CN102586237B - 一种多聚核酸分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分离的具有SEQ ID NO：1所示核酸序列或其部分序列的多聚核酸分子；进一步的，本发明提供了所述多聚核酸分子作为分化标志物或疾病检测标志物的应用及检测方法；更进一步的，本发明提供了能够降低所述多聚核酸分子表达水平的抑制剂，以及包含该抑制剂的药物组合物。

Description

一种多聚核酸分子及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多聚核酸分子及其应用。

背景技术

人类基因组中存在的蛋白编码基因大约有2-3万个，约占总序列量的2％，其余98％的序列不编码蛋白质，曾一度被认为是没有生物学功能的“垃圾DNA”。近年来随着研究的深入，我们发现这些基因组序列能转录产生大量的非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。具体的，根据成熟转录本的大小，将这些非编码分为小分子ncRNA(如siRNA，miRNA，piRNA等)，中等长度ncRNA(70-200nt)和长ncRNA(long ncRNA，IncRNA，＞200nt)。目前，非编码RNA领域的研究工作多集中于小分子非编码RNA的鉴定和功能研究方面，对长非编码RNA的了解还非常有限。最近的研究表明长非编码RNA通常是以RNA转录本的形式，在细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡和类固醇代谢等过程中发挥重要的调控作用。最近的研究还发现长非编码RNA与细胞癌变有着极为密切的联系，在肺癌、非霍杰金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病中，发现某些具有肿瘤抑制功能长非编码RNA的缺失或表达量下降，表明长非编码RNA在细胞增殖、分化和癌变中具有重要的作用，尤其是其中分化相关的长非编码RNA，有可能为分化相关疾病尤其是肿瘤的诊断和治疗提供生物标志物和靶点。

发明内容

本发明涉及以下按顺序编号的段落中定义的主题：

1、一种分离的多聚核酸分子，其特征在于所述核酸分子选自：

1)具有SEQ ID NO：1所示核酸序列的多聚核酸分子；

2)具有SEQ ID NO：1所示核酸序列的部分核酸序列的多聚核酸分子；

3)具有与1)或2)所述多聚核酸分子序列90％或以上同源性核酸序列的多聚核酸分子；

4)具有与1)、2)或3)所述多聚核酸分子序列互补核酸序列的多聚核酸分子。

2、段落1所述的多聚核酸分子作为分化标志物的应用。

3、段落1所述的多聚核酸分子作为脂肪组织分化标志物的应用。

4、段落1所述的多聚核酸分子作为疾病标志物的应用，其特征在于所述疾病选自脂肪瘤、子宫平滑肌肉瘤、间质瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺样囊性癌、或II型糖尿病。

5、段落1所述的多聚核酸分子作为疾病治疗靶点的应用，其特征在于所述疾病选自脂肪瘤、子宫平滑肌肉瘤、间质瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺样囊性癌、或II型糖尿病。

6、一种在离体样本中检测段落1所述多聚核酸分子表达水平的方法，其特征在于所述方法选自杂交法、扩增法或测序法。

7、段落6所述的方法，其特征在于离体样本选自分离的体液、淋巴结样本、或组织样本。

8、段落6所述的方法，其特征在于所述杂交法选自斑点杂交、Northern杂交、或基因芯片杂交。

9、段落6所述的方法，其特征在于所述扩增法选自半定量RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、Taqman PCR。

10、段落9所述的方法，其特征在于所使用的引物组合选自SEQ ID NO：200-SEQIDNO：209所示的核酸序列。

11、段落6所述的方法，其特征在于所述测序法选自双脱氧终止测序法、或高通量测序。

12、一种检测系统，其特征在于包含段落10所述的引物组合。

13、段落12所述的检测系统，其特征在于该系统还包括逆转录酶及其反应缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸底物、DNA聚合酶、荧光定量PCR反应缓冲液、人工合成的内参及正常人对照品。

