CN116898957A

CN116898957A - 藻蓝蛋白在制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药物中的应用

Info

Publication number: CN116898957A
Application number: CN202311111652.8A
Authority: CN
Inventors: 李文军; 秦松; 卢文菊; 李媛媛; 王琪; 刘润泽; 吕康宁
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2023-08-31
Filing date: 2023-08-31
Publication date: 2023-10-20

Abstract

本发明公开了藻蓝蛋白的一种医药新用途，具体为藻蓝蛋白在制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药物中的应用，属于生物医药技术领域。

Description

藻蓝蛋白在制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白质的应用，具体涉及藻蓝蛋白(PC)在制备治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)的药物中的应用，属于蛋白质药物技术领域。

背景技术

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以气流受限为特征的常见呼吸系统疾病。如果不进行及时预防和治疗，COPD患者的肺功能将继续不可逆转地恶化，直至死亡。COPD的发生因素主要是环境因素和个体有机体因素，其发生与气道和肺组织对烟草烟雾等有害气体或颗粒物的气道炎症反应增强有关，其中吸烟是最重要的诱因。有害气体和颗粒的长期刺激会增加气道过氧化物，导致免疫细胞或上皮细胞损伤。各种免疫细胞的招募包括巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞和淋巴细胞，以及炎症介质的释放可导致肺实质损伤、气道重塑和肺气肿。蛋白酶/抗蛋白酶系统失衡会增加粘液分泌，气道壁变窄会导致阻塞性支气管炎，最终发展为COPD。此外，烟草烟雾和其它有害气体中的外源性氧化剂可直接刺激呼吸道和肺，造成细胞和器官损伤。另一方面，肺循环中的中性粒细胞在外源性氧化剂的作用下被激活，导致大量ROS释放，加速了COPD的发展。近年来，COPD的发病率和死亡率在全球范围内持续上升，成为人类社会的一个严重公共卫生问题。传统的药理学策略是改善COPD症状及其并发症，但不能完全治愈该病。涉及的药物包括支气管扩张剂、皮质类固醇和抗生素，单独或联合使用。

藻蓝蛋白(PC)是从蓝藻、红藻和部分隐藻中提取的捕光色素蛋白。PC主要由α和β亚基组成，其中大部分以天然状态下的杂聚合物形式存在。研究表明，除了有效捕获光能外，PC还具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、神经保护等药理作用。Li等报道PC处理能够改善辐射引起的小鼠肺组织病理学改变，包括肺水肿、肺泡壁增厚和中性粒细胞向肺泡腔内输注等。在百草枯诱导的急性肺损伤模型中，PC明显改善炎症细胞浸润和炎症因子的释放，抑制小鼠肺组织活性氧的增加，提高了肺组织和肺泡灌洗液(BALF)中抗氧化酶的表达，减轻脂质过氧化，从而发挥缓解肺损伤的效果。最近的一项研究发现，PC经复合酶作用后得到的PC肽能够抑制TGF-β1诱导的氧化应激和炎症反应，从而发挥肺保护作用。

吸烟等不良习惯是COPD的主要病因，伴随的气道和肺组织的炎症和氧化应激是该病的重要发病机制。慢性阻塞性肺病的防治与抗氧化、抗炎等密切相关，但PC能否在慢性阻塞性肺疾病中发挥治疗作用尚不清楚。

发明内容

本发明的目的在于：通过脂多糖(LPS)结合香烟烟雾(CS)暴露构建COPD小鼠模型，探讨PC对COPD病变的治疗效果，采用香烟提取物(CSE)处理的RAW264.7细胞模型探究PC肽对氧化应激的调节作用，以期为临床防治COPD提供新思路。

本发明通过体内实验证实，PC能够保护肺泡结构，减少杯状细胞化生和胶原沉积。BALF中炎症细胞也在PC处理后减少。PC还能调节肺组织中HO-1和NQO1的表达和肺巨噬细胞中NOX2的表达使其趋于正常水平，并改善机体的抗氧化应激能力。本发明通过体外实验证实，PC肽处理能够抑制CSE诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7内p-Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的高表达，缓解氧化应激状态。此外，分子对接结果显示，PCB在Keap1和NOX2蛋白中具有很好的结合位点，进一步支持了体内和体外的实验结果。综上，PC通过抗炎和抗氧化对COPD发挥有益作用，这个作用是通过PCB实现的。PC可用于治疗COPD。

