CN110960670B - 一种藻蓝蛋白肽在制备抗肺纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种藻蓝蛋白肽在制备抗肺纤维化药物中的应用，其氨基酸序列为PGSSVAVGVGKMKEAALAIV。藻蓝蛋白肽能够明显改善肺纤维化模型小鼠的纤维化程度，保护肺泡结构，降低纤维化过程中的炎症反应，减少肺组织中的胶原沉积。体外实验结果证明，藻蓝蛋白肽能够显著下调TGFβ1诱导的人肺腺癌基底上皮细胞A549的胶原蛋白表达和上皮间充质转化；显著抑制人胚肺成纤维细胞HFL‑1的增殖和向肌成纤维细胞的转化。体内外实验结果均证明藻蓝蛋白肽具有显著的抗肺纤维化功效，具有作为治疗或改善肺纤维化疾病药物的前景。

Description

一种藻蓝蛋白肽在制备抗肺纤维化药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种藻蓝蛋白肽，具体涉及一种具有抗肺纤维化作用的藻蓝蛋白肽及其在制备防治肺纤维化药物和保健品中的应用。

背景技术

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF），是一种原因不明、以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征的疾病。临床表现为呼吸困难逐渐加重，伴有刺激性干咳，偶有痰血、体力衰弱、食欲减退、体质量减轻、消瘦等症状。病情进一步发展，最终因呼吸衰竭而死。现阶段PF患者对传统治疗药物反应欠佳，其发病率及死亡率逐年增高,且生存期较短,愈后极差,几乎与恶性肿瘤无异。

目前治疗用的常规抗肺炎药物如泼尼松、地塞米松等皮质类激素，与安慰剂对比均未能使肺纤维化患者临床症状得到客观改善，疗效欠佳，且存在严重的副作用^[1]。而近些年上市的新药尼达尼布、吡非尼酮等，虽能在一定程度上减缓病程，但存在胃肠道(恶心、腹痛、腹泻)以及光敏反应、神经系统异常、伴随出血风险等严重副作用^[2-3]，因此寻找防治肺纤维化安全有效的药物，一直是国内外药物研究的热点。多肽主要通过蛋白水解降解和肾过滤来清除，水解的产物为氨基酸，因此一般不考虑多肽药物的代谢产物是否有毒性。小分子多肽易于合成改造和优化组合，能很快确定其药用价值，因而在临床应用上具有非常重要的开发价值^[4-5]。

蓝藻藻蓝蛋白(C-phycocyanin，C-PC)是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素，能高效捕获光能，在钝顶螺旋藻中含量较高，具有较强的抗炎症、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤等生理活性。已有文献报道藻蓝蛋白具有抗肺纤维化作用^[6-7]，本发明的藻蓝蛋白肽来源于蓝藻藻蓝蛋白的β亚基，具有20个氨基酸残基，氨基酸序列为PGSSVAVGVGKMKEAALAIV，目前尚未见有其抗肺纤维化活性的报道。

【参考文献】

1.Li Z , Peng S C , Kang J , et al. Effect of corticosteroids uponthe prognosis of idio- pathic pulmonary fibrosis[J]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2010, 29(90):804-807.

2.Rodríguez-Portal, José Antonio. Efficacy and Safety of Nintedanibfor the Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis: An Update[J]. Drugs in R&D, 2017.

3.Sk Ld C M , Bendstrup E , My llRniemi M , et al. Treatment ofidiopathic pulmonary fibrosis: a position paper from a Nordic expert group[J]. Journal of Internal Medicine, 2016.

4.Vlieghe P, Lisowski V, Martinez J,et al. Synthetic therapeuticpeptides: science and market.[EB/OL]. Drug discovery today:2010:40-56.

5.Fairlie D P , Craik D J , Liras S , et al. The future of peptide-based drugs.[J]. Chemical Biology & Drug Design, 2013, 81(1):136-147.

6.孙英新, 张娟, 于功昌, et al. 钝顶螺旋藻藻蓝蛋白抗百草枯诱导大鼠肺纤维化的研究[J]. 中华劳动卫生职业病杂志, 2012, 30(9):650-655.