14、段落6-13任一项所述的方法或系统在分化标志物检测中的应用。

15、段落6-13任一项所述的方法或系统在脂肪组织分化标志物检测中的应用。

16、段落6-13任一项所述的方法或系统在疾病标志物检测中的应用，其特征在于所述疾病选自脂肪瘤、子宫平滑肌肉瘤、间质瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺样囊性癌、或II型糖尿病。

17、段落14-16任一项所述的应用，其特征在于包含以下步骤：1)测定段落1所述的多聚核酸分子在离体样本中的水平；2)测定段落1所述的多聚核酸分子在参考样本中的水平；3)比较多聚核酸分子在离体样本和参考样本中的水平。

18、一种能降低段落1所述多聚核酸分子表达水平的抑制剂。

19、段落18所述的抑制剂，其特征在于所述抑制剂为小干扰核酸分子。

20、段落19所述的抑制剂，其特征在于所述小干扰核酸分子序列选自SEQ ID NO：300-SEQ ID NO：327所示的核酸序列。

21、段落19-20任一项所述的抑制剂，其特征在于所述小干扰核酸分子包含如下修饰中的至少一种：1)对核酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；2)对核酸序列中核苷酸的核糖的2’-OH的修饰；3)对核酸序列中核苷酸的碱基的修饰。

22、段落18所述的抑制剂，其特征在于所述抑制剂为shRNA表达载体，优选情况下所述表达载体包含选自SEQ ID NO 350-SEQ ID NO 377所示的核酸序列。

23、段落18所述的抑制剂，其特征在于所述抑制剂为反义核酸分子，优选情况下所述反义核酸分子具有SEQ ID NO 240-SEQ ID NO 253所示的核酸序列。

24、一种细胞分化抑制剂，其特征在于包含段落18-23任一项所述的至少一种抑制剂。

25、一种药物组合物，其特征在于包含段落18-23任一项所述的至少一种抑制剂及药学上可接受的载体。

26、段落18-25任一项所述的抑制剂在制备疾病治疗药物组合物中的应用。

27、段落26所述的应用，其特征在于所述疾病选自脂肪瘤、子宫平滑肌肉瘤、间质瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺样囊性癌、以及II型糖尿病。

一方面，本发明提供了一种分离的多聚核酸分子(命名为“TAR”)，该多聚核酸分子具有SEQ ID NO：1所示的全部或部分核酸序列，或与SEQ ID NO：1所示的全部或部分核酸序列具有90％或以上同源性的核酸序列，或与以上核酸序列互补的核酸序列。

另一方面，本发明提供了上述多聚核酸分子作为分化标志物的应用；优选的，本发明提供了上述多聚核酸分子作为脂肪组织分化标志物的应用；更优选的，本发明提供了上述多聚核酸分子作为疾病标志物的应用，所述疾病包括脂肪瘤、子宫平滑肌肉瘤、间质瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺样囊性癌、或II型糖尿病；更优选的，本发明提供了上述多聚核酸分子作为疾病治疗靶点的应用，所述疾病包括脂肪瘤、子宫平滑肌肉瘤、间质瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺样囊性癌、或II型糖尿病。

另一方面，本发明提供了一种在离体样本中检测上述多聚核酸分子的方法，所述离体样本包括分离的体液、淋巴结样本、或组织样本。

另一方面，本发明提供了一种在离体样本中检测上述多聚核酸分子的方法，所述检测方法包括杂交法、扩增法或测序法。具体地说，扩增法包括半定量RTP-CR、实时荧光定量RT-PCR、Taqman PCR；杂交法包括斑点杂交、Northern杂交、或基因芯片杂交；测序法包括双脱氧终止测序法、或高通量测序。

