CN113260370A - 细胞重编程的方法 - Google Patents

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弗兰克·E·扬格
英腾·朱
陈思宇
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Abstract

本文中公开了细胞重编程的方法，所述方法包括使细胞与HC‑HA/PTX3接触足以使所述细胞的表型进行细胞重编程为不同表型的时间。

Description

细胞重编程的方法
交叉引用
本申请要求2018年11月7日提交的美国临时申请号62/757,082的权益，该美国临时申请通过引用而以其整体并入本文中。
关于联邦政府资助的研究的陈述
本发明是依据由美国国立卫生研究院的国立眼研究院给予的合同号RO1EY06819在美国政府的支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
发明内容
在一些方面中，本文提供了将具有第一表型的细胞重编程的方法，其包括：使所述细胞与HC-HA/PTX3接触足以将所述细胞的所述第一表型重编程为第二表型的时间。在一些实施方案中，所述第二表型对应于细胞分化途径中的早期细胞的表型。在一些实施方案中，所述细胞被重编程为细胞分化途径中的早期细胞。在一些实施方案中，所述细胞是从祖细胞分化的细胞。在一些实施方案中，所述祖细胞是神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞，或者心血管祖细胞。在一些实施方案中，所述祖细胞是神经嵴祖细胞。在一些实施方案中，从所述祖细胞分化的细胞是间充质细胞。在一些实施方案中，从所述祖细胞分化的细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、角膜细胞、上皮细胞或角膜缘龛细胞(limbal niche cell)。在一些实施方案中，所述成纤维细胞是肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞，或者心脏成纤维细胞。在一些实施方案中，所述早期细胞是祖细胞。在一些实施方案中，所述细胞存在于组织的损伤或退化之后的组织中。在一些实施方案中，所述组织是眼组织、心脏组织、皮肤组织、关节组织、脊椎组织、软组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、韧带组织、神经组织、椎间盘组织、脊髓组织、脑组织，或者肌肉组织。在一些实施方案中，所述组织是心脏组织。在一些实施方案中，所述组织是眼组织。在一些实施方案中，所述损伤是烧灼、撕裂、缺血性组织、创伤、伤害、溃疡、辐射、化疗或手术切口的结果。在一些实施方案中，所述伤害是心肌梗死。在一些实施方案中，将所述HC-HA/PTX3包含在胎儿支持组织的制剂中。在一些实施方案中，所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织被冷冻或预先冷冻。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织基本上没有红细胞。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织包含基本上没有静脉或动脉的脐带。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。在一些实施方案中，组合物是凝胶、溶液或者悬浮液。在一些实施方案中，所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述成纤维细胞与TGFβ1接触。
在一些方面中，本文提供了治疗有需要的受试者中以不需要的成纤维细胞分化为特征的病症的方法，所述方法包括使所述受试者中感染所述病症的组织内的成纤维细胞与HC-HA/PTX3接触足以使所述成纤维细胞的表型重编程为不同表型的时间段，由此治疗所述病症。在一些实施方案中，所述不同表型与细胞分化途径中早期细胞的表型对应。在一些实施方案中，所述成纤维细胞被重编程为细胞分化途径中的早期细胞。在一些实施方案中，所述成纤维细胞是从祖细胞分化的细胞。在一些实施方案中，所述祖细胞是神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞，或者心血管祖细胞。在一些实施方案中，所述祖细胞是神经嵴祖细胞。在一些实施方案中，从所述祖细胞分化的细胞是间充质细胞。在一些实施方案中，从所述祖细胞分化的细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、角膜细胞、上皮细胞，或者角膜缘龛细胞。在一些实施方案中，所述成纤维细胞是肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞，或者心脏成纤维细胞。在一些实施方案中，所述早期细胞是所述祖细胞。在一些实施方案中，所述组织是眼组织、心脏组织、皮肤组织、关节组织、脊椎组织、软组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、韧带组织、神经组织、椎间盘组织、脊髓组织、脑组织，或者肌肉组织。在一些实施方案中，所述组织是眼组织。在一些实施方案中，所述组织是心脏组织。在一些实施方案中，所述病症是心肌梗死。在一些实施方案中，所述接触发生在支架置入手术操作期间。在一些实施方案中，所述病症发生是由于烧灼、撕裂、缺血性组织、创伤、伤害、溃疡、辐射、化疗或手术切口。在一些实施方案中，将HC-HA/PTX3包含在胎儿支持组织的制剂中。在一些实施方案中，所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织被冷冻或预先冷冻。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织基本上没有红细胞。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织包含基本上没有静脉或动脉的脐带。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。在一些实施方案中，组合物是凝胶、溶液或者悬浮液。在一些实施方案中，所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述成纤维细胞与TGFβ1接触。
在一些方面中，本文中提供了使组织中的疾病状态逆转的方法，其包括使所述组织与HC-HA/PTX3接触足以使所述组织中的患病细胞或不需要的细胞重编程为具有不同表型的细胞的时间，由此逆转所述组织的所述疾病状态。在一些实施方案中，所述不同表型与细胞分化途径中早期细胞的表型对应。在一些实施方案中，所述不同表型对应于祖细胞的表型。在一些实施方案中，所述祖细胞是神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞，或者心血管祖细胞。在一些实施方案中，所述不需要的细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、角膜细胞、上皮细胞，或者角膜缘龛细胞。在一些实施方案中，所述成纤维细胞是肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞，或者心脏成纤维细胞。在一些实施方案中，所述患病细胞或不需要的细胞存在于组织的结疤、损伤或退化之后的组织中。在一些实施方案中，所述组织是眼组织、心脏组织、皮肤组织、关节组织、脊椎组织、软组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、韧带组织、神经组织、椎间盘组织、脊髓组织、脑组织，或者肌肉组织。在一些实施方案中，所述组织是心脏组织。在一些实施方案中，所述组织是眼组织。在一些实施方案中，将所述HC-HA/PTX3包含在胎儿支持组织的制剂中。在一些实施方案中，所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。在一些实施方案中，所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
在一些方面中，本文中提供了从分化细胞产生祖细胞的方法，其包括使所述分化细胞与HC-HA/PTX3接触足以使所述分化细胞重编程为祖细胞表型的时间。在一些实施方案中，所述祖细胞表型与细胞分化途径中早期细胞的表型对应。在一些实施方案中，所述祖细胞表型对应于神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞或心血管祖细胞的表型。在一些实施方案中，所述分化细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、角膜细胞、上皮细胞或角膜缘龛细胞。在一些实施方案中，所述成纤维细胞是肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞，或者心脏成纤维细胞。在一些实施方案中，所述分化细胞存在于组织的结疤、损伤或退化之后的组织中。在一些实施方案中，所述组织是眼组织、心脏组织、皮肤组织、关节组织、脊椎组织、软组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、韧带组织、神经组织、椎间盘组织、脊髓组织、脑组织，或者肌肉组织。在一些实施方案中，所述组织是心脏组织。在一些实施方案中，所述组织是眼组织。在一些实施方案中，将所述HC-HA/PTX3包含在胎儿支持组织的制剂中。在一些实施方案中，所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。在一些实施方案中，所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
在一些方面中，本文提供了使组织再生的方法，其包括：使组织内的细胞的第一分化表型重编程为祖细胞表型，以及使所述祖细胞表型分化为第二分化表型，由此使所述组织再生。在一些实施方案中，所述方法在体外进行。在一些实施方案中，所述方法在体内进行。在一些实施方案中，所述方法在活体外进行。在一些实施方案中，所述祖细胞表型与细胞分化途径中早期细胞的表型对应。在一些实施方案中，所述祖细胞表型对应于神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞或心血管祖细胞的表型。在一些实施方案中，第一分化细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、角膜细胞、上皮细胞或角膜缘龛细胞。在一些实施方案中，所述成纤维细胞是肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞，或者心脏成纤维细胞。在一些实施方案中，所述第一分化细胞存在于所述组织的结疤、损伤或退化之后的所述组织中。在一些实施方案中，所述组织是眼组织、心脏组织、皮肤组织、关节组织、脊椎组织、软组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、韧带组织、神经组织、椎间盘组织、脊髓组织、脑组织，或者肌肉组织。在一些实施方案中，所述组织是心脏组织。在一些实施方案中，所述组织是眼组织。在一些实施方案中，将所述HC-HA/PTX3包含在胎儿支持组织的制剂中。在一些实施方案中，所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。在一些实施方案中，所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
在一些方面中，本文提供了组合物，所述组合物包含a)HC-HA/PTX3和b)治疗性细胞。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3的量足以使所述治疗性细胞维持在多能状态。在一些实施方案中，所述治疗性细胞是祖细胞、干细胞，或者诱导多能干细胞。在一些实施方案中，所述祖细胞是神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞或心血管祖细胞。在一些实施方案中，将HC-HA/PTX3包含在胎儿支持组织的制剂中。在一些实施方案中，所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。在一些实施方案中，所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
在一些实施方案中，本文中公开了使具有不需要的变化的组织再生的方法，其包括：使组织内的成纤维细胞与HC-HA/PTX3接触足以使所述成纤维细胞重编程为祖细胞或者所述组织的特征性正常间充质细胞的时间，所述组织包含所述组织的特征性间充质细胞和异常成纤维细胞。在一些实例中，所述组织不是疤痕组织。在一些实施方案中，将所述HC-HA/PTX3包含在组合物中，所述组合物包含：(a)包含HC-HA/PTX3的制剂；以及(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或者载剂。在一些实例中，所述组织是疤痕组织。在一些实例中，所述异常成纤维细胞是由于退化性疾病、老化、伤疤、创伤、烧灼、辐射、化疗、手术切口、撕裂、溃疡、伤害或者缺血而产生。在一些实例中，所述成纤维细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞，或者心脏成纤维细胞。在一些实例中，所述成纤维细胞不是从羊膜基质细胞分化的肌成纤维细胞。在一些实例中，所述肌成纤维细胞异常地分化。在一些实例中，所述肌成纤维细胞存在于组织的损伤或退化之后的组织中。在一些实例中，所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实例中，所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。在一些实例中，所述胎儿支持组织被冷冻或预先冷冻。在一些实例中，所述胎儿支持组织基本上没有红细胞。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含基本上没有静脉或动脉的脐带。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。在一些实例中，胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。在一些实例中，组合物是凝胶、溶液或者悬浮液。在一些实例中，所述组合物是凝胶。在一些实例中，所述组合物是干粉。在一些实例中，所述组合物是已在等渗溶液中重构的粉末。在一些实例中，所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是眼组织、心脏组织、皮肤组织、关节组织、脊椎组织、软组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、韧带组织、神经组织、椎间盘组织、脊髓组织、脑组织，或者肌肉组织。在一些实例中，所述组织是心脏组织。在一些实例中，所述组织是眼组织。在一些实例中，所述组织包括退化组织、烧灼、撕裂、缺血性组织、创伤、伤害、溃疡或手术切口。在一些实例中，所述伤害是心肌梗死。在一些实例中，所述祖细胞是神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞，或者心血管祖细胞。在一些实例中，所述方法进一步包括使所述成纤维细胞与TGFβ1接触。
在一些实施方案中，本文中公开了治疗由于心肌梗死而具有不需要的变化的心脏组织的方法，其包括：在支架置入手术操作期间使所述心脏组织内的成纤维细胞与HC-HA/PTX3接触足以使异常成纤维细胞重编程为心肌细胞或可分化为心肌细胞的心脏祖细胞的时间段。在一些实施方案中，将所述HC-HA/PTX3包含在组合物中，所述组合物包含：(a)包含HC-HA/PTX3的制剂；以及(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或者载剂。在一些实例中，所述组织不是疤痕组织。在一些实例中，所述组织是疤痕组织。在一些实例中，所述异常成纤维细胞是由于退化性疾病、老化、伤疤、创伤、烧灼、辐射、化疗、手术切口、撕裂、溃疡、伤害或者缺血而产生。在一些实例中，所述成纤维细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞，或者心脏成纤维细胞。在一些实例中，所述成纤维细胞不是从羊膜基质细胞分化的肌成纤维细胞。在一些实例中，所述肌成纤维细胞异常地分化。在一些实例中，所述肌成纤维细胞存在于组织的损伤或退化之后的组织中。在一些实例中，所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实例中，所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。在一些实例中，所述胎儿支持组织被冷冻或预先冷冻。在一些实例中，所述胎儿支持组织基本上没有红细胞。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含基本上没有静脉或动脉的脐带。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。在一些实例中，胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。在一些实例中，组合物是凝胶、溶液或者悬浮液。在一些实例中，所述组合物是凝胶。在一些实例中，所述组合物是干粉。在一些实例中，所述组合物是已在等渗溶液中重构的粉末。在一些实例中，所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实例中，所述祖细胞是心血管祖细胞。
在一些实施方案中，本文中公开了治疗有需要的受试者中以异常成纤维细胞分化为特征的病症的方法，其包括使所述受试者中感染所述病症的组织内的成纤维细胞与HC-HA/PTX3接触足以使所述成纤维细胞重编程为祖细胞或者所述组织的特征性正常间充质细胞的时间段。在一些实施方案中，将所述HC-HA/PTX3包含在组合物中，所述组合物包含：(a)包含HC-HA/PTX3的制剂；以及(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或者载剂。在一些实例中，所述组织不是疤痕组织。在一些实例中，所述组织是疤痕组织。在一些实例中，所述异常成纤维细胞是由于退化性疾病、老化、伤疤、创伤、烧灼、辐射、化疗、手术切口、撕裂、溃疡、伤害或者缺血而产生。在一些实例中，所述成纤维细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞，或者心脏成纤维细胞。在一些实例中，所述成纤维细胞不是从羊膜基质细胞分化的肌成纤维细胞。在一些实例中，所述肌成纤维细胞异常地分化。在一些实例中，所述肌成纤维细胞存在于组织的损伤或退化之后的组织中。在一些实例中，所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实例中，所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。在一些实例中，所述胎儿支持组织被冷冻或预先冷冻。在一些实例中，所述胎儿支持组织基本上没有红细胞。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含基本上没有静脉或动脉的脐带。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。在一些实例中，胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。在一些实例中，组合物是凝胶、溶液或者悬浮液。在一些实例中，所述组合物是凝胶。在一些实例中，所述组合物是干粉。在一些实例中，所述组合物是已在等渗溶液中重构的粉末。在一些实例中，所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实例中，所述祖细胞是神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞，或者心血管祖细胞。
在一些实施方案中，本文中公开了在体外产生祖细胞的方法，其包括：使成纤维细胞的培养物与HC-HA/PTX3接触足以使所述成纤维细胞重编程为祖细胞的时间。在一些实施方案中，将所述HC-HA/PTX3包含在组合物中，所述组合物包含：(a)包含HC-HA/PTX3的制剂；以及(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或者载剂。在一些实例中，所述制剂是胎儿支持组织的无细胞提取物、细胞培养基质、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实例中，所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。在一些实例中，所述胎儿支持组织被冷冻或预先冷冻。在一些实例中，所述胎儿支持组织基本上没有红细胞。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含基本上没有静脉或动脉的脐带。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。在一些实例中，所述胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。在一些实例中，所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实例中，所述成纤维细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞，或者心脏成纤维细胞。在一些实例中，所述成纤维细胞是人角膜成纤维细胞。在一些实例中，所述祖细胞是间充质祖细胞、神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞，或者心血管祖细胞。在一些实例中，所述方法进一步包括使所述成纤维细胞与TGFβ1接触。
援引并入
本说明书中提及的所有发表物、专利和专利申请通过援引并入本文中，在程度上如同每件单独的发表物、专利或者专利申请被明确且单独地指明通过援引而并入。
附图说明
本公开的新颖特征具体地阐述在随附权利要求中。通过参考陈述其中利用本公开的原理的示例说明性实施方案的以下详细描述和附图将获得对本公开的特征和优点的更好理解，在附图中：
图1A-图1C图示HC-HA/PTX3而非HA促进显著的聚集，抑制典型的TGFβ信号传导和肌成纤维细胞分化。图1A图示将P3 HCF(5,000个细胞/96-孔)在有或无固定化的HA或HC-HA/PTX3的塑料上在DMEM+10％FBS中(各自2μg的HA/96-孔)培养72h，然后在有或无TGFβ1的情况下处理24h和72h，而后被采集用于mRNA量化(图1B)或免疫染色pSMAD2/3和α-SMA(图1C)。对于TGF-β1ELISA，将细胞在有或无TGF-β1(10ng/ml)的情况下处理24h，然后在新鲜培养基中再培养另外24h。将上清液收集用于TGFβ1ELISA。对于TGFβ2和TGFβ3ELISA，将细胞在有或无TGFβ1(10ng/ml)的情况下处理48h。当与它们对应的塑料对照比较时，*或#P<0.05，**P<0.01。N＝3。条柱＝100μm
图2A-图2C图示HC-HA/PTX3在没有TGFβ1的情况下促使HCF成为角膜细胞而在TGFβ1的情况下成为神经嵴祖细胞。将P3 HCF在有或无固定化的HA、HC-HA/PTX3复合物的塑料上接种72h，然后在有或无TGFβ1的情况下处理24h，而后采集以便利用在无TGFβ1的塑料上的表达水平作为1来对角膜细胞标志例如角蛋白聚糖、NC标志例如p75NTR、HNK1、Sox9、KLF4、Snail1和MSX1进行mRNA量化(图2A)，并且以便免疫染色p75NTR(图2C)。为了测定角蛋白聚糖的蛋白和p75NTR(图2B)，将细胞在有或无TGF-β1的情况下处理48h，β-肌动蛋白用作负载对照。当与它们对应的塑料对照比较时，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。N＝3。条柱＝25μm。
图3A-图3C图示诱导的NC祖细胞分化为角膜内皮细胞。将P3HCF在有或无固定化的HA、HC-HA/PTX3复合物的塑料上接种72h，然后在有或无TGFβ1的情况下处理24h，而后采集以便对HCEC和基质标志进行mRNA量化。图3A图示在天然HCEC、HCF、神经嵴(NC)样细胞和诱导的HCEC(iHCEC)中若干内皮标志的mRNA表达。图3B图示在天然HCEC、HCF、神经嵴(NC)样细胞和诱导的HCEC(iHCEC)中HCF成纤维细胞标志、波形蛋白和CD34的mRNA表达。当与它们对应的塑料对照比较时，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。N＝3。条柱＝25μm。为了诱导HCEC，将HCF在HC-HA/PTX3复合物上在无血清的DMEM-ITS中在有或无TGFβ1激发的情况下培养3天，并且在低钙DMEM和10％FBS中进一步培养3周以诱导角膜内皮样细胞。在天然HCEC、iHCEC和HCF中，将内皮标志Na-K-ATPase、α-联蛋白、β-联蛋白、F-肌动蛋白、N-钙黏素、p120、ZO-1和成纤维细胞标志S100A4的染色图案进行比较(图3C)。
图4A-图4G图示对典型TGFβ信号传导的抑制是经由下调TGFβRII来介导，其与周期蛋白D1的上调和核易位相关。将P3 HCF在有或无固定化的HA、HC-HA/PTX3复合物的塑料上接种72h，然后在有或无TGFβ1±周期蛋白D1 siRNA的情况下处理24h，而后采集以便对TGFβRI、TGFβRII和TGFβRIII、周期蛋白D1和NC标志进行mRNA量化(图4A、4D、4E和4G)，以便对pSMAD2/3、α-SMA、周期蛋白D1和p75NTR进行免疫染色48h，以便利用β-肌动蛋白作为负载对照对TGFβRI、TGFβRII、TGFβRIII、周期蛋白D1和p75NTR进行蛋白量化(图4B和4F)。对于一些实验，添加了周期蛋白D1 siRNA(图4C、4D、4E、4F和4G)。*或#P<0.05。**P<0.01，***P<0.001。N＝3。条柱＝25μm。
图5A-图5C图示核周期蛋白D1与上游核CD44ICD、TAK1和JNK1暂时缔合。将P3 HCF在玻璃上在DMEM+10％FBS中接种24h，然后在DMEM+ITS中接种24h，在有/无PBS或HA或HC-HA/PTX3±TGFβ1(10ng/ml)±马立马司他(10μM)或±DAPT(10μM)或±二者的情况下处理0、5、15、30和45分钟，然后采集以便对CD44-ICD、TAK1、JNK1和周期蛋白D1进行免疫染色(图5A)，处理5分钟，然后采集以便在细胞组分、活性MT1-MMP和活性γ-分泌酶的分隔分离之后对细胞质和核CD44-ICD实施蛋白质印迹法(图5B)。图5C图示这些标志的mRNA表达。
图6A-图6B图示通过激活MT1-MMP和γ-分泌酶而对核CD44ICD进行调节。将P3 HCF在玻璃上在DMEM+10％FBS中接种24小时，然后在DMEM+ITS中接种24h，在有/无PBS或HA±TGFβ1或HC-HA/PTX3±TGFβ1(10ng/ml)的情况下处理5分钟，然后采集以便通过CD44抗体进行免疫沉淀(图6B)，并且通过活性MT1-MMP和活性γ-分泌酶抗体实施蛋白质印迹法(图6A)。β-肌动蛋白用作负载对照。
图7A-图7D示出人角膜肌成纤维细胞形成了聚集物并且被HC-HA/PTX3逆转为角膜细胞。将HCF以5000个细胞/96-孔的密度在DMEM+10％FBS中培养3天。使细胞饥饿1天，然后用10ng/ml TGFβ1处理3天以诱导肌成纤维细胞。诱导的肌成纤维细胞通过对α-SMA的免疫染色进行验证(图7A)。使肌成纤维细胞传代，并且在塑料或HA或HC-HA/PTX3上进一步培养多达7天。在传代之后，细胞在第1天形成聚集物并且在第4天在HC-HA/PTX3上保留一些聚集物而在塑料或HA上则没有(图7D)，然后使所有细胞在第7天扩展成单层基质细胞(图7B)。在第1天，角蛋白聚糖的mRNA和蛋白表达显著地升高(B和C,*p<0.05,***p<0.001,n＝3)，而α-SMA的表达在HC-HA/PTX3上的细胞中显著地降低，而在塑料或HA上的那些细胞并非如此(图7D)。在第4天和第7天，在塑料或HA上的肌成纤维细胞保留它们的肌成纤维细胞特征性染色α-SMA，而在HC-HA/PTX3上则没有(图7D)。令人关注地，HC-HA/PTX3，而非塑料或HA，促进角膜细胞的mRNA和蛋白表达(图7B和图7C)。条柱＝100μm。
图8A-图8F图示在HC-HA/PTX3上HCF也可以形成聚集物，逆转为角膜细胞，并且对抗TGFβ1。将HCF以5000个细胞/96-孔的密度在DMEM+10％FBS中在塑料或HA或HC-HA/PTX3上培养多达7天。在传代之后，在第1天，在HC-HA/PTX3上所有的细胞形成聚集物，而在塑料或HA上仅有少量。直到第7天，HC-HA/PTX3上的细胞，而非塑料或HA上的细胞，保留聚集物(图8A)。在第1天，角蛋白聚糖的mRNA和蛋白表达显著地升高(图8B和8C,*p<0.05,***p<0.001,n＝3)。HC-HA/PTX3，没有促进TGFβ和TGFβR的表达，除了TGFβ3(一种抗-TGFβ形式)(图8D)。在HC-HA/PTX3上的HCF中pSMAD2/3保留在细胞质中(图8E)。在TGFβ1的激发下，塑料或HA上的细胞，而非HC-HA/PTX3上的细胞，表达α-SMA(图8F)。条柱＝100μm。
图9A-图9D图示逆转为角膜细胞是由典型的BMP信号传导来介导。将成纤维细胞以5000个细胞/96-孔的密度在塑料或HA或HC-HA/PTX3上在DMEM+10％FBS中培养24h以进行实时PCR和免疫染色48h以实施蛋白质印迹法。将mRNA提取，并且BMP、BMPR和角蛋白聚糖的水平通过实时PCR进行测定(图9A和图9C,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,n＝3)。进行免疫染色以便对pSMAD1/5进行细胞定位(图9B)。针对角蛋白聚糖蛋白的表达执行蛋白质印迹法(图9D)。条柱＝100μm。
图10A-图10F图示由SDF1-CXCR4信号传导介导的聚集调节BMP信号传导并且逆转到角膜细胞。将成纤维细胞以5000个细胞/96-孔的密度在塑料或HA或HC-HA/PTX3上在有或无CXCR4抑制剂AMD3100的情况下在DMEM+10％FBS中培养24h以进行实时PCR和免疫染色48h以实施蛋白质印迹法。在第1天、第4天和第7天使成纤维细胞可视化(图10A)。将mRNA提取，并且SDF1、CXCR4、BMP和BMPR的水平通过实时PCR进行测定(图10B和图10D,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,n＝3)。进行免疫染色以便对CXCR4和pSMAD1/5进行细胞定位(图10C和图10E)。执行蛋白质印迹法以进行对CXCR4和角蛋白聚糖的蛋白量化(图10F)。条柱＝100μm。
图11A-图11B图示SDF1/CXCR4和BMP信号传导的依次激活。将P3 HCF在塑料上在DMEM+10％FBS中接种并且用PBS或HA或HC-HA/PTX3处理0、5、15、30、45、60分钟、24和48小时，然后采集以便对SDF1、CXCR4、BMP4和BMP6进行实时PCR(图11A)，以便对CXCR4和pSMAD1/5免疫染色(图11B)。N＝3,条柱＝100μm。
图12A-图12B图示对SDF1/CXCR4信号传导的抑制中止了聚集和BMP信号传导。将P3HCF在塑料上在DMEM+10％FBS中接种并且用PBS或HA或HC-HA/PTX3在有或无CXCR4抑制剂AMD3100的情况下处理0、5、15、30、45、60分钟、24和48小时，然后采集以便对SDF1、CXCR4、BMP4和BMP6进行实时PCR(图12A)，以便对CXCR4和pSMAD1/5免疫染色(图12B)。N＝3。条柱＝100μm。
图13A-图13B图示对BMP信号传导的抑制没有影响SDF1-CXCR4信号传导和聚集。将P3 HCF在塑料上在DMEM+10％FBS中接种并且用PBS或HA或HC-HA/PTX3在有或无BMP抑制剂SB431542的情况下处理0、5、15、30、45、60分钟、24和48小时，然后采集以便对SDF1、CXCR4、BMP4和BMP6进行实时PCR(图13A)，以便对CXCR4和pSMAD1/5免疫染色(图13B)。N＝3。条柱＝100μm。
图14A-图14B图示在系列传代之后在LNC中核Pax6神经嵴祖细胞状态的进行性丧失。将P10 LNC以1x105/ml/96孔(涂有5％MG)接种在改良的胚胎干细胞培养基(MESCM)中。因系列传代所致细胞表型的变化通过以下来确定：将第2代(P2)的表达水平设置为1，对在P10 LNC中神经嵴标志例如Pax6、Sox2、p75NTR、Musashi-1和Nestin的mRNA水平进行定量RT-PCR(图14A,##p<0.01,n＝3；条柱从左至右表示在P2、P4、P6、P8和P10在细胞中每个基因代表的mRNA水平)，并且对在P4和P10 LNC之间Pax6、Sox2、p75NTR、Musashi-1和Nestin进行免疫荧光染色(图14B,条柱＝100μm)。
图15A-图15D图示固定化的HC-HA/PTX3，而非3D MatrigelTM，将P10 LNC逆转到核Pax6+神经嵴祖细胞。将P10 LNC以1x105/mL/96孔(涂有5％MG、3D MG或固定化的HC-HA/PTX3)接种在改良的胚胎干细胞培养基(MESCM)中。相差显微镜用于在24h和48h监测球形成。(图15A,条柱＝50μm)。表型的表征通过定量RT-PCR进行以相对于设为1的涂布的MG来比较在HC-HA/PTX3中Pax6、p75NTR、Musashi-1、Nestin、Msx-1和FoxD3的mRNA水平(图15B,**p<0.01,n＝3)，或者相对于3D MG中的表达水平进行比较(图15B,##p<0.01,n＝3)。对Pax6、Sox2、p75NTR和Musashi-1进行免疫荧光染色(图15C,核由Hoechst 33342进行对比染色，条柱＝25μm)。使源于涂布的MG、3D MG和HC-HA/PTX3的细胞聚集物成为单个细胞，并且经受不同的分化诱导培养基，然后通过神经丝M(NFM)、O4和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫荧光进行评估(图15D,核由Hoechst 33342对比染色，条柱＝50μm)。
图16A-图16C图示在P10 LNC中可溶性HC-HA/PTX3还促进早期细胞聚集和核Pax6+神经嵴祖细胞。将P10 LNC以1x105/mL/96孔(涂有3D MG或固定化的HC-HA/PTX3或涂有MG)接种在MESCM中，其中以25μg/mL添加有可溶性HC-HA/PTX3。细胞形态学和聚集(以白色箭头标志)通过相差显微镜进行评估(图16A,条柱＝100μm)。在不同时间点进行定量RT-PCR来比较可溶性HC-HA/PTX3中p75NTR、NGF和Musashi-1的mRNA水平，时间0时的表达水平设定为1(图16C,##p<0.01,n＝3)。所得的细胞表型通过在48h时对Pax6、Sox2和p75NTR的免疫荧光染色来表征。(图16B,核由Hoechst 33342对比染色,条柱＝50μm)
图17A-图17D图示由可溶性HC-HA/PTX3促进的细胞聚集和核Pax6表达受到CXCR4/SDF-1信号传导的介导。将P10 LNC以1x105/mL/96孔接种在3D MG或涂布的MG(添加有25μg/mL可溶性HC-HA/PTX3)上，其中后者添加有0.1％DMSO(有或无20μg/mL AMD3100/MESCM)。细胞聚集通过相差显微镜进行评估(图17A,条柱＝100μm)。CXCR4/SDF-1信号传导的确定是通过定量RT-PCR，相对于在3D Matrigel上的表达水平，分别比较在HC-HA/PTX3或HC-HA/PTX3+AMD3100中SDF-1和CXCR4的mRNA转录水平，在时间0时设置为1。(图17B,**p<0.01或##p<0.01,n＝3)所得细胞的表型表征通过以下进行：对Pax6、p75NTR、NGF、Musashi-1、Msx-1和FoxD3的mRNA转录水平进行定量RT-PCR，在HC-HA/PTX3或HC-HA/PTX3+AMD3100之间进行比较，将涂布的MG的表达水平设置为1(图17C,**p<0.01)，并且对CXCR4、SDF-1和Pax6的免疫荧光染色(图17D,核由Hoechst 33342对比染色，条柱＝50μm)。
