CN112675189B - 一种LncRNA LOC102555148的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种LncRNA LOC102555148的应用，LncRNA LOC102555148用于制备抑制BMSCs缺氧性凋亡，进而提高BMSCs的移植疗效的药物。本发明中LncRNA LOC102555148在BMSCs缺氧性凋亡中起保护作用，LncRNA LOC102555148通过抑制BMSCs缺氧性凋亡，促进BMSCs在缺氧环境下的存活，从而提高BMSCs的移植疗效。因此，LncRNA LOC102555148可用于制备抑制BMSCs缺氧性凋亡的药物，具有广阔的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于LncRNA技术领域，具体涉及一种LncRNA LOC102555148的应用。
背景技术
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有强大的再生能力，已用于多种缺血缺氧性疾病的移植治疗。但是，移植的BMSCs在病灶区缺氧微环境中存在高凋亡现象，导致其移植疗效受限，如何抑制BMSCs缺氧性凋亡是提高其移植疗效的关键。目前尚无杜绝BMSCs缺氧性凋亡的药物。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类转录本长度在200nt-100kb之间的非编码RNA分子，它们能以序列特异性方式调节凋亡相关基因表达，进而干预细胞凋亡等多种生命活动。LncRNA在抑制BMSCs缺氧性凋亡中的应用，仍处于研发阶段，需要不断的探索和研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种LncRNALOC102555148的应用，该LncRNA LOC102555148在BMSCs缺氧性凋亡中起保护作用，LncRNALOC102555148通过抑制BMSCs缺氧性凋亡，促进BMSCs在缺氧环境下的存活，从而提高BMSCs的移植疗效。因此，LncRNA LOC102555148可用于制备抑制BMSCs缺氧性凋亡的药物，具有广阔的临床应用前景。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种LncRNA LOC102555148的应用，所述LncRNA LOC102555148用于制备抑制BMSCs缺氧性凋亡，进而提高BMSCs的移植疗效的药物。
优选地，所述药物中含有包含LncRNA LOC102555148序列的质粒或者包含LncRNALOC102555148序列的慢病毒表达载体。
优选地，所述LncRNA LOC102555148具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明的LncRNA LOC102555148在BMSCs缺氧性凋亡中起保护作用，LncRNALOC102555148通过抑制BMSCs缺氧性凋亡，促进BMSCs在缺氧环境下的存活，从而提高BMSCs的移植疗效。因此，LncRNA LOC102555148可用于制备抑制BMSCs缺氧性凋亡的药物，具有广阔的临床应用前景。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明实施例1的敲除LncRNA LOC102555148后，Annexin V-FITC/PI双染色法检测BMSCs缺氧性凋亡图。
图2为本发明实施例1的敲除LncRNA LOC102555148后，TUNEL染色法检测BMSCs缺氧性凋亡图。
图3为本发明实施例1的过表达LncRNA LOC102555148后，Annexin V-FITC/PI双染色法检测BMSCs缺氧性凋亡图。
图4为本发明实施例1的过表达LncRNA LOC102555148后，TUNEL染色法检测BMSCs缺氧性凋亡图。
图5为本发明实施例2的BMSCs移植术后48小时，GFP免疫荧光检测移植BMSCs在股骨头坏死区缺氧环境中的凋亡图。
图6为本发明实施例2的BMSCs移植术后48小时，TUNEL染色检测移植BMSCs在股骨头坏死区缺氧环境中的凋亡图。
图7为本发明实施例2的BMSCs移植术后12周，大体标本观察股骨头坏死区的修复情况图。
图8为本发明实施例2的BMSCs移植术后12周，HE染色检测股骨头坏死区的新骨形成面积图。
图9为本发明实施例2的BMSCs移植术后12周，Masson染色检测股骨头坏死区的新骨形成图。
具体实施方式
实施例1
本实施例为LncRNA LOC102555148的应用，为体外实验，所述LncRNALOC102555148用于制备抑制BMSCs缺氧性凋亡的药物，所述药物中包含LncRNALOC102555148序列的质粒或者包含LncRNA LOC102555148序列的慢病毒表达载体；
所述LncRNA LOC102555148具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；
所述LncRNA LOC102555148为长链非编码RNA LOC102555148，BMSCs为骨髓间充质干细胞。
体外实验：
试验A：
