CN105087570B - 一种环状rna人工过表达框架及其表达载体及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环状RNA人工过表达框架，其具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。本发明构建的环状RNA人工过表达框架能够有效地过表达环状RNA。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种环状RNA人工过表达框架及其表达载体和构建方法。
背景技术
生物体内的环状RNA(Circular RNA)是一类具有特殊功能的RNA分子，而且是客观大量存在的。环状RNA(circRNA)由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成，以前的研究由于技术水平的限制，把这部分客观存在的RNA忽略了，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环化的RNA分子，环化RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。对于环化RNA的具体功能尚未有明确，目前只有几种假定的说法：(1)环状RNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA，抑制其功能；(2)环状RNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；(3)环状RNA能与蛋白质结合,抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性；(4)环状RNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。
基因是具有遗传效应的核苷酸序列，研究特定分子的功能中通过克隆表达基因对研究者来说具有重要意义。为了使克隆的基因在宿主细胞中大量表达，就要依据不同的实验目的选择不同的表达系统，构建不同的表达框架。克隆基因在不同的系统中表达的成功率取决于我们对这些系统中基因表达调控规律的认识程度，以及合理的实验设计。过表达线性的基因技术方法已经非常成熟，可以把要克隆的基因通过PCR技术获得，然后直接连接到表达载体中即可；但是人工过表达环状的RNA分子还存在不少问题，比如：如何人工地使RNA分子在特定位点发生准确环化，从而使生物体内的环状RNA可以通过外显子上下游的内含子发生配对，形成局部双链的RNA，然后通过细胞内的RNA体的剪接生成环状的RNA。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效表达环状RNA的环状RNA人工过表达框架。
本发明的另一个目的是提供含有上述环状RNA人工过表达框架的表达载体。
本发明的再一个目的是提供所述环状RNA人工过表达框架的构建方法。
本发明的再一个目的是提供所述环状RNA人工过表达框架的应用。
本发明的再一个目的是提供一种人工表达目的基因的方法。
为此，本发明提供了一种环状RNA人工过表达框架，其具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
根据本发明的环状RNA人工过表达框架，其特征在于，包括上游框架序列、填充序列、下游框架序列、以及环状RNA插入酶切位点。
术语“上游框架序列”指的是：框架中从第1个碱基算起到492个碱基结束的区域核酸序列。
术语“下游框架序列”指的是：框架中从第636个碱基算起到1017个碱基结束的区域核酸序列。
术语“填充(stuffer)序列”指的是：框架中存在于KpnI、BamHI内切酶中间的核酸序列,用于替换目标序列；如果没有填充(stuffer)序列,KpnI、BamHI紧连着,不容易做酶切。
优选地，所述环状RNA插入酶切位点包括NheI、KpnI、BamHI和XhoI。
其中，该过表达框架的碱基序列中，第1～492bp为上游框架序列，第493～635bp为填充序列，第636～1017bp为下游框架序列，其中，第1～6bp、487～492bp、636～641bp、1012～1017bp依次为酶切位点NheI、KpnI、BamHI、XhoI。
本发明还提供了一种包括所述环状RNA人工过表达框架的表达载体。
优选地，所述的表达载体为真核表达载体。
本发明还提供了一种环状RNA人工过表达框架的构建方法，该方法包括以下步骤：设计扩增引物，以人的HEK293细胞的基因组DNA为模板，采用分段PCR扩增，分别扩增过表达框架的上游框架序列、下游框架序列及填充序列，在全长序列两端分别添加NheI、XhoI酶切位点序列，方便将整个过表达框架连接到质粒载体中；在填充序列两端添加KpnI和BamHI酶切位点序列，用于连接所要研究的目标环状RNA的核苷酸序列。
优选地，在该构建方法中，所述扩增引物分为三段，其核苷酸序列如下：
1)第一段扩增上游框架引物：
Up-F：5'CGCGCTAGCTTCTACATGCGCTCAAGAAAACA 3'，
Up-R：5'ATGCTCAGCTGGTACCGCCAAAACAGGTTCAA3'；
2)第二段扩增填充序列引物：
stuffer-F：5'GTTTTGGCGGTACCAGCTGAGCATAGTTC 3'，
stuffer-R：5'TTTGGCGGATCCACTGTGAACCACTGAA 3'；
