CN112138159A - 乳酸脱氢酶在组织炎症和纤维化治疗中的应用 - Google Patents

乳酸脱氢酶在组织炎症和纤维化治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及乳酸脱氢酶在组织炎症和纤维化治疗中的应用。具体而言，本发明提供以乳酸为靶点的减少对象体内或细胞内乳酸水平的试剂在制备治疗或预防炎症以及受益于肺部内皮细胞间质转化和/或上皮细胞间质转化受到抑制的疾病的药物中的应用。本发明还提供以乳酸为靶点的提高体内或细胞内乳酸含量的试剂在制备治疗或预防受益于成纤维细胞活化和/或增殖的疾病的药物中的用途，或在制备用于减少疤痕的美容产品中的应用。

Description

乳酸脱氢酶在组织炎症和纤维化治疗中的应用
技术领域
本发明涉及组织炎症和组织纤维化的治疗，具体涉及乳酸脱氢酶在组织炎症和纤维化治疗中的应用。
背景技术
硬皮病肺纤维化的发生发展是一个复杂的过程，涉及到免疫失调、肺部炎症反应、肺部毛细血管损伤、内皮细胞形态向间质转化、II型肺泡上皮细胞(ATII)表面活性成分丢失致使肺部第一道屏障被破坏、上皮间质转化以及成纤维细胞活化，最终导致大量胶原分泌等几大过程。其复杂的发病机理决定了硬皮病肺纤维化一直是医学界难以攻克的难题，WHO将其列为肺系难治类疾病之一。2014年10月，FDA批准将吡非尼酮(pirfenidone)和尼达尼布(nintedanib)用于治疗特发性肺纤维化，然而这两种药都有很强的毒副作用，其中尼达尼布会增加肝脏的毒副作用，而吡非尼酮对肝脏和肾脏都有很强的毒副作用，且这两种药价格昂贵，治疗成本大。更为糟糕的是，这两种药是针对特发性肺纤维化的治疗，临床上仍然没有一种针对硬皮病肺纤维化的特效药物，尽管环磷酰胺一度被用于治疗硬皮病肺纤维化，但是仍然缺乏足够的证据，尚没有任何一种高质量的临床试验证明服用环磷酰胺的患者病情会有明显改善。
发明内容
本发明提供以乳酸为靶点的减少对象体内或细胞内乳酸水平的试剂在制备治疗或预防炎症以及受益于肺部内皮细胞间质转化和/或上皮细胞间质转化受到抑制的疾病的药物中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述受益于内皮间质转化受到抑制的疾病为心血管疾病，如肺动脉高压、动脉粥样硬化和心肌纤维化；所述受益于上皮细胞间质转化受到抑制的疾病选自：急性呼吸窘迫综合症、肺纤维化、肺损伤、肺动脉高压、肺水肿和肺癌。
在一个或多个实施方案中，所述肺纤维化为硬皮病肺纤维化。
本发明还提供以乳酸为靶点的减少对象体内或细胞内乳酸水平的试剂在制备抑制炎症或肺部内皮细胞间质转化和/或上皮细胞间质转化的药物中的应用。
在上述应用的一个或多个实施方案中，所述试剂选自：
(1)LDHB激动剂；
(2)LDHA抑制剂；和
(3)能清除体内已存在的乳酸的试剂。
在上述应用的一个或多个实施方案中，所述LDHB激动剂选自：LDHB表达载体和能促进宿主细胞自身所携带的LDHB基因表达的核酸分子的表达载体。
在上述应用的一个或多个实施方案中，所述LDHA抑制剂选自：能抑制LDHA表达的试剂，如siRNA、反义RNA、核酶和基因编辑载体，如CRISPR-CAS9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体，和能抑制LDHA活性的试剂，如LDHA的抗体。
在上述应用的一个或多个实施方案中，所述能清除体内已存在的乳酸的试剂为虾青素。
本发明还提供以乳酸为靶点的提高体内或细胞内乳酸含量的试剂在制备治疗或预防受益于成纤维细胞活化和/或增殖的疾病的药物中的用途，或在制备用于减少疤痕的美容产品中的应用。
在上述应用的一个或多个实施方案中，所述受益于成纤维细胞活化和/或增殖的疾病为创伤，包括组织创伤和骨创伤。
在上述应用的一个或多个实施方案中，所述以乳酸为靶点的提高体内或细胞内乳酸含量的试剂选自：
(1)LDHA激动剂；
(2)LDHB抑制剂；和
(3)乳酸或其药学上可接受的盐。
在上述应用的一个或多个实施方案中，所述LDHA激动剂选自：LDHA表达载体和能促进宿主细胞自身所携带的LDHA基因表达的核酸分子的表达载体。
在上述应用的一个或多个实施方案中，所述LDHB抑制剂选自：能抑制LDHB表达的试剂，如siRNA、反义RNA、核酶和基因编辑载体，如CRISPR-CAS9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体，和能抑制LDHB活性的试剂，如LDHB的抗体。
本发明还提供一种祛疤化妆品，所述祛疤化妆品含有乳酸。
附图说明
图1：皮肌炎及皮肌炎肺纤维化患者BALF、小鼠BALF及肺组织的乳酸水平检测。(A)皮肌炎患者及皮肌炎肺纤维化患者的肺泡灌洗液中乳酸水平检测；(B)小鼠肺泡灌洗液中乳酸水平检测；(C)小鼠肺组织匀浆中乳酸水平检测；(Saline，对照生理盐水组；BLM，博莱霉素诱导的肺纤维化模型组；Mean±SD；*，P<0.05，**，P<0.01，***，P<0.001)。
图2：不同处理组小鼠肺组织病理学变化及胶原含量检测。(A)模型小鼠肺组织病理学变化H&E及Masson’s trichrome染色。(B,C)一周及三周模型小鼠肺组织Ashcroft评分。(D,E)一周及三周模型小鼠肺组织胶原含量检测。(Saline，对照生理盐水组；BLM，博莱霉素诱导的肺纤维化模型组；Mean±SD；*，P<0.05；**，P<0.01，***，P<0.001)。
图3：不同处理组小鼠肺组织中基因表达检测、炎症因子水平检测、炎症细胞计数。(A,B)小鼠肺组织中纤维化相关基因表达检测；(C)小鼠肺泡灌洗液中炎症因子的浓度检测；(D)小鼠肺泡灌洗液中炎症细胞计数。
图4：不同处理组小鼠肺组织免疫荧光染色及标志分子基因表达检测。(A,B)小鼠肺组织免疫荧光。(C)小鼠肺组织上皮细胞、内皮细胞、间质细胞标志分子表达检测。
图5：(A)A549细胞在乳酸刺激下细胞形态发生变化。(B)A549细胞在乳酸刺激下上皮细胞、间质细胞标志分子表达检测。(C)A549细胞在乳酸刺激下上皮细胞、间质细胞标志分子蛋白水平检测。(D)A549细胞在乳酸刺激下纤维化相关通路蛋白水平检测。(E)A549细胞在乳酸刺激下炎症相关基因表达检测。(F)A549细胞在乳酸刺激下炎症相关通路蛋白水平检测。(G)HULEC-5a细胞在乳酸刺激下细胞形态发生变化。(H)HULEC-5a细胞在乳酸刺激下内皮细胞、间质细胞标志分子表达检测。(I)HULEC-5a细胞在乳酸刺激下内皮细胞、间质细胞标志分子蛋白水平检测。
图6：(A,B)MRC-5及HFL1细胞在乳酸刺激下纤维化相关通路蛋白水平检测。(C)MRC-5细胞在乳酸刺激下对免疫荧光染色。(D)乳酸诱导MRC-5细胞的增殖检测。
图7：(A)SSc-PF病人的外周血PBMC样本中LDHB基因表达与FVC相关性分析；(B)正常人及SSc-PF病人的外周血PBMC样本中LDHB基因表达检测；(C,D)小鼠肺组织Ldhb基因表达与胶原基因表达相关性分析。
图8：不同处理组LDHB基因表达及蛋白水平检测。(A,B)小鼠肺组织中乳酸脱氢酶LDHB基因的表达；(C,D)小鼠肺组织中乳酸脱氢酶LDHB基因蛋白水平检测及灰度分析。
图9：(A)A549细胞中过表达LDHB基因后乳酸水平检测；(B)A549细胞中过表达LDHB基因后上皮细胞、间质细胞标志分子及纤维化通路蛋白水平检测；(C)A549细胞中过表达LDHB基因后乳酸水平检测；(D)MRC-5细胞中过表达LDHB基因后纤维化通路蛋白水平检测。