附图说明

图1是动物分组和实验程序图；

图2是实验期间各组小鼠体重动态曲线图；

图3是实验结束时各组小鼠最终体重图；

图4是小鼠呼气前20ms功能残余容量(FRC)检测结果图；

图5是小鼠静态肺顺应性(Cchord)检测结果图；

图6是小鼠呼出50％肺容积时最大呼气流量(FEV50％)检测结果图；

图7是小鼠呼气峰流量(PEF)检测结果图；

图8是各组小鼠BALF中炎症细胞的形态图；

图9是各组小鼠BLAF中总细胞的计数结果图；

图10是各组小鼠BLAF中巨噬细胞的计数结果图；

图11是各组小鼠BLAF中中性粒细胞的计数结果图；

图12是各组小鼠BLAF中淋巴细胞的计数结果图；

图13是各组小鼠肺组织中CD68和NOX2免疫荧光染色结果图；

图14是各组小鼠肺组织切片H&E染色结果图；

图15是各组小鼠MLI测量结果图；

图16是各组小鼠肺组织内杯状细胞PAS染色结果图；

图17是各组小鼠肺组织内球细胞指数测量结果图；

图18是各组小鼠肺组织胶原沉积Masson染色结果图；

图19是各组小鼠肺组织内胶原纤维含量测量结果图；

图20是各组小鼠肝指数测量结果图；

图21是各组小鼠脾指数测量结果图；

图22是各组小鼠肾指数测量结果图；

图23是各组小鼠NQO1和HO-1电泳结果图；

图24是各组小鼠NQO1相对水平测量结果图；

图25是各组小鼠HO-1相对水平测量结果图；

图26是各组小鼠肺组织切片HO-1免疫组织化学染色结果图；

图27是各组小鼠肺组织切片HO-1IOD统计图；

图28是各组小鼠肺组织切片NQO1免疫荧光染色结果图；

图29是巨噬细胞RAW264.7的NOX2免疫荧光染色结果图；

图30是巨噬细胞RAW264.7的ROS免疫荧光染色结果图；

图31是不同浓度PC肽对巨噬细胞RAW264.7增殖影响图；

图32是巨噬细胞RAW264.7中p-Nrf2、Nrf2、NQO1和HO-1电泳结果图；

图33是巨噬细胞RAW264.7中p-Nrf2相对水平测量结果图；

图34是巨噬细胞RAW264.7中NQO1相对水平测量结果图；

图35是巨噬细胞RAW264.7中HO-1相对水平测量结果图。

注：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，###P<0.001，##P<0.01。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一、材料与方法

1、实验动物

本研究使用从Charles River Laboratories(中国北京，证书编号：SCXKJing2016-0006)购买的6～8周龄雄性C57BL/6小鼠。将动物饲养在40～60％的湿度和20～24℃的温度下，确保每天12h的明暗交替，并提供自由饮水和饮食。

2、试剂

PC：购买于福清市新大泽螺旋藻有限公司。

羧甲司坦片：购买于广州白云山医药集团有限公司，批号：1190002。

生理盐水：购买于四川科伦药业。

LPS：购买于美国Sigma公司。

p-Nrf2：购买于碧云天生物技术有限公司，货号AF1609。

Nrf2、HO1、NQO1和CD68抗体：购买于abcam公司，货号分别是ab31163、ab189491、ab80588、ab955。

NOX2：购买于赛维尔生物(Servicebio)，货号GB11391。

荧光二抗：购买于CST，其中，fluorophore-conjugated secondary antibodyused was anti-rabbit IgG(H+L)(AlexaFluor 555)货号为4413，anti-mouse IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)货号为4408。

PBS：购买于博士德生物工程有限公司。

RMPI-1640培养基、0.25％胰酶：购买于GIBIO公司。

CCK8：购买于MCE公司。

ROS检测试剂盒：购买于碧云天生物。

苏木素、伊红、Diff-Quik染色试剂盒、PAS染色试剂盒：购买于珠海贝索生物技术有限公司。

阿佛丁：购买于瑞沃德生命科技有限公司。

10％中性福尔马林：购买于广州维格斯生物有限公司。

甲醇、二甲苯、无水乙醇：购买于广州化学试剂厂，均为分析级别试剂。

3、COPD建模和给药方案

动物分组和实验程序见图1，24只小鼠随机分为4组(n＝6)：(1)对照组；(2)模型组；(3)阳性对照组；(4)PC组。

采用CS暴露和LPS滴注诱导COPD模型小鼠。在用阿佛丁麻醉小鼠后，在实验的第1d和第14d，对照组小鼠通过气道滴入生理盐水(0.05mL/只小鼠)，模型组、阳性对照组和PC组小鼠通过鼻腔滴入LPS(75μg/只小鼠)。对照组小鼠暴露于环境空气中，其他组小鼠每天接受两次香烟烟雾暴露，每次暴露持续时间2h，两次间歇时间为4h，每周6d。在第61d到第90d中，PC组和阳性对照组小鼠在暴露于香烟烟雾前1h分别灌胃给药PC和羧甲司坦(羧甲基半胱氨酸)，PC和羧甲司坦(羧甲基半胱氨酸)均用生理盐水溶解，给药量分别为25mg/kg/天、225mg/kg/天，模型组小鼠在暴露于香烟烟雾前1h灌胃给药等量的生理盐水。给药期间每天记录小鼠的体重。