分离培养原代BMSCs，采用CRISPR/Cas9技术敲除BMSCs的LncRNA LOC102555148，然后对BMSCs进行缺氧(0％氧气、95％氮气和5％二氧化碳)处理48小时，实验分为3组：未敲除LncRNA LOC102555148(正常氧浓度)、未敲除LncRNA LOC102555148(缺氧)、敲除LncRNALOC102555148(缺氧)，最后采用TUNEL染色法和Annexin V-FITC/PI双染色法检测各组BMSCs凋亡情况，试验表明，与未敲除LncRNA LOC102555148(缺氧)组相比，敲除LncRNALOC102555148的BMSCs遭受缺氧后，细胞凋亡率显著增加(TUNEL和Annexin V-FITC/PI阳性细胞数量增加)。
如图1所示，Annexin V-FITC/PI双染色法检测各组BMSCs凋亡情况，图中a为未敲除LncRNA LOC102555148(正常氧浓度)，b未敲除LncRNA LOC102555148(缺氧)，c为敲除LncRNA LOC102555148(缺氧)。如图2所示，TUNEL染色法检测各组BMSCs凋亡情况，图中a为未敲除LncRNA LOC102555148(正常氧浓度)，b为未敲除LncRNA LOC102555148(缺氧)，c为敲除LncRNA LOC102555148(缺氧)。由图可知，正常氧浓度培养的BMSCs凋亡率约为(6.11±2.15)％，BMSCs缺氧后细胞凋亡率约为(50.55±2.86)％，当敲除BMSCs的LncRNALOC102555148后进行缺氧处理，细胞凋亡率进一步升高至(65.48±3.01)％，差异显著，有统计学意义(P<0.001)。本试验说明，敲除LncRNA LOC102555148，可增加BMSCs缺氧性凋亡。
试验B：
分离培养原代BMSCs，采用LncRNA LOC102555148过表达慢病毒转染BMSCs，然后对BMSCs进行缺氧(0％氧气、95％氮气和5％二氧化碳)处理48小时，实验分为3组：未过表达LncRNA LOC102555148(正常氧浓度)、未过表达LncRNA LOC102555148(缺氧)、过表达LncRNA LOC102555148(缺氧)，最后采用TUNEL染色法和Annexin V-FITC/PI双染色法检测各组BMSCs凋亡情况，试验表明，与未过表达LncRNA LOC102555148(缺氧)组相比，过表达LncRNA LOC102555148的BMSCs遭受缺氧后，细胞凋亡率显著下降(TUNEL和Annexin V-FITC/PI阳性细胞数量减少)。
如图3所示，Annexin V-FITC/PI双染色法检测各组BMSCs凋亡情况，图中a为未过表达LncRNA LOC102555148(正常氧浓度)，b为未过表达LncRNA LOC102555148(缺氧)，c为过表达LncRNA LOC102555148(缺氧)。如图4所示，TUNEL染色法检测各组BMSCs凋亡情况，图中a为未过表达LncRNA LOC102555148(正常氧浓度)，b为未过表达LncRNA LOC102555148(缺氧)，c为过表达LncRNA LOC102555148(缺氧)。由图可知，正常氧浓度培养的BMSCs凋亡率约为(7.08±1.96)％，BMSCs缺氧后细胞凋亡率约为(50.57±2.13)％，当BMSCs过表达LncRNA LOC102555148后进行缺氧处理，细胞凋亡率降至(17.85±2.66)％，差异显著，有统计学意义(P<0.001)。本试验说明，LncRNA LOC102555148可抑制BMSCs缺氧性凋亡。
因此，LncRNA LOC102555148用于制备抑制BMSCs缺氧性凋亡的药物，所述药物中包含LncRNA LOC102555148序列的质粒或者包含LncRNA LOC102555148序列的慢病毒表达载体，用于抑制BMSCs缺氧性凋亡。
实施例2
本实施例为Lnc LOC102555148的应用，为体内实验，所述Lnc LOC102555148用于制备抑制BMSCs缺氧性凋亡，进而促进移植BMSCs在股骨头坏死区缺氧环境中的存活，从而显著提高BMSCs对股骨头坏死的移植疗效的药物，所述药物中包含LncRNA LOC102555148序列的质粒或者包含LncRNA LOC102555148序列的慢病毒表达载体；
所述LncRNA LOC102555148具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；
试验A：
首先分离培养原代BMSCs，在体外采用CRISPR/Cas9技术敲除BMSCs的LncRNALOC102555148，或者采用LncRNA LOC102555148过表达慢病毒转染BMSCs以过表达LncRNALOC102555148，并采用绿色荧光蛋白(GFP)标记所有的BMSCs。然后建立SD大鼠股骨头坏死模型，并检测股骨头坏死区氧浓度约为0％，因此，该股骨头坏死区可以作为在体的缺氧环境。最后将敲除或过表达LncRNA LOC102555148的BMSCs植入股骨头坏死区的缺氧环境中，实验分为3组：植入BMSCs、植入敲除LncRNA LOC102555148的BMSCs、植入过表达LncRNALOC102555148的BMSCs。