图10：(A)AAV2/9-LDHB-LUC感染小鼠肺部荧光检测在不同组中小鼠肺组织Ldhb基因表达检测；(B)生理盐水、博莱霉素组AAV2/9、AAV2/9-Ldhb-LUC感染小鼠肺部，肺组织中LDHB基因蛋白水平检测；(C)小鼠肺组织病理学变化Masson、H&E染色；(D)小鼠肺组织胶原含量检测；(E)小鼠肺组织匀浆乳酸浓度检测；(F)小鼠肺组织纤维化基因表达检测；(G)小鼠肺组织炎症基因表达检测。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
乳酸是糖酵解的终产物，由乳酸脱氢酶催化丙酮酸的可逆反应生成。乳酸脱氢酶(LDH)催化丙酮酸与乳酸之间的转化，参与糖酵解的最后一步反应。LDH在人血清中有5种同工酶，均由4个35kD的亚基组成。LDH的亚基可分为两种类型，骨骼肌型(M型或LDHA)和心肌型(H型或LDHB)，两种亚基以不同比例组成五种四聚体，即LDH1(B4)、LDH2(B3A)、LDH3(B2A2)、LDH4(BA3)和LDH5(A4)。LDHA表达的增加能使LDH更有效地催化丙酮酸转化为乳酸，而LDHB表达的增加则有利于催化乳酸生成丙酮酸。LDH在组织中的分布特点是心、肾以LDH1为主，LDH2次之；肺以LDH3、LDH4为主；骨骼肌以LDH5为主；肝以LDH5为主，LDH4次之。
本发明发现，纤维化的肺组织中乳酸水平上升，而且乳酸可加剧博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化；小鼠肺纤维化模型中LDHB表达降低，LDHB过表达则可以降低乳酸水平，缓解肺纤维化。而且，本发明还发现，乳酸可以促进炎症作用，诱导上皮间质转化、内皮间质转化，并诱导成纤维细胞活化和/或增殖。
因此，本发明以乳酸为靶点，通过减少或增加对象(尤其是人)体内乳酸的含量来实现疾病和/或症状的治疗和/或缓解。
具体而言，在一些实施方案中，本发明以乳酸为靶点，通过减少对象体内乳酸含量来治疗或预防炎症以及受益于肺部内皮细胞间质转化和/或上皮细胞间质转化受到抑制的疾病。受益于内皮间质转化受到抑制的疾病包括但不限于心血管疾病，如肺动脉高压、动脉粥样硬化和心肌纤维化。受益于上皮细胞间质转化受到抑制的疾病包括但不限于急性呼吸窘迫综合症(COPD)、肺纤维化、肺损伤、肺动脉高压、肺水肿和肺癌等。
本文中，肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变；包括病因不明(特发性)的肺纤维化，也称为特发性间质性肺炎(IIP)。特发性间质性肺炎(IIP)中最常见的以肺纤维化病变为主要表现形式的疾病类型为特发性肺纤维化(IPF)。本文的一些实施方案中，肺纤维化是硬皮病肺纤维化。
本文中，可通过给予以乳酸为靶点、能减少对象体内或细胞内乳酸水平的试剂来实现本文所述的治疗、预防或抑制。这类试剂包括能促进现存的乳酸清除的试剂，这类试剂包括但不限于虾青素和CN 109432315A中所披露的白茅根提取物。
由于LDHB过表达则可以降低乳酸水平，因此，以乳酸为靶点、能减少体内或细胞内乳酸水平的试剂还包括LDHB表达载体，其能提高细胞中LDHB的表达水平，从而降低体内或细胞内乳酸水平。本文中，表达载体用于在宿主细胞内表达感兴趣的多肽，如LDHB。本文中，LDHB主要包括人的LDHB，其在UniProtKB上的登陆号为P07195。应理解，LDHB代表了本领域周知的以LDHB命名的乳酸脱氢酶H型亚基，包括那些已知的与登陆号为P07195的LDHB的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸取代、但仍被认为是LDHB且仍具有LDHB的生物学功能的乳酸脱氢酶H型亚基。任何能在宿主体内复制和稳定的质粒和载体都可以用于本发明，包括细菌质粒、噬菌体、酵母质粒和病毒(如腺病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒)等。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子和翻译控制元件。编码序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在真核细胞中表达的启动子。翻译控制元件包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在高等真核细胞中表达LDHB时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。因此，在一些实施方案中，本发明的表达载体中还含有增强子。此外，表达载体可任选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如荧光蛋白。
构建含LDHB编码序列的表达载体的方法为本领域周知。例如，可通过化学合成来得到LDHB的编码序列。或者，可应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法获得LDHB的编码序列。然后将该编码序列克隆到合适的表达载体中。可采用本领域熟知的方法构建含本文所述编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
表达载体还包括含有能促进宿主细胞自身所携带的LDHB基因表达的核酸分子的表达载体。
在一些实施方案中，可给予能提高LDHB酶活的试剂。例如，提高LDHB酶活的方法包括在过宿主细胞内过表达其生物学活性比野生型LDHB增强的LDHB突变体。表达载体的构建如前文所述。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。在一些实施方案中，本发明使用腺相关病毒(AAV)构建表达载体。更进一步的，本发明使用血清型的AAV2/9构建表达载体。
由于LDHA能促进乳酸的产生，因此，减少对象体内乳酸含量的方法也包括抑制LDHA的表达和/或活性。同样地，本文中，LDHA主要包括人的LDHA，其氨基酸序列和编码序列可在Genbank等数据库中得到。应理解，LDHA代表了本领域周知的以LDHA命名的乳酸脱氢酶M型亚基。可给以LDHA的抑制剂，包括能抑制LDHA表达的试剂和抑制其活性的试剂。这类试剂可以是蛋白、核酸和小分子化合物。例如，蛋白可以是抗体；核酸可以是siRNA、反义RNA、核酶和基因编辑载体，如CRISPR-CAS9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体；小分子化合物包括本领域周知的能抑制LDHA酶活的小分子化合物，包括但不限于GNE-14外消旋体(CASNo.：1802977-61-2)、GSK2837808A(CAS No.：1445879-21-9)和FX-11(CAS No.：213971-34-7)等。因此，在一些实施方案中，本发明提供以乳酸为靶点的减少对象体内或细胞内乳酸水平的试剂在制备治疗或预防炎症以及受益于肺部内皮细胞间质转化和/或上皮细胞间质转化受到抑制的疾病的药物中的应用。在一些实施方案中，本发明还提供以乳酸为靶点的减少对象体内或细胞内乳酸水平的试剂在制备抑制炎症或肺部内皮细胞间质转化和/或上皮细胞间质转化的药物中的应用。这类试剂包括但不限于本文所述的能抑制或减少乳酸生成的LDHB的激动剂和/或LDHA的抑制剂以及能清除体内已存在的乳酸的试剂。所述疾病包括但不限于前文所述的各类疾病。
