CN108977518A - 一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，包括以下步骤：提取样本DNA；设计用于扩增叶酸代谢相关基因片段的特异性引物；利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段；设计用于叶酸代谢相关基因片段的单碱基延伸引物；叶酸代谢相关基因片段单碱基延伸；核酸质谱分析测量目标DNA序列，能够有效地对结直肠癌患者展开叶酸相关代谢基因突变筛查，帮助个体充分了解自己的遗传状况，为此类患者开展个性化精准诊治奠定临床及科研基础。本发明还涉及一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测试剂盒。

Description

一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学领域，尤其是涉及一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
参与叶酸代谢最重要的三个基因是亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)和甲硫氨酸合成酶(MTR)。研究发现，MTHFR的活性与C677T和A1298C基因位点有关；MTRR的活性与A66G基因位点有关；MTR活性与A2756G基因位点有关。当基因位点发生突变时就会导致MTHFR、MTRR和MTR活性下降，进而引起叶酸利用能力不足。
中国人群中存在一定比例的风险型基因——78％的国人存在叶酸利用能力相关基因突变，导致不同人对叶酸的利用能力不同，所以叶酸补充需要个性化。
因缺乏精准的、高通量的基因突变筛查技术，进而阻碍了精准治疗药物的研发及临床研究。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法和检测试剂盒。
本发明的目的采用以下技术方案实现：
一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，包括以下步骤：提取样本DNA；设计用于扩增叶酸代谢相关基因片段的特异性引物；利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段；设计用于叶酸代谢相关基因片段的单碱基延伸引物；叶酸代谢相关基因片段单碱基延伸；核酸质谱分析测量所述目标DNA序列。
进一步地，所述叶酸代谢相关基因片段包括MTHFR-1片段、MTHFR-2片段、MTRR片段、MTR片段。
进一步地，所述用于扩增叶酸代谢相关基因片段的特异性引物包括：用于扩增所述MTHFR-1片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：1，反向引物为SEQ ID Nos：2；用于扩增所述MTHFR-2片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：3，反向引物为SEQ ID Nos：4；用于扩增所述MTRR片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：5，反向引物为SEQ IDNos：6；用于扩增所述MTR片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：7，反向引物为SEQID Nos：8。
进一步地，所述用于叶酸代谢相关基因片段的单碱基延伸引物包括：用于所述MTHFR-1片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：61；用于所述MTHFR-2片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：62；用于所述MTRR片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：61；用于所述MTR片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：61。
进一步地，所述利用单管多重PCR扩增反应包括以下步骤：Taq酶激活，DNA变性。
进一步地，所述Taq酶激活时温度为95℃。
进一步地，所述Taq酶激活时间为15分钟。
进一步地，所述DNA变性时温度为95℃。
进一步地，DNA变性时间为15秒。
一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测试剂盒，包括：用于扩增叶酸代谢相关基因片段的特异性引物，所述特异性引物包括SEQ ID Nos：1、SEQ ID Nos：2、SEQ ID Nos：3、SEQ ID Nos：4、SEQ ID Nos：5、SEQ ID Nos：6、SEQ ID Nos：7、SEQ ID Nos：8；用于叶酸代谢相关基因片段的单碱基延伸引物，所述单碱基延伸引物包括SEQ ID Nos：61、SEQ ID Nos：62。
相比现有技术，本发明通过设计特异性引物扩增叶酸代谢相关基因片段，设计单碱基延伸引物使叶酸代谢相关基因片段的单碱基延伸，再通过核酸质谱分析测量目标DNA序列，能够有效地对结直肠癌患者展开叶酸相关代谢基因突变筛查，帮助个体充分了解自己的遗传状况，为此类患者开展个性化精准诊治奠定临床及科研基础。
附图说明
图1为本发明一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，当组件被称为“固定于”另一个组件，它可以直接在另一个组件上或者也可以存在居中的组件。当一个组件被认为是“连接”另一个组件，它可以是直接连接到另一个组件或者可能同时存在居中组件。当一个组件被认为是“设置于”另一个组件，它可以是直接设置在另一个组件上或者可能同时存在居中组件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
请参阅图1，本发明涉及一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，包括以下步骤：提取样本DNA；设计用于扩增叶酸代谢相关基因片段的特异性引物；利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段；设计用于叶酸代谢相关基因片段的单碱基延伸引物；叶酸代谢相关基因片段单碱基延伸；核酸质谱分析测量所述目标DNA序列。
叶酸代谢相关基因片段包括MTHFR-1片段、MTHFR-2片段、MTRR片段、MTR片段。
用于扩增叶酸代谢相关基因片段的特异性引物包括：用于扩增所述MTHFR-1片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：1，反向引物为SEQ ID Nos：2；用于扩增所述MTHFR-2片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：3，反向引物为SEQ ID Nos：4；用于扩增所述MTRR片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：5，反向引物为SEQ ID Nos：6；用于扩增所述MTR片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：7，反向引物为SEQ ID Nos：8。
MTHFR-1基因的正向引物SEQ ID Nos：1的序列为：TTGAACGTGTGATTGGCAGAAAC，
MTHFR-1基因的反向引物SEQ ID Nos：2的序列为：GGAATGAGATAGTTTCTG，