图18A-图18D图示在P10 LNC中CXCR4/SDF-1是由可溶性HC-HA/PTX3激活BMP信号传导所需的。将P10 LNC单个细胞以1x105/mL/96孔接种在3D MG或涂有25μg/mL可溶性HC-HA/PTX3的MG中，其中后者在有或无AMD3100的情况下添加在MESCM中。对BMP配体和BMP受体的定量RT-PCR进行比较，在可溶性HC-HA/PTX3中P4和P10 LNC中的转录水平，P4 LNC的表达水平设置为1(图18A,**P<0.01,n＝3)免疫荧光染色证实在涂布的MG上早期P4和晚期P10LNC的核染色pSmad1/5/8(红色)。(图18B,核由Hoechst 33342对比染色,条柱＝25μm)在不同时间点定量RT-PCR用来相对于HC-HA/PTX3+AMD3100(图18C,##P<0.01,n＝3)比较在可溶性HC-HA/PTX3中BMP配体的mRNA表达水平(图18C,**p<0.01,n＝3)，在时间0时3D MG的表达水平设置为1。还比较了pSmad1/5/8的免疫荧光染色(阳性核染色以白色箭头标记)(图18D,核由Hoechst 33342对比染色,条柱＝25μm)。
图19A-图19E图示由HC-HA/PTX3促进的细胞聚集和CSCR4/SDF-1信号传导不受BMP信号传导影响。对于BMPR1A、BMPR1B、BMPR2和ACVR1，将P10 LNC在涂布的MG上在MESCM中用或不用LDN-193189预处理，或者转染siRNA，然后在涂布的MG上在有或无可溶性HC-HA/PTX3的情况下接种在MESCM中。当与杂乱的RNA(scRNA)作为对照时，转染效率通过qRT-PCR来验证(图19A,**p<0.01,n＝3)。BMP信号传导通过对pSmad1/5/8免疫荧光染色来测量(图19B)，并且细胞聚集通过相差显微镜来检测(图19C,条柱＝100μm)。通过CXCR4和SDF-1的转录表达的qRT-PCR来评估CXCR4/SDF-1信号传导，在时间0时在HC-HA/PTX3+scRNA的情况下细胞的表达水平设置为1。(图19D,*p>0.05,n＝3)通过到CXCR4和Pax6的免疫荧光染色进行(图19E,核由Hoechst 33342对比染色，条柱＝25μm)。
图20图示示例性细胞分化途径，细胞类型呈现在方框中并且细胞类型的标志实例标示在每种细胞类型的上方或下方。
具体实施方式
在某些实施方案中，本文中提供了HC-HA/PTX3(包括包含HC-HA/PTX3的制剂或组合物)将细胞的细胞表型重编程为不同细胞表型的用途。这种重编程用于本文提供的方法中，例如，使组织(例如受损组织或疤痕组织，或者感染疾病例如退化性疾病的组织)的患病或受损状态逆转的方法；将组织中的分化细胞重编程为祖细胞的方法，由此使所述组织恢复活力；将组织中的细胞的第一表型重编程为祖细胞并且使所述祖细胞分化为第二表型的方法，由此使所述组织再生。本文中还提供了HC-HA/PTX3(包括包含HC-HA/PTX3的制剂或组合物)在具有治疗性细胞的组合物中的用途。
在某些实施方案中，本文中提供了将细胞的第一表型重编程为第二表型的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与HC-HA/PTX3接触足以使所述细胞的第一表型重编程为第二表型的时间。在一些实施方案中，第一细胞表型是分化细胞的表型。在一些实施方案中，第二细胞表型是祖细胞的表型。在一些实施方案中，重编程的细胞在组织内。在一些实施方案中，重编程为第二表型的细胞被分化为与包含其的组织对应的分化细胞类型。这种方法可以在体内用于使受损组织、退化组织、疤痕组织、感染疾病的组织或衰老组织恢复活力或再生。
在某些实施方案中，本文中进一步提供了治疗有需要的受试者中以不需要的成纤维细胞分化为特征的病症的方法。所述方法可以包括使所述受试者中感染所述病症的组织内的成纤维细胞与HC-HA/PTX3接触足以使所述成纤维细胞的表型重编程为不同表型的时间段，由此治疗所述病症。
在某些实施方案中，本文中进一步提供了在体外产生祖细胞的方法，其包括：使成纤维细胞或其他分化细胞的培养物与HC-HA/PTX3接触足以使所述成纤维细胞重编程为祖细胞的时间。这种祖细胞可以分化为关注的分化细胞类型。这种方法可以用于组织工程化以产生用于移植手术的组织或器官。
在一些实施方案中，所述方法为由于退化(起因于疾病、衰老或伤疤)或者在损害例如烧灼、创伤、伤害、溃疡、辐射、化疗或手术之后而具有不需要的变化的组织提供改善的治疗，这是通过使所述组织与包含HC-HA/PTX3的制剂在允许细胞重编程发生的时间窗内接触来进行。在一些实施方案中，所述方法为由于退化(起因于疾病、衰老或伤疤)或者在损害例如烧灼、创伤、伤害、溃疡、辐射、化疗或手术之后而被预期承受不需要的变化的组织提供预防性治疗，这是通过使所述组织与包含HC-HA/PTX3的制剂接触来进行。在一些实施方案中，所述不需要的变化是所述组织的细胞从第一细胞分化为第二细胞。在一些实施方案中，所述第二细胞是有害细胞或者潜在地有害细胞。不需要的变化的一个实例是在心肌梗死之后心脏组织中的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞。在一些实施方案中，肌成纤维细胞参与创伤愈合过程中。但是，在一些情况中，肌成纤维细胞长期存在于受损组织中导致不需要的变化，例如心脏组织中的心脏纤维化。
当用于提及细胞时本文中使用的“表型”或“细胞表型”表示所述细胞的分子或细胞特征、性质和/或功能。在一些实施方案中，细胞表型由细胞聚集特征、细胞形状或至少一种细胞特异性标志的表达中的一种或更多种来定义。在一些实施方案中，细胞表型对应于祖细胞的表型。在一些实施方案中，祖细胞表型是指能够分化为一种或更多种不同类型分化细胞的细胞。在一些实施方案中，祖细胞表型对应于神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞或者心血管祖细胞的细胞表型。在一些实施方案中，细胞表型对应于分化细胞的表型。在一些实施方案中，分化细胞表型对应于神经细胞、骨细胞、上皮细胞、肝细胞、肾细胞、胰细胞、肺细胞、肌肉细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、角膜细胞、上皮细胞、皮肤细胞、角膜缘龛细胞、成纤维细胞、角膜细胞、内皮细胞或者肌成纤维细胞的表型。在一些实施方案中，分化细胞表型与组织例如眼组织、心脏组织、皮肤组织、关节组织、脊椎组织、软组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、韧带组织、神经组织、椎间盘组织、脊髓组织、脑组织或者肌肉组织内的细胞的表型对应。
在一些实施方案中，细胞具有第一表型。在一些实施方案中，本文中所述的方法可以包括使具有第一表型的细胞与HC-HA/PTX3或包含HC-HA/PTX3的制剂或组合物接触足以使所述细胞的第一表型重编程为第二表型的时间。在一些实施方案中，第一表型或第二表型被表征为细胞聚集特征、细胞形状或者至少一种细胞特异性标志的表达。在一些实施方案中，细胞聚集特征选自细胞的聚集和未聚集。在一些实施方案中，细胞形状选自纺锤形和圆形。
在一些实施方案中，表型被表征为细胞特异性标志的表达(或缺少表达)。在一些实施方案中，细胞特异性标志是神经嵴细胞标志。在一些实施方案中，神经嵴细胞标志是Pax6、p75NTR、Musashi-1、Sox2、Nestin、Sox9、FOXD3、MSX1、HNK1、Snail1/2、Twist1/2、AP2α、AP2β或其组合。在一些实施方案中，细胞特异性标志是内皮细胞标志。在一些实施方案中，内皮细胞特异性标志是Na-K ATPase、ZO1、N-cad、或其组合。在一些实施方案中，细胞特异性标志是角膜细胞细胞标志。在一些实施方案中，角膜细胞细胞标志是角蛋白聚糖、CD34、ALDH3A1、PTDGS或其组合。在一些实施方案中，细胞特异性标志是成纤维细胞细胞标志。在一些实施方案中，成纤维细胞细胞标志是整合素α5β1、纤连蛋白、EDA或其组合。在一些实施方案中，细胞特异性标志是肌成纤维细胞细胞标志。在一些实施方案中，肌成纤维细胞细胞标志是α-SMA、S100A4或其组合。在一些实施方案中，足以使细胞的第一表型重编程为第二表型的时间是至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周或4周。在一些实施方案中，足以使细胞的第一表型重编程为第二表型的时间小于1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周或4周。在一些实施方案中，第一表型是分化细胞表型。在一些实施方案中，第二表型是祖细胞表型。
在一些实施方案中，第一表型包括第一细胞的表型。在一些实施方案中，第一细胞是分化细胞。在一些实施方案中，第一细胞选自角膜缘龛细胞、成纤维细胞、角膜细胞、内皮细胞或者肌成纤维细胞。在一些实施方案中，第一表型包括无细胞聚集。在一些实施方案中，第一表型包括纺锤形细胞形状。在一些实施方案中，第一表型包括至少一种细胞特异性标志的表达。在一些实施方案中，表征第一表型的细胞特异性标志是角膜缘龛细胞标志、成纤维细胞细胞标志、角膜细胞细胞标志、内皮细胞标志，或者肌成纤维细胞细胞标志。
在一些实施方案中，第二表型包括第二细胞的表型。在一些实施方案中，第二细胞是祖细胞。在一些实施方案中，第二细胞选自神经嵴祖细胞、角膜缘龛细胞、成纤维细胞、角膜细胞，或者内皮细胞。在一些实施方案中，第二表型包括细胞聚集。在一些实施方案中，第二表型包括圆形细胞形状。在一些实施方案中，第一表型包括至少一种特异性标志的表达。在一些实施方案中，表征第二表型的细胞特异性标志是神经嵴细胞标志、角膜缘龛细胞标志、成纤维细胞细胞标志、角膜细胞细胞标志，或者内皮细胞标志。
在一些实施方案中，本文中所述的方法进一步包括检测第一表型、第二表型，或其组合。在一些实施方案中，本文中所述的方法进一步包括检测表征第一表型的细胞特异性标志、表征第二表型的细胞特异性标志，或其组合。
在一些实施方案中，所述接触防止第一细胞分化为第二细胞(例如实施例1，描述防止成纤维细胞分化为肌成纤维细胞)。在一些实施方案中，第二细胞是由于损害例如例如烧灼、创伤、伤害、溃疡、辐射、化疗、手术或者由于缺血而产生。在一些实施方案中，所述接触使细胞重编程为来自同一细胞分化谱系的早期细胞(例如实施例2，描述了成纤维细胞重编程为角膜细胞样祖细胞)。在一些实施方案中，细胞分化谱系包括祖细胞，以及从(a)祖细胞分化的任何细胞，或者(b)从祖细胞分化的细胞分化的细胞，及诸如此类。在一些实施方案中，细胞分化谱系的实例图示于图20中。
在一些实施方案中，细胞是肌成纤维细胞并且早期细胞是成纤维细胞、角膜细胞、内皮细胞，或者神经嵴祖细胞。在一些实施方案中，细胞是成纤维细胞并且早期细胞是角膜细胞、内皮细胞，或者神经嵴祖细胞。在一些实施方案中，细胞是角膜细胞并且早期细胞是神经嵴祖细胞。在一些实施方案中，细胞是内皮细胞并且早期细胞是神经嵴祖细胞。在一些实施方案中，细胞是角膜缘龛细胞并且早期细胞是神经嵴祖细胞。
某些定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与要求保护的主题所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。
本文中使用的范围和量可以表述为“约”特定的值或范围。约还包括确切的量。因此，“约5μg”意指“约5μg”和“5μg”。一般而言，术语“约”包括可能被预期在实验误差内的量。在一些实施方案中，“约”表示列举的数或值、“+”或“-“该数或值的20％、10％或5％。
本文中使用的“胎儿支持组织产品”意指从用于支持胎儿发育的组织获得的任何分离的产品。胎儿支持组织的实例包括但不限于：(i)胎盘羊膜(PAM)或者基本上分离的PAM、(ii)脐带羊膜(UCAM)或基本上分离的UCAM、(iii)绒毛膜或基本上分离的绒毛膜、(iv)羊膜-绒毛膜或基本上分离的羊膜-绒毛膜、(v)胎盘或基本上分离的胎盘、(vi)脐带或基本上分离的脐带，或者(vii)它们的任何组合。在一些实施方案中，胎儿支持组织选自由胎盘羊膜(PAM)、脐带羊膜(UCAM)、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、胎盘、脐带及其任何组合组成的组。在一些实施方案中，胎儿支持组织包含脐带。在一些实施方案中，胎儿支持组织包含胎盘羊膜和脐带。胎儿支持组织产品包括胎儿支持组织的任何形式，包括低温保存的、终端-灭菌的、冻干的胎儿支持组织，或者由研磨胎儿支持组织而得的粉末。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是磨碎的、粉碎的、分碎的、移植物、片状、粉末、凝胶、匀浆、提取物，或者终端-灭菌的产品。
本文中使用的“胎盘”是指器官，其将发育中的胎儿与母体子宫壁连接以允许经由母体血液供给来进行营养物摄取、废物清除和气体交换。胎盘由三层构成。包围胎儿的最内胎盘层称为羊膜。尿囊是胎盘的中间层(源于胚胎后肠)；起源于脐的血管穿过此膜。胎盘的最外层绒毛膜与子宫内膜接触。绒毛膜和尿囊融合而形成绒毛膜尿囊膜。
本文中使用的“绒毛膜”是指由胚外中胚层和两层滋养层形成的膜。绒毛膜由两层构成：由滋养层形成的外层，以及由体壁中胚层形成的内层；羊膜与后者接触。滋养层由立方形或棱形细胞的内层、细胞滋养层或郎罕氏层，以及无细胞界限的富有成核的原生质的外层合体滋养层构成。无血管的羊膜粘附于绒毛膜的内层。
本文中使用的“羊膜-绒毛膜”是指包含羊膜和绒毛膜的产品。在一些实施方案中，羊膜和绒毛膜未被分离(即，羊膜天然地粘附于绒毛膜的内层)。在一些实施方案中，羊膜被初始地从绒毛膜分离，而后在处理期间与绒毛膜合并。
本文中使用的“脐带”是指将发育中的胎儿与胎盘连接的器官。脐带由脐带胶质(主要由粘多糖制得的胶状物质)构成。它包含一个静脉和两个动脉，该静脉将充氧的富有营养物的血液运载到胎儿，所述动脉将缺氧的营养物耗尽的血液运离。在一些实施方案中，脐带基本上缺少静脉和动脉。在一些实施方案中，脐带包括脐带胶质的全部或部分。
本文中使用的“胎盘羊膜”(PAM)是指源于胎盘的羊膜。在一些实施方案中，PAM被基本上分离。
本文中使用的“脐带羊膜”(UCAM)意指源于脐带的羊膜。UCAM是半透明膜。UCAM具有多层：上皮层；基膜；致密层；成纤维细胞层；以及海绵层。UCAM缺少血管或直接血液供给。在一些实施方案中，UCAM包含脐带胶质。在一些实施方案中，UCAM包含血管和/或动脉。在一些实施方案中，UCAM包含脐带胶质和血管和/或动脉。
本文中使用的“人组织”意指源于人体的任何组织。在一些实施方案中，人组织是胎儿支持组织，其选自由胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、胎盘或它们的任何组合组成的组。
本文中使用的“最小操作”意指：(1)对于结构组织而言，不改变组织的与组织的重建、修复或置换用途相关的原始相关特征的处理；以及(2)对于细胞或非结构组织而言，不改变所述细胞或组织的相关生物特征的处理。
本文中使用的“移植物”意指用于置换损伤的、受损的或缺失的组织的蛋白(例如胶原蛋白和弹性蛋白)和聚糖(例如皮肤素、透明质酸和软骨素)的基质。在某些实例中，该基质被铺设并且宿主细胞逐渐地整合到该基质中。
本文中使用的“片材”意指任何连续的扩展或表面。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的片材基本上变平。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的片材是扁平的。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的片材是管状的。在一些实施方案中，该片材是适合于待治疗的创伤的任何形状或尺寸。在一些实施方案中，该片材是方形、圆形、三角形或矩形。
术语"新生胎儿支持组织"是指在出生之后少于10天的胎儿支持组织，并且其是与出生后基本上相同的形式。
"基本上分离的"或"分离的"，在用于胎儿支持组织的上下文中时，意指该胎儿支持组织从源于原始源生物的大多数其他非胎儿支持组织材料(例如其他组织、红细胞、静脉、动脉)分离。
本文中使用的短语“其中分离的胎儿支持组织产品的生物和结构完整性基本上被保存”意指当与新生胎儿支持组织的生物活性和结构完整性比较时，分离的胎儿支持组织的生物活性和结构完整性仅降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％或者约60％。
本文中使用的“处理”意指对胎儿支持组织或包含HC-HA/PTX3的制剂执行的除了恢复、供体筛查、供体测试、贮藏、标记、包装或分配之外的任何活动，例如测试微生物、配制、灭菌、灭活或除去外来剂(adventitious agent)的步骤、防腐以便贮藏、以及从贮藏取出。
本文中使用的术语“纯化的”和“分离的”意指材料(例如HC-HA/PTX3复合物)基本上或大体上没有通常在其天然状态时伴随其的组分。在一些实施方案中，“纯化的”或“分离的”意指约50％或更多的材料(例如HC-HA/PTX3复合物)没有通常在其天然状态时伴随其的组分，例如约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或者约99％没有通常在其天然状态时伴随其的组分。
本文中使用的“生物活性”意指在包含HC-HA/PTX3的制剂中多肽和多糖的活性。在一些实施方案中，存在于所述制剂中的多肽和多糖的生物活性是抗炎、抗疤痕、抗血管生成，或者抗粘附。在一些实施方案中，生物活性是指所述制剂中的HC-HA/PTX3复合物的体内活性，或者在体内给药所述制剂时产生的生理反应。在一些实施方案中，在胎儿支持组织中HC-HA/PTX3复合物的生物活性基本上被保存。在一些实施方案中，存在于所述制剂中的多肽和多糖的活性是促进创伤愈合。在一些实施方案中，存在于所述制剂中的多肽和多糖的活性是防止疤痕。在一些实施方案中，存在于所述制剂中的多肽和多糖的活性是减轻炎症。因此，生物活性涵盖所述制剂中的HC-HA/PTX3复合物的治疗效果和药学活性。
本文中使用的“结构完整性”意指构成胎儿支持组织产品的基质和基膜的完整性。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的结构完整性导致缝合拉出强度。
本文中使用的重构的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物是通过在体外该复合物的组分分子组装而形成的HC-HA/PTX3复合物。组装rcHC-HA/PTX3的方法包括用从生物来源纯化的天然蛋白或分子、通过重组方法产生的重组蛋白或者体外合成的合成分子进行重建。在一些实例中，用于组装rcHC-HA/PTX3的纯化的天然蛋白是含有其他蛋白的复合物(即多聚体、多链蛋白或其他复合物)中的蛋白。在一些实例中，PTX3被纯化为来自细胞的多聚体(例如均多聚体)并且用于组装rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，rcHC-HA/PTX3复合物包含HC1、HC2、HA和PTX3。在一些实施方案中，rcHC-HA/PTX3复合物包含HC1、HC2、HA、PTX3和TSG-6。
本文中使用的纯化的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物是指从生物来源例如细胞、组织或生物流体纯化的HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3是从胎儿支持组织纯化的。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3是从羊膜纯化的。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3是从脐带纯化的。这种复合物一般在体内在受试者中或者在活体外在来自受试者(包括人或其他动物)的细胞、组织或者生物流体中进行组装。
本文中使用的PTX3/HA复合物是指通过使PTX3与固定化的HA接触而形成的中间复合物。在本文提供的方法中，PTX3/HA复合物是在HC1添加到HA之前产生。
本文中使用的“透明质酸”、“玻尿酸”或“透明质酸盐”(HA)可互换地用于表示含有D-葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺(D-葡糖醛酰基-N-乙酰基葡糖胺)的重复二糖单元的基本上无硫酸的直链糖胺聚糖(GAG)。
本文中使用的术语“具有不需要的变化的组织”是指由于例如退化性疾病(例如关节炎、多发性硬化、帕金森氏病、肌肉萎缩症和亨廷顿氏病)或老化而退化的组织；疤痕组织；由于损害例如烧灼、创伤、撕裂、伤害、溃疡、辐射、化疗、手术或由于缺血而受损的组织；或者患病组织(例如由于疾病状态例如癌症而具有减弱的、削弱的或消除的功能的组织)。在一些实施方案中，退化组织具有相对于非退化组织减弱的、削弱的或消除的功能能力。在一些实施方案中，退化组织表现出组织的部分细胞从第一细胞类型分化为第二细胞类型。退化组织的实例是心肌梗死之后的心脏组织，其中心脏组织的部分成纤维细胞已分化为肌成纤维细胞。
本文中使用的术语“组织特征性间充质细胞”是指组织特征性的并且从间充质干细胞分化的特化细胞，例如，心肌细胞、成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞(软骨细胞)、肌细胞(肌肉细胞)和脂肪细胞(肥胖细胞)。
本文中使用的术语"高分子量"或"HMW"，如在高分子量透明质酸(HMW HA)中，意指重均分子量大于约100千道尔顿(kDa)的HA，例如，约100kDa至约10,000kDa、约500kDa至约10,000kDa、约800kDa至约8,500kDa、约1100kDa至约5,000kDa，或者约1400kDa至约3,500kDa。在一些实施方案中，HMW HA具有3000kDa或更高的重均分子量。在一些实施方案中，HMW HA具有3000kDa重均分子量。在一些实施方案中，HMW HA是重均分子量约3000kDa的
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在一些实施方案中，HMW HA具有约100kDa至约10,000kDa的分子量。在一些实施方案中，HMW HA具有约500kDa至约10,000kDa的分子量。在一些实施方案中，HMW HA具有约800kDa至约8,500kDa的分子量。在一些实施方案中，HMW HA具有约3,000kDa的分子量。
本文中使用的术语"低分子量"或"LMW"，如在低分子量透明质酸(LMW HA)中，意指重均分子量小于500kDa的HA，例如，小于约400kDa、小于约300kDa、小于约200kDa、小于约100kDa、约100-300kDa、约200-300kDa，或者约1-300kDa。
本文中使用的正五聚蛋白3或者PTX3蛋白或多肽是指任何PTX3蛋白，包括但不限于重组产生的蛋白、合成产生的蛋白、天然PTX3蛋白，以及从细胞或组织提取的PTX3蛋白。PTX3包括PTX3的多聚体形式(例如均多聚体)，包括但不限于天然或人工产生的二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、四聚体、八聚体及其他多聚体形式。
本文中使用的肿瘤坏死因子刺激的基因-6(TSG-6)是指任何TSG-6蛋白或多肽，包括但不限于重组产生的蛋白、合成产生的蛋白、天然TSG-6蛋白，以及从细胞或组织提取的TSG-6蛋白。
本文中使用的间-α-抑制剂(IαI)是指IαI蛋白，其由类型HC1或HC2的以硫酸软骨素链共价连接的轻链(即双库尼茨抑制剂(bikunin))和一条或两条重链构成。在一些实施方案中，IαI来源于血清，或者来源于在促炎性细胞因子例如IL-1或TNF-α的构成模式刺激下产生IαI的细胞例如肝细胞或羊膜上皮或基质细胞或脐带上皮或基质细胞。
本文中使用的“透明质酸结合蛋白”、“HA结合蛋白”或“HABP”是指与HA特异性结合的任何蛋白。
本文中使用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指给药足量的药剂或化合物，其将在某种程度上缓解正被治疗的疾病或病症的一种或更多种症状。在一些实施方案中，结果是减弱和/或减轻疾病的征兆、症状或病因，或者生物系统的任何其他期望的改变。例如，治疗性用途的“有效量”是提供疾病症状的临床上显著减轻而无过度的不良副作用所需的包含本文公开的化合物的组合物的量。在任何个别情况中适当的“有效量”可以利用技术例如剂量递增研究来确定。术语“治疗有效量”包括例如预防性有效量。本文公开的化合物的“有效量”是有效达到期望效果或治疗性改善而无过度的不良副作用的量。应理解，“有效量”或“治疗有效量”可以由于在组合物的代谢、受试者的年龄、重量、总体状况、正被治疗的病症、正被治疗的病症的严重性以及处方医师的判断方面的差异而因受试者而异。
本文中使用的术语"受试者"、"个体"和"患者"可互换地使用。所述术语都不应被解释为需要医学专业人员(例如医生、护士、医师助理、值班人员、临终关怀医院工作者)的监督。本文中使用的受试者是任何动物，包括哺乳动物(例如人类或非人类的动物)和非哺乳动物。在本文提供的方法和组合物的一个实施方案中，哺乳动物是人类。
本文中使用的术语"治疗"及其他语法等同形式，包括但不限于：减轻、削弱或者改善疾病或病症的一种或更多种症状，缓解、防止或降低疾病或病症的一种或更多种额外症状的出现、严重性或频率，缓解或防止疾病或病症的一种或更多种症状的潜在代谢原因，抑制疾病或病症例如阻止疾病或病症的发展，减轻疾病或病症，使疾病或病症消退，减轻由疾病或病症所致的状况，或者预防性和/或治疗性地抑制疾病或病症的症状。在非限制性实例中，为了预防性益处，将本文公开的rcHC-HA/PTX3复合物或组合物向有风险患有特定疾病的个体、倾向于患有特定疾病个体、或者报告疾病的一种或更多种生理症状的个体给药。
胎儿支持组织产品
本文中使用的术语“制剂”或“产品”是指从胎儿支持组织获得的磨碎的、粉碎的、分碎的、移植物、片状、粉末、凝胶、匀浆、提取物，终端-灭菌的产品、纯化的天然HC-HA/PTX3复合物、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实施方案中，制剂是胎儿支持组织产品或胎儿支持组织的提取物。在一些实施方案中，胎儿支持组织是胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、胎盘、羊膜基质、羊膜胶质或其任何组合。
在一些实施方案中，制剂是脐带产品、羊膜产品，或者脐带羊膜产品。在一些实施方案中，脐带产品包含脐带羊膜和至少一些脐带胶质。在一些实施方案中，脐带产品缺少脐带静脉和动脉。
在一些实施方案中，制剂是胎儿支持组织的提取物。在一些实施方案中，制剂是从胎儿支持组织纯化的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)。在一些实施方案中，制剂是重构的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)。在一些实施方案中，制剂主要由nHC-HA/PTX3组成。在一些实施方案中，制剂主要由rcHC-HA/PTX3组成。在一些实施方案中，制剂包含nHC-HA/PTX3和rcHC-HA/PTX3的组合。
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是UC产品。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是AM产品。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是UCAM产品。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品包含：不包含静脉或动脉的分离的胎儿支持组织。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品包含：分离的胎儿支持组织，其不包含静脉或动脉、具有代谢活性的细胞、活动性HIV-1、活动性HIV-2、活动性HTLV-1、活动性乙型肝炎、活动性丙型肝炎、活动性西尼罗病毒、活动性巨细胞病毒、活动性人传染性海绵状脑病，或者活动性梅毒螺旋体(Treponema pallidum)，其中胎儿支持组织产品的天然结构完整性在初始切取之后至少15天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品包含脐带羊膜和脐带胶质。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品中HC-HA/PTX3复合物的生物活性基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品中HC-HA/PTX3复合物的生物活性在至少15天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少20天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少25天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少30天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少35天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少40天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少45天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少50天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少55天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少60天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少90天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少180天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少1年期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少2年期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少3年期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少4年期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少5年期间基本上得以保存。
在某些实施方案中，本文中进一步公开了生产胎儿支持组织产品的方法，包括：获得预冷冻的胎儿支持组织，其中胎儿支持组织产品的结构完整性在处理之后至少15天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，将基本上全部血液从胎儿支持组织产品除去。在一些实施方案中，通过将预冷冻的胎儿支持组织解冻并且将基本上全部血液从脐带除去而对胎儿支持组织进行处理。在一些实施方案中，将脐带静脉和脐带动脉从胎儿支持组织除去。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少20天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少25天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少30天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少35天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少40天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少45天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少50天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少55天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少60天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少90天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少180天期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少1年期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少2年期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少3年期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少4年期间基本上得以保存。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在处理之后至少5年期间基本上得以保存。在一些实施方案中，将至少一部分脐带胶质除去。在一些实施方案中，将胎儿支持组织从任何适合的来源(例如医院或组织库)回收。在一些实施方案中，胎儿支持组织是从哺乳动物获得。在一些实施方案中，胎儿支持组织是从人类、非人类灵长类动物、牛或猪获得。
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品被冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在或低于0℃直至已确定供体和样本合格性。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在或低于0℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或者-80℃。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在或低于0℃杀死存在于胎儿支持组织中的基本上所有细胞。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在或低于0℃杀死存在于胎儿支持组织产品中的基本上所有细胞，同时相对于新鲜(即未冷冻的)胎儿支持组织维持或增高胎儿支持组织产品的生物活性(例如其抗炎、抗疤痕、抗-抗原和抗粘附性质)。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在或低于0℃导致存在于胎儿支持组织中的基本上所有细胞的代谢活性损失。在一些实施方案中，胎儿支持组织被干燥。在一些实施方案中，胎儿支持组织没有脱水。
对胎儿支持组织的处理
所有处理都遵循良好组织操作规范(Good组织Practices(GTP))进行以确保没有污染物被引入胎儿支持组织产品中。
利用FDA许可的筛查测试来对胎儿支持组织进行HIV-1、HIV-2、HTLV-1、乙型和丙型肝炎、西尼罗病毒、巨细胞病毒、人传染性海绵状脑病(例如Creutzfeldt-Jakob疾病)和梅毒螺旋体测试。组织被HIV-1、HIV-2、HTLV-1、乙型和丙型肝炎、西尼罗病毒或巨细胞病毒污染的任何指征导致对该组织样本的立即隔离检疫和后续破坏。
另外，对供体的医疗记录进行风险因素检查，并且检查乙型肝炎、丙型肝炎或者HIV感染的临床证据。供体具有风险因素的任何指征，和/或感染有HIV-1、HIV-2、HTLV-1、乙型和丙型肝炎、西尼罗病毒、巨细胞病毒、人传染性海绵状脑病(例如Creutzfeldt-Jakob疾病)和梅毒螺旋体的临床证据导致对该组织样本的立即隔离检疫和后续破坏。