术后48小时，取出股骨头组织，采用GFP免疫荧光染色和TUNEL染色检测各组移植的BMSCs在股骨头坏死区的凋亡情况，试验表明，单纯植入BMSCs和植入敲除LncRNA LOC102555148的BMSCs在股骨头坏死区缺氧环境中大量凋亡，而过表达LncRNALOC102555148的BMSCs在股骨头坏死缺氧环境中凋亡率显著减少(TUNEL阳性细胞数量减少，GFP阳性数量增加)。术后12周，取出股骨头组织，将股骨头组织纵行剖开，通过大体标本观察、HE染色和Masson染色评估各组股骨头坏死区的修复情况，试验表明，未植入BMSCs、植入BMSCs和植入敲除LncRNA LOC102555148的BMSCs组，坏死区无明显修复，坏死区内未见新生骨小梁和成熟的骨组织，而植入过表达LncRNA LOC102555148的BMSCs组坏死区已完全修复，骨小梁连续、重建完整，骨组织趋于成熟。
如图5所示，术后48小时，采用GFP免疫荧光染色检测各组移植的BMSCs在股骨头坏死区的凋亡情况，图中a为植入BMSCs，b植入过表达LncRNA LOC102555148的BMSCs，c植入敲除LncRNA LOC102555148的BMSCs。如图6所示，术后48小时，TUNEL染色法检测各组BMSCs凋亡情况，图中a为植入BMSCs，b植入过表达LncRNA LOC102555148的BMSCs，c植入敲除LncRNALOC102555148的BMSCs。由图5-6可知，将BMSCs植入股骨头坏死区缺氧环境中，大量细胞出现凋亡，而过表达LncRNA LOC102555148的BMSCs植入股骨头坏死区缺氧环境中，凋亡率减少，敲除LncRNA LOC102555148的BMSCs植入股骨头坏死区缺氧环境中，凋亡率增加(TUNEL阳性细胞数量增加，GFP阳性数量减少)
如图7所示，术后12周，取出股骨头组织，将股骨头组织纵行剖开，通过大体标本观察各组股骨头坏死区的修复情况，图中a为植入BMSCs，b植入过表达LncRNA LOC102555148的BMSCs，c植入敲除LncRNA LOC102555148的BMSCs。如图8所示，术后12周，取出股骨头组织，采用HE染色评估各组股骨头坏死区的修复情况，图中a为植入BMSCs，b植入过表达LncRNA LOC102555148的BMSCs，c植入敲除LncRNA LOC102555148的BMSCs。如图9所示，术后12周，取出股骨头组织，采用Masson染色评估各组股骨头坏死区的修复情况，图9中a为植入BMSCs，b植入过表达LncRNA LOC102555148的BMSCs，c植入敲除LncRNA LOC102555148的BMSCs。由图7-9可知，植入BMSCs和植入敲除LncRNA LOC102555148的BMSCs组，坏死区无明显修复，坏死区内未见新生骨小梁和成熟的骨组织，而植入过表达LncRNA LOC102555148的BMSCs组坏死区已完全修复，骨小梁连续、重建完整，骨组织趋于成熟。
因此，LncRNA LOC102555148用于制备促进移植BMSCs在股骨头坏死区缺氧环境中的存活，从而显著提高BMSCs对股骨头坏死的移植疗效的药物，所述药物中包含LncRNALOC102555148序列的质粒或者包含LncRNA LOC102555148序列的慢病毒表达载体，用于修复、重建骨组织。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 贵州医科大学附属医院
<120> 一种LncRNA LOC102555148的应用
<130> 2020.11.15
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 289
<212> DNA
<213> 人工合成 (Artificial synthesis)
<400> 1
tcccaccttg atgataatgg actgaacctc tgaaccttca gctctcagaa tatttatgag 60
agtaccacgc ttctcatgtt gcaaagaagg ccaattcaaa atactcatga ctcttcagat 120
tattgatgct tgaccagcaa ggttacaatg agggctggag atccaactca gcttcaccag 180
tgctggtcta gtactctacc actgaactat actcccagcc ttctacagtg attcatagga 240
agagttgttt tctaccaaat tcatgtttat tacatatatg tttaaaaca 289
Claims (2)
1.一种LncRNA LOC102555148的应用，其特征在于，所述LncRNA LOC102555148用于制备抑制骨髓间充质干细胞缺氧性凋亡，进而提高骨髓间充质干细胞的移植疗效的药物；所述LncRNA LOC102555148的核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种LncRNA LOC102555148的应用，其特征在于，所述药物中含有包含LncRNA LOC102555148序列的质粒或者包含LncRNA LOC102555148序列的慢病毒表达载体。
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