CN107058360A

CN107058360A - 一种基于快速克隆技术的环状rna表达载体构建方法及其应用

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Publication number: CN107058360A
Application number: CN201710215532.0A
Authority: CN
Inventors: 杨展
Original assignee: 杨展
Current assignee: Second Hospital of Hebei Medical University
Priority date: 2017-04-04
Filing date: 2017-04-04
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2037-04-04
Also published as: CN107058360B

Abstract

环状RNA在体内外过表达时不容易形成环状结构，目前多数过表达环状RNA方法中只有10%左右的形成率，即使改良的方法中提高了表达量，但会将原本不属于环状RNA的序列加入环状RNA中。本发明是一种基于一步法快速克隆的、人工改造的、可以完整高效地表达环状RNA载体的构建方法及应用。利用特殊的环状RNA过表达序列框架，上下游特异性序列，酶切位点，以及利用一步法（快速克隆法）插入环状RNA序列的方法，达到高效、完整、便利地克隆及过表达环状RNA。该方法及载体可以广泛应用于各种环状RNA的表达，为研究环状RNA的作用机制提供便利条件，为应用环状RNA作为体内基因靶向治疗、药物筛选提供基础。

Description

一种基于快速克隆技术的环状RNA表达载体构建方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学研究领域，所涉及的应用范围包括体内外过表达环状RNA分子的基础研究和用于体内过表达环状RNA基因靶向治疗的应用研究领域。具体定义为一种完整高效地过表达环状RNA序列的载体构建方法，序列结构及其应用。

背景技术

环状RNA( circular RNA，circRNA)是新近确认的一类特殊的非编码RNA( non-coding RNA，ncRNA)分子，通常由部分外显子或内含子环化而成的RNA 分子，因而其结构比普通线状RNA稳定。circRNA普遍存在于真核细胞，具有一定的组织、时序和疾病特异性。circRNA是RNA 家族的一颗极具发展潜力的正在升起的新星，也是RNA 领域最新的研究热点。早期，关于circRNA 的文献报道少，且表达水平相对低，故在很长一段时间里，circRNA被认为是错误可变剪接( alternative splicing ) 而形成的副产品，属于自然界中一种极罕见现象，甚至被当做遗传意外或实验人为因素所致，并未引起学术界重视。随着RNA 测序和生物信息学等技术的快速发展，人们在大规模研究转录组数据时发现，circRNA并不像之前所认为的那样是一种极罕见现象，反而大量存在于真核细胞中。Danan 等发现，circRNA 在古生菌细胞普遍存在，并认为其极有可能具有生物学功能。同时，Salzman 等也证实circRNA 在人类细胞基因表达中是一个普遍现象，并可能扮演着多种生物学功能的重要角色。Jeck等采用高通量测序方法，在人成纤维细胞中检测到超过25000 种circRNA，认为circRNA 是RNA 剪切后所形成的一类极稳定的保守性产物，此外还发现circRNA可被小型干扰RNA( small interfering RNA， siRNA) 降解。Memczak 等研究证实circRNA 参与转录后调控，Hansen 等的研究则揭示circRNA 可作为miRNA 海绵( miRNA sponge) 来影响基因的调控与表达。尽管circRNA 被发现已有30 余年，但由于技术限制等原因，circRNA一直处于被学术界忽视的地位。但随着近年有关circRNA 的几项突破性研究的发现，尤其是国际著名权威刊物Nature 发表两篇有关circRNA生物学功能的论文，震惊学术界，从此拉开揭开circRNA 神秘面纱的序幕，circRNA 已引起国内外学术界的关注，并将掀起研究热潮。而Glazar 等建立了circRNA 专用数据库“circBase”，该数据库对目前已发表的circRNA 资料进行整合统一，同时提供已知的及新的circRNA 测序资料，旨在为circRNA的研究提供一个较好的交流平台。