在一些实施方案中，胎儿支持组织被冷冻。在一些实施方案中，胎儿支持组织未被冷冻。若胎儿支持组织未被冷冻，则对其按照紧接着下文所述进行处理。
在一些实施方案中，将基本上全部血液从胎儿支持组织(例如来自存在于胎儿支持组织中的任何动脉和静脉，以及已渗入组织中的血液)除去。在一些实施方案中，在胎儿支持组织被冷冻之前将基本上全部血液除去。在一些实施方案中，没有将血液从胎儿支持组织除去。在一些实施方案中，在胎儿支持组织被冷冻之前没有将血液从胎儿支持组织除去。在一些实施方案中，在胎儿支持组织已被冷冻之后将血液基本上除去。
在一些实施方案中，将胎儿支持组织在搅拌下用缓冲剂进行洗涤以除去过量的血液和组织。在一些实施方案中，将胎儿支持组织在搅拌下浸透缓冲剂以除去过量的血液和组织。在一些实施方案中，在搅拌下洗涤或浸透缩短了洗涤时间。在一些实施方案中，将缓冲剂洗涤溶液替换为新鲜缓冲剂溶液。在一些实施方案中，在接触期间(例如当红细胞从胎儿支持组织扩散的速率缓慢时)，任选地将缓冲剂改变。在一些实施方案中，在接触期间增加了磁性搅拌器。在一些实施方案中，增加(和启动)磁性搅拌器增大了红细胞从胎儿支持组织扩散的速率。在一些实施方案中，将胎儿支持组织浸泡在等渗溶液溶液中并使溶液交换。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用等渗缓冲剂或组织培养基进行洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用盐水进行洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用PBS进行洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织进行1X PBS洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用TRIS-缓冲的盐水进行洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用HEPES–缓冲的盐水进行洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用林格溶液进行洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用林格乳酸盐溶液进行洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用哈特曼溶液进行洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用EBSS进行洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用HBSS进行洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用蒂罗德盐溶液进行洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用Gey平衡盐溶液进行洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用DMEM进行洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用EMEM进行洗涤。在一些实施方案中，将UC用GMEM进行洗涤。在一些实施方案中，将胎儿支持组织用RPMI进行洗涤。
在一些实施方案中，所述用途是同源用途(例如功能同源用途或结构同源用途)。在一些实施方案中，对胎儿支持组织产品进行最小操作。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品除了包含水、类晶体或灭菌剂、防腐剂或储存剂之外，不包含另外的制品。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品没有全身效果，并且对于其主要功能而言不依赖于活细胞的代谢活性。
处理以产生胎儿支持组织移植物
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是胎儿支持组织移植物。在一些实施方案中，分离的胎儿支持组织用于产生胎儿支持组织移植物。在一些实施方案中，将胎儿支持组织(例如利用手术刀)切割成多个切片。切片的尺寸取决于从胎儿支持组织获得的胎儿支持组织移植物的期望用途。在一些实施方案中，将切割的胎儿支持组织任选地用缓冲剂再次洗涤以进一步除去过量的血液和组织。
在一些实施方案中，胎儿支持组织移植物从脐带(UC)组织获得。在一些实施方案中，将脐带的切片(例如利用手术刀或剪刀)纵向地切割以打开UC。在一些实施方案中，未将UC的切片对半切割。在一些实施方案中，将UC的切片切成两半。在一些实施方案中，对脐带胶质进行额外切割以促使UC变平。在一些实施方案中，将UC利用任何合适的方法(例如将其用针或销钉(例如T形钉)紧固)来紧固到基材(例如聚苯乙烯泡沫板)上。在一些实施方案中，将脐带的两端紧固到基材。在一些实施方案中，仅一端被附接到基材。在一些实施方案中，将UC用基材(例如吸收性毛巾布、帷帘)来稳定化。在一些实施方案中，使UC取向为UC的内侧面(例如包含脐带胶质的面)面向上而外侧面(即包含UCAM的面)面向基材。若脐带的一端保持自由，则在一些实施方案中，将脐带的自由端(例如用夹具、止血钳子或钳子套装(例如宽锯齿尖钳子))固持同时将脐带胶质的部分或全部除去。可替代地，在一些实施方案中，UC的两端都保持自由。
脐带包含两个动脉(脐带动脉)和一个静脉(脐带静脉)。在一些实施方案中，将静脉和动脉从UC除去。在某些实例中，静脉和动脉被包围(或悬浮或埋藏)在脐带胶质内。在一些实施方案中，将静脉和动脉除去同时除去脐带胶质。在一些实施方案中，将静脉和动脉(例如利用钳子套装)从脐带剥离(或拉出)。在一些实施方案中，将静脉和动脉从呈切片的脐带切除(例如剔除)。在一些实施方案中，旋转烧蚀机(rotoblator)除去静脉和动脉同时除去脐带胶质。在一些实施方案中，脂肪抽吸机用于去除静脉和动脉同时除去脐带胶质。在一些实施方案中，静脉剥离器用于除去静脉和动脉同时除去脐带胶质。在一些实施方案中，高压液体除去静脉和动脉同时除去脐带胶质。在一些实施方案中，刷子除去静脉和动脉同时除去脐带胶质。在一些实施方案中，手术取皮机除去静脉和动脉同时除去脐带胶质。
在一些实施方案中，UC产品包含UCAM作为支架，以及整合到该支架中的多个细胞。在一些实施方案中，所述细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞或成年谱系定向的干细胞，或者分化的表皮细胞(例如以治疗皮肤中的烧灼或手术切口)。在一些实施方案中，所述细胞是间皮细胞(例如以治疗内部器官中的创伤(例如手术切口))。
在一些实施方案中，胎儿支持组织移植物是从羊膜组织获得。在一些实施方案中，羊膜组织是从胎盘获得。在一些实施方案中，胎盘已除去绒毛膜。在一些实施方案中，羊膜移植物用作支架，并且多个细胞整合到该支架中。在一些实施方案中，所述细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞或成年谱系定向的干细胞，或者分化的表皮细胞(例如以治疗皮肤中的烧灼或手术切口)。在一些实施方案中，所述细胞是间皮细胞(例如以治疗内部器官中的创伤(例如手术切口))。
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品呈任何适合的形状(例如方形、圆形、三角形、矩形)。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品从胎儿支持组织的片材产生。在一些实施方案中，该片材是扁平的。在一些实施方案中，该片材是管状。
胎儿支持组织移植物的尺寸取决于胎儿支持组织移植物的期望用途。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品(例如利用手术刀)切成多个切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约1.0cm x约0.25cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约1.0cm x约0.5cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约1.0cmx约0.75cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约1cm x约1cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约1cm x约2cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约1cm x约3cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约1cm x约4cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约1cm x约5cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约1cm x约6cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约2cm x约2cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约2cm x约3cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约2cm x约4cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约2cm x约5cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约2cm x约6cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约3cm x约3cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约3cm x约4cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约3cmx约5cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约3cm x约6cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约4cm x约4cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约4cm x约5cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约4cm x约6cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约5cm x约5cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约5cm x约6cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约6cm x约6cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约8cm x约1cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约8cm x约2cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约8cm x约3cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约8cm x约4cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约8cm x约5cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约8cm x约6cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约10cm x约10cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约12cm x约10cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约15cm x约10cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约20cm x约10cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约25cm x约10cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约30cm x约10cm的切片。
处理以产生分碎的胎儿支持组织产品
在一些实施方案中，分离的胎儿支持组织用于产生分碎的胎儿支持组织产品。本文中使用的“碎片”是指已从较大组织获得的尺寸范围约0.1mm至约1.0cm长度、宽度或厚度的组织颗粒。本文中所述的“碎片”保留其所源于的组织的特征并且在检查时可鉴定为所述组织。本文中使用的术语“分碎的”、“分碎”和“分碎化”是指与本申请的“碎片”相关的动作。在一些实施方案中，将分碎的胎儿支持组织产品通过使分碎的胎儿支持组织与载体混合而进一步处理成溶液、悬浮液或乳液。在一些实施方案中，将分碎的胎儿支持组织产品配制成乳膏、洗剂、软膏剂、糊剂、凝胶、薄膜或者涂料。在一些实施方案中，使分碎的胎儿支持组织产品与贴片或创伤敷料接触。
在一些实施方案中，将羊膜组织和脐带组织的0.001:99.999w/w％至99.999:0.001w/w％中的任何比例的混合物通过利用本领域技术人员已知的任何分碎工具(例如组织研磨机、超声破碎器、珠磨式研磨机(bread beater)、冷冻机/磨碎机、混合器、研钵/杵、转子-定子、厨房用切碎器、磨碎器、尺子和手术刀)从新鲜或冷冻的组织进行分碎，从而获得尺寸范围约0.1mm至约1.0cm长度、宽度或厚度的碎片。在一些实施方案中，将所得的碎片均质化而产生尺寸一致的碎片。在一些实施方案中，将所得的碎片湿法使用，通过本领域技术人员已知的任何方法例如离心或冻干进行部分脱水，或者基本上脱水。在一些实施方案中，将所得的制剂立即使用，或者储存在本领域技术人员已知的任何类型的容器例如袋子、罐子、瓶子、管、安瓿和预填充的注射器中以供后续使用。在一些实施方案中，将分碎的制剂通过本领域技术人员已知的任何方法例如γ辐射进行灭菌。
在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织在分碎之前任选地进行冻干。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过任何适合的方法(例如暴露于液态气体、置于冷冻机中)进行冻干。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织置于冻干装置的真空室中直至全部或基本上全部流体(例如水)已被除去。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织在冷冻(例如暴露于低于0℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-75℃、-80℃、-90℃或者-100℃的温度)之后进行冻干。
处理以产生粉碎的胎儿支持组织产品
在一些实施方案中，分离的胎儿支持组织用于产生粉碎的胎儿支持组织产品。本文中使用的“粉碎的胎儿支持组织产品”意指包含已被破碎(或解离)的组织的胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，粉碎的胎儿支持组织产品是干粉。在一些实施方案中，将粉碎的胎儿支持组织产品通过使胎儿支持组织粉末与载剂混合而进一步处理成溶液、悬浮液或乳液。在一些实施方案中，将粉碎的胎儿支持组织产品配制成乳膏、洗剂、软膏剂、糊剂、凝胶、薄膜或涂料。在一些实施方案中，使粉碎的胎儿支持组织产品与贴片或创伤敷料接触。
在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过任何适合的方法进行粉碎。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过使用粉碎机(例如Bessman组织粉碎机、Biospec生物粉碎机，或者Covaris CryoPrep)进行粉碎。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过使用组织研磨机(例如Potter-Elvehjem研磨机或Wheaton顶置式搅拌机)进行粉碎。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过使用超声破碎器进行粉碎。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过使用珠磨式研磨机(bead beater)进行粉碎。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过使用冷冻机/磨粉机(例如SPEX样品Prep冷冻机/磨粉机或Retch球磨机)进行粉碎。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过使用杵和研钵进行粉碎。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过手动使用杵和研钵进行粉碎。
在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织在粉碎之前任选地进行冻干。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过任何适合的方法(例如暴露于液态气体、置于冷冻机中)进行冻干。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织置于冻干装置的真空室中直至全部或基本上全部流体(例如水)已被除去。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织在冷冻(例如暴露于低于0℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-75℃、-80℃、-90℃或者-100℃的温度)之后进行冻干。
胎儿支持组织产品的储存
在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存以供后续使用。在一些实施方案中，储存胎儿支持组织产品没有破坏胎儿支持组织细胞外基质的完整性。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品被冻干。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在任何适合的储存介质中。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在50％DMEM+50％甘油中。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者100％甘油中。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者100％丙二醇中。在一些实施方案中，％甘油或％丙二醇分别是在溶液中甘油或丙二醇的重量/体积(w/v)百分比或者体积/体积(v/v)百分比。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在盐水溶液中。
在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品任选地与基材(即支持性背衬)接触。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品没有与基材接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品取向为以便胎儿支持组织产品与基材接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品取向为以便基质与基材接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品取向为以便上皮侧与基材接触。
在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品附接到基材。在一些实施方案中，所述基材是硝酸纤维素纸(NC)。在一些实施方案中，所述基材是尼龙膜(NM)。在一些实施方案中，所述基材是聚醚砜膜(PES)。
低温保存
在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品冷冻以便进行低温保存。在一些实施方案中，低温保存胎儿支持组织产品没有破坏胎儿支持组织细胞外基质的完整性。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品暴露于液态气体(例如液氮或液氢)。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品暴露于液氮。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品没有接触液态气体。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品置于容器中并且使该容器与液态气体接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品暴露于液态气体直至该胎儿支持组织产品被冷冻。
冻干
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品被冻干。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品在冷冻之后进行冻干。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品在通过任何适合的方法(例如暴露于液态气体、置于冷冻机中)冷冻之后进行冻干。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约0℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-20℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-40℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-50℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-60℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-70℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-75℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-80℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-90℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-100℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于液态气体进行冷冻。
在一些实施方案中，低温保存的胎儿支持组织产品被冻干。在一些实施方案中，将低温保存的胎儿支持组织产品置于冻干装置的真空室中直至全部或基本上全部流体(例如水)已被除去。
磨碎
在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织通过任何适合的方法进行磨碎。磨碎的持续时间和频率可以根据期望的结果而改变。确定必要的参数在本领域技术人员的技能内。本文中使用的“磨碎”意指使胎儿支持组织缩小到小颗粒或粉末的任何方法。术语磨碎包括微粉化、粉碎、均质化、锉碎、磨粉、擦碎、捣碎和压碎。
在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织通过使用磨碎容器进行磨碎。在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织通过使用粉碎机(例如Bessman组织粉碎机或CovarisCryoPrep)进行磨碎。在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织通过使用组织研磨机(例如Potter-Elvehjem研磨机或Wheaton顶置式搅拌机)进行磨碎。在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织通过使用超声破碎器进行磨碎。在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织通过使用珠磨式研磨机进行磨碎。在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织通过使用冷冻机/磨粉机(例如SPEX样品Prep冷冻机/磨粉机)进行磨碎。在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织通过使用杵和研钵进行磨碎。在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织通过手动使用杵和研钵进行磨碎。
在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织通过使用磨碎容器进行磨碎。在一些实施方案中，将胎儿支持组织以约10Hz至约25Hz的频率进行磨碎。在一些实施方案中，将胎儿支持组织以约10Hz的频率进行磨碎。在一些实施方案中，将胎儿支持组织以约15Hz的频率进行磨碎。。在一些实施方案中，将胎儿支持组织以约20Hz的频率进行磨碎。在一些实施方案中，将胎儿支持组织以约25Hz的频率进行磨碎。在一些实施方案中，磨碎持续任何适合的时间段。磨碎频率越低，磨碎冻干的胎儿支持组织所需的时间量越大。磨碎的持续时间随着粉末的期望形式而改变。在一些实施方案中，磨碎持续约1至约6分钟，例如约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟，或者约6分钟。
在一些实施方案中，磨碎冻干的胎儿支持组织进一步包括连续地冷冻冻干的胎儿支持组织。例如，在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织置于磨碎容器中并且使磨碎容器暴露于低于0℃的温度(例如将磨碎容器浸入液氮中或该容器包括自动化的液氮冷却特征)。
在一些实施方案中，磨碎冻干的胎儿支持组织产生粉末。本文中使用的“粉末”意指呈干燥细颗粒或基质形式的物质。在一些实施方案中，颗粒在尺寸方面不是均一的。在一些实施方案中，颗粒在尺寸方面是基本上均一的。
在一些实施方案中，将胎儿支持组织在冻干之前分割成碎块。在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织在磨碎之前分割成碎块。在一些实施方案中，将粉末冷冻。在一些实施方案中，将粉末在环境温度下储存。在一些实施方案中，将粉末等分。在一些实施方案中，将粉末a)冷冻；b)解冻；和c)等分。在一些实施方案中，将粉末等分而没有预先冷冻。在一些实施方案中，将粉末在等分之前在环境温度下储存。在一些实施方案中，将等分的粉末包装到包装、小瓶、预填充的注射器或瓶子中。
灭菌
在一些实施方案中，对胎儿支持组织产品通过任何适合的(例如医学上可接受的)方法进行终端灭菌。在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织产品暴露于γ辐射足以将胎儿支持组织产品灭菌的时间段。在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织产品暴露于25kGy的γ辐射足以将胎儿支持组织产品灭菌的时间段。在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织产品暴露于电子束足以将胎儿支持组织产品灭菌的时间段。在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织产品暴露于X-射线辐射足以将胎儿支持组织产品灭菌的时间段。在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织产品暴露于UV辐射足以将胎儿支持组织产品灭菌的时间段。
再水化
在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品部分地或完全地再水化。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过使胎儿支持组织产品与缓冲剂或与水接触进行再水化。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与等渗缓冲剂接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织与盐水接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与PBS接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与林格溶液接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与哈特曼溶液接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与TRIS-缓冲的盐水接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品接触HEPES-缓冲的盐水；50％DMEM+50％甘油；10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者100％甘油；和/或10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者100％丙二醇。
在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触10分钟。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触15分钟。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触20分钟。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触25分钟。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触30分钟。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触35分钟。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触40分钟。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触45分钟。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触50分钟。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触55分钟。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触60分钟。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触2小时。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触3小时。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触4小时。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触5小时。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触6小时。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触6小时。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触10小时。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触12小时。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触18小时。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触24小时。
制备分离的nHC-HA/PTX3复合物的方法
在一些实施方案中，分离的nHC-HA/PTX3复合物从羊膜组织分离。在一些实施方案中，分离的nHC-HA/PTX3复合物从羊膜或脐带分离。在一些实施方案中，分离的nHC-HA/PTX3复合物从新鲜的、冷冻的或者预先冷冻的胎盘羊膜(PAM)，新鲜的、冷冻的或者预先冷冻的脐带羊膜(UCAM)，新鲜的、冷冻的或者预先冷冻的胎盘，新鲜的、冷冻的或者预先冷冻的脐带，新鲜的、冷冻的或者预先冷冻的绒毛膜，新鲜的、冷冻的或者预先冷冻的羊膜-绒毛膜，或者它们的任何组合分离。在一些实施方案中，这种组织从任何哺乳动物(例如但不限于人类、非人类灵长类动物、牛或猪)获得。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3通过任何适合的方法进行纯化。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物的纯化是通过离心(例如超速离心、梯度离心)、色谱法(例如离子交换色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱和羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤或者差分溶解度、乙醇沉淀，或者通过任何其他可供用于纯化蛋白的技术(参见，例如Scopes，ProteinPurification Principles and Practice第2版，Springer-Verlag,New York,1987；Higgins,S.J.和Hames,B.D.(编)，Protein Expression:A Practical Approach,OxfordUniv Press,1999；以及Deutscher,M.P.、Simon,M.I.、Abelson,J.N.(编)，Guide toProtein Purification:Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series,第182卷),Academic Press,1997，全部都通过援引并入本文中)。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3从提取物分离。在一些实施方案中，该提取物从羊膜提取物制得。在一些实施方案中，该提取物从脐带提取物制得。在一些实施方案中，脐带提取物包含脐带基质和/或脐带胶质。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物被包含在通过超速离心制得的提取物中。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物被包含在利用CsCl/4-6M胍HCl梯度通过超速离心制得的提取物中。在一些实施方案中，该提取物通过至少2轮超速离心制得。在一些实施方案中，该提取物通过多于2轮超速离心制得(即nHC-HA/PTX3 2nd)。在一些实施方案中，该提取物通过至少4轮超速离心制得(即nHC-HA/PTX34th)。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含富含亮氨酸的小蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含HC1、HA、PTX3和/或富含亮氨酸的小蛋白聚糖。