4、肺功能测量

使用DSI Buxco PFT动物肺功能检测系统评估小鼠的肺功能。用浓度为2％(w/v)的阿佛丁麻醉各组小鼠(1.5mL/kg)后，将小鼠固定在仰卧位。用手术剪刀和镊子分离小鼠的气管，从气管上切下一个小孔，然后立即插入专用导管。记录小鼠呼气前20ms(FEV20)的功能残余容量(FRC)、静态肺顺应性(Cchord)、呼出50％肺容积时的最大呼气流量(FEV50％)和呼气峰流量(PEF)。

5、支气管肺泡灌洗液(BALF)与肺部采集

从小鼠主支气管注射生理盐水冲洗肺部，收集BALF和白细胞。灌洗液在4℃、1000rpm下离心5min，收集1.5mL上清液，并将其储存在-80℃冰箱中。将剩余上清液丢弃，待红细胞裂解后加入磷酸盐缓冲液(PBS)，在4℃、1000rpm下离心5min，丢弃上清液，加入1mL生理盐水悬浮细胞进行细胞计数。取部分细胞悬液进行细胞涂片、Diff-Quik染色和免疫细胞分类计数。用体积浓度为10％的中性福尔马林灌注固定左肺过夜。

6、肺组织病理染色

将固定的肺组织从福尔马林中取出，用不同浓度的无水乙醇脱水，包埋在石蜡中，切片(4μm)，常规去石蜡，然后用苏木精和伊红(H&E)、周期性酸性Schiff(PAS)或MASSON染色。

7、免疫组织化学/免疫荧光染色

肺组织切片常规脱蜡，PBS冲洗后，HO-1采用Tris/EDTAbufferpH 9进行修复，其余抗体通过柠檬酸钠修复，修复液微波高温修复10min。加入体积浓度为3％的过氧化氢孵育30min，再用质量浓度为5％的BSA室温下孵育30min。孵一抗4℃过夜，第二天用PBS冲洗3次，每次5min。接着，在室温下孵育二抗1h。免疫组化通过DAB染色，苏木素染细胞核。免疫荧光通过DAPI标记细胞核，实验完成后在镜下观察。

8、器官指数

处死小鼠，取肝、肾和脾，分别记录肝、肾和脾的重量，并根据以下公式计算肝指数、肾指数和脾指数：

肝指数＝(肝湿重/体重)×100％

肾指数＝(肾湿重/体重)×100％

脾指数＝(脾湿重/体重)×100％

9、藻蓝蛋白固定肽(PC肽)制备

PC肽的制备方法具体如下：

(1)将藻蓝蛋白粉倒入装有纯水的酶解罐中，藻蓝蛋白粉与纯水的质量比为1:80，再向酶解罐中倒入复合蛋白酶MC101(用于水解藻蓝蛋白)，酶的添加量为5％(wt％)，在温度57℃、pH值自然的条件下反应4h；

(2)反应时间到了之后，先将酶解液加热至75℃(终止酶解反应)，然后于4000r/min离心10min(除去蛋白酶)，最后用白色硅藻土抽滤上清液，即得到PC肽。

10、CSE准备

去掉香烟的过滤嘴后点燃香烟，然后采用负压吸引器对香烟进行连续抽吸，并将香烟烟雾收集于无菌瓶中。每2只香烟烟雾鼓泡通过10mL细胞生长培养基，采用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，并将该溶液作为100％浓度的CSE原液。

11、细胞培养

RAW264.7细胞采用含10％(v/v)胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。细胞生长到对数期后，用0.25％(w/v)胰酶消化，并接种于六孔板中。接种后的第二天：

对照组：24h后收取细胞进行各项指标检测。

CSE组：给予1％(v/v)CSE干预细胞，24h后收取细胞进行各项指标检测。

CSE+PC肽组：给予1％(v/v)CSE和0.1mg/mLPC肽同时干预细胞，24h后收取细胞进行各项指标检测。

PC肽组：给予0.1mg/mL PC肽干预细胞，24h后收取细胞进行各项指标检测。

检测的指标包括：NOX2的免疫荧光染色、ROS的免疫荧光染色、巨噬细胞RAW264.7的增殖情况、p-Nrf2等蛋白的表达情况。

12、CCK8实验

将RAW264.7细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后，分别给予0mg/mL、0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL PC肽干预细胞，24h后向每孔加入10μLCCK8溶液。将培养板置于培养箱内孵育1～4h，然后用酶标仪测定RAW264.7细胞在450nm处的吸光度。

13、活性氧(ROS)测定

采用无血清培养液对DCFH-DA进行稀释，稀释比例1:1000，使DCFH-DA的终浓度为10μmol/L。用1％(v/v)CSE刺激RAW264.7细胞24h，弃掉细胞上清，加入适当体积稀释好的DCFH-DA，并置于37℃细胞培养箱内孵育20min。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。在488nm激发波长、525nm发射波长下采用荧光显微镜进行拍照观察。