优选的，上述PCR检测中所用的检测引物选自SEQ ID NO：214-SEQ ID NO：219所示的核酸序列组合。

另一方面，本发明提供了一种在离体样本中检测上述多聚核酸分子的检测系统，该系统包含上述检测引物；在较佳的实施方式中，该系统还包括逆转录酶及其反应缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸底物、DNA聚合酶、荧光定量PCR反应缓冲液、人工合成的内参及正常人对照品。

另一方面，本发明提供了上述检测方法、检测试剂或检测系统在分化标志物检测中的应用。优选的，本发明提供了上述检测方法、检测试剂或检测系统在脂肪组织分化标志物检测中的应用；更优选的，本发明提供了上述检测方法、检测试剂或检测系统在疾病标志物检测中的应用，所述疾病包括脂肪瘤、子宫平滑肌肉瘤、间质瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺样囊性癌、或II型糖尿病；更优选的，本发明提供了上述检测方法、检测试剂或检测系统在疾病治疗中的应用，所述疾病包括脂肪瘤、子宫平滑肌肉瘤、间质瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺样囊性癌、或II型糖尿病。

另一方面，本发明提供了一种疾病检测及诊断方法，该方法包含以下步骤：1)测定离体样本中上述多聚核酸分子的水平；2)测定参考样本中相应多聚核酸分子的水平；3)比较多聚核酸分子在离体样本和参考样本中的水平。如果与参考样本相比，离体样本中多聚核酸分子的水平有显著改变，表明分化或疾病的存在。

如果与参考样本相比，多聚核酸分子在离体样本中的水平显著升高，表明有分化或疾病发生。“显著升高”在此指的是所述多聚核酸分子的表达水平增加至少5％，包括例如增加至少6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、或更多。

另一方面，本发明提供了一种能够降低所述多聚核酸分子表达水平的抑制剂。优选的，所述抑制剂包括小干扰核酸分子(siRNA)、shRNA表达载体、或反义核酸分子。这些抑制剂不仅能够降低所述多聚核酸分子的表达水平，也能够改变组织分化或疾病的发生。更优选的，所述小干扰核酸分子选自SEQ ID NO：300-SEQ ID NO：327所示的核酸序列、或其化学修饰产物，所述反义核酸选自SEQ ID NO：240-SEQ ID NO：253所示的核酸序列、或其化学修饰产物。所述化学修饰为如下修饰中的至少一种：1)对核酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；2)对核酸序列中核苷酸的核糖的2’-OH的修饰；3)对核酸序列中核苷酸的碱基的修饰。

在反义核酸研究中，各种化学修饰方法很多，其中又以硫代和甲氧代修饰的研究最为全面。这两种化学修饰能够有效地抑制核酸酶对反义核酸分子的降解，保持其生物学活性；此外，硫代反义核酸还能显著提高RNA酶降解其杂交RNA链的活性。应当明确的是，任何能够增加反义核酸分子稳定性和提高其生物利用度的化学修饰方法都可以应用于本发明，如胆固醇修饰、PEG修饰等。优选的，本发明中反义核酸分子的化学修饰包括硫代修饰、2’-甲氧基修饰、胆固醇修饰中的一种或几种。

对于小干扰核酸(siRNA)而言，所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰和硼烷化磷酸盐修饰。这两种修饰均能显著提高siRNA结构的稳定性，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。

所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2’-OH的修饰，即在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如，2’-氟代修饰、2’-氧甲基修饰、2’-氧亚乙基甲氧基修饰、2，4’-二硝基苯酚修饰、锁核酸(LNA)、2’-氨基修饰、2’-脱氧修饰。这些修饰可以提高siRNA的生物利用度、与靶序列的亲和性、以及抗核酸酶降解能力。