在一些实施方案中，对通过在等渗溶液中提取而制得的提取物进行超速离心。在一些实施方案中，该等渗溶液是PBS。例如，在一些实施方案中，将组织在PBS中进行均质化以产生均质的样品。在一些实施方案中，该均质的样品然后通过离心而分离成可溶性部分和不溶性部分。在一些实施方案中，对PBS-提取的组织的可溶性部分进行超速离心。在这种实施方案中，通过对PBS-提取的组织超速离心而纯化的nHC-HA/PTX3称为nHC-HA/PTX3可溶性复合物。在一些实施方案中，nHC-HA可溶性复合物包含富含亮氨酸的小蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3可溶性复合物包含HC1、HA、PTX3和/或富含亮氨酸的小蛋白聚糖。
在一些实施方案中，对通过对羊膜和/或脐带组织进行直接胍HCl提取(例如4-6MGnHCl)而制得的提取物进行超速离心。在一些实施方案中，GnHCl提取的组织而后被离心而产生GnHCl可溶性部分和GnHCl不溶性部分。在一些实施方案中，对GnHCl可溶性部分进行超速离心。在这种实施方案中，通过对胍HCl-提取的组织超速离心而纯化的nHC-HA/PTX3称为nHC-HA/PTX3不溶性复合物。在一些实施方案中，nHC-HA不溶性复合物包含富含亮氨酸的小蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3不溶性复合物包含HC1、HA、PTX3和/或富含亮氨酸的小蛋白聚糖。
在一些实施方案中，对通过对PBS-提取的组织的不溶性部分进一步进行胍HCl提取而制得的提取物进行超速离心。例如，在一些实施方案中，将组织在PBS中进行均质化以产生均质的样品。在一些实施方案中，均质的样品然后通过离心而分离成可溶性部分和不溶性部分。在一些实施方案中，然后将该不溶性部分在胍HCl(例如4-6M GnHCl)中进一步提取并且离心而产生胍HCl可溶性部分和不溶性部分。在一些实施方案中，对胍HCl可溶性部分进行超速离心。在这种实施方案中，通过对胍HCl-提取的组织超速离心而纯化的nHC-HA/PTX3称为nHC-HA/PTX3不溶性复合物。在一些实施方案中，nHC-HA不溶性复合物包含富含亮氨酸的小蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3不溶性复合物包含HC1、HA、PTX3和/或富含亮氨酸的小蛋白聚糖。
在一些实施方案中，纯化分离的nHC-HA/PTX3提取物的方法包括：(a)将分离的提取物(例如通过本文中所述的可溶性或不溶性方法制得)以1.35g/ml的初始密度溶解在CsCl/4-6M胍HCl中而产生CsCl混合物；(b)将该CsCl混合物以125,000x g在15℃下离心48h而产生第一纯化的提取物；(c)提取该第一纯化的提取物并且将其相对于蒸馏水进行透析以除去CsCl和胍HCl而产生透析液。在一些实施方案中，纯化分离的提取物的方法进一步包括：(d)将该透析液与包含1.3％(w/v)乙酸钾的3体积95％(v/v)乙醇在0℃下混合1h而产生第一透析液/乙醇混合物；(e)将该第一透析液/乙醇混合物以15,000x g离心而产生第二纯化的提取物；以及(f)提取该第二纯化的提取物。在一些实施方案中，纯化分离的提取物的方法进一步包括：(g)将该第二纯化的提取物用乙醇(例如70％乙醇)洗涤而产生第二纯化的提取物/乙醇混合物；(h)将该第二纯化的提取物/乙醇混合物离心而产生第三纯化的提取物；以及(i)提取该第三纯化的提取物。在一些实施方案中，纯化分离的提取物的方法进一步包括：(j)将该第三纯化的提取物用乙醇(例如70％乙醇)洗涤而产生第三纯化的提取物/乙醇混合物；(k)将该第三纯化的提取物/乙醇混合物离心而产生第四纯化的提取物；以及(l)提取该第四纯化的提取物。在一些实施方案中，纯化的提取物包含nHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物通过免疫亲和色谱进行纯化。在一些实施方案中，使抗-HC1抗体\抗-HC2抗体或二者生成并且附着于固定支持物。在一些实施方案中，使未纯化的HC-HA复合物(即流动相)经过该支持物。在某些实例中，HC-HA复合物结合到抗体(例如经由(a)抗-HC1抗体与HC1的相互作用、(b)抗-HC2抗体与HC2的相互作用、(c)抗-PTX3抗体与PTX3的相互作用、(d)抗-SLRP抗体与SLRP的相互作用，或者(e)它们的任何组合)。在一些实施方案中，将支持物(例如用PBS)洗涤以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，然后将支持物用使nHC-HA/PTX3复合物能够从支持物洗脱的溶液(例如1％SDS、6M胍-HCl或者8M脲)进行洗涤。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物通过亲和色谱进行纯化。在一些实施方案中，使HABP产生并且附着于固定支持物。在一些实施方案中，使未纯化的nHC-HA/PTX3复合物(即流动相)经过该支持物。在某些实例中，nHC-HA/PTX3复合物结合到HABP。在一些实施方案中，将支持物(例如用PBS)洗涤以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，然后将支持物用使HC-HA复合物能够从支持物洗脱的溶液进行洗涤。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物通过HABP亲和色谱与免疫亲和色谱的组合进行纯化，该免疫亲和色谱利用抗-HC1抗体、抗-HC2抗体、抗-PTX3抗体、对抗SLRP或SLRP组合的抗体，或者所述抗体的任何组合。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物是利用一种或更多种抗体从本文所述的不溶性级分进行纯化。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物是利用抗-SLRP抗体从本文所述的不溶性级分进行纯化。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物是从本文所述的可溶性级分进行纯化。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物是利用抗-PTX3抗体从本文所述的可溶性级分进行纯化。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含富含亮氨酸的小蛋白聚糖(SLRP)。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含I类、II类或者III类SLRP。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白聚糖选自I类SLRP例如饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白聚糖选自II类SLRP例如纤调蛋白聚糖、光蛋白聚糖、PRELP(富含脯氨酸精氨酸末端的富含亮氨酸的蛋白)、角蛋白聚糖和骨粘附蛋白聚糖。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白聚糖选自III类SLRP例如epipycan和骨诱导因子(osteoglycin)。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白聚糖选自双库尼茨抑制剂、饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨粘附蛋白聚糖。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白包括糖胺聚糖。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白聚糖包括硫酸角质素。
制备rcHC-HA/PTX3复合物的方法
在一些实施方案中，制备重构的HC-HA/PTX3复合物的方法包括使PTX3/HA复合物与IαI和TSG-6接触。在一些实施方案中，TSG-6催化间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HC1)转移到HA。本文中提供了通过这种方法制备的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。
在一些实施方案中，制备重构的HC-HA/PTX3复合物的方法包括：(a)使高分子量透明质酸(HMW HA)与IαI和TSG-6接触而形成与TSG-6预结合的HC-HA复合物，以及(b)在适合的条件下使HC-HA复合物与正五聚蛋白3(PTX3)接触而形成rcHC-HA/PTX3复合物。本文中提供了通过这种方法制得的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)和(b)按照顺序依次进行。在一些实施方案中，所述方法包括使与TSG-6预结合的HC-HA复合物与PTX3接触。
在一些实施方案中，所述方法包括首先使高分子量透明质酸(HMW HA)与正五聚蛋白3(PTX3)在适合的条件下接触而形成PTX3/HA复合物，然后使该PTX3/HA复合物与IαI和TSG-6接触。
在一些实施方案中，使IαI蛋白和TSG-6蛋白接触而以约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1或者20:1(IαI:TSG-6)的摩尔比复合。在一些实施方案中，IαI:TSG-6的比值范围是约1:1至约20:1，例如约1:1至约10:1、例如约1:1至5约:1、例如约1:1至约3:1。在一些实施方案中，IαI:TSG-6的比值是3:1或更高。在一些实施方案中，IαI:TSG-6的比值是3:1。
在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)和(b)按照顺序依次进行。在一些实施方案中，所述方法包括使PTX3/HA复合物与IαI和TSG-6接触。
在某些实例中，TSG-6与IαI相互作用并且与IαI的HC1和HC2形成共价复合物(即HC1·TSG-6和HC2·TSG-6)。在某些实例中，在HA存在下，HC转移至HA而形成rcHC-HA。在一些实施方案中，将TSG-6·HC1复合物添加到预结合的PTX3/HA复合物以催化HC1转移到HA。在一些实施方案中，所述方法包括首先使固定化的高分子量透明质酸(HMW HA)与正五聚蛋白3(PTX3)在适合的条件下接触而形成PTX3/HA复合物，然后使该PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物接触。在一些实施方案中，将HC1·TSG-6复合物和HC2·TSG-6复合物的组合添加到PTX3/HA复合物。
在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤发生至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更久。在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤发生至少2小时或更久。在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤发生至少2小时。在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤发生在37℃。在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤发生在5mM MgCl2/PBS中。
在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与IαI和TSG-6接触的步骤发生至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更久。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC2·TSG-6复合物接触的步骤发生至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更久。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC2·TSG-6复合物接触的步骤发生至少2小时或更久。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC2·TSG-6复合物接触的步骤发生至少2小时。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC1·TSG-6复合物接触的步骤发生在37℃。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC1·TSG-6复合物接触的步骤发生在5mM MgCl2/PBS中。
在一些实施方案中，所述方法包括使高分子量透明质酸(HMW HA)与正五聚蛋白3(PTX3)蛋白、间-α-抑制剂(IαI)蛋白(包含重链1(HC1))和肿瘤坏死因子α-刺激的基因6(TSG-6)在适合的条件下同时接触而形成HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，HMW HA与PTX3、IαI和TSG-6接触发生至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更久。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤发生在37℃。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤发生在5mM MgCl2/PBS中。
在一些实施方案中，所述方法包括使高分子量透明质酸(HMW HA)与正五聚蛋白3(PTX3)蛋白、间-α-抑制剂(IαI)蛋白(包含重链1(HC1))和肿瘤坏死因子α-刺激的基因6(TSG-6)在适合的条件下以任何顺序依次地接触而形成HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，HMW HA与PTX3、IαI和TSG-6接触发生至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更久。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤发生在37℃。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤发生在5mM MgCl2/PBS中。
在一些实施方案中，制备rcHC-HA/PTX3复合物的方法进一步包括添加一种或更多种富含亮氨酸的小蛋白聚糖(SLRP)。在一些实施方案中，制备重构的HC-HA/PTX3复合物的方法包括：(a)使固定化的高分子量透明质酸(HMW HA)与正五聚蛋白3(PTX3)在适合的条件下接触而形成PTX3/HA复合物，(b)使PTX3/HA复合物与IαI和肿瘤坏死因子-刺激的基因-6(TSG-6)接触，和(c)使PTX3/HA复合物与一种或更多种SLRPS接触。本文中提供了通过这种方法制得的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，TSG-6催化间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HC1)转移到HA。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)、(b)和(c)按照顺序依次进行。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)、(b)和(c)同时进行。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)进行，然后所述方法的步骤(b)和(c)按照顺序依次进行。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)进行，然后所述方法的步骤(b)和(c)同时进行。
在一些实施方案中，制备重构的HC-HA/PTX3复合物的方法包括：(a)使固定化的高分子量透明质酸(HMW HA)与IαI和TSG-6接触而形成与TSG-6预结合的HC-HA复合物，(b)使HC-HA复合物与正五聚蛋白3(PTX3)接触，和(c)使HC-HA复合物与一种或更多种SLRPS在适合的条件下接触而形成rcHC-HA/PTX3复合物。本文提供了通过这种方法制得的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。在一些实施方案中，使与TSG-6预结合的HC-HA复合物与PTX3接触。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)、(b)和(c)按照顺序依次进行。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)、(b)和(c)同时进行。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)进行，然后所述方法的步骤(b)和(c)按照顺序依次进行。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)进行，然后所述方法的步骤(b)和(c)同时进行。
在一些实施方案中，SLRP选自I类、II类或者III类SLRP。在一些实施方案中，SLRP选自I类SLRP例如饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白聚糖选自II类SLRP例如纤调蛋白聚糖、光蛋白聚糖、PRELP(富含脯氨酸精氨酸末端的富含亮氨酸的蛋白)、角蛋白聚糖和骨粘附蛋白聚糖。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白聚糖选自III类SLRP例如epipycan和骨诱导因子。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白聚糖选自双库尼茨抑制剂、饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨粘附蛋白聚糖。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白包括糖胺聚糖。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白聚糖包括硫酸角质素。
PTX3
在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3从细胞或多个细胞(例如组织提取物)分离。适合于表达PTX3的示例性细胞包括但不限于动物细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人类细胞、啮齿动物细胞、昆虫细胞、细菌和酵母和植物细胞，包括但不限于，藻类、被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物。在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3从人类细胞分离。在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3从用一种或更多种促炎性细胞因子刺激以上调PTX3表达的细胞分离。在一些实施方案中，促炎性细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3从羊膜细胞分离。在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3从来自脐带的羊膜细胞分离。在一些实施方案中，将羊膜细胞用一种或更多种促炎性细胞因子刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎性细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3从脐带细胞分离。在一些实施方案中，将脐带细胞用一种或更多种促炎性细胞因子刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎性细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3从羊膜上皮细胞分离。在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3从脐带上皮细胞分离。在一些实施方案中，将羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞用一种或更多种促炎性细胞因子刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎性细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3从羊膜基质细胞分离。在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3从脐带基质细胞分离。在一些实施方案中，将羊膜基质细胞或脐带基质细胞用一种或更多种促炎性细胞因子刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎性细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3是从细胞分离的天然PTX3蛋白。在一些实施方案中，将细胞用一种或更多种促炎性细胞因子刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎性细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，PTX3通过重组技术进行制备。在一些实施方案中，PTX3是由重组表达载体表达。在一些实施方案中，编码PTX3的核酸可操作地连接到组成型启动子。在一些实施方案中，编码PTX3的核酸可操作地连接到诱导型启动子。在一些实施方案中，PTX3是在转基因动物中进行表达。在一些实施方案中，PTX3是重组蛋白。在一些实施方案中，PTX3是从细胞分离的重组蛋白。在一些实施方案中，PTX3是在无细胞提取物中产生的重组蛋白。
在一些实施方案中，PTX3从羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜流体或其组合进行纯化。在一些实施方案中，PTX3从羊膜细胞进行纯化。在一些实施方案中，羊膜细胞是羊膜上皮细胞。在一些实施方案中，羊膜细胞是脐带上皮细胞。在一些实施方案中，羊膜细胞是羊膜基质细胞。在一些实施方案中，羊膜细胞是脐带基质细胞。在一些实施方案中，将羊膜细胞用一种或更多种促炎性细胞因子刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎性细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，PTX3未从细胞或多个细胞(例如组织提取物)分离。
在一些实施方案中，PTX3包含PTX3的片段，该片段足以结合到HA并且促进形成rcHC-HA/PTX3复合物。用于提供的方法中的PTX3的变体包括物种变体、等位基因变体，以及包含保守性和非保守性氨基酸突变的变体。在一些实例中，PTX3变体进一步包括具有氨基酸修饰(即氨基酸置换(替换)、缺失或者插入)的变体。在一些实施方案中，这种修饰改善PTX3多肽的一种或更多种性质，例如改善rcHC-HA/PTX3复合物的一种或更多种治疗性质(例如抗炎、抗-免疫、抗血管生成、抗疤痕、抗粘附、再生或者本文所述的其他治疗活性)。
在一些实施方案中，PTX3蛋白从商业来源获得。PTX3的示例性商业来源是但不限于PTX3(目录号1826-TS；R&D Systems,Minneapolis,MN)。
在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3蛋白是多聚体蛋白。在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3蛋白是均多聚体。在一些实施方案中，均多聚体是二聚体、三聚体、四聚体、六聚体、五聚体或者八聚体。在一些实施方案中，PTX3均多聚体是三聚体、四聚体或者八聚体。在具体的实施方案中，PTX3均多聚体是八聚体。在一些实施方案中，多聚结构域被修饰为改善PTX3蛋白的多聚。在一些实施方案中，多聚结构域被替换为异质多聚结构域(例如Fc多聚结构域或亮氨酸拉链)，其在融合到PTX3时，改善PTX3的多聚。
TSG-6
在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6从细胞或多个细胞(例如组织提取物)分离。适合于表达TSG-6的示例性细胞包括但不限于动物细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人类细胞、啮齿动物细胞、昆虫细胞、细菌和酵母和植物细胞，包括但不限于，藻类、被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6从人类细胞分离。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6从用一种或更多种促炎性细胞因子刺激以上调TSG-6表达的细胞分离。在一些实施方案中，促炎性细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6从羊膜细胞分离。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6从来自脐带的羊膜细胞分离。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6从用一种或更多种促炎性细胞因子刺激以上调TSG-6表达的羊膜细胞分离。在一些实施方案中，促炎性细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6从脐带细胞分离。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6从用一种或更多种促炎性细胞因子刺激以上调TSG-6表达的脐带细胞分离。在一些实施方案中，促炎性细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6从羊膜上皮细胞分离。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6从脐带上皮细胞分离。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6从用一种或更多种促炎性细胞因子刺激以上调TSG-6表达的羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞分离。在一些实施方案中，促炎性细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6从羊膜基质细胞分离。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6从脐带基质细胞分离。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6从用一种或更多种促炎性细胞因子刺激以上调TSG-6表达的羊膜基质细胞或脐带基质细胞分离。在一些实施方案中，促炎性细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6是从细胞分离的天然TSG-6蛋白。在一些实施方案中，将细胞用一种或更多种促炎性细胞因子刺激以上调TSG-6表达。在一些实施方案中，促炎性细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，TSG-6通过重组技术进行制备。在一些实施方案中，TSG-6是由重组表达载体表达。在一些实施方案中，编码TSG-6的核酸可操作地连接到组成型启动子。在一些实施方案中，编码TSG-6的核酸可操作地连接到诱导型启动子。在一些实施方案中，TSG-6是在转基因动物中进行表达。在一些实施方案中，TSG-6是重组蛋白。在一些实施方案中，TSG-6是从细胞分离的重组蛋白。在一些实施方案中，TSG-6是在无细胞提取物中产生的重组蛋白。
在一些实施方案中，TSG-6从羊膜、羊膜、绒毛膜、羊膜流体或其组合进行纯化。在一些实施方案中，PTX3从羊膜细胞进行纯化。在一些实施方案中，羊膜细胞是羊膜上皮细胞。在一些实施方案中，羊膜上皮细胞是脐带上皮细胞。在一些实施方案中，羊膜细胞是羊膜基质细胞。在一些实施方案中，羊膜细胞是脐带基质细胞。在一些实施方案中，将羊膜细胞用一种或更多种促炎性细胞因子刺激以上调TSG-6表达。在一些实施方案中，促炎性细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，TSG-6未从细胞或多个细胞(例如组织提取物)分离。
在一些实施方案中，TSG-6包含TSG-6的片段，该片段足以促进或催化IαI的HC1转移到HA。在一些实施方案中，TSG-6包含TSG-6的连接模块。在一些实施方案中，TSG-6包含TSG-6的氨基酸Trp18至Leu277。在一些实施方案中，TSG-6变体包括例如物种变体、等位基因变体，以及包含保守性和非保守性氨基酸突变的变体。人TSG-6的天然等位基因变体包括例如包含氨基酸置换Q144R的TSG-6。用于提供的方法中的TSG-6变体或其HA结合片段包括具有氨基酸修饰(即氨基酸置换(替换)、缺失或者插入)的变体。在一些实施方案中，这种修饰改善TSG-6多肽的一种或更多种性质，例如改善IαI的HC1转移到HA，或者改善在IαI的HC1转移到HA之后TSG-6多肽从rcHC-HA/PTX3复合物释放。
在一些实施方案中，TSG-6包括亲和标签。示例性亲和标签包括但不限于血凝素标签、多组氨酸标签、myc标签、FLAG标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签。这种亲和标签在本领域中熟知用于纯化。在一些实施方案中，这种亲和标签参入TSG-6多肽中作为融合蛋白，或者经由化学连接基进行。在一些实施方案中，TSG-6包括亲和标签，并且未结合的TSG-6通过亲和纯化而从rcHC-HA/PTX3复合物除去。
在一些实施方案中，TSG-6蛋白从商业来源获得。TSG-6的示例性商业来源是但不限于TSG-6(目录号2104-TS R&D Systems,Minneapolis,MN)。
IαI
在一些实施方案中，IαI包含HC1链。在一些实施方案中，IαI包含HC1和HC2链。在一些实施方案中，IαI包含HC1和双库尼茨抑制剂。在一些实施方案中，IαI包含HC1和HC2链和双库尼茨抑制剂。在一些实施方案中，IαI包含HC1和HC2链，以及由硫酸软骨素链连接的双库尼茨抑制剂。
在一些实施方案中，IαI从生物样品分离。在一些实施方案中，生物样品是来自哺乳动物的生物样品。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，生物样品是血液、血清、血浆、肝脏、羊膜、绒毛膜或者羊膜流体样品。在一些实施方案中，生物样品是血液、血清或者血浆样品。在一些实施方案中，生物样品是血液样品。在一些实施方案中，生物样品是血清样品。在一些实施方案中，生物样品是血浆样品。在一些实施方案中，IαI从人血液、血浆或血清纯化。在一些实施方案中，IαI从人血清分离。在一些实施方案中，IαI未从血清分离。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在羊膜细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在脐带细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在来自脐带的羊膜细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在羊膜上皮细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在脐带上皮细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在羊膜基质细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在脐带基质细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在肝细胞中产生。在一些实施方案中，IαI通过重组技术进行制备。
在一些实施方案中，IαI的HC1从生物样品分离。在一些实施方案中，生物样品是来自哺乳动物的生物样品。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，生物样品是血液、血清、血浆、肝脏、羊膜、绒毛膜或者羊膜流体样品。在一些实施方案中，生物样品是血液、血清或者血浆样品。在一些实施方案中，生物样品是血液样品。在一些实施方案中，生物样品是血清样品。在一些实施方案中，生物样品是血浆样品。在一些实施方案中，IαI的HC1从人血液、血浆或血清纯化。在一些实施方案中，IαI从人血清分离。在一些实施方案中，IαI的HC1未从血清纯化。在一些实施方案中，IαI的HC1通过重组技术进行制备。在一些实施方案中，IαI的HC1从肝细胞纯化。在一些实施方案中，IαI的HC1从羊膜细胞纯化。在一些实施方案中，IαI的HC1从羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞纯化。在一些实施方案中，IαI的HC1从羊膜基质细胞或脐带基质细胞纯化。
在一些实施方案中，IαI的HC2从生物样品分离。在一些实施方案中，生物样品是来自哺乳动物的生物样品。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，生物样品是血液、血清、血浆、肝脏、羊膜、绒毛膜或者羊膜流体样品。在一些实施方案中，生物样品是血液、血清或者血浆样品。在一些实施方案中，生物样品是血液样品。在一些实施方案中，生物样品是血清样品。在一些实施方案中，生物样品是血浆样品。在一些实施方案中，IαI的HC2从人血液、血浆或血清纯化。在一些实施方案中，IαI的HC2从人血清分离。在一些实施方案中，IαI的HC2从人血清分离。在一些实施方案中，IαI的HC2未从血液血清分离。在一些实施方案中，IαI的HC2通过重组技术进行制备。在一些实施方案中，IαI的HC2从肝细胞纯化。在一些实施方案中，IαI的HC2从羊膜细胞纯化。在一些实施方案中，IαI的HC2从羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞纯化。在一些实施方案中，IαI的HC2从羊膜基质细胞或脐带基质细胞纯化。
玻尿酸(HA)