本发明还提供一种炎症或受益于肺部内皮细胞间质转化和/或上皮细胞间质转化受到抑制的疾病的治疗或预防方法，该方法包括给予需要的对象治疗或预防有效量的以乳酸为靶点的减少对象体内或细胞内乳酸水平的试剂，包括但不限于本文所述的能抑制或减少乳酸生成的LDHB的激动剂和/或LDHA的抑制剂以及能清除体内已存在的乳酸的试剂。所述疾病包括但不限于前文所述的各类疾病。本文中，有效量是足以改善或以某些方式减轻与疾病有关的症状的给药量。给药量是有效地改善或消除一个或多个病症的药量，可根据对象的年龄、性别、身体状态等由本领域普通技术人员加以确定。给药量也许可治愈疾病，但是给药通常是为了改善疾病的症状。一般需要反复给药来实现所需的症状改善。
在本发明的另外一些实施方案中，可给予提高乳酸含量的试剂来治疗或预防受益于成纤维细胞活化和/或增殖的疾病。例如，在创伤修复(如伤口愈合)过程中，成纤维细胞起到十分重要的作用；在骨创伤(如骨折)修复中，成纤维细胞是参与纤维骨痂阶段的主要细胞成分。此外，有研究认为，小鼠皮肤中的成纤维细胞至少有两种类型：一种是结缔组织上层的成纤维细胞，它们是皮肤毛囊形成所必须；另一种则是结缔组织下层中的成纤维细胞，这部分细胞负责制造大部分的皮肤胶原纤维，触发受损皮肤的修复。刺激增加成纤维细胞的数量有助于伤口愈合过程中毛囊的形成，进而降低皮肤愈合后落下疤痕的几率；此外，皮肤的厚度和成分会随着年龄增加而改变，老年人的皮肤很容易受伤，且不易愈合，这很可能是因为上层皮肤成纤维细胞缺失所致，刺激这些细胞生长，就有可能恢复皮肤的弹性，同样还能刺激毛囊形成，减少疤痕。因此，受益于成纤维细胞活化和/或增殖的疾病包括但不限于创伤(如组织如皮肤伤口愈合、骨创伤等)。在某些实施方案中，给予提高乳酸含量的试剂还可以起到恢复皮肤弹性的作用，减少疤痕，从而可实现美容的效果。
因此，本申请还包括以乳酸为靶点的提高体内或细胞内乳酸含量的试剂在制备治疗或预防受益于成纤维细胞活化和/或增殖的疾病的药物中的用途，以及在制备美容产品中的用途。
提高乳酸含量的试剂包括LDHA的激动剂和/或LDHB的抑制剂。LDHA的激动剂包括LDHA的表达载体或含有能促进宿主细胞自身所携带的LDHA基因表达的核酸分子的表达载体。LDHA的激动剂还包括含其生物学活性比野生型LDHA增强的LDHA突变体的编码序列的表达载体或同源重组载体。LDHB的抑制剂包括能抑制LDHB表达的试剂和抑制其活性的试剂。这类试剂可以是蛋白、核酸和小分子化合物。例如，蛋白可以是抗体；核酸可以是siRNA、反义RNA、核酶和基因编辑载体，如CRISPR-CAS9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体；小分子化合物包括本领域周知的能抑制LDHB酶活的小分子化合物。在某些实施方案中，直接给予乳酸来实现成纤维细胞活化和/或增殖，从而治疗受益于成纤维细胞活化和/或增殖的疾病。在一些实施方案中，直接给予乳酸，从而减少疤痕形成，和/或恢复皮肤弹性，实现美容效果。
除含有本文所述的活性成分(如所述抑制剂、激动剂或清除剂等)外，本文所述的药物或药物组合物中还含有本领域常用的各类药学上可接受的载体或赋形剂。本文中，“药学上可接受的载体”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害所服用药物组合物中所述试剂的生物活性及性能的那些载体和稀释剂。“药学上可接受的赋形剂”是指加到药物组合物中进一步有利于所述试剂的服用的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。药物组合物中所述试剂以治疗有效量或预防有效量存在。本发明的药物组合物可被配制成任何合适的剂型，用于以口服、静脉注射或局部等方式给药。
在一些实施方案中，本发明还提供一种化妆品，其含有适量的乳酸和化妆品中常用的其它成分，包括辅料以及起到美容作用的其它成分。通常，所述化妆品为外用，可以是霜、膏、面膜、爽肤水、洗面奶等各种合适的形式。
可采用本领域常规的方法制备本发明的药物及化妆品。
本文中，对象为哺乳动物，尤其指人。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
一、材料和试剂
1、RNA抽提及定量相关试剂：Trizol购买于美国Sigma-Aldrich公司；氯仿、异丙醇购买于国药集团化学试剂有限公司；DEPC购买于美国Sigma-Aldrich公司；反转录试剂盒(High Capacity cDNA Reverse transcription Kit，Applied Biosystems)，购买于美国Thermo Fisher Scientific公司；
Figure BDA0002112329520000081
Premix Ex TaqTM，购买于宝日医生物技术(北京)有限公司；RNAlater购买于美国Ambion公司。
2、乳酸检测试剂盒，MAK065，购买于美国Sigma-Aldrich公司。
3、pcDNA3.1+C-eGFP-LDHB质粒，购买于南京金斯瑞生物科技有限公司。
4、pAAV-CMV-Ldhb-3flag-P2A-LUC，pAAV-CMV-luc(无WPRE)，购买于和元生物技术(上海)股份有限公司。
5、博莱霉素购买于日本化药株式会社。
6、Sircol Soluble Collagen Assay试剂盒购买于英国Biocolor公司。
二、方法
1、RNA抽提及定量进行基因表达水平检测
1)肺组织的总RNA提取
(1)组织匀浆：用于研磨组织的钢珠用DEPC水浸泡过夜，高压灭菌、烘箱烘干水分备用。每份组织中加入1ml Trizol，并加入一个钢珠，将离心管中心对称放置在研磨仪置物架上，用60Hz研磨120s，若有明显组织块则增加60s研磨时间。
(2)组织研磨充分后，加入200μl三氯甲烷，充分震荡混匀后，室温静置5min。
(3)13,200rpm，4℃离心10min。
(4)小心的吸取上层水相至新的EP管中，此步骤注意不能吸到中间白色固体，下层有机相弃去。
(5)加入同体积异丙醇充分混匀，室温下静置5min。
(6)13,200rpm，4℃离心10min。
(7)有白色沉淀聚集在离心管底部，弃去上清，加入1ml预冷的75％乙醇(现用现配)，颠倒离心管清洗沉淀。
(8)13,200rpm，4℃离心10min，弃去乙醇。
(9)重复步骤7、8，待乙醇完全挥发。
(10)加入50μl DEPC水溶解RNA沉淀，RNA于-80℃长期保存。
2)RNA反转录
(1)用Nano Drop 2000测定RNA浓度，取1500ng RNA作为反转录模板。
(2)反转录体系：20μl
表1：RNA反转录体系
Figure BDA0002112329520000091
(3)反转录程序：
表2：RNA反转录程序
Figure BDA0002112329520000092
(4)加入200μl稀释样本。
3)实时定量PCR
(1)使用Primer bank在线引物库、Primer5.0设计实时定量PCR所需的引物；
(2)实时定量PCR反应体系：
表3：实时定量PCR反应体系
Figure BDA0002112329520000093
(3)将配好的反应液加入384孔板，封好盖膜，于3000rpm离心5min；
(4)放入Life Quant Studio 7Flex(Applied Biosystems)中进行PCR反应，反应程序如表4所示：
表4：实时定量PCR反应程序