7、Li C C, Yu Y, Li W J, et al. Phycocyanin attenuates pulmonaryfibrosis via the TLR2-MyD88-NF-κB signaling pathway [J]. Sci Rep, 2017, 7(1), 5843

发明内容

本发明的目的在于提供一种藻蓝蛋白肽的新用途：用于制备防治肺纤维化药物和保健品，或作为防治肺纤维化药物和保健品的有效成分，或利用藻蓝蛋白肽作为防治肺纤维化药物前体改造，或与治疗肺纤维化药物联合应用治疗肺纤维化。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种藻蓝蛋白肽在制备防治肺纤维化药物和保健品中的应用。

一种藻蓝蛋白肽，具有如SEQ ID NO ：1 所示的氨基酸序列，即PGSSVAVGVGKMKEAALAIV,

可采用现有技术领域常规方法对藻蓝蛋白肽进行修饰。

所述的藻蓝蛋白肽可以通过合成或其它方法产生。

所述的多肽可以通过多种给药方式防治肺纤维化，包括静脉、皮下、肌肉、腹腔、口服给药。

本发明的有益效果在于：

1、本发明所述的藻蓝蛋白肽首次发现能有效抑制肺纤维化的发生发展，具有抗肺纤维化作用。

2、本发明所说的藻蓝蛋白肽的医药用途是用于制备防治肺纤维化药物和保健品，或作为防治肺纤维化药物和保健品的有效成分，或利用藻蓝蛋白肽作为防治肺纤维化药物前体改造，或与治疗肺纤维化药物联合应用治疗肺纤维化。

3、本发明所述的防治肺纤维化的药物、保健品含有藻蓝蛋白肽，能够制成粉剂或注射针剂或口服液等多种形式，可以单独作为成品使用，也可以作为有效成分与生理盐水、葡萄糖溶液等佐剂配合成组合物，还可以与目前使用的治疗肺纤维化药物联合使用。

下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1藻蓝蛋白肽纯度鉴定（A）及分子量鉴定（B）。

图2各组实验小鼠肺组织切片( HE染色×200 )。A：正常组；B：模型组；C：低剂量组（藻蓝蛋白肽 1mg/Kg）；D：中剂量组（藻蓝蛋白肽 3mg/Kg）；E：高剂量组（藻蓝蛋白肽 9mg/Kg）；F：阳性药组；G：藻蓝蛋白组。

图3各组实验小鼠肺组织切片( Masson染色×200)。A：正常组；B：模型组；C：低剂量组（藻蓝蛋白肽 1mg/Kg）；D：中剂量组（藻蓝蛋白肽 3mg/Kg）；E：高剂量组（藻蓝蛋白肽9mg/Kg）；F：阳性药组；G：藻蓝蛋白组。

图4 Western-bloting（WB）检测各组实验小鼠肺组织中IL6、TNF-α、Col I、α-SMA和TGF-β1蛋白表达量，其中A：WB实验图谱；B：IL6/GADPH；C：TNF-α/GADPH;D：Col I/GADPH；E：α-SMA/GADPH；F：TGF-β1/GADPH蛋白表达量统计分析结果。

图5 藻蓝蛋白肽对肺纤维化小鼠肺组织中羟脯氨酸含量的影响。

图6 藻蓝蛋白肽对TGF-β1诱导的A549细胞形态的影响。A：正常组；B：模型组；C：低剂量组（藻蓝蛋白肽10µM）；D：高剂量组（藻蓝蛋白肽30µM）。

图7 藻蓝蛋白肽对TGF-β1诱导的A549细胞胶原蛋白Collagen I表达的影响。

图8 Western-bloting（WB）检测藻蓝蛋白肽对TGF-β1诱导的A549细胞上皮间充质转化相关标志性蛋白表达量。A:WB实验图谱；B:N-cadherin/GADPH表达量统计分析结果；C：E-cadherin /GADPH表达量统计分析结果；D：Vimentin/GADPH表达量统计分析结果；E:α-SMA/GADPH蛋白表达量统计分析结果。