在一些实施方案中，HA从细胞、组织或者流体样品纯化。在一些实施方案中，HA从商业供应商(例如Sigma Aldrich或Advanced Medical Optics,Irvine,CA(例如Healon))获得。在一些实施方案中，HA从商业供应商以粉末形式获得。在一些实施方案中，HA在细胞中被表达。适合于表达HA的示例性细胞包括但不限于动物细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人类细胞、啮齿动物细胞、昆虫细胞、细菌和酵母和植物细胞，包括但不限于，藻类、被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物。在一些实施方案中，HA在人类细胞中被表达。在一些实施方案中，HA在转基因动物中被表达。在一些实施方案中，HA从表达透明质酸合成酶(例如HAS1、HAS2和HAS3)的细胞获得。在一些实施方案中，细胞包含表达HA合成酶的重组表达载体。在某些实例中，HA合成酶通过重复地将葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺添加到新生多糖(在其被挤过细胞膜进入细胞外空间时)而使透明质酸变长。
用于所述方法中的HA典型地是高分子量(HMW)HA。在一些实施方案中，HMW HA的重均分子量大于约100千道尔顿(kDa)，例如约100kDa至约10,000kDa、约500kDa至约10,000kDa、约800kDa至约8,500kDa、约1100kDa至约5,000kDa，或者约1400kDa至约3,500kDa。在一些实施方案中，HMW HA的重均分子量为约3000kDa。
另外的组分
在一些实施方案中，添加一种或更多种另外的组分以产生rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，添加富含亮氨酸的小蛋白聚糖(SLRP)以产生rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，SLRP是I类、II类或者III类SLRP。在一些实施方案中，SLRP选自I类SLRP例如饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP选自II类SLRP例如纤调蛋白聚糖、光蛋白聚糖、PRELP(富含脯氨酸精氨酸末端的富含亮氨酸的蛋白)、角蛋白聚糖和骨粘附蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP选自III类SLRP例如epipycan和骨诱导因子。在一些实施方案中，SLRP选自双库尼茨抑制剂、饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨粘附蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP包括糖胺聚糖。在一些实施方案中，SLRP包括硫酸角质素。
HA固定化
在一些实施方案中，对HMW HA通过任何适合的方法进行固定化。在一些实施方案中，HMW HA被固定化到固体支持物，例如培养皿、珠、柱或其他适合的表面，例如，可移植的医疗装置的表面或其部分，或者在后续与本文所述的可移植的医疗装置连接或合并的表面上。在一些实施方案中，HMW HA例如通过化学连接而被直接固定化到固体支持物。在一些实施方案中，HMW HA经由接头或中间蛋白而间接地附接于固体支持物。本领域技术人员已知许多异双官能的交联剂，其用于在氨基和巯基之间形成共价键，并用于将巯基引入蛋白中。在一些实施方案中，HMW HA经由与固体支持物交联而直接固定化到固体支持物。在一些实施方案中，HMW HA直接固定化到固体支持物而没有与固体支持物交联。在一些实施方案中，HMW HA作为涂料而直接固定化到固体支持物。在一些实施方案中，HMW HA固定化到CovalinkTM-NH表面。在一些实施方案中，HMW HA作为涂料而直接固定化到固体支持物。在一些实施方案中，在4℃下在约16h期间，HMW HA固定化到CovalinkTM-NH表面。
在一些实施方案中，所述方法包括经由与固体支持物的直接连接(即无中间蛋白)而将HMW HA固定化到固体表面。在一些实施方案中，在使固定化的HA与PTX3接触之前，将固体支持物洗涤以除去未结合的HMW HA。在一些实施方案中，在使固定化的HA与PTX3接触之前，将固体支持物用8M GnHCl和PBS的洗液进行洗涤以除去未结合的HMW HA。
在一些实施方案中，所述方法包括经由中间蛋白或接头而将HA固定化到固体表面。在一些实施方案中，该接头是肽接头。在一些实施方案中，该中间蛋白是HA结合蛋白(HABP)。在一些实施方案中，将HABP首先附接到固体支持物(例如通过交联、化学连接或经由化学接头)。在一些实施方案中，然后使包含HABP的固体支持物与HA(例如HMW HA)接触而经由HABP与HA的结合将HA固定化到固体支持物。在一些实施方案中，在使固定化的HMW HA与PTX3接触之前，将固体支持物洗涤以除去未结合的HMW HA。在一些实施方案中，在使固定化的HA与PTX3接触之前，将固体支持物用8M GnHCl和PBS的洗液进行洗涤以除去未结合的HMW HA。
在一些实施方案中，所述方法包括经由肽接头附接到固体支持物并且HA附接到肽接头而将HA固定化到固体表面。在一些实施方案中，该肽接头包含蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，所述方法包括经由可裂解的化学接头(例如但不限于二硫化物化学接头)的附接而将HA固定化到固体表面。
在一些实施方案中，选用于所述方法中的HABP是在形成rcHC-HA/PTX3复合物之后从HA解离的HABP。在一些实施方案中，HABP非共价地结合到HA。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过利用一种或更多种解离剂而使rcHC-HA/PTX3复合物从HABP解离。用于破坏非共价相互作用的解离剂(例如盐酸胍、脲和各种洗涤剂例如SDS)是本领域已知的。在一些实施方案中，该解离剂是脲。在一些实施方案中，该解离剂是盐酸胍。在一些实施方案中，解离剂是约4M至约8M胍-HCl。在一些实施方案中，解离剂是约4M、约5M、约6M、约7M、约8M胍-HCl。在一些实施方案中，解离剂是约4M至约8M胍-HCl/PBS pH 7.5。
在一些实施方案中，这种解离剂用于使rcHC-HA/PTX3复合物从中间HABP解离。用于所述方法中的HABP典型地被选择，以至于对HA的结合亲和性足够强而允许组装rcHC-HA/PTX3复合物但是通过利用适合的解离剂而从rcHC-HA/PTX3复合物解离。在一些实施方案中，解离剂是盐酸胍。
用于本文提供的方法中的示例性HABP包括但不限于：HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、TSG-6、CD44、稳定素-1、稳定素-2，或者其足以与HA结合的部分(例如其连接分子)。在一些实施方案中，HABP是多能蛋白聚糖。在一些实施方案中，HABP是重组蛋白。在一些实施方案中，HABP是重组哺乳动物蛋白。在一些实施方案中，HABP是重组人蛋白。在一些实施方案中，HABP是重组多能蛋白聚糖蛋白或其足以与HA结合的部分。在一些实施方案中，HABP是重组聚集蛋白聚糖蛋白或其足以与HA结合的部分。在一些实施方案中，HABP是天然HABP或其足以与HA结合的部分。在一些实施方案中，天然HABP从哺乳动物组织或细胞分离。在一些实施方案中，HABP从牛鼻软骨(例如来自Seikagaku的HABP，其包含聚集蛋白聚糖的HA结合结构域和连接蛋白)分离。
在一些实施方案中，HABP包含HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、TSG-6、CD44、稳定素-1或者稳定素-2的连接模块。在一些实施方案中，HABP包含多能蛋白聚糖的连接模块。在一些实施方案中，包含连接模块的HABP是重组蛋白。在一些实施方案中，包含多能蛋白聚糖的连接模块的HABP是重组蛋白。
在一些实施方案中，中间蛋白例如HABP包含蛋白水解序列，其被位点特异性蛋白酶(例如弗林蛋白酶、3C蛋白酶、胱天蛋白酶、基质金属蛋白酶或者TEV蛋白酶)识别并水解。在这种实施方案中，通过使固定化的复合物与裂解特异性裂解序列的蛋白酶接触而使组装的rcHC-HA/PTX3复合物从固体支持物脱离。
在一些实施方案中，rcHC-HA/PTX3复合物被纯化。在一些实施方案中，rcHC-HA/PTX3复合物通过任何适合的方法或方法的组合进行纯化。下述实施方案旨在仅仅示例性而非排他性。
在一些实施方案中，rcHC-HA/PTX3复合物的纯化是通过色谱法(例如离子交换色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱和羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤、离心(例如梯度离心)、或者差分溶解度、乙醇沉淀，或者通过任何其他可供用于纯化蛋白的技术。
在一些实施方案中，rcHC-HA/PTX3复合物通过免疫亲和色谱进行纯化。在一些实施方案中，抗体是对抗rcHC-HA/PTX3复合物的组分而产生(例如抗-HC1、抗-PTX、以及对抗rcHC-HA/PTX3复合物的一种或更多种SLRP的抗体，例如抗-双库尼茨抑制剂、抗-饰胶蛋白聚糖、抗-双糖链蛋白聚糖，或者抗-骨粘附蛋白聚糖)并且附固于固体支持物。在一些实施方案中，使未纯化的rcHC-HA/PTX3复合物(即流动相)通过支持物。在某些实例中，rcHC-HA/PTX3复合物结合到抗体。在一些实施方案中，将支持物(例如用PBS)洗涤以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，然后将支持物用使rcHC-HA/PTX3复合物能够从支持物洗脱的溶液(例如1％SDS、6M胍-HCl或者8M脲)进行洗涤。在一些实施方案中，将解离剂从解离的rcHC-HA/PTX3复合物除去。在一些实施方案中，将解离剂通过方法(包括但不限于离子交换色谱法、透析、凝胶过滤色谱、超过滤或者渗滤)从解离的rcHC-HA/PTX3复合物除去。
在一些实施方案中，rcHC-HA/PTX3复合物通过亲和色谱进行纯化。在一些实施方案中，HABP用于结合到rcHC-HA/PTX3复合物以便纯化复合物并且附固到固定支持物。在一些实施方案中，使未纯化的rcHC-HA/PTX3复合物(即流动相)经过该支持物。在某些实例中，rcHC-HA/PTX3复合物结合到HABP。在一些实施方案中，将支持物(例如用PBS)洗涤以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，然后将支持物用使rcHC-HA复合物能够从支持物洗脱的溶液(例如解离剂)进行洗涤。在一些实施方案中，将解离剂通过方法(包括但不限于离子交换色谱法、透析、凝胶过滤色谱、超过滤或者渗滤)从解离的rcHC-HA/PTX3复合物除去。
在一些实施方案中，rcHC-HA/PTX3复合物通过HABP亲和色谱与免疫亲和色谱的组合进行纯化，该免疫亲和色谱利用对抗rcHC-HA/PTX3复合物的一种或更多种组分的抗体。
在一些实施方案中，本文公开的rcHC-HA/PTX3复合物的一种或更多种组分包含亲和标签(例如PTX3或HC1与亲和标签的融合蛋白)。在一些实施方案中，加入rcHC-HA/PTX3复合物的一种或更多种组分中的示例性亲和标签包括但不限于血凝素标签、多组氨酸标签、myc标签、FLAG标签或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)序列。在一些实施方案中，亲和标签的配体被附固到固体支持物。在一些实施方案中，使未纯化的rcHC-HA/PTX3复合物经过该支持物。在某些实例中，rcHC-HA/PTX3复合物结合到配体。在一些实施方案中，将支持物(例如用PBS)洗涤以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，然后将支持物用使本文公开的rcHC-HA/PTX3复合物能够从支持物洗脱的溶液进行洗涤。在一些实施方案中，将洗脱剂通过方法(包括但不限于离子交换色谱法、透析、凝胶过滤色谱、超过滤或者渗滤)从解离的rcHC-HA/PTX3复合物除去。
在一些实施方案中，将PTX3、TSG-6和/或HC1缀合到标记。“标记”是指直接或间接地与多肽缀合而产生标记的多肽的可检测的化合物或组合物。在一些实施方案中，标记本身是可检测的(例如放射性同位元素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况中，催化底物化合物组成的可检测的化学改变。标记的非限制性实例包括发荧光的部分、染料、荧光标签、绿色荧光蛋白或者荧光素酶。
药物组合物
在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3的制剂是药物组合物。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3复合物是nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物，如本文中所述。在一些实施方案中，药物组合物主要由nHC-HA/PTX3复合物或rcHC-HA/PTX3复合物组成。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或者载剂。在一些实施方案中，药物组合物的适当的配方取决于所选的给药途径。任何熟知的技术、载体和赋形剂可以根据适合性和本领域中的理解进行使用。
在一些实施方案中，药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含佐剂、赋形剂、防腐剂、延迟吸收剂、填料、粘结剂、吸附剂、缓冲剂和/或增溶剂。配制成包含本文提供的HC-HA/PTX3复合物的示例性药物组合物包括但不限于：凝胶、溶液、悬浮液、乳液、糖浆、颗粒、粉末、匀浆、软膏剂、片剂、胶囊、丸剂或气雾剂。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3的制剂是移植物或片材。
在一些实施方案中，药物组合物进一步包含治疗性细胞。在一些实施方案中，所述治疗性细胞是祖细胞、干细胞，或者诱导多能干细胞。在一些实施方案中，所述祖细胞是神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞或心血管祖细胞。
剂型
在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂作为水悬浮液进行给药。在一些实施方案中，水悬浮液包含水、林格溶液和/或等渗氯化钠溶液。在一些实施方案中，水悬浮液包含甜味剂或调味剂、着色物或染料，以及若需要，乳化剂或助悬剂，以及稀释剂水、乙醇、丙二醇、甘油，或者其组合。在一些实施方案中，水悬浮液包含助悬剂。在一些实施方案中，水悬浮液包含：羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯基-吡咯烷酮、黄蓍胶和/或阿拉伯树胶。在一些实施方案中，水悬浮液包含分散剂或润湿剂。在一些实施方案中，水悬浮液包含天然存在的磷脂例如卵磷脂，或者氧化烯与脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或者氧化乙烯与长链脂肪族醇的缩合产物例如十七乙烯-氧基鲸蜡醇，或者氧化乙烯与从脂肪酸和己糖醇而得的偏酯的缩合产物例如聚氧基乙烯山梨醇单油酸酯，或者氧化乙烯与从脂肪酸和己糖醇酐而得的偏酯的缩合产物例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。在一些实施方案中，水悬浮液包含防腐剂。在一些实施方案中，水悬浮液包含乙基对羟基苯甲酸酯或者正丙基对羟基苯甲酸酯。在一些实施方案中，水悬浮液包含甜味剂。在一些实施方案中，水悬浮液包含蔗糖、糖精或阿斯巴甜。
在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂作为油悬浮液进行给药。在一些实施方案中，油悬浮液通过使活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中，或者在矿物油(例如液体石蜡)中进行配制。在一些实施方案中，油悬浮液包含增稠剂(例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇)。在一些实施方案中，油悬浮液包含甜味剂(例如上述那些)。在一些实施方案中，油悬浮液包含抗氧化剂(例如丁羟基茴香醚或α-生育酚)。
在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制用于肠胃外注射(例如经由注射或输注，包括动脉内、关节内、心脏内、皮内、十二指肠内、髓内、肌肉内、骨内、腹膜内、鞘内、血管内、静脉内、玻璃体内、硬膜外和/或皮下)。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂作为无菌的溶液剂、悬浮剂或乳剂进行给药。
在一些实施方案中，用于肠胃外给药的配方剂包括包含HC-HA/PTX3复合物的制剂的无菌的水和/或非水(油)注射液，在一些实施方案中，该注射液包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和/或溶质(该溶质使得该配方剂与预期接受者的血液等渗)；和/或无菌的水和/或非水悬浮剂，在一些实施方案中，该悬浮剂包含助悬剂和/或增稠剂。在一些实施方案中，用于肠胃外给药的配方剂包含适合的稳定剂或增溶剂，该增溶剂使包含HC-HA/PTX3复合物的制剂的溶解度增大而允许配制高度浓缩的溶液剂。
在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂作为水包油微乳剂进行给药，其中活性成分溶解在油相中。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂溶解在脂肪油(例如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酸酯，或者脂质体中。在一些实施方案中，包含本文公开的HC-HA/PTX3复合物的制剂溶解在黄豆油和/或卵磷脂的混合物中。在一些实施方案中，将油溶液引入水和甘油混合物中并且处理而形成微乳剂。
在一些实施方案中，配制用于肠胃外给药的组合物作为单次推注进行给药。在一些实施方案中，配制用于肠胃外给药的组合物经由连续静脉内递送装置(例如DeltecCADD-PLUSTM型号5400静脉内泵)进行给药。
在一些实施方案中，用于注射的配方剂以单位剂型存在，例如在安瓿中或在多剂量容器中，添加有防腐剂。在一些实施方案中，用于注射的配方剂以粉末形式或者冷冻干燥(冻干)的状况储存，仅需要在使用之前即刻添加无菌的液体载剂，例如，盐水或无菌的无热原的水。
在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制用于局部给药。局部配方剂包括但不限于，软膏剂、乳膏、洗剂、溶液剂、糊剂、凝胶、薄膜、药棒(stick)、脂质体、纳米颗粒。在一些实施方案中，局部配方剂通过使用贴片、绷带或创伤敷料进行给药。
在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂被配制为固体、交联凝胶或脂质体形式的组合物。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制为不溶性交联水凝胶。
在一些实施方案中，局部配方剂包含胶凝剂(或增稠剂)。适合的胶凝剂包括但不限于：纤维素、纤维素衍生物、纤维素醚(例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素)、瓜尔胶、黄原胶、刺槐豆胶、海藻酸盐(例如褐藻酸)、硅酸盐、淀粉、黄芪胶、羧基乙烯基聚合物、卡拉胶、石蜡、凡士林、阿拉伯树胶(阿拉伯树胶)、琼脂、硅酸镁铝、海藻酸钠、硬脂酸钠、墨角藻、皂土、卡波姆、卡拉胶、聚羧乙烯、黄原胶、纤维素、微晶纤维素(MCC)、长角豆属、陨石球粒、右旋糖、红藻胶、明胶、茄替胶(ghatti gum)、瓜尔胶、锂蒙脱石、乳糖、蔗糖、麦芽糖糊精、甘露醇、山梨醇、蜂蜜、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、刺梧桐树胶、聚乙二醇(例如PEG200-4500)、黄蓍胶、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、氧化聚明胶、果胶、聚明胶肽、聚维酮、碳酸丙烯酯、甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物(PVM/MA)、聚(甲基丙烯酸甲氧基乙基酯)、聚(甲基丙烯酸甲氧基乙氧基乙基酯)、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(CMC)、二氧化硅、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP:聚维酮)，或其组合。
在一些实施方案中，本文公开的局部配方剂包含润肤剂。润肤剂包括但不限于：蓖麻油酯、可可脂酯、红花油酯、棉花籽油酯、玉米油酯、橄榄油酯、鱼肝油酯、杏仁油酯、鳄梨油酯、棕榈油酯、芝麻油酯、角鲨烯酯、kikui油酯、大豆油酯、乙酰化甘油单酸酯、乙氧基甘油单硬脂酸酯、月桂酸己酯、月桂酸异己酯、棕榈酸异己酯、棕榈酸异丙酯、棕榈酸甲酯、油酸癸酯、油酸异癸酯、硬脂酸十六基酯、硬脂酸癸酯、异硬脂酸异丙酯、异硬脂酸甲酯、己二酸二异丙酯、己二酸二异己酯、己二酸二己基癸基酯、癸二酸二异丙酯、乳酸月桂酯、乳酸十四烷酯、乳酸十六烷酯、肉豆酸油酯、硬脂酸油酯和油酸油酯、壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、异硬脂酸、羟基硬脂酸、油酸、亚油酸、蓖麻油酸、花生酸、山嵛酸、芥酸、月桂醇、十四烷醇、鲸蜡醇、十六烷醇、硬脂醇、异硬脂醇、羟基硬脂醇、油醇、蓖麻油醇、山嵛醇、芥醇、2-辛基十二烷基醇、羊毛脂和羊毛脂衍生物、蜂蜡、鲸脑、肉豆蔻酰肉豆蔻酸酯、硬脂酰硬脂酸酯、巴西棕榈蜡、烛树蜡、卵磷脂和胆固醇。
在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制有一种或更多种天然聚合物。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制有天然聚合物，该天然聚合物是纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、玻尿酸、硫酸肝素、硫酸软骨素。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制有聚合物凝胶，该聚合物凝胶由天然聚合物配制。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制有聚合物凝胶，该聚合物凝胶由天然聚合物配制，该天然聚合物例如但不限于：纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、玻尿酸、硫酸肝素、硫酸软骨素及其组合。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制有交联的聚合物。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制有非交联的聚合物。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制有非交联的聚合物和交联的聚合物。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制有交联的透明质酸凝胶。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制有不溶性交联的HA水凝胶。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制有非交联的透明质酸凝胶。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制有胶原蛋白基质。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制有纤维蛋白基质。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制有纤维蛋白/胶原蛋白基质。
在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制用于向眼或其相关组织给药。适合于向眼给药的配方剂包括但不限于：溶液、悬浮液(例如水悬浮液)、软膏剂、凝胶、乳膏、脂质体、泡囊、药质体、纳米颗粒，或者其组合。在一些实施方案中，用于向眼局部给药的包含HC-HA/PTX3复合物的制剂通过喷施、洗涤或其组合进行给药。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂通过可注射的贮库制剂向眼进行给药。
本文中使用的“贮库制剂”是植入眼或其相关组织(例如巩膜)中的(例如皮下、肌肉内、玻璃体内，或者结膜内)控释的配方剂。在一些实施方案中，贮库制剂通过在生物可降解的聚合物中形成包含HC-HA/PTX3复合物的制剂的微囊化的基质(也称为微胶囊化的基质)进行配制。在一些实施方案中，贮库制剂通过将包含HC-HA/PTX3复合物的制剂包埋在脂质体或微乳剂中进行配制。
用于向眼给药的配方剂具有眼科上可接受的渗透性。在某些实例中，泪液具有与0.9％氯化钠溶液相等的等渗值。在一些实施方案中，约0.6％至约1.8％氯化钠等效的等渗值适合于向眼局部给药。在一些实施方案中，本文公开的向眼给药的配方剂具有约200至约600mOsm/L的渗量。在一些实施方案中，本文公开的向眼给药的配方剂是低渗的，因此需要添加任何适合的物质以达到适当的渗透性范围。眼科上可接受的调节渗透性的物质包括但不限于：氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
用于向眼给药的配方剂具有眼科上可接受的澄清度。眼科上可接受的澄清化剂的实例包括但不限于聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80，或者其组合。
在一些实施方案中，用于向眼给药的配方剂包含眼科上可接受的粘度增强剂。在一些实施方案中，粘度增强剂增加本文公开的配方剂保留在眼中的时间。在一些实施方案中，增加本文公开的配方剂保留在眼中的时间允许更大的药物吸收和效果。粘膜粘附性聚合物的非限制性实例包括羧甲基纤维素、卡波姆(丙烯酸聚合物)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯酰胺、聚卡波非、丙烯酸/丙烯酸丁酯共聚物、海藻酸钠和葡聚糖。
在一些实施方案中，用于向眼给药的配方剂被给药或递送到眼的后段(例如视网膜、脉络膜、玻璃质和视神经)。在一些实施方案中，本文公开的用于向眼给药的局部配方剂为了递送到眼的后部而包含增溶剂，例如硫酸葡聚糖和/或环糊精。用于一些实施方案中的硫酸葡聚糖包括但不限于：硫酸葡聚糖、硫酸环糊精和β-1,3-硫酸葡聚糖、其天然的和衍生物，或者任何化合物，该化合物暂时地结合到并被保留在包含成纤维细胞生长因子(FGF)的组织，改善药物的稳定性和/或溶解性，和/或改善本文公开的用于向眼给药的配方剂的穿透性和眼部吸收。用于一些实施方案中作为增溶剂的环糊精衍生物包括但不限于：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟乙基β-环糊精、羟丙基γ-环糊精、羟丙基β-环糊精、硫酸α-环糊精、硫酸β-环糊精、磺基丁基醚β-环糊精。
在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制用于直肠或阴道给药。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂作为栓剂进行给药。在一些实施方案中，适合于直肠给药的组合物通过将包含HC-HA/PTX3复合物的制剂与适合的非刺激性赋形剂混合进行配制，该非刺激性赋形剂在常温下是固体但在直肠温度下是液体，因此将在直肠中熔化而释放药物。在一些实施方案中，适合于直肠给药的组合物通过将包含HC-HA/PTX3复合物的制剂与以下赋形剂混合进行配制：可可油、甘油明胶、氢化植物油、各种分子量的聚乙二醇或聚乙二醇的脂肪酸酯的混合物。
在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂配制用于吸入。在一些实施方案中，所述制剂在喷雾器、加压的计量剂量吸入器(pMDI)，或者干粉吸入器(DPI)中。
在某些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂任选地被包含在受控释放的颗粒、脂质复合物、脂质体、纳米颗粒、微球、微颗粒、纳米胶囊或者增强或促进向皮肤定位递送的其他物质内。用于药物制剂的常规的微囊化工艺的实例描述在美国专利号3,737,337中，为了这些公开内容而通过援引并入本文中。
剂量
药物组合物的给药量部分地取决于被治疗的个体。在向人类受试者给予药物组合物的情况中，每日剂量将通常取决于处方医师，剂量一般根据以下而改变：个体的年龄、性别、膳食、重量、总体健康和反应、个体的症状的严重性、正被治疗的确切疾病或病症、正被治疗的疾病或病症的严重性、给药时间、给药途径、组合物的分配、排出速度、药物联用，以及处方医师的判断。
在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂的剂量为约0.001至约1000mg/kg体重/天。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂的量范围在约0.5至约50mg/kg/天。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量为约0.001至约7g/天。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂的量为约0.01至约7g/天。在一些实施方案中，本文公开的包含HC-HA/PTX3复合物的制剂的量为约0.02至约5g/天。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂的量为约0.05至约2.5g/天。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂的量为约0.1至约1g/天。
在一些实施方案中，在组织中不需要的变化发生之前、期间或之后给予包含HC-HA/PTX3复合物的制剂。在一些实施方案中，在组织中不需要的变化发生之前、期间或之后施用联合治疗。在一些实施方案中，在疾病或病症发生之前、期间或之后与联合治疗一起给予包含HC-HA/PTX3复合物的制剂。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3的组合物的给药时间改变。因此，在一些实例中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂用作预防，并且向倾向于在组织中发生不需要的变化的受试者连续地给药以防止组织中不需要的变化的发生。在一些实施方案中，在不需要的变化开始期间或之后尽可能快地向受试者给予包含HC-HA/PTX3复合物的制剂。在一些实施方案中，在不需要的变化开始的最初48小时内，优选地在症状开始的最初48小时内，更优选地在症状开始的最初6小时内，最优选地在症状开始的3小时内，开始给予包含HC-HA/PTX3复合物的制剂。在一些实施方案中，初始给药是经由任何可行的途径，例如，静脉注射、推注、在5分钟至约5小时期间输注、丸剂、胶囊、透皮贴片、经颊递送，或者其组合。优选地，在检测到或者怀疑不需要的变化开始之后尽快地给予包含HC-HA/PTX3复合物的制剂，并且持续治疗所需的时长，例如，约1个月至约3个月。在一些实施方案中，治疗时长因每个受试者而异，并且时长是利用已知的标准进行确定。在一些实施方案中，在至少2周，优选约1个月至约5年，更优选约1个月至约3年期间，给予包含HC-HA/PTX3复合物的制剂或包含复合物的配方剂。
在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂每天一次以单剂量进行给药。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂每天多于一次以多剂量进行给药。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂每天两次进行给药。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂每天三次进行给药。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物每天四次进行给药。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂每天多于四次进行给药。
在一些实施方案中，给予包含HC-HA/PTX3复合物的制剂以进行预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，在一些实施方案中，向由于组织具有不需要的变化而已患有疾病或病症的个体以足以治愈或至少部分地阻止不需要的变化的量给予包含HC-HA/PTX3复合物的制剂。对于此用途有效的量将取决于因疾病或病症所致的不需要的变化的严重性和过程、先前的治疗、个体的健康状态、重量以及对药物的反应，以及治疗医师的判断。
在预防性应用中，在一些实施方案中，向有特定病症风险的个体给予包含HC-HA/PTX3复合物的制剂，该病症可能导致该个体的组织中具有不需要的变化。这种量被定义为“预防有效量或剂量”。在这种用途中，确切量也取决于个体的健康状态、重量，以及个体的其他身体参数。
在个体的状况没有改善的情况中，根据医生的判断，长期地给予包含HC-HA/PTX3复合物的制剂，即在延长的时间段期间，包括个体生命的整个持续时间，以便改善或以其他方式控制或限制个体的疾病或病症的症状。
在一些实施方案中，在个体的状态确实改善的情况中，根据医生的判断，连续地给予包含HC-HA/PTX3复合物的制剂，或者在特定的时长期间(即“药物假期”)被给予的药物剂量暂时减小或暂停。在一些实施方案中，药物假期的长度范围在2天至1年，仅示例性包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。在一些实施方案中，在药物假期期间剂量减少10％-100％，仅示例性包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，或者100％。
一旦个体的状况已发生改善，若需要，则以维持剂量进行给药。在一些实施方案中，然后，给予的剂量或频率或二者根据症状而减小至改善的状况得以保持的水平。在一些实施方案中，当不需要的变化有任何复发时，个体需要长期的间歇性治疗。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物是适合于单次给药精确剂量的单位剂型。在单位剂型中，配方剂被分成单位剂，其包含适当量的本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，单位剂型是包含离散量的配方剂的包装的形式。非限制性实例是包装的片剂或胶囊，以及小瓶或安瓿中的粉末。在一些实施方案中，水悬浮液组合物被包装在单剂量不可再封闭的容器中。在一些实施方案中，使用多剂量可再封闭的容器，其中典型地在组合物中包含防腐剂。在一些实施方案中，用于肠胃外注射的配方剂以单位剂量形式提供，包括但不限于安瓿，或者在添加有防腐剂的多剂量容器中。
包含HC-HA/PTX3复合物的制剂的适合的每日剂量为例如约0.01至2.5mg/kg体重。在较大的哺乳动物(包括但不限于人类)中，指示的每日剂量范围为约0.5mg至约100mg，方便地以分剂量进行给药，包括但不限于每天多达四次，或者以延长释放的形式。适合于口服给药的单位剂型包含约1至50mg活性成分。上述范围仅是建议性，因为关于个体治疗方案的变量数量大，并且从这些建议值显著的偏离并非不常见。在一些实施方案中，剂量根据多种变量而改变，不限于nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的活性、组织中不需要的变化的程度、给药模式、个体受试者的需求、不需要的变化的严重性，以及执业医师的判断。