通过与疾病关联的miRNA 相互作用，circRNA 在疾病中发挥着重要的调控作用，又因其结构相对稳定，故有巨大潜力成为新型的临床诊断标志物。目前陆续有报道环状RNA与疾病之间的关系，如环状 cANRIL是基因INK4 /ARF 的反义转录物，可通过有差异的PcG募集来抑制INK4/ARF 表达，从而影响动脉粥样硬化的发生。Hansen 等已证实CDR1as 与miR-7 在小鼠大脑中共表达，可影响中脑发育。Ghosal 等则发现CDR1as 亦可能与帕金森病有关。Fang L等报道cir-ITCH可能通过调节Wnt信号途径在食管癌的发生发展过程起着重要作用。Li ZY等人研究发现，circRNAs如，circEIF3J和circPAIP2在细胞核中通过U1的snRNA和EIciRNAs之间特定RNA-RNA相互作用，促进其亲本基因的表达。大量的研究已经表明环状RNA在生理病理过程的重要性显而易见，目前对环状RNA的功能及其机制了解甚少。但是，要研究环状RNA的功能和其调控机制，及观察其对细胞的功能影响，对细胞内环状RNA的过表达就成为必不可少的手段了。然而，以往对基因过表达都是将基因序列直接插入到一般商业化的表达载体上，如pcDNA3.1，pEGFP-N1等，但这种常规方法不能将基因表达出环状结构，只得到线性mRNA分子。因此，一个完整而又高效的过表达环状RNA的载体是以上研究的必要条件。

现有技术方案一的内容：目前从文献报道的方法中，多采用以基因组DNA为模板，以环状RNA为中心，扩增其上下游很长（1000 bp 左右）的一段内含子序列，然后插入到普通的表达载体上，从而实现过表达该环状RNA的目的。现有技术方案一的缺点：但这种方法有明显的局限性，1）环状RNA形成率太低，通过以上方法所过表达环状RNA的形成率往往不到该序列线性RNA的10%。因为它们的序列是完全相同的，到底是环状RNA还是该片段的线RNA在起作用的，所以对后期环状RNA功能的研究带来大大的不便。2）该方法繁琐，难度大，周期长，效率低；往往需要设计4对以上的引物，通过不同片段的PCR扩增、鉴定、回收，然后再桥连，一方面容易出错，另一方面因基因片段过长而不容易克隆。这样给广大研究者研究环状RNA带来极大的不便，限制其研究和应用。

现有技术方案二的内容：目前也有部分商业化的环状RNA过表达载体，其通过将某个环状RNA上下游的Alu序列框架整合到一般的商业过表达载体上，中间连上某些克隆位点，达到方便快速克隆不同环状RNA的目的。现有技术方案二的缺点：但该方法仍然存在两大不足之处，其一：还是表达量过低，从它的结果来看，环状RNA只过表达10-30倍之多，如果同时检测其线性RNA的话，估计还是只有10%-20%的形成率。其二：他们所有的是普通的克隆方法，即环状RNA基因片段两端必须加入酶切位点，这样才保证环状RNA基因能与载体边接上。问题就在这里，所加入的酶切位点序列就将自动环化进环状RNA中，也就是说，所表达出来的环状RNA已经不完全是原来的基因序列，多出来酶切位点的序列。在某些程度上可能已经改变了原来环状RNA的功能，因此这种方法也是不完整，不能正确地表达环状RNA。

现有技术方案三的内容，还有一种商业的表达载体，该方法的最大特点是充分利用真核生物基因RNA剪接原理，则GT-AG法则。在环状RNA基因上下游加入一段短的反向重复序列，5’上游还含一段供体序列，而3’下游还加入一小段受体序列，大大缩短了Alu序列，同时也实现了高表达环状RNA。现有技术方案三的缺点，但是和方案二相同，该方法也是用普通的基因克隆方法，在供体和受体之间插入一段多克隆位点，连接环状RNA时必须加入酶切位点，载体和基因片段分别经酶切后，再用连接酶进行连接。问题所在仍然是多加入的酶切位点序列，当环状RNA环化时，部分克隆位点的序列就自动加入到环状RNA序列中。在某些程度上可能已经改变了原来环状RNA的功能，因此这种方法也是不完整，不能正确定地表达环状RNA。