3)第三段扩增下游游框架引物：
Down-F：5'TGGTTCACAGTGGATCCGCCAAAACAGGTTCAAG 3'，
Down-R：5'GGCCTCGAGAGGAAGTCCAGTTATTAA3'。
优选地，在该构建方法中，所述分段PCR扩增的反应体系如下：第一轮PCR为20μl总体系，PCR分别扩增：具体是2×PCR MIX 10μl，10mM上下游引物各1μl，HEK293细胞DNA模板1μl，用灭菌水补足20μl体系；第一轮反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃30s变性，60℃30s退火，72℃延伸40s，共35个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后20℃保存；第一轮PCR反应完取每个片段的PCR产物1μl进行第二轮重叠PCR扩增反应，具体反应体系是50μl：具体是2×PCR MIX 25μl，10mM的Up-F和Down-R引物各2.5μl，第一轮PCR产物各段产物总共3μl，用灭菌水补足50μl体系；第二轮反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃30s变性，60℃30s退火，72℃延伸1min,共40个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后20℃保存。
本发明所述的环状RNA人工过表达框架应用于人工表达目的基因。
本发明还提供了一种人工表达目的基因的方法，包括：用KpnI和BamHI酶切除所述环状RNA人工过表达框架(具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列)中的填充序列，然后直接将目标基因的核苷酸序列连接到所述环状RNA人工过表达框架中进行表达。
本发明根据环状RNA天然形成的分子分子机理，设计环状RNA的人工过表达框架，该框架包括上游框架序列、填充序列、下游框架序列、环状RNA插入酶切位点。本框架可以成功地使目标RNA分子发生特定位点的环化，使用者可以直接将需要环化的基因的线性核苷酸序列通过酶切位点直接连接到表达框架中，通过载体导入细胞中就可以获得目标环状RNA分子。本发明构建的环状RNA人工过表达框架为广大科研工作者提供了一种有效表达环状RNA的工具。此外，将本发明构建的环状RNA人工过表达框架构建到特定的真核表达载体中，载体转染细胞后，可以在细胞内通过RNA剪接形成环状的RNA分子，为环状RNA的生物学功能研究提供一种不可缺少的技术方法。
附图说明
图1是根据本发明的环状RNA人工过表达框架的组成示意图。
图2是根据本发明的环状RNA人工过表达框架的PCR扩增琼脂糖电泳图。
图3是含有根据本发明的环状RNA人工过表达框架的真核表达载体的图谱。
图4是根据本发明的环状RNA人工过表达框架的荧光定量检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例：构建环状RNA人工过表达框架
一、设计环状RNA人工过表达框架
本发明设计环状RNA人工过表达框架包括上游框架序列、填充序列、环状RNA插入酶切位点、下游框架序列。该框架的组成示意图如图1所示。该框架的碱基序列如SEQ IDNO.1所示。其中，该框架的碱基序列中，第1～492bp为上游框架序列(碱基长度共492bp)，第493～635bp为框架填充(stuffer)序列(碱基长度共143bp)，第636～1017bp为下游框架序列(碱基长度共382bp)，第1～6bp、487～492bp、636～641bp、1012～1017bp依次为酶切位点(NheI、KpnI、BamHI、XhoI)。
二、环状RNA人工过表达框架序列的获得
根据上述环状RNA人工过表达框架的设计方案，通过设计扩增引物，以人的HEK293细胞的基因组DNA为模板，采用分段PCR扩增，分别扩增过表达框架的上游框架序列、下游框架序列，及填充序列共1017BP，在全长序列两端分别添加NheI、XhoI酶切位点序列，方便将整个过表达框架连接到质粒载体中；在填充序列两端分别添加KpnI和BamHI酶切位点序列，用于连接所要研究的目标环状RNA的核苷酸序列。
具体的实施方案如下：
1、设计PCR扩增引物如下(分3段扩增引物设计)：
(1)第一段扩增上游框架引物
Up-F:5'CGCGCTAGCTTCTACATGCGCTCAAGAAAACA 3'(SEQ ID NO.2)
Up-R:5'ATGCTCAGCTGGTACCGCCAAAACAGGTTCAA3'(SEQ ID NO.3)
第一段扩增大小为505bp；
(2)第二段扩增填充序列引物
stuffer-F:5'GTTTTGGCGGTACCAGCTGAGCATAGTTC 3'(SEQ ID NO.4)
stuffer-R:5'TTTGGCGGATCCACTGTGAACCACTGAA 3'(SEQ ID NO.5)
中间端扩增填充序列，扩增大小为169bp；
(3)第三段扩增下游游框架引物
Down-F:5'TGGTTCACAGTGGATCCGCCAAAACAGGTTCAAG 3'(SEQ ID NO.6)
Down-R:5'GGCCTCGAGAGGAAGTCCAGTTATTAA3'(SEQ ID NO.7)
第一段扩增大小为396bp。
2、PCR扩增环状RNA过表达框架