Figure BDA0002112329520000094
Figure BDA0002112329520000101
(5)结果分析：使用Quant StudioTMReal-Time PCR分析软件(AppliedBiosystems)进行。
4)采用RT-PCR检测各个组别小鼠肺组织中乳酸脱氢酶基因mRNA水平的表达差异，用β-actin为内参。利用引物Primer bank在线引物库以及Primer 5.0对目的基因进行定量引物设计，用NCBI网站blast功能优化设计结果，得到最佳的定量引物，并送到苏州金唯智生物科技有限公司进行引物合成。
2、Western blot进行蛋白水平检测
1)总蛋白抽提
(1)取小鼠肺组织，用预冷的1×PBS清洗肺组织后用纱布吸干PBS，用天平秤取肺组织的重量，以每1mg需要10μl裂解液的比例计算RIPA裂解液总量，并按照100：1的比例加入磷酸化蛋白酶抑制剂A液、B液配制RIPA裂解液，按照组织重量1mg对应10μl加入RIPA裂解液。
(2)研磨组织的钢珠提前用DEPC水浸泡过夜，去除并烘干DEPC水，用高压灭菌锅灭菌。
(3)将无菌的钢珠、肺组织、RIPA裂解液放入研磨管中，将研磨管平衡的放入组织研磨仪中，于60Hz研磨120s，彻底研碎肺组织，冰上孵育10min使组织细胞充分裂解。
(4)12,000rpm离心10min将上清转移至新的离心管中，去除组织残渣，得到组织蛋白裂解液。
2)BCA法测定蛋白浓度
(1)每个样品需要200μl BCA工作液，根据样本数量计算BCA工作液总量，按照BCA试剂A液：B液为50：1的比例配制工作液，并充分混匀，将200μl BCA工作液加入到96孔板中备用。
(2)将1mg/ml的BSA蛋白标准品分别取0、1、2、4、8、12、16、20μl用生理盐水补足至20μl，分别加入到BCA工作液中。
(3)取组织蛋白裂解液1μl用生理盐水补足至20μl，分别加入到BCA工作液中，于37℃孵育30min。
(4)用酶标仪在452nm下检测吸光度，绘制标准曲线，计算出样本的蛋白浓度。
3)Western Blot
(1)试剂配制：
1L电泳缓冲液：3.03g Tris，14.4g甘氨酸，1g SDS，1L ddH2O。
1L转膜缓冲液：3.03g Tris，14.4g甘氨酸，800ml ddH2O，200ml甲醇。
1L TBST缓冲液：3.03g Tris，14.4g NaCl，1ml Tween，1L ddH2O。
(2)在蛋白样品中加入5×加样缓冲液，煮沸10min，冰上降温，于4℃、12,000rpm离心10min，取上清至新的离心管中备用。
(3)配制8％的变性PAGE胶。
(4)取15μg的蛋白样品及蛋白marker上样，于80V恒压电泳40min，120V恒压电泳50min。
(5)转膜：取6cm×9cm的PVDF膜浸入甲醇中备用，300mA恒流转膜120min，转膜槽保持冰浴降温。
(6)封闭：将PVDF膜浸入含5％BSA的TBST溶液中，于摇床上缓慢摇动封闭2h。
(7)一抗孵育：根据抗体说明书对一抗进行稀释，用TBST溶液稀释一抗，将膜浸入一抗稀释液中，4℃摇床上缓慢孵育过夜。
(8)洗膜：将膜浸入TBST溶液中清洗三次，于摇床上快速摇动每次10min。
(9)二抗孵育：根据抗体说明书对二抗进行稀释，用TBST溶液稀释二抗，将膜浸入二抗稀释液中，室温摇床上缓慢孵育2h。
(10)洗膜：重复步骤(7)
(11)显影：按照显影液A液：B液为1：1的比例配制，现用现配。
(12)用Image J计算不同条带的灰度值。
3、肺组织、肺泡灌洗液及细胞培养上清的乳酸水平检测
(1)样品制备
肺组织匀浆：按照前面提到的肺组织称取办法，称取10mg左右的肺组织，每1mg需要10μl乳酸检测缓冲液加入到肺组织中，加入无菌的钢珠将肺组织研碎4℃、12,000rpm离心10min，分离上清至新的离心管中，去除组织残渣。
肺泡灌洗液(BALF)：离心去除BALF中的细胞，留上清液备用。
细胞培养上清：离心去除上清中的细胞碎片，留上清液备用。
(2)用10kD MWCO超滤管对肺组织匀浆及肺泡灌洗液进行超滤，去除其中的乳酸脱氢酶，避免影响检测结果。
(3)准备1mM的乳酸标准品，分别取0、2、4、6、8、10μl加乳酸检测缓冲液至46μl，用于绘制标准曲线。
(4)50μl反应体系如下：
表5：乳酸浓度检测反应体系
样品或标准品(μl) 空白对照(μl)
乳酸检测缓冲液 46 48
乳酸酶混合物 2 -
乳酸底物混合物 2 2
(5)在96孔板加入50μl反应混合物，用水平振荡器混合均匀，在室温下避光孵育30min。
(6)用酶标仪在450nm下检测吸光值，颜色在4h保持稳定。
4、建立肺纤维化小鼠模型及乳酸尾静脉注射
1)造模准备
按照每只小鼠注射量约100μl计算3％水合氯醛溶液的用量，并配制；莫来霉素溶液配置成2.5mg/ml，小鼠的灌注量为2.5mg/kg。
2)肺纤维化模型的建立
建立肺纤维化小鼠模型的方法：单次气管灌注给药法。模型组给予2.5mg/kg博来霉素气管灌注，小鼠称重计算出博来霉素体积，并用生理盐水补足至50μl，正常对照组给予等体积的生理盐水(50μl)气管灌注，整个过程在无菌操作台中进行。
造模前用3％的水合氯醛溶液100μl对小鼠进行腹腔注射，麻醉小鼠，待其行动迟缓后，将其仰卧固定于固定板上，头部和四肢固定，找到上肢直线的中点“十”字处，用酒精消毒，再用剪刀将气管外皮肤切开，切口不宜过大，用镊子钝性剥离肌肉，找到气管使其暴露，用微量注射器与气管保持15度进针进行气管灌注，灌注之后迅速直立固定板，保持十秒，使药物在肺部分布均匀，然后缝合皮肤并用碘伏给创口消毒，将小鼠放置于电热毯上，待苏醒后放置于鼠笼中常规饲养。待博来霉素刺激后一周、三周解剖取得小鼠肺组织。
3)肺组织的收集
实验结束时，用3％水合氯醛麻醉后处死小鼠，固定于固定板上，打开胸腔暴露肺部，将左肺从支气管处结扎，用1ml含有5％胎牛血清的生理盐水对剩余肺组织进行肺泡灌洗，得到肺泡灌洗液(BALF)。将结扎的左肺取下完全浸没于福尔马林中固定，用于后期病理组织学检测，剩余的五叶肺组织分成三份，一份剪成小块放入RNAlater中，用于后期RNA的抽提，两份冻存，用于胶原蛋白的抽提、总蛋白的提取及其他用途。
4)乳酸尾静脉注射
在博莱霉素诱导的肺纤维化模型基础上，尾静脉注射给予4μM乳酸，称为博莱霉素-乳酸组(BLM-LA组)。①炎症期小鼠模型组中，博来霉素-乳酸组在造模前四天开始尾静脉注射乳酸，每两天注射一次，直至造模后第七天收取炎症期模型，共注射五次。②纤维化期小鼠模型中，博来霉素-乳酸组在造模后一天开始进行乳酸尾静脉注射，每两天注射一次，直到造模后第二十一天收取纤维化期模型，共注射十次。
5、腺相关病毒给药
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是一类细小病毒，基因组为单链DNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。AAV可以有效地感染多种组织类型，并且免疫原性极低，目前尚无由AAV引起的人类及哺乳动物疾病报道。因此，AAV是一种高效和安全的体外及体内基因转导工具。
在肺纤维化造模两周前，用腺相关病毒进行感染。将腺相关病毒配制成50μl、滴度为2×1011pfu的溶液，对照组用pAAV-CMV-luc(无WPRE)感染，治疗组用pAAV-CMV-Ldhb-3flag-P2A-LUC感染。感染的两周后，将对照组和治疗组中分别各取一半进行博来霉素和生理盐水的气管灌注，进行肺纤维化造模，造模方法如上，则分为四组：生理盐水-空载病毒组，生理盐水-LDHB病毒组，博来霉素-空载病毒组，博来霉素-LDHB病毒组，21天后收集组织样本进行检测。