发明内容

首先，从环状RNA形成的原理入手，环状RNA是在RNA剪接过程产生的，是RNA剪接过程中发生的一种特殊方式。与普通mRNA形成相似，环状RNA的形成同样遵循5’ GT-AG 3’法则，这是RNA剪接体在该部位剪切的位置。但单纯 5’ GT-AG 3’结构不足以使RNA剪接体准确地识别和剪切该部位，因此需要供体（donor site）和受体(acceptor site)序列结构的存在。典型的结构为“外显子-[cut]-G-U-R-A-G-U (供体)-内含子-(acceptor site)Y-rich-N-C-A-G-[cut]-外显子” （N=A，T，C和G任意一种；R=A或C；Y=U或C），如图1所示，供体和受体在RNA前体中的位置。当这些结构都存在时，RNA剪接体可以识别并结合上去。然而，环状RNA的形成还需要一个必要条件，就是上下游的Alu序列结构，根据WILLIAM R. JECK等人的报道，Alu结构往往是一组富含GC的序列。当这个序列结构足够长能并使其形成茎环结构，在RNA剪接体识别结合到供体和受体上后，进行正常剪接，最后即形成环状RNA（图2）。

其次，一步法基因克隆是近年来发现的一种快速，方便的克隆方法，其原理是模仿基因错配修复酶作用原理，当体系中存一个末端包含15-20 bp的DNA片段与载体DNA切口处重叠时，修复酶就会利用这个片段进行修复，从而将片段连接到载体DNA上。该法简单、快速、高效，适用于任何载体；只要能将DNA线性化，可插入任何位置；不依赖于连接酶，无载体自连现象，阳性率高；可高效克隆片段范围广；线性化克隆载体和PCR产物可不进行纯化直接克隆；无需考虑插入片段自身携带的酶切位点；通过该法可以排除现有环状RNA表达载体在表达环状RNA时将酶切位点的序列引入RNA内。

再次，我们在构建载体时选择了两个特殊的限制性内切酶EcoN1和Pml1，它们的识别位点分别为图3。在序列框架中，我们采用了以下结构SEQ001：5’

CGGGCGCGGTGCCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGCCTGGGGCACTCTGACCATTCCCTTTCTTTCCCTCAG^▼CTAGG 3’ (黑色字体为正向重复序列和受体序列；下划线为EcoN1酶切位点；▼为被切开的位置；)。接着是5’ SEQ002：CAC^▼GTGAAGTATCAACTGCAGACGTTTCGTGCGGCGCCCCAGGCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGGCACCGCGCCCG 3’(黑色字体为反向重复序列和红色为供体序列；下划线为Pml1酶切位点；▼为被切开的位置)。这些酶切位点的所识别并酶切后所形成的DNA切口序列结构分别与5’ 端受体和3’ 端供体一致，这样经过一步法克隆后，就可以将完整的环状RNA表达出来，其不包含多余的碱基序列。