用上述引物配合如下反应体系：第一轮PCR为20μl总体系，PCR分别扩增：具体是2×PCR MIX(Vazyme公司)10μl，上下游引物(10mM)各1μl，HEK293细胞DNA模板1μl(约50ng)，用灭菌水补足20μl体系。反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃30s变性，60℃30s退火，72℃延伸40s，共35个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后20℃保存。第一轮PCR反应完取每个片段的PCR产物1μl进行第二轮重叠PCR扩增反应，具体反应体系是50μl：具体是2×PCR MIX(Vazyme公司)25μl，Up-F和Down-R引物(10mM)各2.5μl，第一轮PCR产物各段产物1μl(共3μl)，用灭菌水补足50μl体系。反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃30s变性，60℃30s退火，72℃延伸1min,共40个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后20℃保存。
PCR完成后取3μl PCR产物进行1％琼脂糖电泳结果参见图2。其中，M为DNA Marker2000，右边箭头所指为本发明的环状RNA人工过表达框架目标条带。
将PCR产物切胶回收，使用胶回收试剂盒回收纯化，然后用NheI、XhoI酶切后，将此框架构建到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建得到含有环状RNA过表达框架的载体，其模式图谱参见图3。
测试例：本发明的环状RNA人工过表达框架过表达环状RNA测试
根据环状RNA-MET基因，(circbae数据库登录号：hsa_circ_0082002，全长为1214bp)序列设计PCR扩增引物，扩增此环状RNA的线性序列，环状RNA-MET基因核苷酸序列由1214bp组成；然后通过KpnI和BamHI酶切位点将目标核苷酸序列连接到本发明的环状RNA人工过表达框架中，构建过表达载体，然后将此载体转染到HEK293细胞中。
通过荧光定量PCR检测，构建的环状RNA人工过表达框架成功地过表达目标环状RNA。其具体检测步骤如下：
1、环状RNA-MET基因PCR扩增引物设计
引物设计好后，需在正向引物5’端加入KpnI酶切位点序列，反向引物5’端加入BamHI酶切位点序列，引物序列如下：
RNA-MET-F:5’GGGGTACCAGATAAACCTCTCATAATGAAGG3’
RNA-MET-R:5’CGGGATCCACCCTATTAAAGCAGTGCTCATGATT3’
2、PCR扩增目标环状RNA序列
用上述引物配合如下反应体系：PCR为30μl总体系，具体是2×PCR MIX(Vazyme公司)15μl，上下游引物(10mM)各2μl，HEK293细胞DNA模板1μl(约50ng)，用灭菌水补足30μl体系。反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃15s变性，62℃30s退火，72℃延伸1min,共30个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后16℃保存。PCR扩增产物通过割胶回收、酶切后连接到含有本发明的环状RNA人工过表达框架的载体中，构建人工过表达MET基因环状RNA载体，命名为PCD-ciR-Met。
3、细胞转染
将上述过表达载体用lipo2000转染试剂转染到HEK293细胞中，载体转染浓度1μg/ml，转然后培养48小时，检测环状RNA的表达情况。
4、荧光定量PCR检测环状RNA的表达
根据环状RNA-MET基因(登录号：hsa_circ_0082002)序列设计PCR扩增引物，特异性检测环状RNA-MET引物序列为：
MET-F:5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'
MET-R:5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'
选取β-actin基因为内参基因，作为荧光定量结果数据的矫正基因，序列如下：
β-actin F:5'GCATGGGTCAGAAGGATTCCT3'
β-actin R:5'TCGTCCCAGTTGGTGACGAT3'；
具体检测方法如下：
(1)将转染过表达载体PCD-ciR-Met的细胞严格按照Reagent(Lifetechnologies公司)试剂操作说明书提取细胞中的总RNA；
提取详细步骤为：
①细胞取100万个左右的细胞，加入1ml trizol。
②加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置15min；
③4℃下，12,000g离心15min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管；
④加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；
⑤4℃下，12,000g离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，弃去上清；