6、病理学检测
1)石蜡包埋
(1)固定：将组织浸没于10％的福尔马林中固定24h以上
(2)脱水：将组织浸入下列浓度梯度乙醇中脱水
a 70％乙醇 1h
b 80％乙醇 1h
c 95％乙醇 1h
d 95％乙醇 2h
e 95％乙醇 2h
f 100％乙醇 1h
g 100％乙醇 2h
(3)透明：二甲基苯10min
二甲基苯20min
(4)浸蜡(60℃)：软蜡1h
软蜡1h
硬蜡2h
(5)包埋：硬蜡包埋
(6)切片：切片机切片厚度4μm
(7)烤片：60℃4h
2)Masson染色
(1)切片脱蜡：二甲苯10min
二甲苯10min
(2)水化：
a 100％乙醇 1min
b 100％乙醇 1min
c 95％乙醇 1min
d 95％乙醇 1min
e 80％乙醇 1min
f 70％乙醇 1min
g 水洗 1min
h 蒸馏水洗 1min
(3)滴混合第一液苏木精液，染3min；
(4)水洗10min；
(5)第二液染3min后弃液；
(6)第三液冲洗至无色；
(7)第四液染2min后弃液；
(8)用第三液冲洗；
(9)用第五液染色3min后弃液；
(10)用95％乙醇洗涤，脱水，透明，封片；
用电子显微镜观察、拍照，进行组织形态学分析，其中胶原、粘液、软骨呈绿色，纤维素、肌肉、神经胶原呈红色，细胞核呈蓝黑色，观察不同组的小鼠肺组织中胶原沉积部位及含量，以评价肺组织纤维化严重程度。
3)H&E染色
(1)切片脱蜡、水化如上。
(2)染色：
a 苏木精染色 5min
b 水洗
c 1％盐酸分化(70％酒精配制) 3s
d 自来水洗 10min
e 1％伊红染液 1min
g 水洗
(3)脱水：将组织浸入下列浓度梯度乙醇中脱水
a 70％乙醇 1h
b 80％乙醇 1h
c 95％乙醇 1h
d 95％乙醇 2h
e 95％乙醇 2h
f 100％乙醇 1h
g 100％乙醇 2h
(4)透明：二甲基苯1min
二甲基苯1min
(5)中性树胶封片
(6)尼康正置显微镜下观察
用电子显微镜观察、拍照，进行组织形态学分析，观察不同组的小鼠肺组织结构改变、炎症细胞浸润，以评价肺组织炎症及纤维化程度。
3)免疫荧光
(1)石蜡包埋及脱蜡酒精复水步骤同上
(2)抗原修复：将切片放置于0.1M PH＝6.0的枸橼酸修复液中，微波炉中火加热6min至微沸腾，中低火维持10min，然后自然冷却30min。
(3)用1×PBS浸洗2min后滴加0.25％Triton X-100透膜10min。
(4)用1×PBS浸洗2次，每次2min，洗去透膜液，用滤纸吸干PBS，滴加含有10％FBS的封闭液，在湿盒中37℃封闭30min。
(5)用滤纸吸干封闭液，按照抗体使用说明配制适宜浓度的含有两种抗体的一抗混合液，滴加在切片表面，放在湿盒中4℃孵育过夜。
(6)用1×PBS浸洗5次，每次3min，洗去一抗，用滤纸吸干PBS，滴加两种荧光二抗的抗体混合液，放在湿盒中室温避光孵育1h，用1×PBS浸洗3次，每次3min，洗去二抗，用滤纸吸干PBS。
(7)滴加DAPI避光孵育2min，对细胞核进行染色，用1×PBS浸洗3次，每次3min，洗去DAPI，用滤纸吸干PBS。
(8)用含有抗体荧光淬灭剂的封片液封片，在显微镜下观察
7、肺组织胶原含量检测
(1)配制乙酸-胃蛋白酶溶液。配置0.5M的乙酸溶液(100ml中含2680μl乙酸)，每10mg组织需要1mg胃蛋白酶消化，一份组织加入1ml溶液进行消化，按组织总重量配制所需的乙酸-胃蛋白酶溶液。
(2)消化肺组织：取10mg肺组织用PBS清洗干净，吸去水分，放入1.5ml离心管中，加入1ml乙酸-胃蛋白酶溶液，用剪刀将组织剪碎，将组织置于摇床上于4℃消化过夜，以后的48h观察消化情况，直至溶液澄清透明，即彻底消化，12,000g离心30min去除组织残渣。
(3)标准曲线胶原配制：用1.0mg/ml的胶原标准品稀释成0.1、0.2、0.3、0.4mg/ml的胶原。
(4)取100μl组织消化液加入1ml染料，混匀30min。
(5)将上述溶液12,000g离心10min沉淀胶原-染料复合物。
(6)弃去未结合的染料，加入750μl洗液洗净残留染料，并用棉签吸净残余液体。
(7)加入250μl碱性试剂充分溶解沉淀并释放染料。
(8)上述溶液取200μl加至96孔板中，用酶标仪检测555nm波长下的吸光值，最终绘制标准曲线，计算组织样本中的胶原含量。胶原的含量可以反映出小鼠肺组织的纤维化严重程度，因为纤维化主要是由于细胞外基质(ECM)中的胶原过度沉寂导致的，胶原含量越高纤维化越严重。
8、载体构建：
构建过表达载体用于LDHB基因功能的细胞实验验证。
过表达载体pcDNA3.1+C-eGFP-LDHB质粒：
基因名称：LDHB Gene ID：3945
NM号：NM_001315537.1 基因大小：1014bp
9、引物
Figure BDA0002112329520000171
Figure BDA0002112329520000181
三、结果
1、纤维化的肺组织中乳酸水平上升
在前期的代谢组学结果中，发现多种代谢物在博莱霉素诱导的肺纤维化中发生变化，其中乳酸水平在肺纤维化的不同时期均呈现上升趋势。为了验证肺纤维化患者的肺组织中乳酸水平是否异常，我们收集了20例皮肌炎患者(dermatomyositis,DM)及13例皮肌炎肺纤维化患者(dermatomyositis pulmonary fibrosis,DM-PF)的肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，检测其乳酸水平。结果如图1(A)所示。结果显示，与无肺纤维化的DM患者相比，DM-PF患者的BALF中，乳酸水平显著上升(P＝0.021)。
同时，我们收集了生理盐水对照组及博莱霉素诱导的肺纤维化模型组的BALF及肺组织，对乳酸水平进行检测，发现博莱霉素诱导肺纤维化模型组的BALF及肺组织匀浆中乳酸水平均显著上升(P<0.001，P＝0.0024)(图1，B、C)。说明在纤维化的肺组织中，不论是在支气管灌洗液还是在肺组织，乳酸水平均升高，这是肺组织纤维化病变的一个代谢特征。
2、乳酸加剧博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化
为了探究乳酸水平升高是否可以加重博莱霉素诱导的肺纤维化，我们对小鼠进行尾静脉注射。对生理盐水对照组(Saline)、博莱霉素诱导的肺纤维化模型组(BLM)以及乳酸刺激组(BLM-LA)进行病理学分析，从H&E染色的结果可以看到，乳酸可以加重炎症细胞浸润、肺部组织结构的破坏，从Masson染色的结果可以看到，乳酸可以加重肺部胶原沉积(图2，A)。与BLM组相比，BLM-LA组的肺纤维化Ashcroft评分也显著上升，说明乳酸可以加重肺组织的纤维化病变(图2，B、C)。同时，对肺组织胶原含量进行定量检测，结果显示BLM-LA组的胶原沉积进一步增多(图2，D、E)。