本发明技术方案流程图，见附图4。

本发明技术方案实例

引物设计

从circBase数据库查找hsa_circ_0079929环状RNA，并于UCSC数据库中下载该序列，如下：

>hg19_hub_1_rybak_circRNAs

ACGGTCTGGAAAATCCCGAAGCAGAAGCCCGTATTCATCTAGGCATTCAAGATCTCGTAGCAGGCACAGATTGTCTAGATCCAGAAGTCGTCATTCTAGTATTTCTCCTAGCACACTAACTCTGAAGAGTAGCCTGGCAGCTGAATTGAACAAGAATAAAAAAGCACGAGCAGCAGAGGCAGCAAGAGCCGCAGAAGCAGCGAAAGCTGCAGAAGCAACTAAGGCTGCTGAGGCTGCTGCCAAGGCTGCAAAAGCTTCAAACACTTCTACACCTACCAAGGGGAACACGGAAACTAGTGCCAGTGCATCACAAACAAACCATGTGAAGGATGTGAAGAAAATTAAAATTGAACATGCACCTTCTCCCTCAAGTGGTGGAACTTTAAAAAATGACAAAGCAAAAACAAAGCCACCTCTTCAGGTAACGAAGGTGGAAAATAATTTGATTGTAGATAAAGCCACCAAGAAAGCAGTCATAGTTGGAAAGGAGAGTAAATCTGCTGCTACAAAGGAGGAATCAGTATCTCTTAAAGAGAAAACCAAACCACTTACACCAAGCATAGGAGCCAAGGAGAAGGAGCAACATGTAGCTTTAGTCACCTCTACATTACCACCGTTACCTTTGCCTCCCATGCTGCCTGAAGATAAAGAAGCTGATAG

用DNAstar软件进行引物设计，如下：

circ79929_GFP_F:CTTCCCTTTCTTTCCCTCAGACGGTCTGGAAAATCCCGAAGC

circ79929_GFP_R:GTCTGCAGTTGATACTCACCTATCAGCTTCTTTATCTTCAGGCAGCATG

引物由“苏州金唯智生物科技有限公司”合成，由于该环状RNA是由一个外显子构成，所以直接用基因组DNA为模板进行PCR（对于由多个外显子组成的circRNA，只能提取RNA反转录成cDNA作为模板或者直接全基因合成）。如果是用基因合成的方法合成环状RNA片段，基因的5’端加上GENE_5：CTTCCCTTTCTTTCCCTCAG序列，3’ 端加上GENE_3：GTGAGTATCAACTGCAGAC序列。

PCR扩增环状RNA片段具体步骤：

（1）于冰上将引物、DNA 模板及5 X PCR buffer融解；

（2）按以下说明配制50 μLPCR反应体系 (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase, CodeNo.: R010A)。（5 X PCR buffer，10 μL；Primerstar PCR enzyme ，0.5 μL；dNTP Mix，4 μL；Primers F，2 μL；Primers R，2 μL；gDNA template，1 μL (50 ng) ；ddH2O，30.5 μL；）总共50 μL；

（3）将混盒液稍稍离心，于PCR仪中反应，条件如下：（98 ℃，3 min ；98 ℃，15 s；68 ℃，45 s；68 ℃ ，2 min ；共34 cycles ）最后4 ℃保存；

（4）取5 μL PCR反应产物于2 % DNA 琼脂糖凝胶电泳，120 V，15 min，紫外灯下拍照记录。

PCR产物用Cycle-pure kit (Omega)核酸纯化试剂盒回收，具体操作如下：

（1）将PCR产物转移到1.5 mLEP管中，加入200 μLCP buffer，振荡混匀并短暂时离心；

（2）将混合液加到已套入2 mL收集管的HiBind DNA结合柱中；

（3）10000 g 室温离心1 min，弃滤出液；

（4）加入700 μL DNA Wash buffer 清洗HiBind DNA结合柱，10000 g 室温离心1 min，弃滤出液，重复一次该步骤；

（5）13000 rpm 室温离心2 min，充分甩干多余液体；

（6）取出HiBind DNA结合柱置于无核酸酶的1.5 mL EP管中，加入30 μL Elutionbuffer，温室静置1 min；

（7）12000 rpm 室温离心1 min，将滤出液重新吸回到HiBind DNA结合柱中，重复离心1min，以获得更多DNA；8)Nano drop检测浓度，-20 ℃保存。