图9 藻蓝蛋白肽对HFL-1细胞增殖的影响。

图10 藻蓝蛋白肽对TGF-β1诱导的HFL-1细胞α-SMA表达的影响。

具体实施方式

一、藻蓝蛋白肽的合成及纯度

所述藻蓝蛋白肽由上海生物工程有限公司合成，纯度为98.9％（图1A），质谱鉴定分子量为1884Da（图1B）。

二、藻蓝蛋白肽抗肺纤维化作用

动物实验

用油酸诱导建立小鼠肺纤维化模型^[8-10]，实验选用清洁级ICR小鼠60只（由扬州大学比较医学中心提供，动物生产许可证号:SCXK(苏)2008-0005）,雄性，4-6周龄，体重20-25g，随机将其分为7组，每组8-9只，分别是正常组，模型组，藻蓝蛋白肽低剂量组（1mg/Kg），藻蓝蛋白肽中剂量组（3mg/Kg），藻蓝蛋白肽高剂量组（9mg/Kg），阳性药组，藻蓝蛋白组（200mg/Kg）。除正常对照组外，其余各组在第0天建立小鼠肺纤维化模型，具体方法为实验前将油酸用含0.1% BSA的生理盐水溶解成的注射液，75%酒精棉消毒小鼠尾部，每只小鼠尾静脉注射0.2μl/g油酸注射液。造模后正常饲养，第3天起开始腹腔注射给药：藻蓝蛋白肽各剂量组（1、3、9mg/Kg）：每天一次，连续28天；阳性药组（地塞米松磷酸钠注射液4mg/Kg，辰欣药业股份有限公司）：每天一次，连续28天；正常组和模型组（生理盐水）：每天一次，连续28天；藻蓝蛋白组（200mg/Kg）灌胃，每天一次，连续28天。于给药后第28日，脱臼处死小鼠，切开颈部及胸部皮肤，沿着胸骨中线剪开胸腔，剪断食道，由肺组织下方（靠背侧）进行剥离，完整取下连有心脏的双肺,在体外分离心脏后剔除脂肪及结缔组织，得到带有气管的完整肺组织，用生理盐水冲洗表面血迹后称重。取右肺置于标记好的EP管中，液氮冻存备用。将左肺经左支气管注入4％的甲醛至肺充盈涨大进行内固定，然后取各组小鼠左下肺放入4％甲醛中固定，逐级酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋后，常规切片，进行HE染色和Masson染色。

HE染色结果显示，正常组肺组织内结构清晰，未见炎症及纤维化表现。模型组呈现纤维化病理状态，小鼠肺泡炎症痕迹明显,主要表现为炎性细胞浸润，肺泡壁明显增厚，间隔增宽，肺泡腔急剧萎缩，大量成纤维细胞和胶原组织沉积，藻蓝蛋白肽组肺组织结构较模型组完整，肺泡内未见明显的炎症细胞，存在少量的纤维灶，纤维化程度明显减轻，且中高剂量组效果尤为明显，低剂量组与藻蓝蛋白组效果相近(图2)。Masson染色显示，正常组肺组织内有少量胶原分布，是细胞外基质的主要组成部分，模型组支气管壁周围和肺泡隔区域，可见蓝色胶原纤维明显增多，呈束状或片状沉积。藻蓝蛋白肽组与模型组相比，胶原纤维沉积明显减少，藻蓝蛋白组效果次之(图3)。组织切片结果均显示，藻蓝蛋白肽能明显改善小鼠肺脏纤维化程度，且效果明显优于藻蓝蛋白组。

肺部损伤早期，组织中的炎症反应是肺纤维化的主要现象，也是纤维化过程中的必要因素，IL6、TNF-α与炎症反应密切相关，其表达量变化的检测可以用来表征藻蓝蛋白肽对肺纤维化炎症反应的影响。过量胶原蛋白，主要是I型胶原蛋白（Col I）使胞外基质过度沉积。α-SMA是肌成纤维细胞的主要标志，致肺组织过度收缩、顺应性下降，最终导致纤维化，其含量能够反映纤维化的程度。转化生长因子（TGF-β）是目前已知的最重要的致纤维化因子，肺纤维化时TGF-β诱导肺间质成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。检测小鼠肺组织中IL6、TNF-α、Col I、α-SMA和TGF-β1的表达量，是评价药物是否具有抗纤维化作用的重要指标。取保存在液氮中的肺部组织，按比例加入提前加好蛋白酶抑制剂的动物组织裂解液，使用匀浆器充分裂解细胞，静置后离心取上清，使用BCA蛋白试剂盒检测总蛋白浓度，分装后-80℃保存，通过免疫印迹法测定蛋白表达量。模型组小鼠肺组织中IL6、TNF-α、Col I、α-SMA和TGF-β1的表达上调，藻蓝蛋白肽使IL6、TNF-α、Col I、α-SMA和TGF-β1水平明显降低（图4），从分子水平证明藻蓝蛋白肽能够抑制肺脏纤维化的发生与发展。

羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4％，在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，羟脯氨酸（HYP）是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。精确称取小鼠肺脏组织湿重30mg，按HYP检测试剂盒（南京建成）说明测定HYP含量。与正常组相比，模型组小鼠肺组织中HYP含量明显升高，有显著性差异（P<0.05）。与模型组相比，藻蓝蛋白肽中高剂量组、阳性药、藻蓝蛋白组小鼠肺组织中HYP含量均有所降低，且高剂量组和阳性药组均与模型组有极显著差异（P<0.01）（图5）。

细胞实验

1、成纤维细胞是由间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。TGF-β诱导肺泡上皮细胞间充质化对肺纤维化的发生发展起重要作用。本实验以药物研究中广泛应用的人肺腺癌肺泡基底上皮细胞A549为体外模型，通过体外细胞实验对藻蓝蛋白肽抗肺纤维化的药理学活性进行鉴定。

（1）藻蓝蛋白肽对TGF-β1诱导的A549细胞形态的影响

取人肺腺癌肺泡基底上皮细胞（A549）培养于10％FBS的1640培养基中，37℃，5％CO₂培养，贴壁后取对数生长期细胞，0.25％胰蛋白酶消化，按照20％细胞密度接种于96孔培养板，待密度达到60%时分组：正常组：0.5% FBS的1640培养基；模型组：TGF-β1( 2ng/ml )；低剂量组：藻蓝蛋白肽（10µM）+TGF-β1( 2ng/ml )；高剂量组：藻蓝蛋白肽（30µM）+TGF-β1(2ng/ml )。藻蓝蛋白肽均使用0.5% FBS的1640培养基溶解，每孔100µl，每组4个复孔。培养24h后光学显微镜观察细胞形态，进行对比分析。

结果表明：与空白正常组对比，单独添加TGF-β1进行诱导A549的模型组，形态有了明显变化，由原来的鹅卵石状细胞发生极化转变成比较明显的梭状细胞，低剂量组多数细胞与正常组形态相似，只有少数的梭形细胞。30µM藻蓝蛋白肽组细胞变成体积大、贴壁更加紧密的形态不规则细胞，与正常组无显著差异（图6）。

（2）藻蓝蛋白肽对TGF-β1诱导的A549细胞胶原蛋白Collagen I表达的影响

取A549细胞培养于10％FBS的1640培养基中，37℃，5％ CO₂培养，贴壁后取对数生长期细胞，0.25％胰蛋白酶消化，按照20％细胞密度接种于6孔培养板，待密度达到60%进行给药，24h后取培养细胞板，弃去培养基，100µl PBS洗3次，3分钟/次；4%甲醛室温固定细胞20分钟；100µl PBS洗3次，5分钟/次；加100µl封闭液，室温1小时；弃去封闭液，不洗，加入100µl稀释的一抗，4℃过夜；回收一抗，100µl PBS洗3次，5分钟/次；暗处加入稀释的荧光二抗，立即放入盒内，避光放置，室温1小时；弃去二抗，100µl PBS洗3次，5分钟/次；加50µlDAPI避光孵育5分钟，对标本进行染核，回收DAPI后，荧光显微镜观察。

结果：与空白正常组对比，经过TGF-β1诱导后的模型组，胶原蛋白Collagen I表达量明显上升，与模型组对比，低剂量组中的胶原蛋白表达量有一定程度的减少，高剂量组的胶原蛋白表达量明显减少（图7）。