14、细胞IF实验

将RAW264.7细胞用无水乙醇固定后，用0.2％Triton X-100进行通透，再加入10％羊血清封闭30min，一抗孵育过夜后加入荧光二抗避光孵育1h。经DAPI染液复染后，用抗荧光衰减封片液进行封片，用荧光显微镜进行拍照观察。

15、蛋白免疫印迹

分别取肺组织匀浆和RAW264.7细胞，再分别加入RIPA裂解液提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。为了分析p-Nrf2、Nrf2、HO-1和NQO1的表达，将30μg蛋白样品分别装载于浓度为8％(w/v)、10％(w/v)和12％(w/v)的SDS-PAGE上，然后将蛋白转移到SDS-PAGE膜上。接下来，在室温下在体积浓度为5％的脱脂牛奶中封闭4h，然后用一抗(p-Nrf2、Nrf2、HO-1和NQO1抗体)在4℃中孵育过夜。然后，用HRP标记的二抗在室温下孵育2h，使用增强化学发光试剂和化学镜Mini3100进行观察，用Image J 5.0软件分别分析p-Nrf2、Nrf2、HO-1和NQO1与β-actin的相对表达量。

16、分子对接分析

受体蛋白的3D结构从https://www.rcsb.org/网站下载，包括Keap1蛋白(BTB结构域)(PDB ID：5GIT)和NOX2蛋白(PDB ID：7U8G)，并使用PyMol去除受体蛋白中的水分子以及原有的小分子配体。PCB(PubChem CID:6438349)和NADPH(PubChem CID:5884)的2D结构下载自PubChem网站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，使用Chem3D 19.0对小分子配体进行能量最小化。Britanin的结构采用ChemDraw 19.0进行绘制，并使用Chem3D 19.0对其进行能量最小化。受体和配体的共价对接在AutoDockFR程序中运行，并采用基于最小对接能量原理的遗传算法对其构象进行优化；非共价对接使用Autodock Vina程序进行。使用PLIP(https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index)分析受体和配体之间的相互作用，结果在PyMol中进行可视化。

17、统计分析

数据以平均值±SEM表示。所有实验结果均使用SPSS25.0单向方差分析(ANOVA)进行。双侧P值小于0.05(P<0.05)被认为具有统计学意义。

二、结果

1、动物的一般状况

在实验过程中，对照组小鼠毛发发亮，呼吸均匀，活动灵活，而模型组小鼠毛发粗糙，呼吸急促，活动减少。与模型组小鼠相比，PC组小鼠毛发较为顺泽，呼吸困难可见改善，活动次数增加。

除了毛发状况和小鼠的运动情况外，小鼠体重也能反映一般情况，尤其是慢性病。实验期间，各组小鼠的体重动态曲线见图2。实验结束时，各组小鼠的最终体重见图3。由图2可知，在治疗的前四周(第63天到第90天)，对照组小鼠体重呈现稳定的增长趋势；与对照组小鼠相比，模型组、PC组和阳性对照组小鼠体重均显著低于对照组小鼠体重，并有体重下降的趋势。由图3可知，PC组小鼠体重与模型组小鼠体重基本保持一致，也就是说，PC给药后并不能逆转LPS联合CS诱导的小鼠体重降低。

2、PC对COPD小鼠肺功能的影响

COPD的发生必然伴随着肺功能的降低。肺功能检测是目前主要的诊断方法，它与这一病理生理学有关，包括FRC、Cchord、FEV50％和PEF等。

各组小鼠肺功能的检测结果见图4至图7。由图4和图5可知，与对照组小鼠相比，模型组小鼠的FRC和Cchord显著升高，这表明LPS联合CS可过早闭合小鼠肺部小气道，肺组织弹性下降，导致慢性阻塞性通气障碍，而PC干预降低了小鼠的FRC和Cchord，与模型组小鼠相比具有显著性差异。由图6和图7可知，LPS联合CS可显著降低小鼠的FEV50％和PEF，与模型组小鼠相比，PC给药后可显著提高小鼠的FEV50％和PEF。这些结果表明：PC可改善COPD小鼠的肺功能。

3、PC对COPD小鼠BALF炎症细胞的影响

吸烟是导致肺部慢性炎症的主要原因。收集BALF中的炎症细胞，并采用Diff-Quck染色进行分类，以探究PC对COPD小鼠肺组织炎症细胞的影响。各组小鼠BALF中的炎症细胞的形态见图8，炎症细胞的分类和计数结果见图9至图12。由图8可知，与对照组小鼠相比，模型组小鼠的炎症细胞数量显著增加。由图9至图12可知，与对照组小鼠相比，模型组小鼠的总细胞数、巨噬细胞数、中性粒细胞数和淋巴细胞数均显著增加，巨噬细胞和淋巴细胞占炎症细胞的比例较高，PC给药显著降低了BALF中的炎症细胞，特别是中性粒细胞和淋巴细胞。这些结果表明：PC对COPD小鼠肺组织中炎症细胞的活化、浸润以及炎性介质的分泌起到了抑制作用。