Circ-pEGFP载体双酶切，具体步骤如下：

（1）于冰上将circ-pEGFP载体、NEB buffer 1融解；

（2）按以下说明配制50 μL酶切反应体系(EcoN1，NEB，R0521S; PmlI，NEB，R0532S)。（10X NEB buffer 1，5 μL；circ-pEGFP vector，10 μL (5 μg)；EcoN1，2.5 μL；PmlI ，2.5 μL；ddH2O，30 μL）总共50 μL；

（3）混合液稍稍离心，于37℃水浴中反应1-2 h；

（4）取5 μL 酶切产物于1 % DNA 琼脂糖凝胶电泳，120 V，15 min，紫外灯下拍照观察记录。

酶切产物产物用Cycle-pure kit (Omega)核酸纯化试剂盒回收，具体操作如上PCR产物回收。

载体与环状RNA片段连接（一步法克隆）：

（1）于冰上将circ-pEGFP载体、5 × CE II Buffer融解；

（2）按以下说明配制10 μL酶切反应体系 (Vazyme, ClonExpress II One StepCloning Kit, C112-01/02)；（5 × CE II Buffe，2 μL；切开的 circ-pEGFP vector，2 μL(50 ng)； circRNA 片段，2 μL (100 ng)；Exnase® II ，1 μL；ddH2O 2 μL）总共10 μL；

（3）混合液稍稍离心，于37 ℃ PCR仪中反应30 min；立即放置冰上，准备转化大肠干菌。

转化大肠干菌：

（1）取出感受态，冰上放置10 min，加入10 μL上述连接产物，细心混匀管中成份。于冰浴放置10到15 min；

（2）把转化管转移至放于42 ℃，准确计时90秒（此时不能摇动转化管）；

（3）把EP管迅速转移至冰上，冰浴2-3分钟；

（4）向每只试管中加入500 μLLB液体培养基，37 ℃振荡培养30-45分钟；

（5）4000 rpm离心收集菌体，去除450 μL LB液体培养基，吹起菌体，涂布于含有卡那霉素抗性的LB-琼脂平板上；

（6）于37 ℃倒置平板培养过夜。

克隆鉴定与扩增：

（1）从上述平板中随机挑选8个单克隆接种到带AMP+的5 mL LB 培养基中；

（2）37 ℃摇床200 rpm 培养12-16小时；

（3）收取菌液，送样进行基因测序；

（4）提取质粒-20℃保存备用。

质粒转染细胞：

（1）根据Lipofectamine® 2000 Reagent（Cat. nos.:11668-019 ）说明书操作，大概步骤如下；

（2）293细胞接种到6孔板或细胞培养瓶中，37 ℃、5 % CO2条件下培养24 h，待细胞贴壁生长至60 %~80 % 密度时进行转染；

（3）转染用质粒终浓度为500 ng/μL，Lipofecta mine 2000转染试剂分别溶于无血清无因子无抗生素的DMEM基础培养基中并充分混匀，5 min后将两者混在一起，短暂离心然后室温静置5-10 min；

（4）培养的293用无血清无抗生素DMEM培养液洗涤细胞两次，换上新鲜的无血清无因子无抗生素的DMEM基础培养基，根据培养体积将脂质体和质粒的混合液加入细胞中，轻轻摇匀后置培养箱中，37℃培养；

（5）转染后6 h，更换为含 2.5 % FBS的DMEM培养基中培养，培养24 h 后收集细胞，提取RNA或进行反转录，再qRT-PCR分析。

总RNA的提取（参照Total mRNA Extract kit (Omiga)操作手册, 具体如下：

（1）转染24 h后，用1 × PBS轻轻冲洗两次，充分去掉多余的液体，加入1 mL RNA裂解液（RNA-Solv），室温将细胞吹下来；

（2）将匀浆液转移到1.5 mL无RNA酶的EP中并加入200 μL的氯仿，剧烈震荡15秒后冰上静置10 min；

（3）待匀浆液出现明显的分层后，放入4 ℃ 12,000 g离心15 min，这时匀浆液便可分为三层；

（4）小心转移上层水相（不超过上层总体积的80 %）到一个新的无RNA酶EP管中，并加入1/2倍体积的无水乙醇，充分混匀15秒；

（5）将混合液体转移到HiBind RNA离心柱中，室温10,000 g离心1 min，弃流出液；、（6）将离心柱放置于新的收集管中，并加入300 μL的RNA 洗杂缓冲液Ⅰ，10,000 g离心30秒，弃去流出液；