此外，为了促进抑制剂进入细胞，可以在以上修饰的基础上，在小干扰核酸分子或反义核酸分子中或其末端引入胆固醇、聚乙二醇等亲脂性基团，提高抑制剂的细胞膜穿透能力。

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有安全有效量的上述至少一种抑制剂和药学上可接受的载体或赋形剂。优选的，所述抑制剂是小干扰核酸分子或反义核酸分子。本发明提供的药物组合物可用于治疗包括肿瘤在内的与分化相关的疾病；优选的，所述疾病包括脂肪瘤、子宫平滑肌肉瘤、间质瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺样囊性癌、或II型糖尿病。所述载体或赋形剂包括但不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、阳离子脂质体、阳性高分子聚合物及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以根据需要被制成多种剂型，如针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备的针剂。所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的成分，即有合理的效益/风险比的物质。

本发明的有益效果

本发明一方面分离了一种多聚核酸分子，该多聚核酸分子可作为组织分化、尤其是脂肪组织分化的标志物和多种疾病的检测标志物而得到应用；另一方面，本发明提供了所述多聚核酸分子的检测方法和系统，该方法和系统能够特异地检测到低丰度的所述多聚核酸分子；另一方面，本发明提供了能够降低所述多聚核酸分子表达水平的抑制剂，以及包含该抑制剂的药物组合物。

附图说明

图1 3T3-L1前脂肪细胞诱导分化的油红O染色

图2 3T3-L1前脂肪细胞诱导分化中PPARα和CEBP的表达变化

图3多聚核酸分子(TAR)的组织表达谱

图4多聚核酸分子(TAR)与PPARα的共调控

图5利用siRNA降低多聚核酸分子(TAR)的表达

图6利用反义核酸降低多聚核酸分子(TAR)的表达

图7利用shRNA表达载体降低多聚核酸分子(TAR)的表达

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明所使用的DNA寡聚核酸由Invitrogen北京分公司合成，所使用的RNA寡聚核酸由广州市锐博生物科技有限公司合成。

表1基因表达检测引物组合

TAR01检测引物组合：

TAR01正向引物：5’-ATCCATCTCCCCTACCCATC (SEQ ID NO：200)

TAR01反向引物：5’-TGCAGAGGACTCACAACTGG (SEQ ID NO：201)

TAR08检测引物组合：

TAR08正向引物：5’-GGTGCAGTTTTGCACTGAGA (SEQ ID NO：202)

TAR08反向引物：5’-GATGGAGAGAAAGGAAGGGG (SEQ ID NO：203)

TAR16检测引物组合：

TAR16正向引物：5’-CCTAGTGCCTTTCTGCCTTG (SEQ ID NO：204)

TAR16反向引物：5’-TGGGGTGATTGTGTAGGGAT (SEQ ID NO：205)

TAR31检测引物组合：

TAR31正向引物：5’-CAAGTGGTTCCGGATTCTGT (SEQ ID NO：206)

TAR31反向引物：5’-CCGTGAAATGAAGTGGTGTG (SEQ ID NO：207)

TAR54检测引物组合：

TAR54正向引物：5’-GCATTTAATTGGTGCTGGCT (SEQ ID NO：208)

TAR54反向引物：5’-GACCCTTCTCCTAGCTGCCT (SEQ ID NO：209)

Actin检测引物组合：

Actin正向引物：5’-GAAGAGCTATGAGCTGCCTGA (SEQ ID NO：210)

Actin反向引物：5’-CTCATCGTACTCCTGCTTGCT (SEQ ID NO：211)

PPARα检测引物组合：

PPARα正向引物：5’-AAGAGCTGACCCAATGGTTG (SEQ ID NO：212)

PPARα反向引物：5’-ACCCTTGCATCCTTCACAAG (SEQ ID NO：213)

hTAR1检测引物组合：

hTAR1正向引物：5’-GGCTACGCTCTCCTCTTTCC (SEQ ID NO：214)

hTAR1反向引物：5’-TGAACCAGAGAGGAGCTTGTT (SEQ ID NO：215)

hTAR2检测引物组合：

hTAR2正向引物：5’-TTGGAGCTGAGGGTAGCTGT (SEQ ID NO：216)

hTAR2反向引物：5’-GAGCAGGGAATTGTGGAAAA (SEQ ID NO：217)

hTAR3检测引物组合：

hTAR3正向引物：5’-TGCTTGTGACTAGCTAAGGAGGA (SEQ ID NO：218)

hTAR3反向引物：5’-CGCCTGGCCTTGAATAAATA (SEQ ID NO：219)