肺泡巨噬细胞是肺泡内的主要细胞类型，位于气道腔和肺泡间隙之间，是宿主抵御吸入生物体和颗粒分子的第一道防线。先前的研究发现，肺泡巨噬细胞可产生多种多样的促炎/抗炎因子及相关蛋白，在调节肺疾病炎症方面起到了至关重要的作用。CD68是一种细胞浆糖蛋白，在巨噬细胞中高度表达，是巨噬细胞可靠的标记物，因此采用免疫荧光染色观察肺组织中CD68的表达。各组小鼠肺组织中CD68的表达情况见图13。由图13可知，LPS联合CS可增加巨噬细胞中CD68的表达，阳性药和PC干预后可降低巨噬细胞中CD68的表达，减缓COPD小鼠肺部炎症。这些结果表明：PC可减少COPD小鼠肺组织中巨噬细胞浸润。

4、PC对COPD小鼠肺部病理的影响

肺气肿是COPD的显著特征之一，测量肺泡直径平均值(MLI)可以评估PC是否可以抑制肺气肿的进展。各组小鼠肺组织切片的H&E染色结果及MLI的测量结果分别见图14和图15。由图14和图15可知，对照组小鼠肺泡及肺泡间组织结构清晰，无炎性细胞浸润，MLI基本一致；与对照组小鼠相比，模型组小鼠的肺泡结构受到破坏，肺泡腔不规则扩大，部分融合成肺大泡，MLI显著高于对照组；PC给药后能够缓解LPS和CS引起的肺泡形态学改变，体现在肺泡结构相对完整，肺泡大小均一，肺大泡数量减少，MLI显著低于模型组。这些结果说明：PC对COPD小鼠的肺组织具有一定的保护作用。

杯状细胞化生(GCM)是COPD的标志。各组小鼠肺组织的杯状细胞的PAS染色结果及球细胞指数的测量结果分别见图16和图17。由图16和图17可知，在对照组小鼠肺组织内仅见到极少量的杯状细胞存在；与对照组小鼠相比，模型组小鼠肺组织内杯状细胞增殖肥大，数量显著高于对照组，同时伴有较多黏液分泌；与模型组小鼠相比，PC给药后小鼠肺组织内杯状细胞显著减少，改善了肺组织杯状细胞化生现象。这些结果说明：PC对COPD小鼠的肺组织具有一定的保护作用。

肺组织受到伤害时，会分泌胶原蛋白进行修复，胶原蛋白在肺组织间沉积会促进COPD病情加重，胶原蛋白沉积也是COPD的显著特征之一。在给药30d后，对各组小鼠肺组织进行Masson染色观察PC对肺组织胶原沉积的影响。各组小鼠肺组织胶原沉积的Masson染色结果及胶原纤维含量的测量结果分别见图18和图19。由图18和图19可知，与对照组小鼠相比，模型组小鼠肺组织内胶原沉积明显增加；与模型组小鼠相比，PC组小鼠肺组织内胶原沉积显著降低，其治疗效果与阳性药(阳性对照组)相当。

5、PC对COPD小鼠肝、肾、脾的影响

脏器指数在一定程度上能够反应药物的副作用。切取各组小鼠的肝、脾和肾，并测定其指数。各组小鼠的肝指数、脾指数和肾指数的测量结果分别见图20、图21和图22。

由图20可知，与对照组小鼠相比，模型组小鼠的肝指数无明显差异；与模型组小鼠相比，阳性对照组小鼠和PC组小鼠的肝指数均无明显差异。由图21可知，与对照组小鼠相比，模型组小鼠的脾指数明显降低，表明LPS联合CS可引起小鼠机体免疫功能紊乱；与模型组小鼠相比，阳性对照组小鼠和PC组小鼠的脾指数均无明显差异。由图22可知，与对照组小鼠相比，模型组小鼠的肾指数无明显差异；与模型组小鼠相比，阳性对照组小鼠和PC组小鼠的肾指数均无明显差异。这些研究结果表明：PC没有肝脾肾毒性。

6、PC对COPD小鼠肺组织氧化应激蛋白HO-1、NQO1和NOX2的影响

氧化应激对COPD进展起着越来越明确的作用，HO-1和NQO1可由多种刺激物(包括生长因子、氧化应激、饮食抗氧化剂)诱导。采用Western Boltting测定各组小鼠肺组织中HO-1和NQO1的表达，探究PC对COPD小鼠抗氧化应激的作用。

各组小鼠NQO1和HO-1的表达情况见图23，NQO1和HO-1的相对水平测量结果分别见图24和图25。由图24和图25可知，COPD小鼠(包括模型组小鼠、PC组小鼠、阳性对照组小鼠)肺中HO-l和NQO1的表达显著高于对照组小鼠，PC处理后(PC组)和阳性药处理后(阳性对照组)可显著降低HO-1和NQO1的表达水平，使HO-1和NQO1的表达趋于正常水平。