在一些实施方案中，这种治疗方案的毒性和治疗效能在细胞培养物或实验动物中通过标准药学操作规程进行确定，包括但不限于，确定LD50(群体50％致死率的剂量)和ED50(50％群体治疗有效的剂量)。在一些实施方案中，毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且其被表述为LD50和ED50之比。表现出高治疗指数的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物是优选的。在一些实施方案中，从细胞培养物测定和动物研究获得的数据用于确定供人使用的剂量范围。包含HC-HA/PTX3复合物的制剂的剂量优选地在最低毒性时包括ED50的循环浓度范围内。在一些实施方案中，剂量在此范围内根据使用的剂型和采用的给药途径而变化。
在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂被包装为制品，其包括包装材料、有效预防和/或治疗疾病或病症的药物组合物，以及标签，该标签说明该药物组合物应用于将由于该疾病或病症而具有不需要的变化的组织中的成纤维细胞重编程。在一些实施方案中，药物组合物被包装成单位剂型，包含用于单剂量或多剂量的药物组合物量。在一些实施方案中，包装的组合物包含药物组合物的冻干粉末，其在给药之前(例如用水或盐水)进行重构。
医疗装置和生物材料组合物
在一些实施方案中，使包含HC-HA/PTX3复合物的制剂直接组装在可植入医疗装置的表面上，或者被配制为用于可植入医疗装置的涂料。用于使透明质酸共价附接到表面(例如但不限于金属表面、聚合物表面、陶瓷表面、二氧化硅表面和复合材料表面)的方法是本领域熟知的，并且在一些实施方案中，与本文提供的将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物组装在这种表面上的方法联合使用(参见，例如美国专利号5,356,433；5,336,518,4,613,665,4,810,784,5,037,677,8,093,365)。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物直接组装在可植入的医疗装置的表面或其部分上。在一些实施方案中，将根据本文提供的方法制得的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物纯化，并且随后直接附接在可植入的医疗装置的表面或其部分上。在一些实施方案中，将根据本文提供的方法制得的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物纯化，并且随后配制为涂料以附接到该医疗装置或其部分。在一些实施方案中，将该涂料直接施加于该表面，或者施加于经预处理或涂布的表面，其中所述预处理或涂布设计成促进该涂料粘附于基材。在一些实施方案中，将根据本文提供的方法制得的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物纯化，并且随后附接到医疗装置或其部分，该医疗装置已经涂有促进nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的附接的物质。例如，在一些实施方案中，该医疗装置或其部分涂有粘附性聚合物，该粘附性聚合物在其表面上提供官能团以便与nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的透明质酸共价附接。在一些实施方案中，偶联剂，例如，但不限于碳二亚胺，用于将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附接到聚合物涂料。在一些实施方案中，光固定化用于将根据本文提供的方法制得的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物共价地附接到该医疗装置或其部分。在一些实施方案中，通过利用包含光化学或热化学反应性基团的间隔分子而将根据本文提供的方法制得的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附接到所述医疗装置或其部分。
在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的涂料配方剂通过例如浸涂而施加到基材。其他施加方法包括但不限于喷涂、洗涤、蒸气沉积、刷涂、辊涂、幕帘式涂布、旋涂及本领域已知的其他方法。
示例性可移植的医疗装置包括但不限于：人工关节、矫形装置、骨植入物、隐形眼镜、缝合线、手术吻合器、手术夹具、导管、血管成形术球囊、传感器、手术器械、电极、针、注射器、创伤引流、分流器、尿道插件、金属或塑料植入物、心脏瓣膜、人工器官、叠缝托圈、瓣膜成形术环、导丝、K-丝或Denham钉、支架、支架移植物、血管移植物、起搏器、丸剂、薄镜片、医用管线、输液套管、可植入式除颤器、神经刺激器、葡萄糖传感器、脑脊髓液分流器、可植入式药物泵、脊柱笼、人工椎间盘、眼部植入物、耳蜗植入物、乳房植入物、髓核置换装置、耳管、人工晶状体、药物递送系统、微颗粒、纳米颗粒和微胶囊。
在具体的实施方案中，可植入式医疗装置是包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的植入物或假体。在具体的实施方案中，该假体是人工关节。在一些实施方案中，该假体是人工髋关节、人工膝部、人工盂肱关节、人工踝。
在具体的实施方案中，该植入物是支架。在具体的实施方案中，该植入物是冠状动脉支架、输尿管支架、尿道支架、前列腺支架、骨支架，或者食管支架。在具体的实施方案中，植入物是冠状动脉支架。在具体的实施方案中，植入物是骨植入物，例如，但不限于，骨内整合性植入物或颅面假体(例如人工耳、眶假体、鼻假体)。
在一些实施方案中，将包含HC-HA/PTX3复合物的制剂直接组装在微颗粒或纳米颗粒上以便将HC-HA/PTX3复合物(例如nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3)递送到受试者(参见，例如WO03/015755和US2004/0241248)。
在一些实施方案中，将包含本文提供的HC-HA/PTX3复合物的制剂附接到、组装在或者作为涂料提供在本文所述的或本领域已知的任何这种可植入式医疗装置的表面或其部分上。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂在植入之后从涂料洗脱并且进入周围组织中。
在一些实施方案中，将包含HC-HA/PTX3复合物的制剂直接组装在用于递送生物材料(例如干细胞或产生胰岛素的细胞)的支架、微颗粒、微胶囊或微载体上。在一些实施方案中，将包含HC-HA/PTX3复合物的制剂附接到微胶囊或者直接组装在微胶囊上。在一些实施方案中，将包含HC-HA/PTX3复合物的制剂与用于形成微胶囊的材料组合，并且产生包括包含HC-HA/PTX3复合物的制剂的微胶囊。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂用于涂布微胶囊的内表面。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂用于涂布微胶囊的外表面。在一些实施方案中，包含HC-HA/PTX3复合物的制剂用于涂布微胶囊的内表面和外表面。
用于微胶囊化细胞的示例性材料包括但不限于：热固性水凝胶例如琼脂糖、藻酸盐，以及人工聚合物例如聚(NiPAAm-co-AAC)、聚(乙二醇)(PEG)和PEG衍生物例如PEG二丙烯酸酯和低聚(聚(乙二醇))富马酸酯。用于培养和微囊化干细胞的方法是本领域中已知的，在一些实施方案中，用于产生包括包含本文提供的HC-HA/PTX3复合物的制剂的微胶囊。
在一些实施方案中，微胶囊包含细胞、多个细胞或其他生物材料。在一些实施方案中，所述细胞或多个细胞是干细胞，例如，但不限于间充质干细胞。在一些实施方案中，所述细胞或多个细胞是分化细胞，例如，但不限于产生胰岛素的细胞。在一些实施方案中，所述细胞或多个细胞是自体细胞(即来自或衍生自细胞的接受者的细胞)。在一些实施方案中，细胞或多个细胞是同种异体细胞(即不是来自或衍生自细胞的接受者的细胞)。在一些实施方案中，微胶囊包含细胞、多个细胞或其他生物材料，并且微胶囊的内表面涂有包含本文提供的HC-HA/PTX3复合物的制剂。在一些实施方案中，微胶囊包含细胞、多个细胞或其他生物材料，并且微胶囊的外表面涂有包含本文提供的HC-HA/PTX3复合物的制剂。在一些实施方案中，微胶囊包含细胞、多个细胞或其他生物材料，并且微胶囊的内表面和外表面涂有包含本文提供的HC-HA/PTX3复合物的制剂。在一些实施方案中，将给予微胶囊以便使由于疾病或病症而具有不需要的变化的组织中的成纤维细胞重编程。针对其可以给予微胶囊的示例性疾病和病症和治疗方法在本文其他部分中描述，并且包括但不限于炎症和免疫相关的疾病。
使用方法
在某些实施方案中，本文中提供了HC-HA/PTX3(包括包含HC-HA/PTX3的制剂或组合物)将细胞的细胞表型重编程为不同细胞表型的用途。这种重编程用于本文提供的方法中，例如，使组织(例如受损组织或疤痕组织，或者感染疾病例如退化性疾病的组织)的患病或受损状态逆转的方法；将组织中的分化细胞重编程为祖细胞的方法，由此使所述组织恢复活力；将组织中的细胞的第一表型重编程为祖细胞并且使所述祖细胞分化为第二表型的方法，由此使所述组织再生。本文中还提供了HC-HA/PTX3(包括包含HC-HA/PTX3的制剂或组合物)在具有治疗性细胞的组合物中的用途。
在一些实施方案中，本文中公开了使组织中的疾病状态逆转的方法，包括使所述组织与HC-HA/PTX3或包含HC-HA/PTX3的药物组合物接触足以使所述组织中的患病细胞或不需要的细胞重编程为具有不同表型的细胞的时间，由此逆转所述组织的所述疾病状态。在一些实施方案中，具有不同表型的细胞是祖细胞。在一些实施方案中，具有不同表型的细胞是细胞分化途径中的早期细胞。
在一些实施方案中，本文中公开了将细胞分化途径中的细胞逆转为细胞分化途径中的早期细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与HC-HA/PTX3或包含HC-HA/PTX3的药物组合物接触，其中该接触发生足以使所述细胞逆转为早期细胞的时间。
在一些实施方案中，本文中还公开了治疗有需要的受试者中以不需要的成纤维细胞分化为特征的病症的方法，所述方法包括使所述受试者中感染所述病症的组织内的成纤维细胞与HC-HA/PTX3或包含HC-HA/PTX3的药物组合物接触足以使所述成纤维细胞的表型逆转为细胞分化途径中的早期细胞的时间段，由此治疗所述病症。在一些实施方案中，所述病症发生是由于烧灼、撕裂、缺血性组织、创伤、伤害、溃疡、辐射、化疗或手术切口。在一些实施方案中，所述病症是心肌梗死。
在一些实施方案中，所述接触在所述细胞或包含所述细胞的组织的伤害之后的时间段内。在一些实施方案中，在所述细胞或组织的伤害之后，该时间段小于1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周或4周。在一些实施方案中，所述接触发生在手术操作期间。在一些实施方案中，所述手术操作包括安置支架。
在一些实例中，所述组织不是疤痕组织。在一些实例中，所述组织是疤痕组织。
在一些实例中，不需要的成纤维细胞包括由于退化性疾病、老化、伤疤、创伤、烧灼、手术切口、撕裂、溃疡、伤害或者缺血而产生的成纤维细胞。在一些实施方案中，不需要的成纤维细胞是已经分化为以退化性疾病、老化、伤疤、创伤、烧灼、手术切口、撕裂、溃疡、伤害或者缺血为特征的细胞类型的成纤维细胞，其中所述分化在没有退化性疾病、老化、伤疤、创伤、烧灼、手术切口、撕裂、溃疡、伤害或者缺血的情况下没有发生。例如，在一些实施方案中，不需要的成纤维细胞是肌成纤维细胞。在一些实例中，不需要的成纤维细胞包括由于退化性疾病、老化、伤疤、创伤、烧灼、手术切口、撕裂、溃疡、伤害或者缺血而产生的成纤维细胞和肌成纤维细胞。在一些实施方案中，所述成纤维细胞是真皮成纤维细胞。在一些实施方案中，所述成纤维细胞是角膜成纤维细胞。在一些实施方案中，所述成纤维细胞是心脏成纤维细胞。在一些实施方案中，所述成纤维细胞是肌成纤维细胞。在一些实例中，所述成纤维细胞不是从羊膜基质细胞分化的肌成纤维细胞。
在一些实例中，所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实例中，所述制剂是胎儿支持组织提取物。在一些实例中，所述制剂是胎儿支持组织匀浆。在一些实例中，所述制剂是胎儿支持组织粉末。在一些实例中，所述制剂是分碎的胎儿支持组织。在一些实例中，所述制剂是粉碎的胎儿支持组织。在一些实例中，所述制剂是磨碎的胎儿支持组织。在一些实例中，所述制剂是胎儿支持组织移植物。在一些实例中，所述制剂是纯化的HC-HA/PTX3。在一些实例中，所述制剂是重构的HC-HA/PTX3。
在一些实例中，所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。在一些实例中，胎儿支持组织来自胎盘。在一些实例中，胎儿支持组织来自胎盘羊膜。在一些实例中，胎儿支持组织来自脐带。在一些实例中，胎儿支持组织来自脐带羊膜。在一些实例中，胎儿支持组织来自绒毛膜。在一些实例中，胎儿支持组织来自羊膜-绒毛膜。在一些实例中，胎儿支持组织来自羊膜基质。在一些实例中，胎儿支持组织来自羊膜胶质。
在一些实例中，所述胎儿支持组织被冷冻或预先冷冻。在一些实例中，所述胎儿支持组织基本上没有红细胞。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含基本上没有静脉或动脉的脐带。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。在一些实例中，胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。在一些实例中，胎儿支持组织被低温保存。在一些实例中，胎儿支持组织被冻干。在一些实例中，胎儿支持组织被灭菌。
在一些实例中，所述组合物是凝胶、溶液或者悬浮液。在一些实例中，所述组合物是凝胶。在一些实例中，所述组合物是溶液。在一些实例中，所述组合物是悬浮液。
在一些实例中，所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实例中，所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3。在一些实例中，所述HC-HA/PTX3是重构的HC-HA/PTX3
在一些实例中，具有不需要的变化的组织是眼组织、心脏组织、皮肤组织、关节组织、脊椎组织、软组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、韧带组织、神经组织、肌肉组织、椎间盘组织、脊髓组织或者脑组织。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是眼组织。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是心脏组织。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是皮肤组织。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是关节组织。在一些实例中，具有不需要的变化的组织来自脊椎。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是软组织。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是软骨。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是骨。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是肌腱。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是韧带。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是神经。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是肌肉组织。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是椎间盘。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是脊髓。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是脑。在一些实例中，所述组织包括退化组织、烧灼、撕裂、缺血性组织、创伤、伤害、溃疡或手术切口。在一些实例中，所述组织包括退化组织。在一些实例中，所述组织包括烧灼。在一些实例中，所述组织包括撕裂。在一些实例中，所述组织包括缺血性组织。在一些实例中，所述组织包括创伤。在一些实例中，所述组织包括伤害。在一些实例中，所述组织包括溃疡。在一些实例中，所述组织包括手术切口。在一些实例中，所述伤害是心肌梗死。
在一些实例中，所述祖细胞是神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞，或者心血管祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是神经嵴祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是造血祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是乳腺祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是肠祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是间充质祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是内皮祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是神经祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是嗅觉祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是睾丸祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是心血管祖细胞。在一些实施方案中，所述接触发生在体内。
在一些实例中，所述方法进一步包括使所述成纤维细胞与TGFβ1接触。在一些实施方案中，执行本文中所述的方法需要另外地给予TGFβ1。在一些实施方案中，执行本文中所述的方法不需要另外地给予TGFβ1。在一些实施方案中，所述细胞与包含HC-HA/PTX3和TGFβ1的制剂同时接触。在一些实施方案中，细胞依次地首先与包含HC-HA/PTX3的制剂接触，然后与TGFβ1接触。在一些实施方案中，细胞依次地首先与TGFβ1接触，然后与包含HC-HA/PTX3的制剂接触。在一些实施方案中，将TGFβ1以治疗有效量进行给药。在一些实施方案中，TGFβ1的治疗有效量是足以使包含HC-HA/PTX3的制剂能够执行本文中所述的方法的TGFβ1量。
在一些实施方案中，本文中还公开了从分化细胞产生祖细胞的方法，包括使所述分化细胞与HC-HA/PTX3接触足以使所述分化细胞重编程为祖细胞表型的时间。在一些实施方案中，所述祖细胞是神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞或心血管祖细胞。在一些实施方案中，分化细胞是角膜缘龛细胞、内皮细胞、角膜细胞、成纤维细胞或者肌成纤维细胞。
在一些实施方案中，本文中还公开了在体外产生祖细胞的方法，包括：使成纤维细胞的培养物与组合物接触足以使所述成纤维细胞重编程为祖细胞的时间，所述组合物包含：(a)包含HC-HA/PTX3的制剂；以及(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或者载剂。在一些实例中，所述制剂是胎儿支持组织的无细胞提取物、细胞培养基质、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实例中，所述制剂是胎儿支持组织的无细胞提取物。在一些实例中，所述制剂是细胞培养基质。在一些实例中，所述制剂是纯化的HC-HA/PTX3。在一些实例中，所述制剂是重构的HC-HA/PTX3。
在一些实例中，所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。在一些实例中，胎儿支持组织是胎盘。在一些实例中，胎儿支持组织是胎盘羊膜。在一些实例中，胎儿支持组织是脐带。在一些实例中，胎儿支持组织是脐带羊膜。在一些实例中，胎儿支持组织是绒毛膜。在一些实例中，胎儿支持组织是羊膜-绒毛膜。在一些实例中，胎儿支持组织是羊膜基质。在一些实例中，胎儿支持组织是羊膜胶质。
在一些实例中，所述胎儿支持组织被冷冻或预先冷冻。在一些实例中，所述胎儿支持组织基本上没有红细胞。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含基本上没有静脉或动脉的脐带。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。在一些实例中，所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。在一些实例中，胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。在一些实例中，胎儿支持组织被低温保存。在一些实例中，胎儿支持组织被冻干。在一些实例中，胎儿支持组织被灭菌。
在一些实例中，所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实例中，所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3。在一些实例中，所述HC-HA/PTX3是重构的HC-HA/PTX3。
在一些实例中，所述成纤维细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞，或者心脏成纤维细胞。在一些实例中，所述成纤维细胞是成纤维细胞。在一些实例中，所述成纤维细胞是肌成纤维细胞。在一些实例中，所述成纤维细胞是真皮成纤维细胞。在一些实例中，所述成纤维细胞是角膜成纤维细胞。在一些实例中，所述成纤维细胞是心脏成纤维细胞。在一些实例中，所述成纤维细胞是人角膜成纤维细胞。
在一些实例中，所述祖细胞是神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞，或者心血管祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是神经嵴祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是造血祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是乳腺祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是肠祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是间充质祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是内皮祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是神经祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是嗅觉祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是睾丸祖细胞。在一些实例中，所述祖细胞是心血管祖细胞。
在一些实例中，所述方法进一步包括使所述成纤维细胞与TGFβ1接触。在一些实施方案中，执行本文中所述的方法需要附加地与TGFβ1接触。在一些实施方案中，执行本文中所述的方法不需要附加地与TGFβ1接触。在一些实施方案中，所述细胞与包含HC-HA/PTX3和TGFβ1的制剂同时接触。在一些实施方案中，细胞依次地首先与包含HC-HA/PTX3的制剂接触，然后与TGFβ1接触。在一些实施方案中，细胞依次地首先与TGFβ1接触，然后与包含HC-HA/PTX3的制剂接触。
实施例
实施例1:通过HC-HA/PTX3与TGFβ1使人角膜成纤维细胞(HCF)
重编程为神经嵴祖细胞
材料和方法
HCF分离和培养
来自年龄18-76岁的个体并且在死亡后在4℃在Optisol(Chiron Vision,Irvine,CA)中保存小于7天的总计89个人角膜从Florida Lions Eye Bank(Miami,FL)获得并且根据赫尔辛基宣言进行操作。将HCF分离并且培养。将上皮和内皮细胞从角膜除去，将基质切成约1mm3的立方块，在2mg/ml胶原蛋白酶中在37℃孵育16h，然后置于培养基中，该培养基由补充有10％胎牛血清(包含50mg/ml庆大霉素和1.25mg/ml两性霉素B)的杜比柯改良的Eagle培养基(DMEM)组成。将培养基每周改变两次。细胞的形态学通过Nikon Eclipse TS100显微镜(Melville,NY)进行监测。将培养到3代(P3)的细胞用于所有实验。
对TGFβ1的处理
将人角膜成纤维细胞(P3)在塑料上在有或无固定化的HC-HA/PTX3复合物的情况下在DMEM+10％FBS中接种72h，然后血清饥饿24h，并且在有或无TGFβ1的情况下处理24h，然后采集用于mRNA量化或免疫染色。为了确定TGFβ受体或p75NTR的蛋白，因为蛋白表达滞后于mRNA表达，将细胞在有或无TGF-β1的情况下处理48h，然后收集蛋白样品。对于TGF-β1ELISA，将细胞在有或无TGF-β1的情况下处理24h，然后在新鲜培养基中再培养另外24h。将上清液收集用于TGFβ1ELISA。对于TGFβ2和TGFβ3ELISA，将细胞在有或无TGFβ1的情况下处理48h。将特定的HCF在玻璃上在DMEM+10％FBS中接种24h，然后在DMEM+ITS(胰岛素-运铁蛋白-硒)中接种24h，在有/无PBS或玻尿酸(HA)或HC-HA/PTX3±TGFβ1(10ng/ml)±马立马司他(10μM)或±DAPT(10μM)或±二者的情况下处理0、5、15、30和45分钟，然后采集用于对CD44-ICD、JNK1、周期蛋白D1和p75NTR进行免疫染色，以及处理5分钟然后采集用于在细胞组分的分隔分离之后对细胞质和核CD44-ICD、活性MT1-MMP和活性γ-分泌酶执行蛋白质印迹法。
使HCF逆转为NC样细胞并使NC分化为内皮样细胞
为了使HCF重编程为NC样细胞，将HCF在HC-HA/PTX3复合物上在无血清-DMEM-ITS中在有或无TGFβ1激发的情况下培养48h以诱导神经嵴样细胞。将神经嵴样细胞在低钙DMEM和10％FBS中进一步培养3周以诱导HCEC。
RNA提取、反转录和实时PCR
将总RNA利用RNeasy微型试剂盒进行提取并且利用高容量反转录试剂盒(AppliedBiosystems)进行反转录。将获得的cDNA通过实时RT-PCR利用特异性引物-探针混合物和DNA聚合酶在7000实时PCR系统(Thermo-Fisher Scientific,Carlsbad,CA)中进行扩增。实时RT-PCR谱由在95℃下初始激活10分钟，而后在95℃下15秒变性以及在60℃下1min退火和1min延伸的40次循环组成。每个PCR产物的真正身份通过利用2％琼脂糖凝胶进行尺寸测定而后根据EC3成像系统(BioImaging System,Upland,CA)溴化乙锭染色以及PCR标志进行确认。
ELISA
TGFβ的Quantikine人ELISA试剂盒用于根据生产商(R和D Systems,Minneapolis,MN)的说明书测定TGFβ。
免疫染色
将HCF、诱导的人角膜内皮细胞(HCEC)和HCEC单层培养物风干，并且在4％甲醛pH7.0中在室温下固定15min，在PBS中再水化，与0.2％Triton X-100一起孵育15min，用PBS冲洗三次，每次各5min。在与2％BSA一起孵育30min以阻止非特异性染色之后，将它们与期望的第一抗体(都以1:50稀释)在4℃一起孵育16h。在用PBS洗涤三次之后，将它们与对应的Alexa-Fluor-缀合的二级IgG(都以1:100稀释)一起孵育60min。然后将样品用Hoechst33342进行对比染色并且用Zeiss LSM 700共聚焦显微镜(Thornhood,NY)进行分析。对应的小鼠和兔血清分别用作初级单克隆抗体和多克隆抗体的阴性对照。
免疫沉淀
将天然CD44蛋白根据供应商的说明书通过免疫沉淀试剂盒(Abcam,ab206996)利用CD44抗体(Abcam,ab157107)进行免疫沉淀。
蛋白质印迹
将细胞裂解物在放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲剂或非变性裂解缓冲剂中进行制备，并且在4-15％(w/v)梯度丙烯酰胺凝胶上分离以进行蛋白质印迹。将蛋白提取物转移到硝酸纤维素膜，然后将其用5％(w/v)无脂奶在tris-缓冲的盐水(TBST,50mM Tris-HCl,pH7.5,150mM NaCl,0.05％(v/v)Tween-20)中进行封闭，然后依次与特异性初级抗体(对抗TGFβRI、TGFβRII、TGFβRIII、p75NTR、周期蛋白D1、CD44-ICD、活性MT1-MMP和活性γ-分泌酶)以及它们相应的二级抗体一起孵育，用β-肌动蛋白或α-微管蛋白作为负载对照。免疫反应性蛋白是利用Western Lighting化学发光进行检测。
统计分析
所有总结数据被报告为平均值±标准偏差，对每组进行计算，并且通过微软Excel(Microsoft,Redmont,WA)利用学生不成对t检验进行比较。检验结果报告为双尾P值，其中P<0.05被视为统计学上显著的。
结果
HC-HA/PTX3抑制典型的TBFβ信号传导和肌成纤维细胞分化
如同塑料对照，接种在固定化的HA上的第3代(P3)HCF是纺锤形。相比之下，固定化的HC-HA/PTX3上的细胞早在24h就发生聚集(图1A)。在通过变为DMEM+ITS而血清饥饿24h尽管添加TGFβ1另外进行72h之后，球形得以保持(图1A)。在没有TGFβ1的情况下培养时观察到相同的结果(未示出)。利用建立的培养物，在塑料和HA上接种的HCF中，在mRNA和蛋白二者水平，外源TGFβ1预期地上调TGFβ1，但TGFβ2并非如此(图1B)。这在HC-HA/PTX3上没有观察到。出人意料地，TGFβ3抗疤痕异构体，在mRNA和蛋白水平，在有或无TGFβ1的情况下，仅被HC-HA/PTX3上调。如预期，在塑料和HA上，外源TGFβ1导致pSMAD2/3的核易位以及α-SMA的阳性细胞质表达(图1C)。但是，它在接种于HC-HA/PTX3上的HCF中没有诱导这种变化(图1C)。
HC-HA/PTX3在没有TGF-β1的情况下促进了角蛋白聚糖的表达，但是在TGF-β1存在下促进p75NTR的表达和核易位，并且在有和无TGFβ1的情况下促进NC标志的表达
在没有TGFβ1的情况下，在HC-HA/PTX3上HCF独特地上调角蛋白聚糖的mRNA和蛋白(图2A)。相比之下，HA上调角蛋白聚糖的mRNA而非蛋白(图2A和2B)。在TGF-β1的存在下，对于HA和HC-HA/PTX3，前述上调均消失(图2B)。
在无TGFβ1的情况下，HA仅上调HNK1的表达(图2A)。相比之下，HC-HA/PTX3上调除了Sox9和MSX1之外所有NC标志的表达(图2A)。在有TGFβ1的情况下，在塑料上，p75NTR、Sox9和Snail的转录表达以及p75的蛋白表达被上调(图2A和2B)。在HA上，p75NTR、HNK1、Sox9、Snail和MSX1的mRNA表达，以及p75NTR的蛋白表达进一步上调而没有p75NTR核易位(图2A-2C)。相比之下，在HC-HA/PTX3上，p75NTR的蛋白以及所有NC标志进一步上调，伴随着p75NTR核易位(图2A-2C)。
诱导的NC祖细胞通过分化为角膜内皮细胞而被验证
相较于天然HCEC的表达，在HCF中，内皮标志Na-K-ATPase、CA2、COL4A4、PITX2、SLC4A4、LEF1、N-钙黏素、ZO-1的mRNA表达都显著较低，但是在HCF中，COL4A4、α-联蛋白、β-联蛋白和p120的表达相似(图3A，#p<0.05,n＝3)，而在神经嵴样细胞中，Na-K-ATPase、CA2、SLC4A4、N-钙黏素的表达较低，但是PITX2、p120SLC4A4、LEF1、N-钙黏素、ZO-1的表达相似，并且COL4A4、α-联蛋白、β-联蛋白、LEF1的表达较高(图3A)。此外，当与来自天然HCEC的那些比较时，诱导的HCEC表达是CA2、COL4A4、PITX2、α-联蛋白、β-联蛋白、LEF1、p120和ZO-1的相似水平，但是N-钙黏素的水平较低，Na-K-ATPase、SLC4A4的水平较高(图3A)。此外、相比于天然HCF成纤维细胞标志，波形蛋白和CD34的表达在HCF和诱导的NC细胞二者中显著增高但在诱导的HCEC中则非如此(图3B)。在重编程期间TGFβRII被周期蛋白D1独特地下调而抑制典型TGF信号传导
结果表明，在HC-HA/PTX3上，在TGFβ1激发之后，TGFβRII mRNA的表达降低至三分之一，而TGFβRII蛋白的表达降至几乎零(图4A和4B)。在添加TGFβ1之后，虽然TGFβRIIImRNA的表达降低至四分之一，但是TGFβRIII蛋白的表达未显著降低(图4A和4B)。因此，这种mRNA降低可能不显著地影响结果。结果还表明，由HC-HA/PTX3+TGFβ1协同促进的mRNA和蛋白的过度表达以及周期蛋白D1的核易位被周期蛋白D1 siRNA减弱(图4C-4F)。这种周期蛋白D1被周期蛋白D1 siRNA下调伴随着TGFβRII mRNA、蛋白的增高(图4D和图4F)。这些结果还表明，因为周期蛋白D1 siRNA将HC-HA/PTX3+TGFβ1对核pSMAD2/3的抑制逆转，所以周期蛋白D1 siRNA可能将对典型TGFβ信号传导的抑制逆转(图4C)。此外，周期蛋白D1 siRNA能够将HC-HA/PTX3对α-SMA形成的抑制逆转(图4C)。此外，由HC-HA/PTX3+TGFβ1诱导的p75NTR的核易位(图4C)、p75NTR mRNA和蛋白的过度表达(图4F和图4H)，以及其他NC标志的过度表达(图4H)，都受到周期蛋白D1 siRNA抑制。
由HC-HA/PTX3+TGFβ1依次激活fCD44-ICD-TAK1-JNK1-周期蛋白D1-p75NTR
这些结果表明，早在5min时，仅HC-HA/PTX3+TGFβ1促进CD44-ICD的核易位(图5A)。此外，HC-HA/PTX3+TGFβ1在10分钟时促进TAK1的核易位，并且早在15分钟时促进JNK1的核易位(图5A)。此外，这些结果表明，早在30分钟时，仅HC-HA/PTX3+TGFβ1显著地促进周期蛋白D1的核易位(图5A)。最后，这些结果表明，早在45分钟时，HC-HA/PTX3+TGFβ1促进p75NTR的核易位(图5A)。结果表明，CD44-ICD-TAK1-JNK1-周期蛋白D1-p75NTR被HC-HA/PTX3+TGFβ1依次激活。
马立马司他(广谱MMP抑制剂)，或者DAPT(特异性GSI[γ-分泌酶抑制剂(GSI)])，或者二者在5min时抑制CD44-ICD的核易位(图5A)。在马立马司他或DAPT或二者的此效果之后，在后续的时间点，TAK1、JNK1、周期蛋白D1和p75NTR的核易位也被抑制(图6A)。与免疫染色结果相符，根据蛋白质印迹，在5分钟时，HC-HA/PTX3+TGFβ1促进CD44-ICD的核易位(图6B)。根据蛋白质印迹，在5分钟时，马立马司他(广谱MMP抑制剂)，或者DAPT(特异性GSI[γ-分泌酶抑制剂(GSI)])，或者二者抑制CD44-ICD的核易位(图5B)。如结果所示，根据蛋白质印迹，HC-HA/PTX3+TGFβ1激活由它们各自的抑制剂抑制的MT1-MMP和γ-分泌酶。因为TAK1和JNK1受它们的siRNA抑制减弱它们因HC-HA/PTX3+TGFβ1而对NC标志的上调，所以诱导的NC潜力还与TAK1-JNK1信号传导的激活相关联(图5B)。