对小鼠肺组织的纤维化基因表达进行检测。结果显示，与BLM组相比，BLM-LA组的肺组织中α-sma，Ctgf，Col1a1，Col1a2和Col3a1的表达显著升高(图3，A、B)。对小鼠的BALF中炎症因子水平进行检测，与BLM组相比，BLM-LA组的BALF中IL-6、Eotaxin、G-CSF、KC、MCP-1、MIP-1a和RANTES等炎症因子水平显著升高(图3，C)。对小鼠的BALF进行炎症细胞计数，结果显示，与BLM组相比，BLM-LA组的BALF中白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞比例显著升高(图3，D)。说明乳酸不仅对炎症有促进作用，也对纤维化有促进作用，乳酸可以通过促炎、促纤维化进一步加重博莱霉素诱导的肺纤维化。
3、乳酸加剧博莱霉素诱导的上皮间质转化及内皮间质转化
上皮细胞、内皮细胞在纤维化的过程中被认为是起始因素，在受到外界刺激后，细胞会发生间质转化。对II型肺泡上皮细胞标志分子SP-C及间质细胞标志分子α-SMA进行免疫荧光染色，结果显示，与BLM组相比，BLM-LA组的上皮标志分子表达下调，间质标志分子上调，标志着上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的共定位区域细胞数变多，乳酸加剧了博莱霉素诱导的EMT(图4，A)。同时，对内皮细胞标志分子CD31及间质细胞标志分子α-SMA进行免疫荧光染色，结果显示，与BLM组相比，BLM-LA组的内皮标志分子表达下调，间质标志分子上调，标志着内皮间质转化(endothlial-mesenchymal transition，EndoMT)的共定位区域细胞数变多，乳酸加剧了博莱霉素诱导的EndoMT(图4，B)。对小鼠肺组织基因表达水平进行检测，结果显示，与BLM组相比，BLM-LA组的上皮细胞标志分子Spa、Spc表达下调，内皮细胞标志分子Cd31、Cdh5表达下调，间质细胞标志分子Snail1、S100a4、Fn1表达上调，乳酸加重了博莱霉素诱导的EMT、EndoMT(图4，C)。这些结果表明乳酸可以通过加重博莱霉素诱导的EMT、EndoMT来加重纤维化。
4、乳酸可以诱导上皮间质转化、内皮间质转化
用20mM乳酸刺激人的II型肺泡上皮细胞A549，发现乳酸可以诱导上皮细胞发生间质细胞样的形态变化(图5，A)，同时，对基因表达水平进行检测，结果显示乳酸可以使上皮细胞标志分子SPC表达下调，间质细胞标志分子SNAIL1、SLUG、ZEB1、ZEB2、FN1表达上调(图5，B)，对蛋白水平进行检测，同样上皮细胞标志分子SP-C蛋白水平下降，间质标志分子表达α-SMA蛋白水平上升(图5，C)，说明乳酸可以在体外诱导上皮细胞EMT。同时，对纤维化、炎症通路进行检测，结果表明，乳酸可以使β-catenin上调表达，激活Wnt信号通路，可以使p42/44下调表达、p-p42/44上调表达，激活MAPK信号通路，可以使p-SMAD2/3上调表达，激活TGF-β信号通路(图5，D)，乳酸可以使多个纤维化信号通路被激活。同时IL-1β、IL-6、IL-4、IL-17A、TNF-α、MCP-1炎症基因表达显著上调(图5，E)，TNF-α表达上调，p-p65上调表达，p65下调表达，激活NFκB信号通路(图5，F)，乳酸可以使激活炎症信号通路、激活炎症因子表达。
用10mM乳酸刺激人肺微血管内皮细胞HULEC-5a，发现乳酸可以诱导内皮细胞发生间质细胞样的形态变化(图5，G)，同时，对基因表达水平进行检测，发现乳酸可以使内皮细胞标志分子CD31、CDH5表达下调，间质细胞标志分子α-SMA、TGF-β、SNAIL1、FN1表达上调(图5，H)，对蛋白水平进行检测，同样内皮细胞标志分子VE-cadherin、CD31蛋白水平下降，胶原蛋白水平上升(图5，I)，说明乳酸可以在体外诱导上皮细胞EndoMT。这些结果表明，在体外，乳酸可以诱导EMT、EndoMT，可以激活多个纤维化、炎症信号通路的激活，激活炎症因子的表达，从而诱导纤维化的发生。
5、乳酸可以诱导成纤维细胞活化及增殖
成纤维细胞是纤维化的最终效应细胞，成纤维细胞活化可以使细胞外基质的大量累积。用20mM乳酸刺激人肺呈现细胞MRC-5、HFL1，对蛋白水平检测，结果发现胶原水平上升，p-SMAD2/3上调表达，TGF-β信号通路被激活，p-p65上调表达，NFκB信号通路被激活，β-catenin上调表达，Wnt信号通路被激活(图6，A、B)，乳酸刺激成纤维细胞活化。同时用间质细胞标志分子α-SMA进行乳酸刺激后的成纤维细胞进行免疫荧光染色，结果显示乳酸可以显著上调间质细胞标志分子α-SMA的表达(图6，C)。用RTCA实时细胞增殖检测方法检测乳酸刺激后MRC-5细胞的数量变化，发现乳酸可以促进成纤维细胞增殖(图6，D)。这些结果表明，在体外，乳酸可以诱导成纤维细胞的活化和增殖。
6、LDHB基因表达与用力肺活量正相关，且肺纤维化中表达下调，与胶原基因表达负相关
乳酸脱氢酶基因包括两种亚基组成的四聚体，直接催化乳酸的生成和分解，两种亚基包括LDHA以及LDHB，其中LDHB亚基倾向于催化乳酸生成丙酮酸。对硬皮病肺纤维化患者(systemic scleroderma pulmonary fibrosis，SSC-PF)的外周血单核细胞(PBMC)的LDHB进行表达检测，发现LDHB基因表达与患者的肺功能指标FVC(用力肺活量)呈显著正相关(R＝0.5277，P＝0.0168)(图7，A)，同时SSC-PF的PBMC中LDHB基因表达与正常对照相比显著下调(图7，B)。对小鼠模型肺组织的基因表达进行检测，发现在BLM组中，Ldhb表达与Col1a1、Col1a2、Col3a1呈显著负相关(R<-0.6865，P<0.01)，说明肺纤维化的乳酸异常的累积可能是由于LDHB的异常低表达引起的。
7、在BLM诱导的小鼠肺纤维化模型中LDHB表达降低
对小鼠模型肺组织进行基因表达及蛋白水平检测，发现与生理盐水组相比，在肺纤维化的炎症期、纤维化期BLM组的Ldhb基因表达均显著下调(图8，A、B)，LDHB蛋白水平也同样显著下调(图8，C、D)。
8、LDHB过表达可以降低乳酸水平，缓解纤维化
在A549细胞中，在20mM乳酸刺激的条件下对LDHB基因进行过表达，对细胞培养上清进行乳酸水平检测。结果表明，与乳酸刺激的对照组(LA组)相比，过表达组的乳酸水平显著下调(图9，A)。对蛋白水平检测，发现过表达LDHB后，SP-C表达上调，p-SMAD2/3、α-SMA表达下调(图9，B)。同样在MRC-5细胞中，过表达LDHB基因可以降低乳酸水平(图9，C)。对蛋白水平检测，发现过表达LDHB后，胶原、p-SMAD2/3、β-catenin表达下调(图9，D)，说明过表达LDHB基因可以降低乳酸水平，从而减弱乳酸诱导的纤维化。
9、LDHB过表达可以缓解博莱霉素诱导的肺纤维化
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是一种单链DNA病毒，近年来由于其安全性、低毒性、稳定表达而被广泛应用为基因转移载体。对于肺部而言，血清型的AAV2/9有较高的感染效力。我们构建AAV2/9-LDHB-LUC作为治疗载体，构建AAV2/9-LUC作为对照载体，用于感染小鼠模型。由于AAV感染后2-3周基因表达到达高峰，我们在小鼠造模前两周对小鼠进行AAV滴鼻感染小鼠肺部。对小鼠肺组织进行基因表达及蛋白水平检测。结果显示，与BLM-AAV组(感染了不含LDHB基因的AAV)相比，BLM-AAV-LDHB治疗组的LDHB基因表达显著上升(图10，A)，LDHB蛋白水平显著上升(图10，B)。对小鼠肺组织进行病理学检测，H&E和Masson染色的结果显示，与BLM-AAV组相比，BLM-AAV-LDHB治疗组的炎症细胞浸润减少、肺组织结构紊乱减轻、胶原沉积减少(图10，C)。对肺组织胶原含量进行检测，发现BLM-AAV-LDHB治疗组肺组织的胶原含量显著降低(图10，D)，肺组织乳酸水平显著下降(图10，E)。同时对肺组织的基因表达进行检测，发现与BLM-AAV组相比，BLM-AAV-LDHB治疗组纤维化基因Col1a1，Col1a2和Col3a1表达显著下降(图10，F)，炎症基因Il-6、Mcp-1、Il-4表达显著下降(图10，G)。这些结果说明在博莱霉素诱导的肺纤维化模型中过表达LDHB基因可以减低肺组织中的乳酸水平，从而降低炎症和纤维化水平，达到治疗肺纤维化的目的。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 乳酸脱氢酶在组织炎症和纤维化治疗中的应用