表2反义核酸序列表

TAR01-As1：5’-AACCTTGTGGGCTATATAAC (SEQ ID NO：240)

TAR01-As2：5’-CCCTACCCCCACCTCAAACT (SEQ ID NO：241)

TAR01-As3：5’-CTCAAATCAGCACAGATGTG (SEQ ID NO：242)

TAR08-As1：5’-CCTATTCAACTGGGCTCAGC (SEQ ID NO：243)

TAR08-As2：5’-ACCCAGTCCAGCTTCAAGAT (SEQ ID NO：244)

TAR08-As3：5’-TCATACTTAGCACAGCTTCT (SEQ ID NO：245)

TAR16-As1：5’-CATTCTAGGCGAGAAAGCAA (SEQ ID NO：246)

TAR16-As2：5’-TGCCTGTCAGGAAGGTAGCC (SEQ ID NO：247)

TAR16-As3：5’-TGGTCTACAGAGTGAGTTCC (SEQ ID NO：248)

TAR31-As1：5’-GCAACAGCCAGGTGTGCCTG (SEQ ID NO：249)

TAR31-As2：5’-GCAGGAAGGATAATGCCACC (SEQ ID NO：250)

TAR31-As3：5’-GTGTTTGCCAGCATGCATGT (SEQ ID NO：251)

TAR54-As1：5’-CAGCACTTGGGAGGCAGAGG (SEQ ID NO：252)

TAR54-As2：5’-TGCTTGGCCCAGGGAGTGGC (SEQ ID NO：253)

实施例一、3T3-L1前脂肪细胞体外诱导分化

3T3-L1前脂肪细胞的培养和诱导分化在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素的DMEM培养液中进行3T3-L1前脂肪细胞培养和传代，隔天换一次培养液。当细胞培养到80-90％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，然后将消化产物接种到24孔培养板中，待细胞长至融合后，继续培养2天。随后开始培养细胞的诱导分化，将培养基换成含有0.5mM 1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(Sigma，St.Louis，MO)、1uM地塞米松(Sigma)和167nM胰岛素(Sigma)的DMEM培养基；培养2天后，再将培养基换成仅含167nM胰岛素的DMEM培养基，继续培养2天，在诱导分化的第4天，将培养基换成普通的DMEM培养基进行后续培养。

油红O染色为了监测3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化过程，在培养的第0天、14天、和21天分别收获一定量的细胞，用冷PBS溶液洗涤3次，然后在3.7％的福尔马林溶液中固定2分钟，在室温条件下用油红O染液孵育1小时进行染色。染色完成后，用水冲洗，在倒置显微镜下进行观察照相(图1)。实验结果表明，诱导分化21天后，90％的3T3-L1细胞呈现脂肪细胞表型，细胞内可见明显脂滴，表明3T3-L1前脂肪细胞被成功地诱导分化成为成熟的脂肪细胞。

其他分化相关指标的监测除了检测成熟脂肪细胞中的脂滴情况以外，发明人还进一步分析了在脂肪细胞分化过程中发挥重要调控作用的两个关键转录调控因子(PPARα和CEBP)的表达。按照实施例三中描述的方法，以Actin为内参，发明人利用实时荧光定量RT-PCR检测了这两个因子在诱导分化的第0天、14天和21天的表达水平，结果如图2所示。与文献报道的情况一致，这两个转录因子的表达量随着分化的进程逐步升高，表明在发明人所建立的实验条件下，3T3-L1前脂肪细胞能够被高效地诱导分化成为成熟的脂肪细胞。