（7）在离心柱中再次加入400 μL RNA 洗杂缓冲液Ⅰ，10,000 g离心1 min，弃去流出液；（8）往离心柱中加入500 μL 用无水乙醇稀释的RNA 洗杂缓冲液Ⅱ，10,000 g离心1 min，弃流出液；

（9）重复（8）洗涤后13,000 g离心2 min充分除去残余液体；

（10）将离心柱置于新的1.5 mL无RNA酶离心管中，在离心柱中加入30 μL DEPC水，室温静置2 min后，13,000 g离心1 min，重新将洗出液吸回离心柱中，重复离心一次，最后收集洗脱液，-80 ℃保存。

RNA的鉴定和定量：取2 µl 所得的RNA溶液，于1 %琼脂糖凝胶电泳，在核酸检测仪下观察RNA完整性，28S、18S条带完整、清晰，且28S亮度是18S的2倍，并拍照片保存，表明RNA完整无降解。另取2 µl RNA溶液，在核酸定量仪进行定量，所得到RNA浓度，OD 260/280比值在1.8-2.0范围内，表明所得的RNA纯度比较高，达到下一步实验的要求。

反转录反应和过程取5 μg上述所得的总 RNA，根据M-MLV First Strand Kit操作手册反转录合成cDNA，反应体系为20 µl。具体步骤如下：

（1）在RNA酶的0.2 mL微量离心管中加入1 μg的总RNA，oligo(dT) 1 μL和10 mM dNTP1 μL，然后补水至12 μL，离心混匀后65 ℃变性5 min，迅速置于冰上冷却，短暂离心后分别加入4 μL 5×第一链合成缓冲液、2 μL 0.1 M DTT 和1 µL RNaseOUT核酸酶抑制剂；

（2）离心混匀，然后置于PCR反应仪中37 ℃孵育2 min，随后常温下加入1 μL M-MLV逆转录酶（200 U/μL），离心混匀；

（3）重新放回PCR仪中，预设程序37 ℃反应50 min，接着70 ℃处理15 min以灭活逆转录酶，最后4 ℃冷却。制备的cDNA保存在-20 ℃备用。

实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)：

（1）将上一步所得的反转录产物按照1: 10稀释，并按照如下比例配制反应的体系（SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG，10μL；cDNA，1μL；Primer-forword，1μL；Primer-forword，1μL；Nuclease-free water，7μL）总共20μL；

（2）离心混匀后，按照如下反应条件，进行实时定量PCR反应（ 50 ℃，2 min；95 ℃，2min；95 ℃，15秒；适当的退火温度（60 ℃），30秒；读板；从步骤3到步骤5重复40个循环；溶解曲线测定）；

（3）相对定量法采用比较Ct法， GAPDH作为内参，采用∆Ct(Ct目的-Ct内参)法进行相对定量分析，用2 -∆Ct计算所得值作为目的RNA的相对表达量。所用引物序列如下：F:CATAGGAGCCAAGGAGAAGGAG；R: GACTTCTGGATCTAGACAATCTGTGC。

普通PCR产物基因测序：

（1）于冰上将引物、cDNA 模板及5 X PCR buffer融解；

（2）按以下说明配制50 μL PCR反应体系 (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase, CodeNo.: R010A)。（5 X PCR buffer，10 μL；Primerstar PCR enzyme，0.5 μL；dNTP Mix，4 μL；Primers F，2 μL；Primers R，2 μL；cDNA template，1 μL 原液；ddH2O， 30.5 μL）总共50 μL；