⑥加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；
⑦室温晾干，加入20μl DEPC水溶解沉淀。
(2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA
使用RNase-free的DNase I(全式金公司)，按照说明书配置反应液，37℃消化30min，加入0.5μl EDTA,65℃灭活10min。
(3)将RNA逆转录成cDNA
严格按照逆转录试剂盒(Vazyme公司)操作说明书在PCR管中加入模板RNA、随机逆转录引物等，总量10ul。
反应条件：25℃5min，42℃20min，85℃5min，4℃2min。
(4)荧光定量检测环状RNA-MET
按照荧光定量反应试剂盒Real-time PCR试剂盒(Vazyme公司)的说明书配置反应体系；具体检测反应体系如下：
其中，荧光定量PCR反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒(此步骤收集荧光信号)；40个循环，然后进行融解曲线分析：温度60℃-95℃收集荧光信号。
荧光定量结果显示，转染细胞过表达框架载体后，目标环状RNA-MET分子成功检测出来高表达，相对于未转染组，高表达30多倍(参见图4)。实验证明本发明构建的环状RNA表达框架可以有效过表达环状RNA。
Claims (6)
1.一种环状RNA人工过表达框架，其包括上游框架序列、填充序列、下游框架序列、以及环状RNA插入酶切位点，且具有如SEQ ID NO.1 所述的核苷酸序列，其中，第1～492 bp为上游框架序列，第493～635 bp为填充序列，第636～1017 bp为下游框架序列，其中，第1～6bp、487～492 bp、636～641 bp、1012～1017 bp依次为酶切位点NheI、KpnI、BamHI、XhoI。
2.包括权利要求1所述环状RNA人工过表达框架的表达载体。
3.权利要求1所述的环状RNA人工过表达框架的构建方法，该方法包括以下步骤：设计扩增引物，以人的HEK293细胞的基因组DNA为模板，采用分段PCR扩增，分别扩增表达框架的上游框架序列、下游框架序列及填充序列，在全长序列两端分别添加NheI、XhoI酶切位点序列，方便将整个表达框架连接到质粒载体中；在填充序列两端添加KpnI和BamHI酶切位点序列，用于连接所要研究的目标环状RNA的核苷酸序列；
其中，所述扩增引物分为三段，其核苷酸序列如下：
1）第一段扩增上游框架引物：
Up-F：5' CGCGCTAGCTTCTACATGCGCTCAAGAAAACA 3'，
Up-R：5'ATGCTCAGCTGGTACCGCCAAAACAGGTTCAA3'；
2）第二段扩增填充序列引物：
stuffer-F：5' GTTTTGGCGGTACCAGCTGAGCATAGTTC 3'，
stuffer-R：5' TTTGGCGGATCCACTGTGAACCACTGAA 3'；
3）第三段扩增下游游框架引物：
Down-F：5' TGGTTCACAGTGGATCCGCCAAAACAGGTTCAAG 3'，
Down-R：5' GGCCTCGAGAGGAAGTCCAGTTATTAA3'。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述分段PCR扩增的反应体系如下：第一轮PCR为 20 μl总体系，PCR分别扩增：具体是2×PCR MIX 10μl，10mM上下游引物各1μl，HEK293细胞DNA模板 1μl，用灭菌水补足20 μl体系；第一轮反应条件为：95℃ 5min预变性，循环内95℃ 30s变性，60℃ 30s退火，72℃延伸 40s，共35个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸 7min，然后20℃ 保存；第一轮PCR反应完取每个片段的PCR产物1μl进行第二轮重叠PCR扩增反应，具体反应体系是50μl：具体是2×PCR MIX 25μl， 10mM的Up-F和Down -R引物各2.5μl，第一轮PCR产物各段产物总共3μl，用灭菌水补足50 μl体系；第二轮反应条件为：95℃ 5min预变性，循环内95℃ 30s变性，60℃ 30s退火，72℃延伸 1min ,共40个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸 7 min，然后20℃ 保存。
5.权利要求1所述的环状RNA人工过表达框架在人工表达目的基因中的用途。
6.一种人工表达目的基因的方法，包括：用KpnI和BamHI酶切除环状RNA人工过表达框架中的填充序列，然后直接将目标基因的核苷酸序列连接到所述环状RNA人工过表达框架中进行表达，其中所述环状RNA人工过表达框架具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，包括上游框架序列、填充序列、下游框架序列、以及环状RNA插入酶切位点，其中，第1～492 bp为上游框架序列，第493～635 bp为填充序列，第636～1017 bp为下游框架序列，其中，第1～6 bp、487～492 bp、636～641 bp、1012～1017 bp依次为酶切位点NheI、KpnI、BamHI、XhoI。
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