MTHFR-2基因的正向引物SEQ ID Nos：3的序列为：TCTCCCTCATGACGCTGCGGAA，
MTHFR-2基因的反向引物SEQ ID Nos：4的序列为：ATATGGAGTAGGGTCACCCACCC，
MTRR基因的正向引物SEQ ID Nos：5的序列为：TGATGGGCACTTGGATTACTTTCAC，
MTRR基因的反向引物SEQ ID Nos：6的序列为：TAACCAGGCGTGGTGGGTTCTTC，
MTR基因的正向引物SEQ ID Nos：7的序列为：CAATGGACATGAACAACCCT，
MTR基因的反向引物SEQ ID Nos：8的序列为：ACTGATTGACCAGTTAAACATC。
用于叶酸代谢相关基因片段的单碱基延伸引物包括：用于所述MTHFR-1片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：61；用于所述MTHFR-2片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：62；用于所述MTRR片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：61；用于所述MTR片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：61。
MTHFR-1基因的单碱基延伸引物SEQ ID Nos：61的序列为：ACGTTGGATGTCTTCATGAAGACCTCACAG，
MTHFR-2基因的单碱基延伸引物SEQ ID Nos：62的序列为：ACGTTGGATGCCACTAAATCGAGATTTCAC，
MTRR基因的单碱基延伸引物SEQ ID Nos：61的序列为：ACGTTGGATGTCTTCATGAAGACCTCACAG，
MTR基因的单碱基延伸引物SEQ ID Nos：61的序列为：ACGTTGGATGTCTTCATGAAGACCTCACAG。
利用单管多重PCR扩增反应包括以下步骤：Taq酶激活，DNA变性。Taq酶激活时温度为95℃。Taq酶激活时间为15分钟。DNA变性时温度为95℃。DNA变性时间为15秒。
下表为叶酸代谢相关基因片段的引物序列表
本发明还涉及上述叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法中使用的一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测试剂盒，包括：用于扩增叶酸代谢相关基因片段的特异性引物，所述特异性引物包括SEQ ID Nos：1、SEQ ID Nos：2、SEQ ID Nos：3、SEQ ID Nos：4、SEQ IDNos：5、SEQ ID Nos：6、SEQ ID Nos：7、SEQ ID Nos：8；用于叶酸代谢相关基因片段的单碱基延伸引物，所述单碱基延伸引物包括SEQ ID Nos：61、SEQ ID Nos：62。
本发明通过设计特异性引物扩增叶酸代谢相关基因片段，设计单碱基延伸引物使叶酸代谢相关基因片段的单碱基延伸，再通过核酸质谱分析测量目标DNA序列，能够有效地对结直肠癌患者展开叶酸相关代谢基因突变筛查，帮助个体充分了解自己的遗传状况，为此类患者开展个性化精准诊治奠定临床及科研基础。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取样本DNA；
设计用于扩增叶酸代谢相关基因片段的特异性引物；
利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段；
设计用于叶酸代谢相关基因片段的单碱基延伸引物；
叶酸代谢相关基因片段单碱基延伸；
核酸质谱分析测量所述目标DNA序列。
2.根据权利要求1所述的叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于：所述叶酸代谢相关基因片段包括MTHFR-1片段、MTHFR-2片段、MTRR片段、MTR片段。
3.根据权利要求2所述的叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于：所述用于扩增叶酸代谢相关基因片段的特异性引物包括：
用于扩增所述MTHFR-1片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：1，反向引物为SEQID Nos：2；
用于扩增所述MTHFR-2片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：3，反向引物为SEQID Nos：4；
用于扩增所述MTRR片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：5，反向引物为SEQ IDNos：6；
用于扩增所述MTR片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：7，反向引物为SEQ IDNos：8。
4.根据权利要求2所述的叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于：所述用于叶酸代谢相关基因片段的单碱基延伸引物包括：
用于所述MTHFR-1片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：61；
用于所述MTHFR-2片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：62；
用于所述MTRR片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：61；
用于所述MTR片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：61。
5.根据权利要求1所述的叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于：所述利用单管多重PCR扩增反应包括以下步骤：Taq酶激活，DNA变性。
6.根据权利要求5所述的叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于：所述Taq酶激活时温度为95℃。
7.根据权利要求5所述的叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于：所述Taq酶激活时间为15分钟。
8.根据权利要求5所述的叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于：所述DNA变性时温度为95℃。
9.根据权利要求5所述的叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于：DNA变性时间为15秒。
10.一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测试剂盒，其特征在于，包括：
用于扩增叶酸代谢相关基因片段的特异性引物，所述特异性引物包括SEQ ID Nos：1、SEQ ID Nos：2、SEQ ID Nos：3、SEQ ID Nos：4、SEQ ID Nos：5、SEQ ID Nos：6、SEQ ID Nos：7、SEQ ID Nos：8；
用于叶酸代谢相关基因片段的单碱基延伸引物，所述单碱基延伸引物包括SEQ IDNos：61、SEQ ID Nos：62。
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