（3）将混盒液稍稍离心，于PCR仪中反应，条件如下（激活98 ℃，3 min；变性98 ℃，15s；退火和延伸68 ℃，45 s；34循环；最后68 ℃，2 min）4 ℃保存；

（4）取5 μL PCR反应产物于1.5 % DNA 琼脂糖凝胶电泳，120 V，15 min，紫外灯下拍照记录；

（5）余下PCR产物和引物一起送样北京金唯智生物科技有限公司测序；

（6）从测序结果中分析环状RNA连接处的序列结构。

结果与分析：荧光定量PCR结果显示，与空载体及普通载体连接的该环状RNA相比（环状RNA基因片段直接与pEGFP-N1载体相连），circ-pEGFP表达载体连接的该环状RNA显著高表达hsa_circ_0079929环状RNA，增高率达约200倍（图5）。而同时我们也检测该环状RNA的线性基因片段，与空载体相比，pEGFP-N1连接的和circ-pEGFP连接的该环状RNA其线性基因表达量均达300倍，在线性基因表达中，pEGFP-N1和circ-pEGFP表达载体之间没有显著差异（图6）。

从普通PCR产物测序结果显示，来源于空载体组和circ-pEGFP表达载体组hsa_circ_0079929环状RNA连接处碱基序列与数据库的序列一致“GAAGCTGATAGACGGTCTGGA”（下划线为3’端序列，无下划线为5’序列）（图7，9），说明circ-pEGFP载体达到完整地过表达环状RNA。而pEGFP-N1载体连接的环状RNA组，测序结果色谱柱型图在环状RNA连接处序列发生改变“GAAGGACAAAGACGGTCTGGA” （下划线为改变的序列）（图8 ），说明这个载体所表达出来的环状RNA与细胞自身表达的序列不一致，这也是目前其他表达环状RNA所共同存在的问题。

综上所述，本发明的circ-pEGFP表达载体的特异序列框架和克隆方法，成功达到高效，完整，无多余序列地表达环状RNA。

本发明技术方案将带来的有益效果：由于环状RNA结构比普通线状RNA稳定，而circRNA普遍存在于真核细胞，具有一定的组织、时序和疾病特异性，其必然是RNA 家族的一颗极具发展潜力的正在升起的新星，也将是RNA 领域最新的研究热点。首先，对环状RNA功能的研究必然要过表达它，因此在基础研究方面，商业化的环状RNA表达载体将有广阔的市场前景。其次，环状RNA的重要性将越来越受人们重视，随着对其深入了解，也可能成为基因靶向治疗的新方向，其表达载体的应用将进一步拓展。