<130> 194024
<160> 64
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacctgaaac gccttcttat cg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
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tttctggctc atgtggagac c 21
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tctaggccct ggctgctaca a 21
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acatctgagt gggtctggag gtg 23
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ccactccacc ctcccttatt tc 22
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cggtggctgt cagtcaaag 19
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aaacctcggc ttcctccata a 21
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gccagtgaaa tgatggctta t 21
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gctgtagtgg tggtcggaga 20
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tacatcctcg acggcatctc 20
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caccaggcaa gtctcctcat t 21
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ccaactgctt ccccctctg 19
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tctgttacgg tcaactcggt g 21
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ctgtccccat ccagcaagag 20
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aggccacatg gtggacaatc 20
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gaggccaagc cctggtatg 19
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cgggccgatt gatctcagc 19
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ctcatagcag ccaccttcat tc 22
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tcacagcttc tttgggacac tt 22
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tctgtgaccg ccaattctaa ga 22
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gcaccagatt gagccgactc 20
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agcgcggcta cagct 15
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ggccatctct tgctcgaagt 20
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gtcccagaca tcagggagta a 21
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tcggatactt cagcgtcagg a 21
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aaggaccgca cagcagttgg 20
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aggcagttgg ctcgcatcat ag 22
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ggtccacaag gtttccaagg 20
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gctgttccag gcaatccac 19
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ggacccgttg gcaaagatg 19
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caccaggagg accaggag 18
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gaggaaacag aggtgaaaga gg 22
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cagcaatggc agcagcac 18
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gaggagcttc agactgcact c 21
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agactttatc ccccactgac ag 22