实施例二、多聚核酸分子(TAR)在脂肪分化过程中的表达变化

PolyA-minus RNA转录本分离按照实施例一描述的实验方案，发明人进行了3T3-L1前脂肪细胞的体外诱导分化，在分化的第0天、第14天和第21天分别收获处于不同分化阶段的培养细胞1×10⁶。利用购自北京博迈德生物生物技术发展公司的离心柱型RNApure试剂盒，提取细胞总RNA；然后利用购自北京坚诚达科技有限公司的核糖体RNA去除试剂盒去除18s和28s核糖体RNA，随后用oligo-dT杂交分离法去除信使RNA，用NEB公司的RNase free的DNase I(Cat：M0303S)消化残留的基因组DNA，最终获得polyA-minus RNA转录本样本。

高通量转录本测序从分化第0天、第14天和第21天获得的每个polyA-minus RNA转录本样本中，取2ug交由浙江加州国际纳米技术研究院系统生物学平台进行高通量转录本测序，测序平台为Illumina公司1G Illumina genome analyzer。与传统的测序技术相比，高通量转录本测序技术的一个重要的技术优势是通过对测序数据的分析，可以精确计算基因转录本的表达丰度。发明人采用最常用的计算方式(RPKM，Reads Per Kilobase oftranscript per Million mapped reads)，计算每百万个测序片段中分布在1kb基因组区域内的片段数，用于表示转录本的表达丰度。计算结果表明，与前脂肪细胞相比，本发明所述的分离的多聚核酸分子(TAR)(SEQ ID NO：1)的表达丰度在成熟脂肪细胞中提高了19倍，表明该转录本的表达与脂肪细胞分化显著相关。

实施例三、多聚核酸分子(TAR)的表达及功能分析

组织RNA提取及表达谱分析获得手术分离的小鼠肝脏、心脏、肺、肾脏、脑骨骼肌、小肠、及脂肪等主要脏器和组织，用NORGEN公司的动物组织RNA纯化试剂盒提取总RNA，并进行定量。

利用实时荧光定量RT-PCR和表1所列的基因表达检测引物组合(TAR01、TAR16、和TAR54)，检测上述组织中多聚核酸分子(TAR)的表达量。具体步骤如下：

1)RNA逆转录：使用天根生化科技公司的逆转录试剂盒(TIANScript M-MLV，cat：ER104-03)进行RNA样本的逆转录反应，具体按照试剂盒说明书的方法进行，步骤如下：取1微克提取的总RNA样本，加入2μl(10μM)6碱基随机逆转录引物，2μl dNTP(10mM)，混匀后置70℃水浴变性5分钟；冰上放置3分钟后取出，加入4μl5×First-Strand Buffer，0.5μlRNase inhibitor(40U/μl)，1μl M-MLV(200U/μl)，总体积为20μl；混匀后短暂离心，置于Eppendorf PCR仪中进行逆转录反应，反应参数为25℃，10分钟；42℃，50分钟；95℃，5分钟；随后置于4℃保存。其中，RNase inhibitor(cat#N211)为Promega公司的产品。

2)实时荧光定量PCR：使用天根生化科技公司的的HotMaster Taq DNApolymerase(cat#：ET106-01-01)对样本中多聚核酸分子(TAR)的表达进行定量检测，具体方法按产品说明书进行，步骤如下：取2μl逆转录产物，加入2.5μl 10×HotMaster TaqBuffer，0.5μl(10μM)上游引物，0.5μl(10μM)下游引物，1μl dNTP混合物(各2.5μM)，1μlSYBR Green I(5×)，0.2μl HotMaster Taq DNA polymerase(2.5u/μl)，最后加入17.3μlddH2O，反应总体积为25μl。混匀后短暂离心，置于Eppendorf PCR仪中进行PCR扩增反应，反应参数为95℃预变性2分钟，95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸30秒；循环次数为40个循环。每个反应设置3个重复。