针对本发明中的技术方案的内容，别的替代方案：

（1）本研究包括利用别的载体骨架过表达环状RNA，如pcDNA3.1，其它如腺病毒，慢病毒，反转录病毒和腺相关病毒载体等；

（2）包括利用一步法（快速克隆法）构建环状RNA表达载体的方法；

（3）包括利用末端加尾法加入供体或受体序列的方法构建载体；

（4）包括本发明所用到的上下游特异序列框架表达环状RNA；

（5）包括利用限制性内切酶EcoN1和Pml1作为连接酶切位点构建环状RNA表达载体。

本发明技术方案的关键点：

（1）利用一步法（快速克隆法）构建环状RNA表达载体的方法；

（2）本发明所用到的上下游特异序列框架；

（3）利用限制性内切酶EcoN1和Pml1作为环状RNA连接酶切位点；

（4）利用基因测序法检测环状RNA连接处序列来验证表达的环状RNA是否正确定。

附图说明：

图1 RNA前体中外显子与内含子剪接位置简图；

图2 环状RNA形成需要的序列框架；

图3 EcoN1和Pml1，它们的识别位点；

图4 本发明技术方案流程图

图5 荧光定量PCR检测环状RNA hsa_circ_0079929的表达；

图6 荧光定量PCR检测环状RNA hsa_circ_0079929中线性基因的表达；

图7 293细胞转染空载体pEGFP-N1组，PCR检测环状RNA hsa_circ_0079929连接处基因测序，分析其连接处基因序列和柱型图；

图8 转染载体pEGFP-79929组，环状RNA与普通载体连接，PCR检测环状RNA hsa_circ_0079929连接处基因测序，分析其连接处基因序列和柱型图；

图9 转染载体circ-pEGFP-79929组，PCR检测环状RNA hsa_circ_0079929连接处基因测序，分析其连接处基因序列和柱型图。

>SEQ001

CGGGCGCGGTGCCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGCCTGGGGCACTCTGACCATTCCCTTTCTTTCCCTCAGCTAGG

>SEQ002

CACGTGAGTATCAACTGCAGACGTTTCGTGCGGCGCCCCAGGCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGGCACCGCGCCCG

>hg19_hub_1_rybak_circRNAs

>circ79929_GFP_F

CTTCCCTTTCTTTCCCTCAGACGGTCTGGAAAATCCCGAAGC

>circ79929_GFP_R

GTCTGCAGTTGATACTCACCTATCAGCTTCTTTATCTTCAGGCAGCATG

>GENE_5

CTTCCCTTTCTTTCCCTCAG

>GENE_3

GTGAGTATCAACTGCAGAC

>EcoN1_CUT

CCTCAGCTAGG

>Pml1_CUT

CACGTG

Claims

1.本发明是一种人工改造的、可以完整高效地表达环状RNA载体的构建方法。

2.根据权利1所述的方法中，包含环状RNA过表达序列框架，其特征在于，上下游特异性序列，酶切位点，以及利用一步法（快速克隆法）插入环状RNA序列的方法。

3.根据权利2所述的方法中，其特征在于，所述的上游特异性序列构架SEQ001：CGGGCGCGGTGCCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGCCTGGGGCACTCTGACCATTCCCTTTCTTTCCCTCAGCTAGG；下游特异性序列框架SEQ002：CACGTGAGTATCAACTGCAGACGTTTCGTGCGGCGCCCCAGGCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGGCACCGCGCCCG；的部分和全部序列。

4.根据权利2所述的酶切位点，其特征在于EcoN1和Pml1特异性识别及剪切序列，用于环状RNA插入部位的酶切位点；用于环状RNA插入位点处的EcoN1_CUT：CCTCAGCTAGG;Pml1_CUT：CACGTG。

5.根据权利2所述的利用一步法（快速克隆法）克隆，包括原理是错配修复法、基因交换法等，如Vazymer的ClonExpress 酶及相关产品、Clontech 的In-Fusion®系列产品所构建的环状RNA表达载体。

6.根据权利1所述的方法中，还包括利用末端加尾法加入供体或受体序列的方法构建载体。

7.根据权利1所述的方法中，包括设计引物扩增环状RNA基因及全基因合成环状RNA是加入接头序列：基因的5’端加上GENE_5：CTTCCCTTTCTTTCCCTCAG序列，3’ 端加上GENE_3：GTGAGTATCAACTGCAGAC序列。

8.本权利包括利用别的载体骨架过表达环状RNA，如pcDNA3.1，其它如腺病毒，慢病毒，反转录病毒和腺相关病毒载体等。

9.本权利包括用于环状RNA表达DNA序列的载体应用于各种基础研究的体内外过表达环状RNA，过表达环状RNA应用于基因靶向治疗，药物筛选等方式。

10.说明书所述的实施案例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，本发明的权利要求还包括对本发明技术方案所作的各种变形和改进，均应属于本发明权利要求书的保护范围之内。