各组小鼠肺组织切片HO-1的免疫组织化学染色结果及HO-1的IOD统计结果分别见图26和图27。由图27可知，与对照组比较，模型组HO1表达水平增加，给予PC后，HO1表达减少。

各组小鼠肺组织切片NQO1的免疫荧光染色结果见图28。由图28可知，与对照组比较，模型组NQO1表达增加，PC抑制了COPD小鼠NQO1表达水平。

这些结果显示：相比于对照组小鼠，PC干预可调节NQO1和HO-1的表达，改善LPS联合CS引起的小鼠氧化应激反应。

NOX2是除线粒体外机体产生活性氧的重要来源，通过氧化应激促进COPD的发展。各组小鼠肺组织中NOX2的表达情况见图13。由图13可知，相比于对照组小鼠，模型组小鼠肺组织中NOX2表达升高，PC干预后可降低NOX2的表达，表明PC能够抑制NOX2的表达，降低小鼠肺部的氧化应激反应，对治疗COPD小鼠表现出有益作用。

7、分子对接

研究表明，传统的HO-1诱导剂主要是金属卟啉，它们能显著上调HO-1的表达，但由于存在严重的毒性问题，所以不适合临床使用。胆红素等线性四吡咯也可以激活HO-1，但是胆红素等线性四吡咯的临床给药不仅存在毒性问题，还存在生物利用度低等问题。因此，亟需找到使用安全、耐受性好的线性四吡咯替代品。Keap1在HO-1的表达调控中起到了非常重要的作用。通常情况下，细胞内的Keap1与Nrf2相结合，抑制Nrf2的活性，从而使其无法进入到细胞核内介导HO-1的表达。而当存在氧化应激时，刺激因子能够通过迈克尔加成，共价连接到Keap1上，使Keap1与Nrf2分离，Nrf2激活HO-1的表达，从而降低组织中ROS的水平。

胆红素已经被证明能够通过抑制Keap1的活性诱导HO-1的表达。PC中包含的四吡咯色素PCB具有与胆红素相似的结构，并且都具有α、β-不饱和羰基，因此推测PCB也能够通过迈克尔加成的方式共价结合在Keap1上，从而抑制Keap1的活性。Britanin是一种已经被报道的Keap1抑制剂，通过共价对接在Keap1Cys151上抑制Keap1的活性，因此使用Britanin与PCB进行对照。共价对接结果显示：PCB与Keap1对接后结合能为-3.2kcal/mol，低于Britanin的-2.8kcal/mol，因此PCB具有比Britanin更好的Keap1结合活性。PCB除了能够在Keap1 Cys151形成共价键外，PCB还能够与Keap1蛋白形成更多的相互作用，包括：氢键、疏水作用以及盐桥，这些相互作用能够帮助稳定PCB的构象，并降低结合能。

近年来，也有研究显示PCB与NOX2具有高结合亲和力。NOX2属于NOX超家族，能够通过结合NADPH，将电子从NADPH经过FAD和血红素传递到分子氧，从而生成超氧化物。为了更进一步探究PC抑制COPD的作用机理，使用分子对接的方法对PCB与NOX2的结合进行了研究。分子对接结果显示：PCB能够结合在NOX2的NADPH结合位点上，并且其结合能达到了-7.7kcal/mol，远低于NAPDH的-5.9kcal/mol，说明PCB具有更高的NOX2结合活性，能够通过竞争性结合抑制NOX2与NADPH结合，从而减少组织中超氧化物生成。

8、PC肽对氧化应激蛋白HO-1、NQO1和NOX2的影响

巨噬细胞为BALF中的主要细胞群，在CSE的刺激下，巨噬细胞产生ROS，抗氧化应激相关蛋白表达增加。在体外实验中，给予CSE刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7，并给予PC肽干预小鼠巨噬细胞RAW264.7，NOX2的免疫荧光染色结果见图29，ROS的免疫荧光染色结果见图30。从图29和图30中可以发现，巨噬细胞在受到CSE刺激时，NOX2和ROS表达水平均增加，给予PC肽处理后，NOX2和ROS表达水平下降。

不同浓度PC肽对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响情况见图31。由图31可知，PC肽对巨噬细胞RAW264.7增殖无影响。

鉴于Nrf2调控HO-1和NQO1表达水平，且Nrf2在慢阻肺和氧化应激中发挥重要作用，检测巨噬细胞RAW264.7中p-Nrf2、Nrf2、NQO1和HO-1的表达水平。巨噬细胞RAW264.7中p-Nrf2、Nrf2、NQO1和HO-1的电泳结果见图32，p-Nrf2、NQO1和HO-1的相对水平都计算结果图分别见图33、图34和图35。由图32至图35可知，给予CSE刺激巨噬细胞RAW264.7后，巨噬细胞RAW264.7中p-Nrf2、Nrf2、NQO1和HO-1表达水平均增加，给予PC肽干预巨噬细胞RAW264.7后，巨噬细胞RAW264.7中p-Nrf2、Nrf2、NQO1和HO-1的表达均下降，趋于正常表达水平。

三、讨论

COPD是一种呼吸道和肺间质的慢性进展性疾病，与基因易感个体暴露于烟草和其他环境中有关。COPD患者的肺组织很难恢复至正常水平，且目前的治疗方法也只能减少症状和肺功能的急速下降以防止病情加重。

COPD的发展是多因素的，包括基因因素和环境因素。目前，吸烟被认为是COPD最重要的发病因素。吸烟或吸入其他刺激性气体后能诱发气道和肺泡的炎症反应，同时激活炎性细胞，促进炎症因子释放，加重炎症反应。另一方面，烟草中的颗粒和焦油沉积在肺部会增加肺组织内活性氧的浓度，引起氧化应激反应。而持续的氧化应激会导致肺组织细胞内发生复杂反应，加重COPD的病情。通过LPS联合CS暴露成功复制小鼠COPD模型，其变化范围包括体重变化、肺功能测量、炎症细胞计数和分类、肺组织病理变化等。2008年的一项大规模临床研究发现，长期服用羧甲司坦可以预防与抗氧化和抗炎相关的COPD急性加重，因此选择羧甲司坦作为阳性对照药，以对比PC对COPD的治疗作用。

FRC、Cchord、FEV50％和PEF等指标常被用于衡量肺功能。FRC在生理上起着稳定肺泡气体分压的缓冲作用，其数值的增加提示肺泡扩张，但肺泡过度扩张会引起肺泡壁脆弱，肺组织弹力下降。气流阻断测得的肺静态顺应性用Cchord来进行表示，其数值的大小与肺组织弹力呈负相关。早期的研究表明，慢阻肺患者的FRC和Cchord指标显著高于正常人，这是由于COPD患者的气流受限，造成终末细支气管远端处气腔过度膨胀与肺泡内压力增高，进而使其发生破裂。FEV50％和PEF通常用以判断是否存在通气障碍和气道阻塞。在COPD患者中，小气道气流受阻和通气障碍会引起FEV50％和PEF数值降低。研究表明，PEF在评估COPD患者病情恶化方面更具有优势。经前面的研究发现：PC可降低COPD小鼠的FRC和Cchord，表明肺组织弹力得到恢复；同时，FEV50％和PEF的升高进一步支持PC具有改善COPD小鼠小气道气流受阻和通气障碍的作用。这些发现为PC改善COPD小鼠的肺功能提供了依据。

烟草诱导的COPD的发病机制伴随着各种类型炎症细胞的变化。炎症细胞的招募，包括巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞，以及炎症介质的释放，导致肺实质损伤、气道重塑和肺气肿。前面的实验结果证实了这些病理变化，如图8至图12所示，PC干预可以有效减少BALF中的免疫细胞，尤其是中性粒细胞和淋巴细胞。根据文献报道，COPD患者支气管壁各级浸润各种炎症细胞，主要是中性粒细胞和淋巴细胞。急性发作期可见大量中性粒细胞。在严重病例中，肺组织出现化脓性炎症、粘膜充血、水肿、变性和坏死以及溃疡。CD68是一种分子量为110kDa的糖蛋白，是巨噬细胞最可靠的标记。前面的实验结果显示，PC能显著降低巨噬细胞中CD68的表达，可能与BALF中巨噬细胞的减少有关。这些结果使PC可缓解COPD小鼠肺组织炎症反应的假设得到支持。

烟雾颗粒沉积在气道和肺会引发气管壁和肺组织的反复损伤与修复，导致气管和肺组织结构重塑、胶原含量增加和瘢痕形成。这些病理变化是COPD气流受限的主要病理基础。在前面的实验中，模型组小鼠肺泡MLI增大，部分肺泡融合形成肺大泡(图14和图15)，说明LPS联合CS能够损伤肺泡壁致使肺泡破裂，加重COPD的病情。与模型组小鼠相比，PC给药后可缓解小鼠肺组织形态学的改变，维持肺泡结构完整，避免肺泡过度充气而形成肺大泡。气道内杯状细胞的增多可导致粘液分泌增加并积累，影响呼气容积。如图16和图17所示，PC干预抑制了杯状细胞增殖肥大及黏液分泌，增加了呼气容积，这与PC提高FEV50％和PEF结果相吻合。除了肺气肿和杯状细胞化生，肺部胶原沉积也是COPD的一个显著特征。既往研究表明烟草中的颗粒和焦油可持续引起肺泡炎从而引发不同程度的肺组织胶原分泌增加和沉积。因此前面探讨了LPS联合PC对COPD小鼠肺组织胶原沉积的影响。结果显示，PC给药后可逆转CS引起的肺组织胶原沉积(图18和图19)，改善COPD小鼠的肺病变情况。