3)数据分析：对同一样本分别检测其中目标RNA及内参RNA(actin)的表达，分别用TAR01、TAR16、TAR54引物组合检测多聚核酸分子(TAR)的表达，用actin检测引物组合检测内参的表达；以内参的表达量为基准，对目标RNA的表达进行归一化处理；随后使用本领域通常使用的delta delta Ct法对目标RNA的表达量进行定量。本实验以Actin为内参。具体方法和步骤可以参见文献：Livak KJ and Schmittgen TD.Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method.Methods.2001Dec；25(4)：402-408。

图3所示的实验结果表明多聚核酸分子(TAR)在不同小鼠组织中呈现出组织特异性的表达分布，在脂肪组织中的表达丰度最高；并且其组织分布谱与PPARα一致。

多聚核酸分子(TAR)与PPARα的共调控研究为了进一步研究多聚核酸分子(TAR)与在脂肪组织分化中起关键作用的PPARα之间的表达调控关系，发明人在分化的早期选取了8个时间点，利用上述方案和TAR01、TAR16、TAR54检测引物组合，对多聚核酸分子(TAR)与PPARα的表达调控关系进行了分析，图4所示的实验结果表明他们之间存在显著的共调控关系。

实施例四多聚核酸分子(TAR)在疾病组织(细胞模型)中的表达

利用实施例三所述的方法，分别检测35例人体组织中多聚核酸分子(TAR)的表达水平，其中包括脂肪瘤组织、子宫平滑肌肉瘤组织、间质瘤组织、骨肉瘤组织、腺样囊性癌组织、血管粘液瘤组织及正常脂肪组织各5例。所用检测引物为SEQ ID NO：214-SEQ ID NO：219。与人体正常脂肪组织相比，本发明所述的多聚核酸分子(TAR)的表达量在脂肪瘤组织、子宫平滑肌肉瘤组织、间质瘤组织、骨肉瘤组织、腺样囊性癌组织、血管粘液瘤组织中均显著升高，上升幅度在5-7倍之间，表明本发明所述的多聚核酸分子(TAR)与人类疾病密切相关，可以作为人类疾病的诊断标志物和治疗靶点得到应用。

实施例五、利用siRNA降低多聚核酸分子(TAR)的表达

利用BLOCK-iT^TM RNAi Designer(Invitrogen)程序，发明人设计了针对所述多聚核酸分子(TAR)特异的siRNA分子，具体序列如表3所示。

转染前一天，将3T3-L1细胞接种于6孔培养板中，使细胞贴壁后的融合度达到60-70％。按照操作手册的要求，使用Invitrogen公司的Lipofectamine^TM RNAiMAX转染试剂进行细胞转染实验。对于6孔培养板的每个孔，将100pmol siRNA在400μlOpti-MEM(GIBCO)细胞培养液中制备RNAiMAX/siRNA混合物，室温静置20分钟后，将RNAiMAX/siRNA混合物加入到6孔板中；转染4个小时后，加入正常细胞培养基进行培养。培养2天后，进行第二次转染。在分化诱导培养液中，直接加入RNAiMAX/siRNA混合物，继续培养2天后，收获细胞，进行RNA表达分析。RNA表达量的检测具体参见实施例三。

图5所示的实验结果表明，TAR01-siRNA2、TAR01-siRNA3、TAR08-siRNA2、TAR08-siRNA3、TAR16-siRNA1、TAR31-siRNA2、TAR31-siRNA3和TAR54-siRNA1均能有效抑制目标转录本的表达量。

实施例六、利用反义核酸降低脂多聚核酸分子(TAR)的表达

发明人进一步设计了针对所述多聚核酸分子(TAR)的反义核酸分子，具体如表2所示。以反义核酸分子替代实施例五中的siRNA分子，按照实施例五所述的方案，进行细胞转染和RNA表达检测。