对MT1-MMP和γ-分泌酶的激活由MT1-MMP和γ-分泌酶与CD44的相互作用介导
免疫沉淀和蛋白质印迹结果表明，早在5分钟时，仅HC-HA/PTX3+TGFβ1促进CD44与MT1-MMP和γ-分泌酶的相互作用(图6A-6B)，表明对MT1-MMP和γ-分泌酶的激活由MT1-MMP和γ-分泌酶与CD44的相互作用介导。
讨论
HCF可以从尸体角膜基质在胶原蛋白酶消化并在塑料上在DMEM+10％FBS中培养至第3代(P3)之后获得。在塑料上在有或无固定化的HA的情况下接种的P3 HCF显示出正常的纺锤形(图1A)。但是，在相同的培养基中，早在24小时时，P3 HCF就在固定化的HC-HA/PTX3上形成聚集物(图1A)，表明细胞形状从纺锤形变为小圆形。在通过变为DMEM+ITS而血清饥饿24h在有或无添加TGFβ1的情况下另外进行72h之后，球形得以保持(图1A)。总体而言，结果表明，由于形状变化，甚至在TGFβ1激发下，那些细胞可能在HC-HA/PTX3上将它们的表型变为更年轻细胞的表型。结果类似于先前报告的，例如，少部分牛角膜基质细胞表现出克隆生长，人角膜基质细胞可以在无附着培养基中作为“中性球"克隆地扩增，并且这种"角膜基质干细胞"表现出间充质干细胞(MSC)的性质，包括克隆生长、多能分化，以及干细胞特异性标志的阵列的表达。
利用上述建立的培养物，在没有TGFβ1的情况下，接种于HC-HA/PTX3上的HCF，除了上调TGFβ3之外，关于TGFβ信号传导没有表现出变化(图1B)。在塑料和HA两者上而不是在HC-HA/PTX3上接种的HCF中，外源TGFβ1预期地上调TGFβ1，但不上调TGFβ2，并且出人意料地，TGFβ3(抗疤痕同种型)在有或无TGFβ1的情况下仅被HC-HA/PTX3上调(图1B)。此外，在HC-HA/PTX3上，在TGFβ1激发之后，TGFβRII的表达降至几乎零，可能导致抑制核pSMAD2/3和α-SMA的细胞质表达(图1C)。总体而言，这些结果表明，HC-HA/PTX3下调典型TGFβ信号传导并且防止肌成纤维细胞分化(正常地由外源TGFβ1触发)。结果支持以下观点：(a)在AM基质表面上培养的HCF和人角膜和结膜成纤维细胞中TGFβ的表达和TGFβRII转录被下调，(b)在兔角膜中在体内，基质内植入人AM可能不引起肌成纤维细胞转化(以α-SMA表达为标志)，和(c)可溶性AM提取物诱导细胞聚集并且防止接种于AM基质上的肌成纤维细胞、人和小鼠角膜细胞表达α-SMA，其保持它们的正常表型而(即使暴露于血清或TGFβ1也)不引起pSMAD2/3的核易位。出人意料地，HC-HA/PTX3+TGFβ1促进JNK1过度表达和核易位，表明激活了非典型的TGFβ，即JNK1信号传导。
JNK1是TGFβ1基因表达的阻遏物，因为c-Jun NH2-末端激酶(JNK)已被证明涉及转化生长因子β(TGF-β)的功能。JNK1对TGFβ信号传导的此调节机制代表两个重要信号传导途径之间串话的出人意料的形式。这种串话以及对典型TGFβ信号传导的抑制可能对于某些生物功能例如重编程是重要的。此外，JNK是周期蛋白D1的上游调节物。c-JUN-N-末端激酶可以在肝脏再生期间驱使周期蛋白D1表达。在人胚胎肺成纤维细胞模型中，JNK1上调周期蛋白D1。在人肺成纤维细胞中，二氧化硅-诱导的快速循环是通过JNK/AP1/周期蛋白D1-CDK4-依赖性途径进行介导。在这种模型中，作者表明，显性阴性JNK可以降低处于G1-期的细胞百分比。重要地，周期蛋白D1启动子活性直接受控于c-Jun。因为已经表明，在HCF中典型TGFβ信号传导通过周期蛋白D1下调TGFβRII而被HC-HA/PTX3+TGFβ1抑制，并且这些初步数据还表明，JNK1的转录仅仅被HC-HA/PTX3+TGFβ1激活，而不被HC-HA/PTX3或TGFβ1任一者单独地激活，因此，推测是HC-HA/PTX3+TGFβ1而不是HC-HA/PTX3单独地激活JNK-cJUN-周期蛋白D信号传导，其导致抑制典型TGF-b信号传导。
令人关注地，在没有TGFβ1的情况下，HC-HA/PTX3促进NC标志例如p75NTR的过度表达，以及其他NC标志例如HNK1、KLF4、Snail1的过度表达(图2A)，整体地表明，在没有TGFβ1的情况下，接种于HC-HA/PTX3上的HCF已经被逆转为更年轻的基质细胞。相比之下，观察到在TGFβ1的存在下，在接种于HC-HA/PTX3上的HCF中，p75NTR的独有的mRNA上调和核易位，伴随着NC标志例如HNK1、Sox9、KLF4、Snail1和MSX1的过度表达(图2A)。这些结果表明，在TGFβ1的存在下，HC-HA/PTX3使HCF重编程为神经嵴祖细胞。
为了证明HCF的确重编程为神经嵴祖细胞，将所得的细胞在塑料上在有或无固定化的HA或HC-HA/PTX3在有TGFβ1的情况下接种48小时，在涂有胶原蛋白IV的塑料上以密度20,000个细胞/24-孔在DMEM+10％FBS中培养72小时，然后变为低葡萄糖DMEM+10％FBS培养3周。相比之下，在HC-HA/PTX3上的纺锤形细胞在3周培养之后转变成六边形单层(标记为iHCEC，i表示诱导的)并且表达一般存在于天然HCEC中的相似标志，例如Na-K-ATPase和ZO-1(图3A)。此外，这些结果表明，在HCF中，相比于天然HCEC的表达，内皮标志Na-K-ATPase、CA2、COL4A4、PITX2、SLC4A4、LEF1、N-钙黏素、ZO-1的mRNA表达都显著较低，但是在HCF中COL4A4、α-联蛋白、β-联蛋白和p120的表达是相似的，而Na-K-ATPase、CA2、SLC4A4、N-钙黏素的表达较低，但是PITX2、p120 SLC4A4、LEF1、N-钙黏素、ZO-1的表达是相似的，并且在神经嵴样细胞中COL4A4、α-联蛋白、β-联蛋白、LEF1的表达较高(图3A)。此外，当相比于来自天然HCEC的那些时，诱导的HCEC表达相似水平的CA2、COL4A4、PITX2、α-联蛋白、β-联蛋白、LEF1、p120和ZO-1，但是表达较低水平的N-钙黏素和较高水平的Na-K-ATPase、SLC4A4(图3A)。此外，相比于天然HCF成纤维细胞标志，波形蛋白和CD34的表达在HCF和NC细胞二者中都显著增高，但是在诱导的HCEC中并非如此(图3B)，表明，那些诱导的HCEC表现得像内皮细胞而不像成纤维细胞。
如所示，这些结果还已表明，在HC-HA/PTX3上在TGFβ1激发之后，TGFβRII蛋白的表达降低到几乎零，伴随着周期蛋白D1的mRNA、蛋白的过度表达以及核易位，这可以被周期蛋白D1 siRNA削弱(图4A-4F)，表明周期蛋白D在下调TGFβRII蛋白中起到重要作用。这种观点依据在于，周期蛋白D1 siRNA使周期蛋白D1下调伴随着HC-HA/PTX3+TGFβ1使TGFβRIImRNA、蛋白和核pSMAD2/3增高(图4A-4F)。此外，周期蛋白D1 siRNA还可以逆转HC-HA/PTX3对α-SMA形成的抑制(图4C)。此外，p75NTR的核易位、p75NTR mRNA和蛋白的过度表达，以及由HC-HA/PTX3+TGFβ1诱导的其他NC标志的过度表达，都被周期蛋白D1 siRNA抑制(图4G)，表明，周期蛋白D在由HC-HA/PTX3+TGFβ1使HCF重编程为它们的祖细胞状态中发挥关键作用。
这些结果表明，早在5分钟时，仅HC-HA/PTX3+TGFβ1促进CD44-ICD的核易位(图5A)，表明HC-HA/PTX3+TGFβ1通过它的核易位而激活CD44-ICD信号传导。对于这种激活而言，HC-HA/PTX3和TGFβ1二者都是需要的，并且此激活是即时和早期的反应。此外，HC-HA/PTX3+TGFβ1在10分钟时促进TAK1的核易位并且在15min时促进JNK1的核易位(图5A)，表明HC-HA/PTX3+TGFβ1激活TAK1-JNK1信号传导。此激活是早期反应，但是滞后于CD44-ICD，表明HC-HA/PTX3+TGFβ1依次地激活CD44-ICD和TAK1、JNK1，这种激活需要HC-HA/PTX3和TGFβ1二者。此外，这些结果表明，虽然HA+TGFβ1和HC-HA/PTX3单独地适度地增大周期蛋白D1的核易位，但是，仅仅HC-HA/PTX3+TGFβ1早在30min时显著地促进周期蛋白D1的核易位(图5)，表明HC-HA/PTX3+TGFβ1促进周期蛋白D1的核易位是更晚的事件，在CD44-ICD、TAK1和JNK1之后。结果表明，周期蛋白D1可能是CD44-ICD和/或TAK1和/或JNK1的下游靶。这种激活需要HC-HA/PTX3和TGFβ1二者。最后，结果表明HC-HA/PTX3+TGFβ1在45min时促进p75NTR的核易位，表明HC-HA/PTX3+TGFβ1促进p75NTR的核易位是更晚的事件，在CD44-ICD、TAK1、JNK1和周期蛋白D1之后。结果表明，75NTR可能是CD44-ICD或TAK1或JNK1或周期蛋白D1或它们的组合的下游靶。这种激活需要HC-HA/PTX3和TGFβ1二者。
马立马司他(广谱MMP抑制剂)，或者DAPT(特异性GSI[γ-分泌酶抑制剂(GSI)])，或者二者在5min时抑制CD44-ICD的核易位，表明在产生CD44-ICD中可能涉及由MT1-MMP和γ-分泌酶依次切割，并且马立马司他和DAPT可以用于在早期事件时抑制CD44-ICD的核易位(图5C)。在马立马司他或DAPT或二者的此效果之后，在较晚的时间点时也抑制JNK1、周期蛋白D1和p75NTR的核易位。问题是后续事件是独立地由于马立马司他和/或DAPT，还是由于阻抑CD44-ICD的核易位。
与免疫染色结果相符，蛋白质印迹结果表明，在5min时，HC-HA/PTX3+TGFβ1促进CD44-ICD的核易位(图5C)。马立马司他(广谱MMP抑制剂)或者DAPT(特异性GSI[γ-分泌酶抑制剂(GSI)])，或者二者在5min时抑制CD44-ICD的核易位(图5C)，表明在产生CD44-ICD中涉及由MT1-MMP和γ-分泌酶依次切割，并且马立马司他和DAPT可以用于在早期事件时抑制CD44-ICD的核易位。关于为何细胞质CD44-ICD在受马立马司他或DAPT或二者抑制之后仍然存在，合理地推断，由于CD44-ICD蛋白半衰期是8小时，所以大部分残余的细胞质CD44-ICD仍然存在。若抑制剂进行长时间预处理，细胞质CD44-ICD则将消失，于是将不能看出CD44-ICD核易位是被抑制剂抑制，还是由于没有细胞质CD44-ICD。如结果所示，HC-HA/PTX3+TGFβ1激活MT1-MMP和γ-分泌酶二者(图6A-6B)，其被它们相应的抑制剂抑制。这些结果表明，TGFβ1经由MT1-MMP而促进CD44的外切，从而允许由γ-分泌酶内切而在5min时促进CD44ICD的核易位。
总之，在TGFβ1存在下，HC-HA/PTX3通过抑制典型TGFβ信号传导、激活CD44-ICD-TAK1-JNK1-周期蛋白D信号传导而促进HCF重编程为神经嵴祖细胞。这种诱导的神经嵴祖细胞具有多谱系，例如，分化为角膜内皮样细胞。对于HC-HA/PTX3在临床应用中的前景，这些结果突显了HC-HA/PTX3用于重编程HCF及类似者的独特性。
实施例2:通过HC-HA/PTX3使人角膜成纤维细胞逆转为角膜细胞
材料和方法
材料
杜比柯改良的Eagle培养基(DMEM)、HEPES缓冲剂、Hank平衡盐溶液(HBSS)、磷酸盐缓冲的盐水(PBS)、庆大霉素、胎牛血清(FBS)和Alexa-Fluor-缀合的二级IgG购自Thermo-Fisher Scientific\(Carlsbad,CA)。胰岛素-运铁蛋白-亚硒酸钠培养基补充剂(ITS)从Roche Applied Science(Indianapolis,IN)获得。多聚甲醛、甲醇、Triton X-100、Hoechst33342染料、SB431542、AMD3100和单克隆抗体(抗β-肌动蛋白)购自Sigma-Aldrich(StLouis,MO)。单克隆抗体(抗CXCR4)和多克隆抗体(对抗角蛋白聚糖、SDF1、pSMAD2/3、pSMAD1/5和α-SMA)从Abcam(La Jolla,CA)获得。RNeasy微型试剂盒购自Qiagen(Valencia,CA)。
分离和培养HCF
来自年龄18-76岁的个体并且死亡后在4℃在Optisol(Chiron Vision,Irvine,CA)中保存小于7天的总计89个人角膜从Florida Lions Eye Bank(Miami,FL)获得并且根据赫尔辛基宣言进行操作。将HCF分离并且培养。短暂地，将上皮和内皮细胞从角膜除去，将基质切片切成约1mm3的立方块，在2mg/ml胶原蛋白酶中在37℃孵育16h，然后置于培养基中，该培养基由补充有10％胎牛血清(包含50mg/ml庆大霉素和1.25mg/ml两性霉素B)的DMEM组成。将培养基每周更新两次。将培养到第3代的细胞用于所有实验。
将HCF诱导为肌成纤维细胞
将HCF在DMEM+10％FBS中培养直至70％满层。使细胞进行血清-饥饿1天并且用10ng/ml TGFβ1处理3天以诱导肌成纤维细胞。将人角膜成纤维细胞或肌成纤维细胞在固定化的HC-HA/PTX3上逆转为角膜细胞
为了使成纤维细胞或肌成纤维细胞逆转为角膜细胞，将成纤维细胞或肌成纤维细胞在固定化的HC-HA/PTX3上在DMEM+10％FBS中培养3天，来自塑料和HA上的细胞的样品用作对照。使一些细胞培养物延长多达7天的培养以监测α-SMA形成的表达。
RNA提取、反转录和实时PCR
将总体RNA利用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)进行提取并且利用高容量反转录试剂盒(Applied Biosystems)进行反转录。将cDNA通过实时RT-PCR利用特异性引物-探针混合物和DNA聚合酶在Quant Studio 5实时PCR系统(Applied Biosystems)中进行扩增。实时RT-PCR谱由在95℃下初始激活10分钟，而后在95℃下15秒变性、以及在60℃下1min退火和1min延伸的40次循环组成。每个PCR产物的真正身份通过利用2％琼脂糖凝胶进行尺寸测定而后根据EC3成像系统(BioImaging System,Upland,CA)溴化乙锭染色以及PCR标志进行确认。
免疫染色
将人角膜成纤维细胞、肌成纤维细胞和角膜角膜细胞的样品风干，并且在4％甲醛pH 7.0中在室温下固定15min，在PBS中再水化，与0.2％Triton X-100一起孵育15min，用PBS冲洗三次，每次各5min。在与2％BSA一起孵育30min以阻止非特异性染色之后，将样品与期望的第一抗体(都以1:50稀释)在4℃一起孵育16h。在用PBS洗涤三次之后，将它们与对应的Alexa-Fluor-缀合的二级IgG(都以1:100稀释)一起孵育60min。然后将样品用Hoechst33342进行对比染色并且用Zeiss LSM 700共聚焦显微镜(Thornhood,NY)进行分析。对应的小鼠和兔血清分别用作初级单克隆抗体和多克隆抗体的阴性对照。
蛋白质印迹
将细胞裂解物在RIPA缓冲剂中进行制备，并且在4-15％(w/v)梯度丙烯酰胺凝胶上在变性和还原性条件下分离以进行蛋白质印迹。将蛋白提取物转移到硝酸纤维素膜，然后将其用5％(w/v)无脂奶在TBST[50mM Tris-HCl,pH 7.5,150mM NaCl,0.05％(v/v)Tween-20]中进行封闭，然后依次与特异性初级抗体(对抗角蛋白聚糖)以及它相应的辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的二级抗体一起孵育，用β-肌动蛋白作为负载对照。免疫反应性蛋白是利用Western Lighting化学发光(PerkinElmer,Waltham,MA)进行检测。
SDF1/CXCR4和BMP信号传导的时间过程分析
将HCF在塑料上在DMEM+10％FBS中进行接种，并且在有/无PBS或HA或HC-HA/PTX3在有或无CXCR4抑制剂AMD3100或BMP抑制剂SB431542的情况下处理0、5、15、30、45、60min、24和48h，然后采集用于SDF1、CXCR4和BMP的实时PCR，用于对CXCR4和pSMAD1/5免疫染色。
统计分析
所有总结数据被报告为平均值±标准偏差，对每组进行计算，并且通过微软Excel(Microsoft,Redmont,WA)利用ANOVA和学生不成对t检验进行比较。检验结果报告为双尾P值，其中P<0.05被视为统计学上显著的。
结果
人角膜肌成纤维细胞可能形成聚集物，被HC-HA/PTX3逆转为角膜细胞
先前已经证明，AM基质提取物可以使源于AM基质细胞的肌成纤维细胞逆转为成纤维细胞。不清楚从AM提取的HC-HA/PTX3复合物是否可以使肌成纤维细胞进一步逆转为甚至更年轻的角膜细胞-样祖细胞。为了回答此问题，将肌成纤维细胞首先从HCF诱导。具体地，将HCF用10ng/ml TGFβ1在DMEM+ITS中处理3天以诱导肌成纤维细胞。诱导的肌成纤维细胞通过α-SMA的免疫染色进行验证(图7A)。为了确定HC-HA/PTX3复合物是否可以重编程肌成纤维细胞，对在HC-HA/PTX3复合物上重编程的细胞进行多达7天监测。在第1天，肌成纤维细胞在HC-HA/PTX3上形成聚集物，但在塑料或HA上则没有(图7D)，免疫染色结果表明在HC-HA/PTX3上α-SMA的染色在第1天显著减少，并且在第4天和第7天完全消失，但在塑料和HA上不是这样(图7D)。令人关注地，HC-HA/PTX3诱导角蛋白聚糖mRNA表达的14倍增长，伴随着角蛋白聚糖蛋白表达的相似增长(图7B-7C)。
在HC-HA/PTX3上HCF也可能形成聚集物，被逆转为角膜细胞并且对TGFβ1有抗性
为了确定HC-HA/PTX3是否可以相同地或更好地将HCF逆转为更年轻的角膜细胞，在HC-HA/PTX3上对HCF进行多达7天监测。如所示，成纤维细胞在塑料或HA上形成一些聚集物，其中大多数是纺锤形，相比于在第1天在HC-HA/PTX3上的那些聚集物(图8A)。此外，在多达7天期间，聚集在HC-HA/PTX3上继续进行，但在塑料或HA上则没有(图8A)。此外，TGFβ信号传导甚至在TGFβ1的激发下也未被激活(没有pSMAD2/3的核染色并且在HC-HA/PTX3上在HCF中没有α-SMA染色，塑料或HA则不是这样，图8D、图8E和图8F，除了仅HC-HA/PTX3所致的TGFβ3(抗-TGFβ形式)的12倍增长)。因此，角蛋白聚糖的转录表达升高24-倍，伴随着角蛋白聚糖蛋白的相似增长(图8B和图2C)。HCF逆转为角膜细胞由典型BMP信号传导介导
为了确定那个(些)信号传导参与在由HC-HA/PTX3使HCF逆转为角膜细胞中，将成纤维细胞直接在固定化的HC-HA/PTX3上在有或无BMP抑制剂SB431542的情况下在MESCM中接种24h以测定mRNA，和接种48h以量化蛋白，塑料和HA用作对照。如预期的，HC-HA/PTX3分别诱导BMP4和BMP6的6倍和20倍mRNA增长，以及BMPR1A和BMPR2的3倍和5倍转录增长(图9A)。此外，HC-HA/PTX3促进pSMAD1/5核易位(图9B)。因此，HC-HA/PTX3刺激了角蛋白聚糖mRNA的23倍增长，以及角蛋白聚糖蛋白的相似增长(图9C和图9D)。通过激活典型BMP信号传导而逆转为角膜细胞的结论通过使用BMP抑制剂SB4315412进行证实，该抑制剂完全抑制BMP信号传导，因此，在mRNA和蛋白水平上抑制角蛋白聚糖表达。由SDF1-CXCR4信号传导介导的聚集调节典型BMP信号传导介导的逆转为角膜细胞
为了确定聚集是否由SDF1-CXCR4信号传导介导，若如此，这种信号传导是否介导典型BMP信号传导-调节的逆转为角膜细胞，CXCR4抑制剂AMD3100用于阻断SDF1-CXCR4信号传导。实际上，SDF1-CXCR4信号传导被HC-HA/PTX3激活，依据是SDF1转录的3倍增长的过度表达，以及CXCR4 mRNA的2倍增长(图10B)，以及CXCR4的核易位(图10C)。由AMD3100对SDF1-CXCR4信号传导的阻断，完全减弱细胞聚集(图10A)，SDF1和CXCR4的mRNA过度表达(图10B)，以及CXCR4核易位(图10C)。因此，BMP4、BMP6、BMPR1A、BMPR1B和BMPR2的转录表达(图10D和图10E)以及pSMAD1/5的核易位(图10E)都完全被AMD3100抵消，此外还阻断CXCR4核易位和角蛋白聚糖蛋白表达(图10F)。
激活SDF1/CXCR4，随后BMP信号传导
先前有报告，LNC和SC之间细胞-细胞复合由CXCR4/SDF-1轴介导，其中CXCR4由角膜基质NC强烈表达，而SDF-1由角膜上皮祖细胞表达。尚不清楚在HCF中细胞聚集是否由CXCR4/SDF-1轴介导。此外，已经表明，在早期P4 LNC中HC-HA/PTX3独特地促进BMP信号传导。也不清楚在HCF中HC-HA/PTX3是否促进BMP信号传导的持续激活，若如此，在HCF中，BMP信号传导是否由SDF1-CXCR4信号传导介导，或反之亦然。因此，执行时间过程以确定SDF1-CXCR4和BMP信号传导的时间线。结果表明，在HCF中，在60min时，HC-HA/PTX3而非HA促进聚集(图11A-11B)。此外，在15分钟时HC-HA/PTX3而非HA促进CXCR4 mRNA表达，其在30分钟时达到峰值，在15min时其核易位(图11A-11B)。相比之下，直到24h时SDF1的表达未被HC-HA/PTX3显著促进。此外，在HCF中，HC-HA/PTX3促进BMP4的曲折过度表达(15min至48h)但是BMP6在随后过度表达(24h和48h)，伴随着在30分钟时pSMAD1/5核易位(图11A-11B)。结果表明，SDF1-CXCR4信号传导在BMP信号传导之前。
SDF1/CXCR4信号传导的介导聚集和BMP信号传导
先前，AMD3100对CXCR4的抑制或者阻断型抗体对CXCR4的抑制已经表明，在接种时破坏它们的联合，导致上皮球体表现出更多角膜分化以及全克隆的显著损失。此外，已经表明，在P4 LNC中，HC-HA/PTX3激活BMP信号传导。仍然不清楚HC-HA/PTX3是否促进BMP信号传导的激活，或反之亦然。为了确定SDF1/CXCR4信号传导之间的关系，使用特异性BMP抑制剂AMD3100。结果表明，在HCF中，AMD3100对SDF1/CXCR4信号传导的抑制完全阻断聚集，SDF1和CXCR4的表达以及由HC-HA/PTX3诱导的BMP4和BMP6的表达(图12A-12B)。此外，CXCR4和pSMAD1/5的核易位也不消除(图12A-12B)。结果表明，SDF1/CXCR4信号传导介导BMP信号传导。
BMP信号传导没有影响SDF1-CXCR4信号传导和聚集
为了证实观点：SDF1/CXCR4介导聚集和BMP信号传导，而非反之，使用BMP抑制剂SB431542。如预期，结果表明，SB431542对BMP信号传导的抑制没有影响聚集、SDF1和CXCR4表达以及CXCR4的核易位，但是在HCF中完全抑制BMP4和BMP6的表达以及由HC-HA/PTX3诱导的pSMAD1/5核易位(图13A-13B)。结果表明，SDF1/CXCR4信号传导介导BMP信号传导，而非反之。
讨论
由于二十多年前首次再引入，羊膜(AM)移植已变成标准手术操作以进行眼表面重建，从而递送抗炎、抗血管生成和抗疤痕作用并且促进创伤愈合。从可溶性AM提取物，HC-HA/PTX3已经被纯化并且表征为独特的基质组分来发挥上述AM的治疗作用。HC-HA/PTX3通过与HC-HA的正五聚蛋白3(PTX3)紧密结合而形成，其由通过肿瘤坏死因子刺激的基因-6(TSG-6)的催化作用而与间-α-胰蛋白酶抑制剂的重链1(HC1)共价连接的高分子量玻尿酸(HA)组成。虽然人和鼠科动物角膜细胞可以保持它们的表型而不分化为表达α-SMA的肌成纤维细胞，但是，不清楚从AM提取的固定化的HC-HA/PTX3是否可以将终期分化的人角膜肌成纤维细胞逆转为角膜细胞。为了确定HC-HA/PTX3是否可以将人角膜肌成纤维细胞逆转为角膜细胞，对在HC-HA/PTX3上在培养的7天内逆转的细胞进行表征，用塑料和HA作为对照。已发现，在第1天和第4天，诱导的肌成纤维细胞可以在HC-HA/PTX3上形成聚集物，但在塑料或HA上则没有，(图7A)伴随着细胞形状从细长形变为小圆形，表明那些肌成纤维细胞可以被逆转为甚至更年轻的祖细胞。此外，在塑料或HA上肌成纤维细胞在整个培养期期间保留它们对α-SMA的特征性染色，但是，HC-HA/PTX3上的细胞在第1天显示显著减少的α-SMA，并且在第4天和第7天显示负染色(图7D)，支持我们的观点：肌成纤维细胞已经被逆转为更年轻的祖细胞。进一步分析表明，这种细胞是角膜细胞，表达特异性角膜细胞标志角蛋白聚糖的mRNA和蛋白(图7B-7C)。
为了确定HC-HA/PTX3是否也可以将HCF逆转为更年轻的祖细胞，在HC-HA/PTX3上培养的7天内对细胞进行表征，塑料和HA用作对照。实际上，在HC-HA/PTX3上，与肌成纤维细胞相比，HCF可以形成更多聚集物，细胞形状从细长形变为小圆形，但在塑料或HA上则非如此，直至第7天(图8A)，表明在HC-HA/PTX3上那些成纤维细胞也可以被逆转为角膜细胞。进一步分析表明，在塑料或HA上细胞在整个培养期期间保留它们对α-SMA的特征性染色，但是，HC-HA/PTX3上的细胞在第1天显示显著减少的α-SMA，并且在第4天和第7天显示负染色，支持我们的观点：成纤维细胞已经被逆转为更年轻的祖细胞。这种逆转的细胞也表达角蛋白聚糖的mRNA和蛋白，表明那些细胞的确是角膜细胞(图8B-8C)。令人关注地，TGFβ信号传导被完全抑制(仅抗-TGFβ形式TGFβ3被HC-HA/PTX3增强，图8D)。这种抑制的显著性需要进一步研究。
先前已报告，在小鼠ES细胞(mESC)中，BMP信号传导对于维持多能状态而言是重要的。系统性siRNA筛查进一步发现BMP信号传导的重要作用，以及诱导间充质向上皮转变(MET)。因为HC-HA/PTX3在早期P4 LNC中独特地促进BMP信号传导，所以疑问BMP信号传导是否在成纤维细胞逆转为角膜细胞中发挥重要的调节作用。本文中，已表明，HC-HA/PTX3显著地促进BMP4、BMP6、BMPR1A、BMPR2的mRNA表达(图9A)和pSMAFD1/5的核易位(图9B)，表明BMP信号传导的确被激活。BMP抑制剂SB431542对BMP信号传导的抑制完全地阻断BMP4、BMP6、BMPR1A、BMPR2的过度表达，以及pSMAFD1/5的核易位，以及角蛋白聚糖的mRNA和蛋白表达(图9C-9D)，表明BMP信号传导在成纤维细胞逆转为角膜细胞中发挥重要的作用。
先前已报告，单SC和NC可以再联合而在三维MatrigelTM中在胚胎SC培养基中产生球形生长，并且由SC–NC再联合引发的这种球形生长由SDF-1介导，该SDF-1由角膜上皮祖细胞及其受体CXCR4而非CXCR7独特地表达，由角膜基质NC强表达。由于逆转为角膜细胞与细胞聚集相关联，所以好奇这种聚集是否也由SDF1-CXCR4信号传导介导。结果确实显示，HC-HA/PTX3所致的聚集与SDF1-CXCR4信号传导相关联，依据在于SDF1和CXCR4的mRNA表达的增高(图10B)、CXCR4蛋白表达的增高(图10F)以及CXCR4核易位(图10C)。这种事件与BMP信号传导的激活相关联，依据在于BMP、BMPR的过度表达(图10D)和pSMAD1/5核易位(图10E)。
为了确定逆转为角膜细胞是否相关于聚集、SDF1-CXCR4和BMP信号传导，使用了CXCR4抑制剂、AMD3100和BMP抑制剂、SB431542。如预期，AMD3100完全阻滞BMP和BMPR的mRNA过度表达，防止pSMAD1/5的核易位，抑制角蛋白聚糖的mRNA和蛋白表达(图10D-10F)，表明HCF逆转为角膜细胞是经由激活SDF1-CXCR4-介导的典型BMP信号传导。
为了确认逆转为角膜细胞是否由SDF1-CXCR4-BMP信号传导介导，在HCF中利用可溶性HC-HA/PTX3在有和无CXCR4抑制剂AMD3100或BMP抑制剂SB431542的情况下在1h内完成时间过程。结果表明，在无任何抑制剂的情况下，在HCF中在60min时HC-HA/PTX3促进聚集，CXCR4 mRNA在15分钟时过度表达，在30分钟达到峰值，CXCR4核易位在15min(图11A-11B)。此外，在HCF中，HC-HA/PTX3促进BMP4(15min至48h)和BMP6(24h和48h)的过度表达，在30分钟时pSMAD1/5核易位(图11A-11B)，表明SDF1-CXCR4信号传导在BMP信号传导之前。
为了确定HC-HA/PTX3对SDF1-CXCR4信号传导的激活是否介导BMP信号传导，使用了CXCR4抑制剂AMD3100和BMP抑制剂SB431542。结果表明，AMD3100完全地阻断聚集、SDF1和CXCR4表达以及CXCR4的核易位、BMP和BMPR的mRNA过度表达，防止pSMAD1/5的核易位，抑制角蛋白聚糖的转录和蛋白表达(图12A-12B)，而BMP抑制剂SB431542仅阻断BMP和BMPR的转录过度表达，以及pSMAD1/5的核易位，以及角蛋白聚糖的转录和蛋白过度表达，但是不阻断SDF1和CXCR4的过度表达以及CXCR4的核易位(图12A-12B)，表明HCF逆转为角膜细胞是经由激活SDF1-CXCR4-典型BMP信号传导。
总之，已表明，通过固定化的HC-HA/PTX3经由激活SDF1-CXCR4-典型BMP信号传导，终期分化的肌成纤维细胞被逆转为更年轻的角膜细胞。这种方法可以应用于产生更年轻的功能性祖细胞，并且最终使临床上可应用的组织再生。
实施例3:从人羊膜纯化的HC-HA/PTX3通过经由SDF-1/CXCR4信号传导促进细胞聚集使晚期传代的角膜缘龛细胞逆转为核Pax6+神经嵴祖细胞
材料和方法
人角膜缘龛细胞的材料分离、扩增和处理
在4℃在Optisol(Chiron Vision,Irvine,CA)中保存小于7天的人角膜边缘和中央角膜是从供体(Florida Lions Eye Bank,Miami,FL)获得。将组织用包含50μg/mL庆大霉素和1.25μg/mL两性霉素B的PBS pH 7.4冲洗三次，将过量的巩膜、结膜、虹膜、角膜内皮和小梁网除去，直到角膜巩膜边缘的Schwalbe线，然后在解剖角膜边缘内和外1mm处切成上四分体、鼻四分体、下四分体和颞四分体(temporal quadrant)。包括基底上皮细胞的完整上皮片的获得是通过使每个角膜四分体与10mg/ml分散酶一起在改良的胚胎干细胞培养基(MESCM)(其包含杜比柯改良的Eagle培养基(DMEM)/F-12营养混合物(F-12)(1:1)，补充有10％敲除血清、10ng/mL LIF、4ng/mL bFGF、5mg/mL胰岛素、5mg/mL运铁蛋白、5ng/mL亚硒酸钠补充剂(ITS)、50μg/mL庆大霉素和1.25μg/mL两性霉素B)中在塑料皿容器中在4℃在加湿的5％CO2孵育器中消化16h。将LNC通过与2mg/mL胶原蛋白酶A一起在37℃消化16h而产生漂浮簇进行分离。
为了扩增，将在与0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA(T/E)一起消化之后从角膜簇得到的单细胞以1xcm4/cm2在预涂有5％MatrigelTM的6-孔板中接种在MESCM中并且在加湿的5％CO2中培养，每3-4天改变培养基，总共6-7天。对于体外3D MatrigelTM，将P10 LNC以密度5×104个细胞/cm2接种在3D MatrigelTM中而在MESCM中进行48h以产生聚集物。为了体外时间过程研究，对细胞聚集通过相显微镜Zeiss Axio-Observer Z1电动倒置显微镜(CarlZeiss,Thornwood,NY)进行监测。
当达到80％满层时，将在涂布的MatrigelTM(MG)上培养的P10 LNC在有或无20μg/mL AMD3100或100nM LDN-193189的情况下用0.1％DMSO预处理30min，然后经过胰蛋白酶处理，以2x105/mL接种在涂布的MG上在MESCM(其包含20μg/mL的AMD3100或100nM LDN-193189与25μg/mL可溶性HC-HA/PTX3)中再进行48h。为了siRNA敲低，将在涂布MG的6-孔上80％满层P10 LNC进行转染，这是是通过混合200μl无血清无抗生素的MESCM与4μL的HiPerFectsiRNA转染剂(最终稀释，1:300)和6μl的20μM的scRNA或siRNA(对于BMPR1A、BMPR1B、BMPR2和ACVR1)，最终浓度100nM，逐滴地，然后在1mL新鲜MESCM中在37℃下培养24h，然后将可溶性HC-HA/PTX3以最终浓度25μg/mL加入MESCM培养基中。
HC-HA/PTX3的纯化和固定
将HC-HA/PTX3从Bio-Tissue,Inc.(Miami,FL)提供的低温保存的人胎盘纯化，其中有所改进。简言之，将从胎盘获取的AM通过冷冻磨粉机(冷冻磨粉机6870,
Figure BDA0003150799070001071
SamplePrep,Metuchen,NJ)进行低温粉碎，由PBS(pH 7.4)在4℃提取1h，以48,000x g在4℃下离心30min而产生上清液，该上清液被称为AM提取物。然后将此提取物通过以CsCl梯度在初始密度1.35g/ml在4M GnHCl中以125,000g在15℃超速离心48h(OptimaTML-80X,SW41转子,Beckman Coulter,Indianapolis,IN)进行分级。将共计12个级分(1ml/级分)从每个超速离心管收集。测量每个级分的重量以计算密度，而每个级分中的HA含量和蛋白含量分别通过酶联免疫吸附HA量化测试试剂盒(Corgenix,Broomfield CO)和BCA蛋白测定试剂盒(Life Technologies,Grand Island,NY)进行测量。将包含大部分HC-HA/PTX3的级分2–12合并，并且进一步进行三轮相继的超速离心，对于第2轮，以125,000g在CsCl/4M胍HCl以密度1.40g/mL进行，对于第三轮和第四轮则以密度1.42g/mL进行，每一轮在15℃进行48h。将在第四轮之后包含HC-HA/PTX3但含有少量其他蛋白的级分3-9合并，并且相对于蒸馏水在4℃透析48h，总计换水5次，冻干，并储存在-80℃，被称为HC-HA/PTX3。在使用之前，通过基于琼脂糖凝胶电泳验证HC-HA/PTX3的生化组成包含高分子量HA而对其定性。
证实了在纯化的HC-HA/PTX3中存在HC1(ab70048,Abcam,Cambridge,MA)和PTX3(ALX-804-464-C100,Enzo Life Sciences,Farmingdale,NY)，在有或无HAase消化(1U/μgHA)在蛋白酶抑制剂存在下，Sigma-Aldrich,St。Louis,MO)进行验证。由于其中可忽略量的蛋白，所以HC-HA/PTX3在实验中的用量是基于HA量来表述。
将HC-HA/PTX3固定在Covalink-NH 96孔(Pierce)上，这是首先通过将Covalink-NH 96孔在70％酒精中灭菌30min，然后将孔用蒸馏水洗涤两次。将HC-HA/PTX3(2μg/孔)与交联剂Sulfo-NHS 9.2mg/mL(Pierce)和1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(Pierce)6.15mg/ml加入每个孔(100μl)中并且在4℃过夜孵育。此后，将未交联的HC-HA/PTX3和交联剂除去，并将孔用2M NaCl/50mM MgSO4/PBS洗涤两次，随后PBS洗涤两次。
神经胶质细胞分化
将总共1x104/mL的P10 LNC接种在50μg/mL聚-L-鸟氨酸和20μg/mL层粘连蛋白-涂布的或胶原蛋白IV型涂布的盖玻片上在48-孔板中在NSCM(补充有0.5％N2和1％B27)中2天。为了神经元分化，然后将培养基更换为神经元诱导基础培养基(包含DMEM/F12(1:3)和0.5％N2和1％B27，还包含10ng/mL FGF2和20ng/mL的BDNF(培养基A))进行3天，更换为基础培养基以及6.7ng/mL FGF2和30ng/mL的BDNF进行另外3天。细胞然后替换基础培养基以及2.5ng/mL FGF2、30ng/mL BDNF和200mM抗坏血酸进行另外8天。为了少突胶质细胞分化，然后将培养基更换为基础培养基(其包含DMEM/F12(1:1)和1％N2以及10ng/mL FGF2、10ng/mLPDGF和10μM毛喉素)进行4天，然后将培养基更换为基础培养基以及10ng/mL FGF2、30ng/mL3,3,5-三碘甲状腺氨酸和200μM抗坏血酸进行另外7天。为了星形胶质细胞分化(ThermoScientific,Santa Clara,CA)，将培养基更换为DMEM(其包含1％FBS、1％N2和2mMGlutaMax)进行10天。诱导培养基每3-4天进行更换。