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atggacatga gtagcaaaga ggt 23
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cacgatgaga aggcgtttga g 21
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accgggtgct gttctataag g 21
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tcacctcgta ctcaatcgtg g 21
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gtcgatgcta acacagggaa tg 22
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aatacctggt gcgaaaacac a 21
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cacacgctgc cttgtgtct 19
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ggtcagcaaa agcacggtt 19
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tgagcaactt ggacagcaac a 21
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ttccggggtt ccttatctgg g 21
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gtgctatgac gatgggaaga 20
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ccaggtctac ggcagttgt 19
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ttgtgcaatg gcaattctga 20
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ctggctttgt ctttcttgtt atct 24
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taaaaacctg gatcggaacc aaa 23
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gcattagctt cagatttacg ggt 23
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ggtctcaacc cccagctagt 20
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gccgatgatc tctctcaagt gat 23
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caaagactac tgtgtaactg cga 23
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tggactgtac ttgacaatgt tgg 23
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tgcgtccgtt gcagatgat 19
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tttcggagtc tggaggaaca a 21
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ggctgtattc ccctccatcg 20
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ccagttggta acaatgccat gt 22

Claims (10)

1.以乳酸为靶点的减少对象体内或细胞内乳酸水平的试剂在制备治疗或预防炎症以及受益于肺部内皮细胞间质转化和/或上皮细胞间质转化受到抑制的疾病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述受益于内皮间质转化受到抑制的疾病为心血管疾病，如肺动脉高压、动脉粥样硬化和心肌纤维化；所述受益于上皮细胞间质转化受到抑制的疾病选自：急性呼吸窘迫综合症、肺纤维化、肺损伤、肺动脉高压、肺水肿和肺癌；优选地，所述肺纤维化为硬皮病肺纤维化。
3.以乳酸为靶点的减少对象体内或细胞内乳酸水平的试剂在制备抑制炎症或肺部内皮细胞间质转化和/或上皮细胞间质转化的药物中的应用。
4.如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：
(1)LDHB激动剂；
(2)LDHA抑制剂；和
(3)能清除体内已存在的乳酸的试剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述LDHB激动剂选自：LDHB表达载体和能促进宿主细胞自身所携带的LDHB基因表达的核酸分子的表达载体；
所述LDHA抑制剂选自：能抑制LDHA表达的试剂，如siRNA、反义RNA、核酶和基因编辑载体，如CRISPR-CAS9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体，和能抑制LDHA活性的试剂，如LDHA的抗体和小分子抑制剂；
所述能清除体内已存在的乳酸的试剂为虾青素。
6.以乳酸为靶点的提高体内或细胞内乳酸含量的试剂在制备治疗或预防受益于成纤维细胞活化和/或增殖的疾病的药物中的用途，或在制备用于减少疤痕的美容产品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述受益于成纤维细胞活化和/或增殖的疾病为创伤，包括组织创伤和骨创伤。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述以乳酸为靶点的提高体内或细胞内乳酸含量的试剂选自：
(1)LDHA激动剂；
(2)LDHB抑制剂；和
(3)乳酸或其药学上可接受的盐。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述LDHA激动剂选自：LDHA表达载体和能促进宿主细胞自身所携带的LDHA基因表达的核酸分子的表达载体；
所述LDHB抑制剂选自：能抑制LDHB表达的试剂，如siRNA、反义RNA、核酶和基因编辑载体，如CRISPR-CAS9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体，和能抑制LDHB活性的试剂，如LDHB的抗体。
10.一种祛疤化妆品，其特征在于，所述祛疤化妆品含有乳酸。
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