图6所示的实验结果表明，反义核酸分子TAR01-As2、TAR08-As1、TAR16-As1、TAR16-As2和TAR54-As2均能有效抑制目标基因的表达。

实施例七、利用shRNA表达载体降低多聚核酸分子(TAR)的表达

发明人进一步设计了针对所述多聚核酸分子(TAR)的载体表达的shRNA分子，具体如表4所示。

shRNA表达载体的构建：将按照表4所列序列合成的寡聚DNA核苷酸链，用去离子水溶解，配置成1mg/ml的溶液。取对应的寡核苷酸链溶液各2ul，加入到46ul 1×PBS溶液中，90℃条件下变性3分钟，然后在1小时时间内使其温度缓慢降温至37℃，互补链退火后获得双链DNA片段。用Bam Hl和Hind III限制性内切酶将pSilencer^TM4.1-CMV neo载体(Invitrogen，Catalog：AM5779)酶切，回切线性化的载体。将获得的双链DNA片段与线性化的载体在16℃条件下进行过夜连接，以1∶5的载体∶目的片断的比例设定连接反应，第二天进行大肠杆菌转化及菌落PCR鉴定，挑选出阳性克隆进行测序测定，测序正确的质粒克隆用于后续试验。

以shRNA表达载体替代siRNA分子，按照实施例五所述的方案，进行细胞转染和RNA表达检测。

图7所示的实验结果表明，TAR01-shRNA2、TAR01-shRNA3、TAR08-shRNA2、TAR08-shRNA3、TAR16-shRNA3、TAR31-shRNA1和TAR54-shRNA1均能有效降低目标基因的表达。

实施例八、用于多聚核酸分子(TAR)表达的实时荧光定量RT-PCR试剂盒

用于多聚核酸分子(TAR)表达水平检测的实时荧光定量RT-PCR试剂盒包括以下成分：

1)逆转录酶及其反应缓冲液，缓冲液成分及浓度如下：1M Tris(pH 8.5)，10mM；1MHCl，2.94mM；1M KCl，50mM；1M MgCl₂，2.5mM；10mM dNTP，200μM；50×ROX，0.02×；ddH2O；

2)逆转录及PCR扩增引物组合：逆转录引物：6碱基随机逆转录引物；正向引物：

5’-GGCTACGCTCTCCTCTTTCC (SEQ ID NO：214)；反向引物：

5’-TGAACCAGAGAGGAGCTTGTT(SEQ ID NO：215)；

3)DNA聚合酶；

4)参考样本；

5)试剂盒使用说明书。

Claims (4)

1.一种分离的多聚核酸分子，其特征在于所述多聚核酸分子为SEQ ID NO:1所示核酸序列的多聚核酸分子。

2.一种能降低权利要求1所述多聚核酸分子表达水平的抑制剂，所述抑制剂为小干扰核酸分子TAR01-siRNA2、TAR01-siRNA3、TAR08-siRNA2、TAR08-siRNA3、TAR16-siRNA1、TAR31-siRNA2、TAR31-siRNA3和TAR54-siRNA1，序列如SEQ ID No 302-305、308-313、320-325所示。

3.一种能降低权利要求1所述多聚核酸分子表达水平的抑制剂，所述抑制剂为shRNA表达载体，其中的shRNA为TAR01-shRNA2、TAR01-shRNA3、TAR08-shRNA2、TAR08-shRNA3、TAR16-shRNA3、TAR31-shRNA1和TAR54-shRNA1，序列如SEQ ID No 352-355、358-361、366-369、374-375所示。

4.一种能降低权利要求1所述多聚核酸分子表达水平的抑制剂，所述抑制剂为反义核酸分子TAR01-As2、TAR08-As1、TAR16-As1、TAR16-As2和TAR54-As2，序列如SEQ ID No 241、243、246、247、253所示。