引物,单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示;
用于扩增维生素D代谢相关基因VDR-3片段的单碱基延伸引物,单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
4.根据权利要求1所述的维生素D代谢相关基因突变位点的检测方法,其特征在于,所述单管多重PCR扩增的反应程序为:95℃2分钟,95℃30秒,56℃20秒,72℃60秒,45循环,72℃5分钟,4℃保存。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910335119.7A CN110438209A (zh) | 2019-04-24 | 2019-04-24 | 维生素d代谢相关基因突变位点的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910335119.7A CN110438209A (zh) | 2019-04-24 | 2019-04-24 | 维生素d代谢相关基因突变位点的检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110438209A true CN110438209A (zh) | 2019-11-12 |
Family
ID=68429093
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910335119.7A Pending CN110438209A (zh) | 2019-04-24 | 2019-04-24 | 维生素d代谢相关基因突变位点的检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110438209A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111363805A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-07-03 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 用于检测维生素d代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106282348A (zh) * | 2016-08-18 | 2017-01-04 | 杭州吉洛生物医药科技有限公司 | 一种用于人酒精、叶酸、vd代谢能力相关基因分型的试剂盒 |
CN106834478A (zh) * | 2017-02-24 | 2017-06-13 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | 利用质谱进行叶酸遗传代谢能力和钙吸收遗传检测 |
CN108977518A (zh) * | 2018-07-24 | 2018-12-11 | 为康(苏州)基因科技有限公司 | 一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法及检测试剂盒 |
-
2019
- 2019-04-24 CN CN201910335119.7A patent/CN110438209A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106282348A (zh) * | 2016-08-18 | 2017-01-04 | 杭州吉洛生物医药科技有限公司 | 一种用于人酒精、叶酸、vd代谢能力相关基因分型的试剂盒 |
CN106834478A (zh) * | 2017-02-24 | 2017-06-13 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | 利用质谱进行叶酸遗传代谢能力和钙吸收遗传检测 |
CN108977518A (zh) * | 2018-07-24 | 2018-12-11 | 为康(苏州)基因科技有限公司 | 一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法及检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MARTHA L. SLATTERY ET AL.: ""DIETARY CALCIUM, VITAMIN D, VDR GENOTYPES AND COLORECTAL CANCER"", 《INT. J. CANCER》 * |
翟静等: "《生物化学》", 31 August 2018, 江苏凤凰科学技术出版社 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111363805A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-07-03 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 用于检测维生素d代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法 |
CN111363805B (zh) * | 2020-04-30 | 2022-06-17 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 用于检测维生素d代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109880901A (zh) | 乳糖代谢相关基因突变位点的检测方法 | |
CN107660234A (zh) | 使用二代测序预测器官移植排斥的方法 | |
EP3283657A1 (en) | Quality assessment of circulating cell-free dna using multiplexed droplet digital pcr | |
Malentacchi et al. | Influence of pre-analytical procedures on genomic DNA integrity in blood samples: the SPIDIA experience | |
CN112469836A (zh) | 子宫内膜的miRNA容受性分析 | |
CN114085903A (zh) | 检测线粒体3243a>g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法 | |
CN110172502A (zh) | 一种人类血小板同种抗原基因分型的检测方法和检测试剂盒 | |
CN108265113A (zh) | Aldh2基因多态性检测试剂盒 | |
CN113025701A (zh) | 非酒精性脂肪性肝病易感基因的早筛方法及试剂盒 | |
Gou et al. | The colorimetric isothermal multiple-self-matching-initiated amplification using cresol red for rapid and sensitive detection of porcine circovirus 3 | |
CN105506156B (zh) | 诊断骨肉瘤的分子标志物 | |
CN105441565B (zh) | 作为骨肉瘤诊治靶标的miRNA | |
CN110438209A (zh) | 维生素d代谢相关基因突变位点的检测方法 | |
CN108753952A (zh) | 一种用于人类slc25a13基因10个常见突变位点的基因分型检测试剂盒 | |
CN110184335A (zh) | 维生素e代谢相关基因突变位点的检测方法 | |
CN103757122B (zh) | 基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-188-5p检测试剂盒及其检测方法 | |
CN112592972B (zh) | 弥漫性毒性甲状腺肿易感基因的早筛方法及试剂盒 | |
Bavykin | Circulating microRNAs in the identification of biological fluids: A new approach to standardization of expression-based diagnostics | |
CN113025702B (zh) | 强直性脊柱炎易感基因的早筛方法及试剂盒 | |
CN108546753A (zh) | 巴氯芬药物相关基因gabbr1基因多态性检测试剂盒 | |
CN109988831A (zh) | 叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法 | |
CN110042158A (zh) | 铁元素吸收相关基因突变位点的检测方法 | |
WO2020218554A1 (ja) | デジタル体細胞変異解析 | |
CN113817870A (zh) | 同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用 | |
CN110343743A (zh) | 用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组、试剂、试剂盒、应用和鉴定方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191112 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |