TWI590830B

TWI590830B - 促進幹細胞分化及作爲心肌梗塞癒後保養的活性成分

Info

Publication number: TWI590830B
Application number: TW103113636A
Authority: TW
Inventors: 李連滋; 林周文; 林錚
Original assignee: 財團法人工業技術研究院
Priority date: 2014-04-15
Filing date: 2014-04-15
Publication date: 2017-07-11
Also published as: CN105002135A; TW201538165A; JP2015202107A; JP6099683B2

Description

促進幹細胞分化及作為心肌梗塞癒後保養的活性成分

本案關於黨參萃取物的新穎用途，特別是關於黨參萃取物作為幹細胞分化促進劑及用於心肌梗塞的癒後保養之用途。

心臟衰竭是因為心臟結構或功能異常所造成的現象，對生命具有潛在性的威脅。造成心臟衰竭的原因眾多，大多起因於心肌梗塞及心缺血現象而導致心臟肌肉組織受損或死亡。在工業化國家中，罹患心臟病的機率隨著年齡及其他危險因子，例如糖尿病及肥胖，而增加。

目前對於心臟衰竭的治療方法，主要有藥物投予及外科手術的介入，但是兩者都有其限制。這些治療方法不能使受損的心肌組織復原，更有可能衍生其他的副作用(Li S.C.,Wang L.,Jiang H.,Acevedo J.,Chang A.C.,and Loudon W.G.(2009)Stem cell engineering for treatment of heart diseases：Potentials and challenges.Cell Biol.Int.33,255-67.)。因此，也生出其他使受損的心肌組織恢復的替代療法。

幹細胞具有分化及再生的功能，被視為是治療心臟衰竭具有潛力的治療方法(Ruvinov E.,Dvir T.,Leor J.and Cohen S.(2008)Myocardial repair：from salvage to tissue reconstruction.Expert Rev.Cardiovasc.Ther.6,669-686；Segers V.F.and Lee R.T.(2008)Stem-cell therapy for cardiac disease.Nature 451,937-942；及Zhang J.,Wilson G.F.,Soerens A.G.,Koonce C.H.,Yu J.,Palecek S.P.,Thomson J.A.and Kamp T.J.(2009)Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.Circulation Research 104,e30-e41.)。幹細胞在體外可被誘導為心原代細胞(cardiac progenitor cells)，並分化為心肌細胞，從而可考慮用於替換受到梗塞或者受損的心臟組織並使其恢復功能。但是在移植非心原代細胞時可能導致腫瘤的形成，而造成致命的問題。另外還有幹細胞群的擴展(expansion)、輸入的幹細胞的歸位(homing)及損失(loss)、幹細胞的功能整合、及輸入幹細胞的途徑等的問題需要解決。

因此，如何有效地促使幹細胞分化為具有心肌功能的細胞並且降低副作用的產生，成為此領域中的重要課題。

本揭露係為了解決上述課題所研發之發明。本揭露藉由天然的中草藥萃取物，促進幹細胞的分化，形成具有心肌樣活性(cardiomyogenic activity)的細胞，以用於替換因心肌梗塞或缺血等原因而受到損傷或死亡的心肌細胞。本揭露更透過動物模式，理解到天然的中草藥萃取物可改善梗塞後的心肌細胞的功能。

更具體地說，本揭露揭示以下發明：

(1)一種促進幹細胞分化之方法，包括：於培養該幹細胞的培養基中，添加黨參萃取物作為分化促進劑。

(2)一種黨參萃取物作為幹細胞分化促進劑的用途。

(3)一種黨參萃取物用於心肌梗塞的癒後保養的用途。

第1A圖顯示經形成類胚胎體(embryoid body；EB)的收縮性心肌細胞的明視野成像(左圖)與綠螢光蛋白(eGFP)的表現(中圖)，兩者疊合後(右圖)顯示其中的收縮性細胞群表現eGFP。

第1B圖顯示以免疫細胞化學法染色的收縮性心肌細胞，確認表現eGFP的收縮性細胞為心肌細胞。

第2圖顯示EMG8轉殖基因幹細胞不形成EB而自發分化為心肌細胞的明視野成像(左圖)與eGFP的表現(中圖)，兩者疊合後(右圖)確認分化的心肌細胞表現eGFP。

第3A圖顯示黨參萃取物對EMG8轉殖基因幹細胞的分化的影響，顯示黨參萃取物可促進EMG8轉殖基因幹細胞分化為心肌細胞。

第3B圖顯示黨參萃取物對EMG8轉殖基因幹細胞的分化的劑量依存性。

第4A圖顯示黨參萃取物對心肌梗塞大鼠模式的心臟功能中的短軸縮短百分比(Fractional shortening；FS)的影響。

第4B圖顯示黨參萃取物對心肌梗塞大鼠模式的心臟功能中的短軸收縮面積(Fractional area contraction；FAC)的影響。

第4C圖顯示黨參萃取物對心肌梗塞大鼠模式的心臟功能中的心室射血分率(ejection fraction；EF)的影響。

第5圖顯示本發明一實施例中所構築的載體pMGN22結構。

本揭露使用黨參(Codonopsis pilosula(France)Nannf.)萃取物作為幹細胞分化促進劑以及作為心肌梗塞的癒後保養之活性成分。

黨參(Codonopsis pilosula(France)Nannf.)為桔梗科(Campanulaceae)多年生草本植物的乾燥根，在中國傳統醫學中被認為具有補中益氣、健脾胃的功效，為常用的中藥種類之一(林子超等人，桔梗科植物黨參之本草學考察，J.Chin.Med 18(1,2)：51-64,2007)。黨參多與其他中草藥以複方組合投予，以達到補氣、健胃等效果。然而，尚未有任何文獻記載黨參在促進幹細胞分化上的效果以及在促進心肌梗塞癒後的恢復效果。再者，亦尚未有任何記載黨參對動物體產生毒性的可能性。基於已長期使用且未有動物毒性的觀點，使用黨參可降低或排除使用化學合成藥物可能造成的副作用或毒性。

本揭露使用黨參的萃取物作為幹細胞分化促進劑以及作為心肌梗塞的癒後保養之活性成分。更具體地說，本揭露所使用之黨參萃取物係來自於黨參的乾燥粉末以水萃取。黨參的乾燥粉末與萃取用的水量之比例沒有特別限制，可以是黨參對水的重量比為1：5~1：20(黨參：水)。在一實施例中，使用黨參對水的重量比為1：10進行萃取。萃取的溫度通常高於室溫，可為80~100℃。在一實施例中，採用90~100℃進行萃取。萃取的方法可採用熱回流萃取法(hot backflow extraction)，進行2~5小時。

本揭露之黨參萃取物為了長期、穩定保存，可進一步濃縮、冷凍乾燥，以乾燥粉末型態儲存。於使用前，回溶於水中即可使用。回溶的濃度可為10~1000μg/ml，本揭露一實施例中，回溶的濃度為100μg/ml。

本揭露所述之幹細胞可來自哺乳動物的胚胎幹細胞或成體幹細胞，例如臍帶血幹細胞、骨髓幹細胞、成人周邊血液幹細胞等。由於胚胎幹細胞獲得自發育4-5天的胚胎之中空微小的囊胚(blastocyst)，具有將來各自分化發育成一個完整個體所需的所有細胞組織之能力(pluripotent)，因此為較佳的分化對象。又本案可使用的哺乳動物可例如鼠、兔、豬、牛、狗、貓、猴、猿、或人類等，沒有特別限制。

本揭露為了確認黨參萃取物的幹細胞分化促進效果，特別設計具有小鼠α-心肌球蛋白重鏈(α-cardiac myosin heavy chain；α-MHC)基因啟動子以及綠螢光蛋白基因(eGFP gene)之轉殖基因幹細胞株。α-MHC基因是心臟發育早期表現的心肌細胞專一性基因(Morkin E.(2000)Control of cardiac myosin heavy chain gene expression.Microsc.Res.Tech.50,522-531.)。藉由本揭露設計之轉殖基因幹細胞株，可以透過標記蛋白eGFP的螢光表現，確認幹細胞是否分化為具有心肌樣活性(cardiomyogenic activity)的細胞，以檢測黨參萃取物在幹細胞分化促進上的效果。根據本揭露之一實施例，無論上述轉殖基因幹細胞是否形成類胚胎體(EBs)，本揭露之黨參萃取物皆呈現促進該幹細胞分化為具有心肌樣活性的細胞的效果。另一方面，使用黨參的其他溶劑萃取物，例如乙醇，則未產生促進幹細胞分化的效果(此試驗及數據未顯示於本揭露)。

再一方面，本揭露亦提供黨參萃取物在心肌梗塞癒後保養上的功效。根據本揭露一實施例，黨參萃取物對於心肌梗塞的動物模式具有改善心肌功能的效果，此效果表現在心臟的短軸縮短百分比(fractional shortening；FS)、短軸收縮面積(fractional area contraction；FAC)、心室射血分率(ejection fraction；EF)等的指標數據上。

根據本揭露，黨參萃取物顯現心原性活性(cardiogenic activity)，可用於促進幹細胞，特別是胚胎幹細胞，分化為具有心肌樣活性(cardiomyogenic activity)的細胞，進而可生產心肌細胞而應用於細胞療法中。再者，根據本揭露，黨參萃取物對於罹患急性心肌梗塞後之受損心臟，具有改善心肌功能的效果，可有效作為心肌梗塞癒後的保養活性成分。

以下說明本發明較佳實施形態，為了明確化說明，適當地省略及簡略化以下的記載以及圖式。再者，本發明不限於上述各實施形態。在本發明的範圍內，此業者可容易變更、追加、變換上述實施形態的各要素。

[實施例1] 載體的構築

將小鼠α-MHC啟動子(獲自Jeffrey Robbins (Gulick J.,Subramaniam A.,Neumann J.and Robbins J.(1991)Isolation and characterization of the mouse cardiac myosin heavy chain genes.J.Biol.Chem.266,9180-9185.))之BamHI-SalI切割α-MHC啟動子(5.5kb片段)插入pEGFP-1(Clontech)的多重選殖位(MCS)上的限制酶BgIII-SaII切割位置，構築載體pMGN22(如第5圖)。

含轉殖基因的幹細胞株的製備

根據操作手冊之指示，使用lipofectamine 2000(Invitrogen)將載體pMGN22轉染入小鼠幹細胞株ES-D3細胞(ATCC)，製備轉殖幹細胞株EMG8。

具體地說，在表面塗覆0.1%明膠(Millipore)、無餵養細胞的幹細胞培養基(含有Dulbecco改良的必須培養基(DMEM)(Gibco)、0.1mM非必須胺基酸(Gibco)、0.15mM的α-硫代甘油(monothioglycerol)(ICN Biomedicals Inc.)、15%的幹細胞胎牛血清(ES cell-qualified fetal bovine serum)(Gibco)、盤林西林G(penicillin G.)(100U/ml)、鏈黴素(streptomycin)(100μg/ml)、兩性黴素(amphotericin B)(250ng/ml)、10³U/ml的ESGRO(Chemicon))中，於500μg/ml的G418(Sigma)存在下，篩選上述製備的轉殖幹細胞株EMG8。之後將篩選所得的EMG8轉殖幹細胞株於5%CO₂、37℃培養於含有250μg/ml的G418的幹細胞培養基。每日更換培養基。

α-MHC是心臟發育中早期表現的心肌細胞專一性基因(Morkin E.(2000)Control of cardiac myosin heavy chain gene expression.Microsc.Res.Tech.50,522-531.)。藉由上述構築的轉殖基因幹細胞EMG8，可以呈現幹細胞分化為心肌細胞的過程。

小鼠幹細胞株的分化

將上述所得的EMG8轉殖幹細胞株以每孔2000個細胞接種於含有幹細胞分化培養基(含有高葡萄糖量的DMEM培養基(Gibco)、0.1mM非必須胺基酸(Gibco)、0.1mM的β-硫基乙醇(beta-mercaptoethanol)(Sigma)、20%的胎牛血清(Gibco)、100U/ml盤林西林G(penicillin G.)、100μg/ml鏈黴素(streptomycin)、250ng/ml兩性黴素(amphotericin B)、及250μg/ml的G418)、表面塗覆0.1%明膠(Millipore)的96孔盤(Corning)中。每天更換培養基。10天後，使用SpectraMax M2微滴盤讀計(Molecular Devices)測量在激發光波長480nm及發射光波長519nm下的增強型綠色螢光蛋白(eGFP)的強度。

另一方面，上述所得的EMG8轉殖幹細胞株進行自發性的分化，形成類胚胎體(embryoid bodies；EBs)(Hescheler J.,Fleischmann B.K.,Lentini S.,Maltsev V.A.,Rohwedel J.,Wobus A.M.and Addicks K.(1997)Embryonic stem cells：a model to study structural and functional properties in cardiomyogenesis.Cardiovasc.Res.36,149-162；及Pucéat M.(2008)Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells.Methods 45,168-171.)。簡單地說，於5%CO₂、37℃的2天培養後，在含有培養基的培養皿(SPL)的上蓋形成懸滴狀的類胚胎體(EBs)，在25μl的幹細胞分化培養基中含有500個細胞。之後在幹細胞分化培養基中再懸浮5天。之後將此類胚胎體(EBs)移至含有幹細胞分化培養基、塗佈明膠的6孔盤(Nunc)，持續分化。以光學顯微鏡觀察類胚胎體(EBs)的收縮(contractile)、跳動(beating)表現。使用具有Andor Luca-R EMCCD的Leica DM IRBE顯微鏡觀察記錄表現綠色螢光蛋白(eGFP)的類胚胎體(EBs)的收縮影像。

黨參萃取物的製備

100g的黨參(Codonopsis pilosula(France)Nannf.)粉末以熱回流萃取法於95℃、1000ml水萃取2.5小時。之後冷卻該粗萃取物，以附有吸力的過濾器或層析法從該粗萃取物中分離出澄清的萃取物，之後濃縮、冷凍乾燥形成乾燥粉末，以長期儲存。本實施例中，該萃取物回溶於去離子水，形成100μg/ml濃度，以確認該黨參萃取物的心原性活性(cardiogenic activity)。

免疫化學染色

將前述接種於塗佈明膠的玻片、經15天分化培養、衍生自EMG8的類胚胎體(EBs)，以4%甲醛在室溫下固定20分鐘，之後以0.5% Triton X-100進行細胞透化作用(permeabilization)5分鐘，然後在室溫下以5%健康山羊血清(NGS)/PBS封阻20分鐘。之後將該EBs與初級抗體(兔anti-Nkx2-5：1：150[GeneTex]或小鼠anti-α-Actinin IgG1：1：200[Enzo])在4℃、1%的NGS/PBS共同培養過夜。之後以PBS清洗兩次，使上述EBs於室溫下與次級抗體(山羊抗兔Qdot655-共軛的IgG：1：200[Invitrogen]或山羊抗小鼠TRICT-共軛的IgG：1：200[Jackson ImmunoResearch])共同培養1小時。之後使用有Andor Luca-R EMCCD的Leica DM IRBE顯微鏡觀察染色影像。

實驗動物

以3個月齡的雄大鼠(Wistar rat)(獲自國立成功大學醫學院實驗動物中心)作為實驗動物。所有動物操作流程皆根據國立成功大學實驗動物照護與使用委員會以及實驗室動物資源機構(Institute of Laboratory Animal Resource)之實驗室動物照護與使用之認可而進行。

心肌梗塞的大鼠模式的製備

使上述實驗大鼠在麻醉室吸入異氟烷(isoflurane)後，插入16G血液導管，使用哈佛呼吸機正壓通氣。麻醉藥維持在2%吸入性的異氟烷，建立心電圖(electrocardiograph；EKG)監測。切開左前胸及心包，從第四肋間隙看到心臟。以7-0 prolene線環繞綑綁左前下行動脈(left anterior descending(LAD)artery)(Kan C.D.,Lee H.L.,and Yang Y.J.(2010)Cell transplantation for myocardial injury：a preliminary comparative study.Cytotherapy 12,692-700.)。操作過程中，以目視及EKG ST段評估確認心肌缺血現象。再使用3-0 Vicryl(Ethicon Co,Inc)及3-0 Ethilon(Ethicon Co,Inc)將肋骨及皮下與皮膚的傷口縫合。所有實驗大鼠術後獲得同量的肌肉內抗生素及麻醉藥。

心肌功能評估

在左前下行動脈(LAD)綑綁後1週，使用心臟超音波(echocardiography)測量心肌功能及受影響的心肌壁體積，作為基準線(baseline)的數據。麻醉大鼠，成左外側臥位，將左心室(LV)的乳頭肌水平(mid-papillary level)的短軸2D影像儲存為數位迴路，並且追蹤心內緣膜(endocardial borders)，確認收縮末期容積區域(end-systolic(ESA)cavity area)及舒張末期容積區域(end-diastolic(EDA)cavity area)。

以左心室收縮末期內徑(LV end-diastolic dimension(LVEDD))減去左心室舒張末期內徑(LV end-systolic dimension(LVESD))再除以左心室收縮末期內徑(LVEDD)的M-mode影像，計算出短軸縮短率(fractional shortening；FS)。

以舒張末期容積區域與收縮末期容積區域的差相對於舒張末期容積區域的百分比([EDA-ESA]/EDA×100)計算出短軸收縮面積(fractional area contraction；FAC)。

以心搏血量與舒張末期體積的百分比[(SV/EDV)×100]計算出心室射血分率(ejection fraction(EF))。心搏血量(SV)相當於舒張末期體積(end-diastolic volume；EDV)減去收縮末期體積(end-systolic volume；ESV)。

每次測量進行三次，取平均值。大鼠在心臟超音波評估、LAD綑綁後，任意地分為兩組實驗群(即控制組及黨參萃取物投予組)。心肌功能由未告知上述實驗處理的觀察者以相同的心臟超音波評估。

結果 經形成類胚胎體(EBs)的收縮性心肌細胞的eGFP表現

在培養後第15天(2天懸滴狀培養、5天懸浮培養、及8天固定培養)，以螢光顯微鏡觀察類胚胎體(EBs)生長中的 eGFP表現，如第1A、1B圖所示。第1A圖的左圖為明視野成像，顯示收縮性細胞群位在圓形區域內。第1A圖的中間圖顯示eGFP的綠色螢光表現，與左圖的明視野成像完全重疊(第1A圖的右圖)後顯示，這些收縮性細胞群表現eGFP。

為了進一步地確認表現eGFP的收縮性細胞，將EB生長以免疫細胞化學法呈現。結果如第1B圖所示，表現eGFP的收縮性細胞以anti-α-Actinin與anti-Nkx2-5抗體染色後，由於α-Actinin與Nkx2-5為心肌細胞中專一性存在的蛋白，由此確認表現eGFP的收縮性細胞為心肌細胞。

在自發分化的EMG8細胞中觀察到表現eGFP的心肌細胞

EMG8細胞不形成EB而直接接種於幹細胞分化培養基上自發分化。9天後將分化的幹細胞以落射螢光顯微鏡(epifluroescence microscope)觀察eGFP的表現。結果如第2圖所示，存在eGFP陽性細胞，顯示EMG8細胞自發分化為心肌細胞。由此結果，可藉由將EMG8細胞接種於含有黨參萃取物的幹細胞分化培養基中來評估黨參萃取物的心原性活性。

黨參萃取物以劑量依存性促進EMG8細胞的心原性分化

為了觀察黨參萃取物的心原性活性，將EMG8細胞以每孔2000個細胞接種於含有幹細胞分化培養基的明膠塗佈的96孔盤(第1天)。第2天每孔加入0.5mg/ml黨參萃取物，每一樣本有5個試驗品。每天更換培養基。第11天移除培養基，將此96孔盤移至設定激發光波長480nm及發射光波長519nm的螢光微滴盤讀計檢測。結果如第3A圖所示，黨參萃取物的心原性活性為24.2%，高於控制組。而且黨參萃取物對EMG8細胞的心原性活性顯示劑量依存性(第3B圖)。

另一方面，使用形成類胚胎體(EBs)的模式，評估黨參萃取物的心原性活性。結果顯示黨參萃取物可以促進跳動的EB生長，與未形成EB的幹細胞分化模式中所得到的結果(未顯示數據)相同。由此結果推知，黨參萃取物含有可促進未分化的EMG8細胞進行心原性分化的潛在成分。基於此點，再進一步將黨參萃取物進行體內動物模式的評估。

黨參萃取物改善心肌梗塞大鼠模式的心臟功能

前述實驗大鼠經左前下行動脈(LAD)綑綁1日後，每日每隻腹腔注射10mg黨參萃取物，連續10天。3週及6週後，監測經處理之大鼠的短軸縮短百分率(FS)、短軸收縮面積(FAC)及心室射血分率(EF)。

根據下表1及第4A~4C圖的心臟超音波數據，顯示在黨參萃取物投予後的1週，大鼠的心臟功能沒有顯著地改善。但是在3週後，黨參萃取物投予組(n=6)則顯著地改善大鼠的心臟功能，FS為40.8%(p<0.05)、FAC為59.1%(p<0.01)、及EF為40.2%(P<0.01)，相較於控制組(n=6)。在6週後，FS有22.6%的改善，FAC有35.3%(p<0.05)的改善，EF有29.6%(P<0.05)的改善。雖然從第3週至第6週，黨參萃取物投予組的FAC及EF下降，但是相較於控制組，受損的心臟仍然有顯著地功能性改善。此結果證實黨參萃取物可以改善、促進梗塞後的心臟功能。

Claims

一種促進幹細胞分化之方法，包括：於培養該幹細胞的培養基中，添加黨參萃取物作為分化促進劑，其中該幹細胞分化為具有心肌樣活性的細胞。
如申請專利範圍第1項所述之促進幹細胞分化之方法，其中該黨參萃取物為水萃取物。
如申請專利範圍第2項所述之促進幹細胞分化之方法，其中該黨參萃取物是以80~100℃的水所萃取。
如申請專利範圍第1-3項任一項所述之促進幹細胞分化之方法，其中該幹細胞包括胚胎幹細胞或成體幹細胞。
一種黨參萃取物在製備促進幹細胞分化之藥物的用途，其中該黨參萃取物促進幹細胞分化為具有心肌樣活性的細胞。
如申請專利範圍第5項所述之黨參萃取物在製備促進幹細胞分化之藥物的用途，其中該黨參萃取物為水萃取物。
如申請專利範圍第6項所述之黨參萃取物在製備促進幹細胞分化之藥物的用途，其中該黨參萃取物是以80~100℃的水所萃取。
如申請專利範圍第5-7項任一項所述之黨參萃取物在製備促進幹細胞分化之藥物的用途，其中該幹細胞包括胚胎幹細胞或成體幹細胞。
一種黨參萃取物在製備心肌梗塞癒後保養之藥物的用途。
如申請專利範圍第9項所述之黨參萃取物在製備心肌梗塞癒後保養之藥物的用途，其中該黨參萃取物為水萃取物。
如申請專利範圍第10項所述之黨參萃取物在製備心肌梗塞癒後保養之藥物的用途，其中該黨參萃取物是以80~100℃的水所萃取。