定量实时PCR
将总的RNA根据生产商的指南通过RNeasy微型试剂盒(Quiagen,Valencia,CA)从不同传代的LNC提取，和使1-2ug
RNA提取物反转录为cDNA，利用高容量反转录试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,CA)，利用补充表S3中所列的引物进行反转录。将所得的cDNA通过特异性TaqMan基因表达测定混合物和通用PCR主混合物在QuantStudioTM 5实时PCR系统(ThermoFisher,Santa Clara,CA)中进行扩增，实时RT-PCR谱由以下组成：在95℃下初始激活10min，而后在95℃下变性15sec，以及在60℃下1min退火和延伸的40个循环。相关基表达数据通过比较CT方法(ΔΔCT)进行分析。所有测定按照一式三份地进行。将结果通过甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内部对照进行归一化。
免疫荧光染色
将处于不同传代的LNC的单细胞用0.05％胰蛋白酶和1mM EDTA在37℃采集10min，并且准备以利用Cytofuge(StatSpin Inc.,Norwood,MA)以1000rpm 8min离心涂片。将细胞用4％甲醛pH 7.0在室温下固定15min，用0.2％Triton X-100/PBS渗透15min，用2％牛血清白蛋白(BSA)阻断1h，然后与初级抗体一起在4℃孵育16h。在用PBS洗涤3次后，将对应的Alexa Fluor-缀合的二级IgG(都以1:100稀释)孵育60min，用PBS洗涤3次。在用PBS洗涤3次后，将第二初级抗体孵育60min，随后用对应的Alex Fluor-缀合的二级IgG孵育。将核用Hoechst 33342对比染色，然后用Zeiss LSM 700共聚焦显微镜(Carl Zeiss,Thornwood,NY)进行分析。对应的小鼠和兔血清分别用作初级单克隆和多克隆抗体的阴性对照。
统计分析
所有总结数据被报告为平均值±标准偏差，对每组进行显著性计算，并且通过微软Excel(Microsoft,Redmont,WA)利用双尾学生t检验进行比较。检验结果报告为p值，其中p<0.05被视为统计学上显著的。
结果
经过LNC的连续传代核Pax6+NC表型的进行性损失
已有报告，LNC连续传代至P10导致NC祖细胞状态的损失，已被报告为特征在于核Pax6染色、胚胎干细胞(ESC)和神经嵴(NC)祖细胞标志(例如p75NTR、Musashi-1、Sox2、Nestin、Msx1和FoxD3)的表达，以及神经胶质细胞分化。为了证实此发现，使LNC在涂布的MatrigelTM(MG)上在改良的胚胎干细胞培养基(MESCM)中连续传代至P10，其表型通过转录表达和免疫测定来表征。结果的确证实P10LNC中Pax6、Sox2、p75NTR、Musashi-1和Nestin的转录表达水平，在与P2 LNC比较时显著降低(图14A,##p<0.01,n＝3)免疫荧光染色进一步证实，在与P4 LNC比较时，在P10 LNC中Pax6的核染色损失，伴随着对这种NC标志例如p75NTR和Musashi-1染色的明显减弱(图14B)。
固定化的HC-HA/PTX3促进细胞聚集并使P10 LNC逆转为核Pax6+NC祖细胞
观察到，在涂布的MG上在MESCM中扩增的P4 LNC当重新接种在3D MG或固定化的HC-HA/PTX3上时形成细胞聚集，其中后者还有助于恢复ESC标志的表达。因此，好奇P10 LNC是否可以通过重新接种在固定化的HC-HA/PTX3上而表现相同地恢复核Pax6+NC祖细胞状态。因此，将在涂布的MG上扩增的P10 LNC在MESCM中在涂布的MG、3D MG或固定化的HC-HA/PTX3上在MESCM中重新接种48h。相差显微镜表明，在24h和48h时，P10 LNC在3D MG和固定化的HC-HA/PTX3中形成细胞聚集(图15A)。定量RT-PCR表明，当与涂布的MG(图15B,**p<0.01,n＝3)或3D MG(图15B,##p<0.01,n＝3)比较时，在固定化的HC-HA/PTX3上，在P10 LNC中，Pax6、p75NTR、Musashi-1、Nestin、Msx-1和FoxD3的转录水平显著地上调。免疫荧光染色证实核Pax6染色和核Sox2染色的重新出现(图15C)。分析了P10 LNC在重新接种在3D MG或固定化的HC-HA/PTX3上之后分化为神经元、少突胶质细胞的和星形胶质细胞潜力。相差显微镜表明，当P10 LNC重新接种在固定化的HC-HA/PTX3上时，当与它们的重新接种在3D MG中的对应物相比时，在P10 LNC中，细胞表现出减小的尺寸并且采用扩大的潜力分化为神经元、少突胶质细胞的和星形胶质细胞(图15D)。总之，这些结果表明，固定化的HC-HA/PTX3而非3D MG独特地使P10 LNC逆转为核Pax6+NC祖细胞，具有较高的神经胶质细胞分化潜力。
可溶性HC-HA/PTX3也促进细胞聚集和逆转为Pax6+NC祖细胞
随后测试，在P10 LNC接种在涂布的MG上时将可溶性HC-HA/PTX3直接加入MESCM中是否也可以达到相同的结果。相差显微镜表明，早在60min时可溶性HC-HA/PTX3也促进细胞聚集(以白色箭头标记)，但是直至24h，在涂布的MG上聚集的细胞铺展成单纺锤形细胞，而在3D MG中细胞聚集变得更加显著(图16A)，相似于图15A中所示。定量RT-PCR揭示，当与3DMG相比时，在24和48h，可溶性HC-HA/PTX3显著地上调p75NTR和Musashi-1转录(图16B,##p<0.01,n＝3)。免疫荧光染色也证实，当与在3D MG上培养的细胞相比时，在48h，可溶性HC-HA/PTX3实现了Pax6和Sox2的核染色以及p75NTR的细胞质染色(图16C)。这种染色模式类似于在固定化的HC-HA/PTX3上观察到的(图15C)。
由可溶性HC-HA/PTX3促进的细胞聚集由CXCR4/SDF-1信号传导介导并且导致核Pax6+NC祖细胞
先前已报告，在3D MG中P4 LNC和LEPC之间的再联合通过CXCR4/SDF-1信号传导来介导，其中受体CXCR4由LNC强表达，而SDF-1配体由LEPC表达，并且这种再联合对于维持LEPC的自我更新是关键。因此，想知道在P10 LNC中由可溶性HC-HA/PTX3促进的细胞聚集是否可能也通过CXCR4/SDF-1信号传导进行介导。为了测试此假设，对CXCR4/SDF-1信号传导通过添加AMD3100(其是小分子CXCR4抑制剂)进行干扰。相差显微镜证实，在P10 LNC中在60min时可溶性HC-HA/PTX3的确促进细胞聚集，类似于上述，并且这种聚集被AMD3100完全中止(图17A)。通过qRT-PCR对转录表达的时间过程研究表明，当将可溶性HC-HA/PTX3添加到在涂布的MG上的P10 LNC时，与它们的在3D MG中的对应物相比，CXCR4转录早在15min时上调四倍并且在60min时达到高峰几乎500倍(图17B,**p<0.01和**p<0.01,n＝3)。AMD310的添加显著地下调在24h时CXCR4转录的这种上调并且在48h时完全中止(图17B)。相比之下，在前60min期间，在所有培养物中，SDF-1转录没有上调，但是在24h时被3D MG显著上调40倍而被可溶性HC-HA/PTX3上调10-倍，其中后者也被AMD3100完全中止(图17B,##p<0.01,n＝3)。在3D MG上，在整个60min期间，CXCR4的免疫荧光染色显示膜/细胞质染色；而在可溶性HC-HA/PTX3中CXCR4染色在0和5min是膜/细胞质染色，在15和30min是核染色，在60min在细胞聚集中主要是膜(图17D)。后者染色模式在加入AMD3100时逆转成3D MG的模式(图17D)。相比之下，在接种在3D MG或可溶性HC-HA/PTX3的细胞中，在整个60min，SDF-1的免疫染色是强烈的膜/细胞质染色，而在添加AMD3100之后变为负染色(图17D)。CXCR4/SDF-1信号传导被AMD3100阻断不仅防止由可溶性HC-HA/PTX3促进的细胞聚集而且导致Pax6、p75NTR、NGF、Musashi-1、Msx-1和FoxD3转录的显著下调(图17C,**p<0.01,n＝3)。此外，在P10 LNC中由可溶性HC-HA/PTX促进的核Pax6染色被AMD3100中止(图17D)。这些数据共同地表明，在P10 LNC中由可溶性HC-HA/PTX3促进的细胞聚集上是通过CXCR4/SDF-1信号传导来介导，其作为诱因而与核Pax6+NC祖细胞表型的恢复相关联。
CXCR4/SDF-1信号传导是由HC-HA/PTX3激活BMP信号传导所需的
已经报告，在P4 LNC中固定化的HC-HA/PTX3而非3D MG独特地上调BMP信号传导，其导致角膜SC维持静态。因此，疑问在P10 LNC中BMP信号传导是否也可能由可溶性HC-HA/PTX3促进，若如此，它是否可能受由HC-HA/PTX3激活的CXCR4-SDF1信号传导影响。qRT-PCR表明，当与在涂布的MG上扩增的P4 LNC相比时，P10 LNC对BMP配体和BMP受体的转录表达显著地下调(图18A,**p<0.01,n＝3)。免疫荧光染色证实，pSmad1/5/8的核定位在P4 LNC中弱表达而在P10 LNC中为零(图18B)。相比之下，qRT-PCR揭示，当相比于3D MG时，BMP2、BMP4、BMP6转录表达水平的确被可溶性HC-HA/PTX3显著地上调(图18C,##p<0.01,n＝3)。令人关注地，BMP4和BMP6的上调是早在15min时并且在接近48h时循环到较高水平，而这对于BMP2仅在24h之后观察到(图18C)。AMD3100的添加在整个48h中中止BMP2、BMP4和BMP6的转录水平(图18C,**p<0.01,n＝3)。免疫荧光染色进一步证实，在P10 LNC中指示典型BMP信号传导的pSmad1/5/8的强核染色由可溶性HC-HA/PTX3促进，但是在用AMD3100处理之后失活而成细胞质染色(图18D)。这些发现充分表明，在P10 LNC中由HC-HA/PTX3促进的CXCR4/SDF-1信号传导也作为诱因而与典型BMP信号传导的激活相关联。
抑制BMP信号传导没有影响由HC-HA/PTX3促进的CXCR4/SDF-1信号传导介导的核Pax6染色和细胞聚集
干扰由可溶性HC-HA/PTX3促进的BMP信号传导以确定通过CXCR4/SDF-1信号传导来介导的细胞聚集是否需要BMP信号传导。将P10 LNC在有或无LDN-193189、小分子BMP抑制剂或BMP受体(即BMPR1A、BMPR1B、BMPR2)的短干扰RNA(siRNA)和Activin受体I型(ACVR1)的情况下预处理，接种在涂布的MG上，然后将可溶性HC-HA/PTX3加入MESCM中，进行另外48h。定量RT-PCR和免疫荧光染色证实了在降低BMP受体的转录表达(图19A,**p<0.01,n＝3)和防止pSmad1/5/8核染色(图19B)方面LDN-193189(数据未示出)和针对BMP受体的siRNA的效能。然而，相差显微镜揭示，当相比于用杂乱RNA(scRNA)预处理的对照时，在P10 LNC中可溶性HC-HA/PTX3所致的细胞聚集没有被LDN-193189或针对BMP受体的siRNA影响(图19C)。定量RT-PCR进一步揭示，当P10LNC被LDN-193189或针对BMP受体的siRNA预处理时，在整个48h中，CXCR4和SDF-1的表达水平没有显著差异(图19D,P>0.1,n＝3)。此外，免疫荧光染色还表明，CXCR4的短暂核易位和核Pax6染色未受影响(图19E)。这些数据共同地表明，当典型BMP信号传导被抑制时，HC-HA/PTX3所致的细胞聚集、核Pax6染色和CXCR4/SDF-1信号传导激活未受影响。
讨论
先前已表明，早期传代的P4 LNC当被重新接种在固定化的HC-HA/PTX3上时恢复在涂布的MG中连续传代期间损失的ESC标志的表达。在此实施例中表明了，传代的P10 LNC当被重新接种在固定化的HC-HA/PTX3上时也恢复了在连续传代期间损失的核Pax6+NC多能神经嵴祖细胞表型(图15A-15D)。虽然固定化的HC-HA/PTX3和3D MG二者都促进细胞聚集(图15A-15D)，但是这种表型逆转是HC-HA/PTX3独有的，因为当P10 LNC仍然在涂布的MG上培养时，当将可溶性HC-HA/PTX3添加到MESCM中时，早在60min时就发生细胞聚集，但在其没有HC-HA/PTX3的对应物中或重新接种在3D Matrigel上的情况中则没有(图16A-16C)。HC-HA/PTX3诱导的细胞聚集不同于3D MG所致的细胞聚集的观点进一步依据在于CXCR4/SDF-1信号传导的激活存在于前者中而非后者。其例证在于，在HC-HA/PTX3促进的细胞聚集之前，在15min时CXCR4转录的显著上调，以及在15和30min时CXCR4的核易位(图17A-17D)。AMD3100对CXCR4的抑制不仅中止CXCR4转录的上调以及CXCR4的核易位，而且消除SDF-1的膜和细胞质染色以中断CXCR4/SDF-1信号传导。由于它也中止在60min时的细胞聚集，所以得出结论HC-HA/PTX3促进的早期细胞聚集是通过CXCR4/SDF-1信号传导来介导。这种由HC-HA/PTX3促进的早期细胞聚集对于表型逆转为核Pax6+NC祖细胞状态是关键，如观察结果所示，AMD3100的添加也防止核Pax6染色以及NC标志的基因的转录上调(图17A-17D)。由于表型逆转的发生仅通过HC-HA/PTX3而非
Figure BDA0003150799070001141
其中二者都造成细胞聚集，但是推测由同型CXCR4/SDF-1信号传导触发的细胞聚集上独特的。未来的研究需要查看这种机制是否可以扩展来理解间充质细胞聚集/压缩，其与在牙齿、骨、头发、皮肤和肌肉中促进器官形成相关联，或者在皮肤成纤维细胞开始重编程为诱导多能干细胞(iPSC)期间作为关键形态学事件。
CXCR4在LNC中高度表达，LNC在角膜基底上皮干细胞/祖细胞下方。但是其表达也随着在涂布的Matrigel上连续传代而下降(数据未示出)。在此注意到，CXCR4的核易位紧随在添加HC-HA/PTX3之后。此外，AMD3100的添加防止CXCR4的这种短暂核易位，中止细胞聚集和随后的表型逆转。因此，引人推测HC-HA/PTX3通过CXCR4的核易位而激活CXCR4/SDF-1信号传导。然而，CXCR4的核易位已被视为若干癌细胞中高恶性的强指示，并且与HIF1α关联作为前馈环路而促进肿瘤生长和RCC细胞中癌转移。因为相比于在癌细胞中因持续的SDF-1刺激而已观察到的，在LNC中CXCR4的核易位发生快得多，即在添加HC-HA/PTX3之后15和30min，需要进一步研究来确定在LNC中由HC-HA/PTX3促进的CXCR4的核易位是否通过相似的机制。
已表明，在P4 LNC中固定化的HC-HA/PTX3而非3D MG激活BMP信号传导，其是维持角膜上皮SC静态所需的。因此了解到，BMP信号传导(其依据是pSmad1/5/8的核易位和BMP配体和受体的上调)也在连续传代期间损失(图18A)，类似于核Pax6染色(图14A-14B)。此外，注意到，在P10 LNC中固定化的(未示出)和可溶性HC-HA/PTX3二者也激活BMP信号传导，其依据是在细胞聚集之前在30min时pSmad1/5/8的核染色以及BMP4和BMP6转录以周期性波模式上调(图18A-1B)。因为BMP信号传导参与在体细胞重编程的早期期间，这也由在细胞聚集和从单个成年小鼠成纤维细胞的间充质上皮转变突显，并且因为在小鼠间充质干细胞(MSC)中CXCR4/SDF-1信号传导与激活BMP信号传导相关联，以促进破碎性创伤愈合，应解决其在所述表型逆转而促进多能性中的作用。这些数据揭示，AMD3100对CXCR4/SDF-1信号传导的破坏中止前述由HC-HA/PTX3促进的BMP信号传导(图18C-18D)。相比之下，BMP信号传导被LDN-193189或BMP受体的siRNA破坏，基于CXCR4转录表达和核CXCR4染色，既没有影响由CXCR4/SDF-1信号传导介导的细胞聚集，也没有中止核Pax6染色(图19A-19E)。总之，这些结果表明，在P10 LNC中HC-HA/PTX3通过激活CXCR4/SDF-1信号传导而促进早期细胞聚集，其也是激活BMP信号传导所需的，并且CXCR4/SDF-1信号传导而非BMP信号传导在P10 LNC的表型逆转中是关键。
先前已报告，从人AM纯化的HC-HA/PTX3发挥广泛的抗炎和抗疤痕作用并且支持LNC以确保角膜上皮SC静态。这些作用共同地公开了分子机制，解释了为何低温保存的羊膜可以促进再生性愈合。因此，已首次提供证据表明，HC-HA/PTX3还可以促使老化的LNC逆转而恢复它们的Pax6+NC祖细胞状态，有助于解释为何AM的移植提高体内和活体外扩增角膜SC来治疗因角膜SC缺陷所致的角膜失明的成功率。因为Pax6+NC祖细胞具有宽分化潜力分化为神经血管细胞，HC-HA/PTX3可以进一步在身体的许多其他神经血管龛中支持SC。
虽然已经在本文中示出和描述了本公开的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见仅仅以示例的方式提供这些实施方案。在不脱离本公开内容的情况下本领域技术人员将想到许多变型、改变和替代。应理解，本文描述的本公开的实施方案的要素的各种替代方案可以用于实施本公开。以下权利要求旨在界定本公开的范围，并且旨在由此覆盖处于这些权利要求的范围内的方法和结构以及它们的等同方案。

Claims (112)

1.一种将具有第一表型的细胞重编程的方法，所述方法包括：使所述细胞与HC-HA/PTX3接触足以使所述细胞的所述第一表型重编程为第二表型的时间。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二表型与细胞分化途径中早期细胞的表型对应。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞被重编程为细胞分化途径中的早期细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是从祖细胞分化的细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述祖细胞是神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞或者心血管祖细胞。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述祖细胞是神经嵴祖细胞。
7.根据权利要求4-6中的任一项所述的方法，其中从所述祖细胞分化的所述细胞是间充质细胞。
8.根据权利要求4所述的方法，其中从所述祖细胞分化的所述细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、角膜细胞、上皮细胞或角膜缘龛细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述成纤维细胞是肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞或者心脏成纤维细胞。
10.根据权利要求4-9中的任一项所述的方法，其中所述早期细胞是所述祖细胞。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的方法，其中所述细胞存在于组织的损伤或退化之后的组织中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述组织是眼组织、心脏组织、皮肤组织、关节组织、脊椎组织、软组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、韧带组织、神经组织、椎间盘组织、脊髓组织、脑组织或者肌肉组织。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述组织是心脏组织。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述组织是眼组织。
15.根据权利要求11-14中的任一项所述的方法，其中所述损伤是烧灼、撕裂、缺血性组织、创伤、伤害、溃疡、辐射、化疗或手术切口的结果。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述伤害是心肌梗死。
17.根据权利要求1-16中的任一项所述的方法，其中将所述HC-HA/PTX3包含在胎儿支持组织的制剂中。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。
20.根据权利要求17或19所述的方法，其中所述胎儿支持组织被冷冻或预先冷冻。
21.根据权利要求17-20中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织基本上没有红细胞。
22.根据权利要求17-21中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织包含基本上没有静脉或动脉的脐带。
23.根据权利要求17-22中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。
24.根据权利要求17-23中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。
25.根据权利要求17-24中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。
26.根据权利要求1-25中的任一项所述的方法，其中组合物是凝胶、溶液或者悬浮液。
27.根据权利要求1-26中的任一项所述的方法，其中所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
28.根据权利要求1-27中的任一项所述的方法，其进一步包括使所述成纤维细胞与TGFβ1接触。
29.一种治疗有需要的受试者中以不需要的成纤维细胞分化为特征的病症的方法，其包括使所述受试者中感染所述病症的组织内的成纤维细胞与HC-HA/PTX3接触足以使所述成纤维细胞的表型重编程为不同表型的时间段，由此治疗所述病症。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述不同表型与细胞分化途径中早期细胞的表型对应。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述成纤维细胞被重编程为细胞分化途径中的早期细胞。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述成纤维细胞是从祖细胞分化的细胞。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述祖细胞是神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞，或者心血管祖细胞。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述祖细胞是神经嵴祖细胞。
35.根据权利要求32-34中的任一项所述的方法，其中从所述祖细胞分化的所述细胞是间充质细胞。
36.根据权利要求32所述的方法，其中从所述祖细胞分化的所述细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、角膜细胞、上皮细胞，或者角膜缘龛细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述成纤维细胞是肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞，或者心脏成纤维细胞。
38.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述早期细胞是所述祖细胞。
39.根据权利要求29-38中的任一项所述的方法，其中所述组织是眼组织、心脏组织、皮肤组织、关节组织、脊椎组织、软组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、韧带组织、神经组织、椎间盘组织、脊髓组织、脑组织，或者肌肉组织。
40.根据权利要求29-38中的任一项所述的方法，其中所述组织是眼组织。
41.根据权利要求29-38中的任一项所述的方法，其中所述组织是心脏组织。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述病症是心肌梗死。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述接触发生在支架置入手术操作期间。
44.根据权利要求29-41中的任一项所述的方法，其中所述病症发生是由于烧灼、撕裂、缺血性组织、创伤、伤害、溃疡、辐射、化疗或手术切口。
45.根据权利要求29-44中的任一项所述的方法，其中将HC-HA/PTX3包含在胎儿支持组织的制剂中。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。
48.根据权利要求45或47所述的方法，其中所述胎儿支持组织被冷冻或预先冷冻。
49.根据权利要求45-48中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织基本上没有红细胞。
50.根据权利要求45-49中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织包含基本上没有静脉或动脉的脐带。
51.根据权利要求45-50中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。
52.根据权利要求45-51中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。
53.根据权利要求45-52中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。
54.根据权利要求29-53中的任一项所述的方法，其中组合物是凝胶、溶液或者悬浮液。
55.根据权利要求29-54中的任一项所述的方法，其中所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
56.根据权利要求29-55中的任一项所述的方法，其进一步包括使所述成纤维细胞与TGFβ1接触。
57.一种使组织中的疾病状态逆转的方法，其包括使所述组织与HC-HA/PTX3接触足以使所述组织中的患病细胞或不需要的细胞重编程为具有不同表型的细胞的时间，由此逆转所述组织的所述疾病状态。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述不同表型与细胞分化途径中早期细胞的表型对应。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述不同表型对应于祖细胞的表型。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述祖细胞是神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞，或者心血管祖细胞。
61.根据权利要求57所述的方法，其中所述不需要的细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、角膜细胞、上皮细胞，或者角膜缘龛细胞。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述成纤维细胞是肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞，或者心脏成纤维细胞。
63.根据权利要求57-62中的任一项所述的方法，其中所述患病细胞或不需要的细胞存在于组织的结疤、损伤或退化之后的组织中。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述组织是眼组织、心脏组织、皮肤组织、关节组织、脊椎组织、软组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、韧带组织、神经组织、椎间盘组织、脊髓组织、脑组织，或者肌肉组织。
65.根据权利要求63所述的方法，其中所述组织是心脏组织。
66.根据权利要求63所述的方法，其中所述组织是眼组织。
67.根据权利要求57-66中的任一项所述的方法，其中将所述HC-HA/PTX3包含在胎儿支持组织的制剂中。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。
70.根据权利要求67-69中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。
71.根据权利要求67-70中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。
72.根据权利要求67-71中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。
73.根据权利要求57-72中的任一项所述的方法，其中所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
74.一种从分化细胞产生祖细胞的方法，其包括使所述分化细胞与HC-HA/PTX3接触足以使所述分化细胞重编程为祖细胞表型的时间。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述祖细胞表型与细胞分化途径中早期细胞的表型对应。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述祖细胞表型对应于神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞或心血管祖细胞的表型。
77.根据权利要求74所述的方法，其中所述分化细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、角膜细胞、上皮细胞或角膜缘龛细胞。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述成纤维细胞是肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞，或者心脏成纤维细胞。
79.根据权利要求74-77中的任一项所述的方法，其中所述分化细胞存在于组织的结疤、损伤或退化之后的组织中。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述组织是眼组织、心脏组织、皮肤组织、关节组织、脊椎组织、软组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、韧带组织、神经组织、椎间盘组织、脊髓组织、脑组织，或者肌肉组织。
81.根据权利要求79所述的方法，其中所述组织是心脏组织。
82.根据权利要求79所述的方法，其中所述组织是眼组织。
83.根据权利要求74-82中的任一项所述的方法，其中将所述HC-HA/PTX3包含在胎儿支持组织的制剂中。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
85.根据权利要求83所述的方法，其中所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。
86.根据权利要求83-85中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。
87.根据权利要求83-86中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。
88.根据权利要求83-87中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。
89.根据权利要求74-88中的任一项所述的方法，其中所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
90.一种使组织再生的方法，其包括：使组织内的细胞的第一分化表型重编程为祖细胞表型，以及使所述祖细胞表型分化为第二分化表型，由此使所述组织再生。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述祖细胞表型与细胞分化途径中早期细胞的表型对应。
92.根据权利要求90所述的方法，其中所述祖细胞表型对应于神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞或心血管祖细胞的表型。
93.根据权利要求90所述的方法，其中第一分化细胞是成纤维细胞、肌成纤维细胞、角膜细胞、上皮细胞或角膜缘龛细胞。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述成纤维细胞是肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞，或者心脏成纤维细胞。
95.根据权利要求93-94中的任一项所述的方法，其中所述第一分化细胞存在于所述组织的结疤、损伤或退化之后的所述组织中。
96.根据权利要求90-95中的任一项所述的方法，其中所述组织是眼组织、心脏组织、皮肤组织、关节组织、脊椎组织、软组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、韧带组织、神经组织、椎间盘组织、脊髓组织、脑组织，或者肌肉组织。
97.根据权利要求90-95中的任一项所述的方法，其中所述组织是心脏组织。
98.根据权利要求90-95中的任一项所述的方法，其中所述组织是眼组织。
99.根据权利要求90-98中的任一项所述的方法，其中将所述HC-HA/PTX3包含在胎儿支持组织的制剂中。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
101.根据权利要求99或权利要求100所述的方法，其中所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。
102.根据权利要求99-101中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织包含基本上全部死亡的细胞。
103.根据权利要求99-102中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织包含脐带羊膜以及至少一部分脐带胶质。
104.根据权利要求99-103中的任一项所述的方法，其中所述胎儿支持组织被低温保存、冻干、灭菌或其组合。
105.根据权利要求90-104中的任一项所述的方法，其中所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
106.一种组合物，其包含a)HC-HA/PTX3和b)治疗性细胞。
107.根据权利要求106所述的组合物，其中所述治疗性细胞是祖细胞、干细胞，或者诱导多能干细胞。
108.根据权利要求107所述的组合物，其中所述祖细胞是神经嵴祖细胞、造血祖细胞、乳腺祖细胞、肠祖细胞、间充质祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、嗅觉祖细胞、睾丸祖细胞或心血管祖细胞。
109.根据权利要求106-108中的任一项所述的组合物，其中HC-HA/PTX3被包含在胎儿支持组织的制剂中。
110.根据权利要求109所述的组合物，其中所述制剂是胎儿支持组织提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
111.根据权利要求109或权利要求110所述的组合物，其中所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。
112.根据权利要求106-111中的任一项所述的组合物，其中所述HC-HA/PTX3是天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。
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