脏器指数是药物评价中的一种必要的检测指标，为药物的评价提供了参考。脾指数是衡量机体免疫功能的重要指标。在前面的研究中，观察到模型组小鼠的脾指数降低(图21)，表明LPS联合CS能够引起机体免疫功能紊乱，这一结果与肺部炎症细胞增多一致。然而，PC给药后并不能逆转COPD小鼠脾指数的降低。事实上，脏器系数具有一定的局限性。因为动物受到药物的影响作用是复杂的，有的脏器出现重量变化可能是药物的直接作用，也可能是一种继发改变。但这一结果也至少表明PC在50mg/kg的剂量下是安全的，且长期服用并不会对小鼠的器官造成损伤。早期的研究发现，PC在炎症动物模型中的有效口服剂量范围为25～300mg/kg，即使给予最高剂量的PC(300mg/kg)，也不会引起动物死亡。长期毒性试验也揭示了大剂量(4g/kg)PC连续服用12周，大鼠的各项器官也未发生病理损伤，表明PC具有良好的口服安全性。

氧化应激和氧化/抗氧化的失衡与COPD发展密切相关。香烟中含有的外源性氧化剂是诱导COPD的主要危险因素。HO-1是人体内重要的抗氧化因子，同其催化血红素的代谢产物如一氧化碳和铁蛋白等共同发挥抗氧化作用。有研究发现，吸烟引发COPD小鼠处于高强度的氧化应激状态，体内HO-1表达升高，而给予芒果苷治疗能够平衡小鼠机体的氧化防御系统，使HO-1的表达趋于正常水平。NQO1是一种抗氧化解毒酶，在保护内源性抗氧化剂中起着重要作用。既往研究表明，在COPD患者中，NQO1的活性下调，而NQO1的表达升高。香烟颗粒作为COPD的主要诱因之一，能改变COPD小鼠肺部的氧化/抗氧化稳态，引起MnSOD和NQO1蛋白的高表达。这些发现与前面的研究结果一致，在前面的实验中，香烟烟雾联合LPS引起小鼠机体HO-1和NQO1高表达，PC干预可使HO-1和NQO1表达趋于正常水平(图23至图25)，从而缓解小鼠的氧化应激反应。体外实验也得到了类似的结果，即CSE能够促进小鼠巨噬细胞细胞RAW 264.7内p-Nrf2、NQO1和HO-1增加，给予PC肽干预可以降低这些蛋白的表达，使其趋于正常水平(图32至图35)。

NOX2是产生ROS的关键酶之一，主要在巨噬细胞和中性粒细胞中表达。经报道，在COPD患者和急性吸烟暴露小鼠中NOX2的表达升高，诱导了肺部的氧化应激与炎症，说明氧化应激与NOX2的表达有密不可分的联系。因此，为了进一步研究PC是否通过抗氧化途径对COPD小鼠模型发挥肺保护作用，前面探讨了肺巨噬细胞中NOX2在PC给药前后的表达情况。正如预期的那样，经PC处理后，COPD小鼠肺巨噬细胞中NOX2的表达趋于正常水平(图13)，这可能是缓解COPD小鼠病情的关键因素。这些发现支持PC可通过抗氧化发挥对COPD的治疗作用。

分子对接是分子模拟的一个重要分支，可以模拟在实验条件无法达到的情况下研究小分子与大分子受体(蛋白质)在整体或局部的相互关系，特别是在药物筛选、微观结构以及机理研究方面具有独特的优势。PCB是PC中一种四吡咯化合物，具有与胆红素类似的结构。在细胞中，胆红素可以与Keap1结合从而诱导HO-1的表达。因此，采用分子对接技术探究PCB是否具有与胆红素同样的作用机制。从分子对接结果中可以看到，PCB通过共价键、氢键、疏水作用等方式与Keap1结合，进一步调节HO-1的表达。此外，PCB还与NOX2具有很好的结合活性，能够通过竞争性结合NOX2。这一发现支持了前面的体内实验结果，即PC可降低NOX2的活性，降低组织超氧化物的产生，缓解COPD小鼠的氧化应激和肺纤维化。因此，推测PCB作为PC的主要活性成分之一，在PC发挥抗氧化的作用中发挥了关键性的作用。

四、结论

前面的研究建立了LPS联合CS诱导的小鼠COPD模型，并评价了PC对COPD小鼠的作用。体内实验数据表明，PC能够保护肺泡结构，减少杯状细胞化生和胶原沉积。BALF中炎症细胞也在PC处理后减少。PC还能调节肺组织中HO-1和NQO1的表达和肺巨噬细胞中NOX2的表达使其趋于正常水平，并改善机体的抗氧化应激能力。在体外研究中，PC肽处理能够抑制CSE诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7内p-Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的高表达，缓解氧化应激状态。此外，分子对接结果显示，PCB在Keap1和NOX2蛋白中具有很好的结合位点，进一步支持了体内和体外的实验结果。综上，PC通过抗炎和抗氧化对COPD发挥有益作用，这个作用是通过PCB实现的。

需要说明的是，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.藻蓝蛋白在制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药物中的应用。