（3）藻蓝蛋白肽对TGF-β1诱导的A549细胞上皮间充质转化（EMT）相关标志性蛋白表达影响

取A549细胞培养于10％FBS的1640培养基中，37℃，5％ CO₂培养，贴壁后取对数生长期细胞，0.25％胰蛋白酶消化，按照20％细胞密度接种于6孔培养板，待密度达到60%进行给药，24h后观察细胞，PBS润洗两次，加去离子水将细胞用细胞刮刀刮下，裂解细胞，来回吹打混匀后离心取上清，按比例加入5X loading buffer，金属浴95℃，10min后进行WesternBloting检测EMT相关标志蛋白。

结果显示，经TGF-β1造模处理后的细胞N-cadherin、α-SMA、Vimentin的表达量有明显的上调，E-cadherin则明显下调。而经过藻蓝蛋白肽处理后，与间充质转化相关的N-cadherin、α-SMA、Vimentin蛋白表达量下调，E-cadherin的表达也有明显恢复。说明藻蓝蛋白肽对细胞EMT有显著的逆转效果（图8）。

2、TGF-β1诱导成纤维细胞（FB）增殖以及成纤维细胞转化为肌成纤维细胞（MFB），进一步促进纤维化的发生，而α-SMA是肌成纤维细胞的主要标志物。本实验以人肺成纤维细胞HFL-1为体外模型，通过研究藻蓝蛋白肽对肺成纤维细胞增殖及TGF-β1诱导的成纤维细胞α-SMA表达的影响，为藻蓝蛋白肽在肺纤维化病的防治中的应用提供实验依据。

取人胚肺成纤维细胞（HFL-1）培养于10％FBS的DMEM培养基中，37℃，5％ CO₂培养，贴壁后取对数生长期细胞，0.25％胰蛋白酶消化，按照20％细胞密度接种于96孔培养板，待密度达到60%时分组：正常组：0.5% FBS的DMEM培养基；低剂量组：藻蓝蛋白肽（10µM）；高剂量组：藻蓝蛋白肽（30µM）。藻蓝蛋白肽均使用0.5% FBS的培养基溶解，每孔100µl，每组4个复孔。分别于培养12h、24h、48h后加CCK8继续孵育3h，酶标仪OD450检测吸光值，进行对比分析。免疫荧光法检测藻蓝蛋白肽对TGF-β1诱导的HFL-1细胞α-SMA表达的影响。

结果显示，与空白组对照，藻蓝蛋白肽显著抑制HFL-1细胞增殖，且呈现时间依赖性（图9）。而HFL-1细胞的免疫荧光结果显示， TGF-β1处理后α-SMA的表达量增加，藻蓝蛋白肽干预后显著抑制α-SMA的表达（图10）。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

【参考文献】

8.Zhou Z , Kozlowski J , Schuster D P . Physiologic, Biochemical, andImaging Characteriza- tion of Acute Lung Injury in Mice[J]. American Journalof Respiratory and Critical Care Medicine, 2005, 172(3):344-351.

9.Felippe G D A C , Ribeiro S A , Burth Patrícia, et al. AcuteRespiratory Distress Syndrome: Role of Oleic Acid-Triggered Lung Injury andInflammation[J]. Mediators of Inflammation, 2015, 2015:1-9.

10.周平, 王磊, 何春香, et al. 博来霉素和油酸致大鼠肺纤维化病理模型的比较[J]. 世界最新医学信息文摘, 2015, v.15(87):53-56。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种藻蓝蛋白肽在制备抗肺纤维化药物中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Pro Gly Ser Ser Val Ala Val Gly Val Gly Lys Met Lys Glu Ala Ala

1 5 10 15

Leu Ala Ile Val

20

Claims (3)

1.一种藻蓝蛋白肽在制备预防或治疗肺纤维化疾病药物中的应用，其特征在于所述的

藻蓝蛋白肽的序列为：Pro-Gly-Ser-Ser-Val-Ala-Val-Gly-Val-Gly-Lys-Met-Lys-Glu-Ala-Ala-Leu-Ala-Ile-Val。

2.根据权利要求1所述的藻蓝蛋白肽在制备预防或治疗肺纤维化疾病药物中的应用，其特征在于所述的多肽采用药剂学常规工艺制备成冻干粉剂。

3.根据权利要求1所述的藻蓝蛋白肽在制备预防或治疗肺纤维化疾病药物中的应用，其特征在于所述的多肽通过多种给药方式包括静脉、皮下、肌肉、腹腔给药。

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