KR102289661B1 - 요산분해효소를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 통풍의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 요산분해효소를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 통풍의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 미니서클벡터로 형질전환된 중간엽 줄기세포는 생체외에서 요산분해효소가 과발현 되는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 고농도 요산 결정을 투여한 마우스 모델에 요산분해효소 발현 중간엽 줄기세포를 투여한 결과, 염증을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였으므로, 급성 통풍 또는 만성 결절성 통풍의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

요산분해효소를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 통풍의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating Gout comprising stem cells overexpressing Uricase}

본 발명은 요산분해효소를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 통풍의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 요산분해효소(uricase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 미니서클벡터로 형질전환된 중간엽 줄기세포 및 상기 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 급성 통풍 또는 만성 결절성 통풍의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

통풍은 혈액 내에 요산의 농도가 높아지면서 요산염 결정이 관절의 연골, 힘줄, 주위 조직에 침착되는 질병이다. 요산염 결정의 침착은 관절의 염증을 유발하여 극심한 통증을 동반하는 재발성 발작을 일으키며, 통풍결절(tophi)이 침착되면서 관절의 변형과 불구가 발생하게 된다. 관절의 이상 외에도 다양한 신장질환을 일으키고 요산에 의해 콩팥에 돌이 생기는 콩팥돌증(nephrolithiasis, 신석증)이 나타나기도 한다.

요산은 퓨린의 마지막 대사물로서 잔틴 산화효소(xanthine oxidase)라는 효소를 갖고 있는 간과 소장에서 합성되어 혈장, 체액, 관절액 내에서는 요산의 이온화된 형태인 요산염(monosodium urate)으로 존재한다. 요산염의 2/3~3/4은 신장을 통해 배설되고 나머지는 장을 통해 배설된다. 혈액 내 요산 농도가 7.0mg/dL 이상을 넘는 고요산혈증은 요산이 과잉 생산되는 경우와 요산의 배설이 감소되는 경우로 나눌 수 있다. 통풍은 주로 남성에서 발생하는데, 이는 남성은 콩팥에서의 요산 제거 능력이 나이가 들수록 감소하는데 반하여 여성은 폐경 이전까지는 여성호르몬의 영향으로 요산 제거 능력이 유지되기 때문이다.

통풍은 급성통풍과 만성통풍으로 구분 지을 수 있으며, 급성통풍은 처음부터 가벼운 증상에서 시작하여 대개 양쪽 엄지발가락에 열을 동반한 극심한 통증과 부어오르는 증상이 나타나는데 야간에 더욱 심하며, 음주, 과격한 운동, 탈수, 수술, 출혈, 외상, 요산 배출에 영향을 미치는 과다한 약물 복용 등 여러 요인으로 인하여 완화와 재발하는 과정을 반복하다 보면 하얗게 치약같은 결절이 발생되는 만성결절성통풍, 통풍성신병증으로 진행되어 관절의 기능을 잃고 심지어는 기형이 발생하기도 한다

극심한 통증을 동반하는 통풍 환자들에게 사용되는 대표적인 약물인 콜히친, 비스테로이드항염제, 스테로이드 등은 약물에 의한 부작용으로 인해 대사증후군과 신장병 등 합병증으로 고생하고 수명이 단축될 수 있다는 보고가 나오고 있다. 또한, 만성기 통풍의 치료는 완치의 개념보다는 관리의 개념으로 치료하며, 2회 이상 급성 통풍 발작이 있다면 요산강하제를 사용하게 되는데, 이러한 요산강하제 투여에도 조절되지 않는 비반응성 통풍(refractory gout) 이 존재하며, 만성 결절성 통풍의 경우 약물 치료로는 제거에 수년 이상이 소요되기도 한다. 따라서 부작용이 없고 효과가 우수한 새로운 통풍 치료제의 개발이 요구되고 있다.

중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cells; MSCs)는 면역조절, 항염증 효과 및 재생 효능으로 인해 다양한 질병에 대한 치료제로 연구되고 있으며, 특정 유전자로 조작된 중간엽줄기세포는 치료효과가 개선되었다는 보고가 있다 (대한민국 공개특허 제10-2018-0072644호; 대한민국 공개특허 제10-2012-0018724호; Dai, F. et al., Tissue Eng., 12:2583-2590, 2006). 줄기세포로의 유전자 전달 기술과 관련하여, 비-바이러스성 유전자 전달 기술이 안전한 방법으로서 주목 받고 있다. 상업적인 DNA 벡터 플라스미드는 세균 유래의 서열을 포함하고 있어, 세균성 단백질에 대한 면역 반응이 유도될 수 있기 때문이다. 이를 위해 미니서클벡터를 사용할 수 있는데, 미니서클벡터는 항생제 내성 유전자, 세균성 구조 단백질을 암호화하는 유전자 및 전사 단위 유전자를 제거하여 상대적으로 작은 크기를 가지는 벡터를 말한다. 미니서클벡터는 크기가 작고 면역 반응을 피할 수 있다는 장점과 함께, in vitro및 in vivo에서 외부 유전자를 높은 수준으로 발현할 수 있다는 특징을 가져, 전-임상 유전자 치료 연구에서 사용 이점을 가질 수 있는 것으로 주목 받고 있다.

이에, 본 발명에서는 부작용이 없이 효과가 우수한 통풍 치료제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 미니서클벡터로 형질전환된 중간엽줄기세포를 제조하였다. 본 발명에서 제조한 중간엽줄기세포는 생체외에서 요산분해효소의 발현이 이루어지는 것을 확인하였으며, 고농도 요산 결정을 투여한 마우스 모델에 요산분해효소 발현 중간엽 줄기세포를 투여한 결과, 염증을 효과적으로 억제하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 요산분해효소(uricase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 미니서클벡터로 형질전환된 중간엽 줄기세포 및 상기 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 통풍의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해,

본 발명은 (a) 프로모터, 요산 분해 효소(uricase) 단백질을 코딩하는 유전자 및 전사 터미네이터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고,

(b) 상기 (a)의 유전자 발현 카세트 외부에 위치하는, 박테리오파지 람다의 att 부착 서열을 포함하며; 및

(c) 복제 개시점 및 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는 비-바이러스성 벡터가 도입된 요산 분해 효소 과발현 줄기세포를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 요산분해효소 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계의 프로모터는 CMA 프로모터이며, 전사 터미네이터는 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 상기 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 통풍의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 통풍은 급성 통풍 또는 만성 결절성 통풍일 수 있다.

본 발명의 요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 미니서클벡터로 형질전환된 중간엽 줄기세포는 생체 외에서 요산분해효소가 과발현 되는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 고농도 요산 결정을 투여한 마우스 모델에 요산분해효소 발현 중간엽 줄기세포를 투여한 결과, 염증을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였으므로 급성 통풍 또는 만성 결절성 통풍의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포의 제작 모식도이다.
도 2는 요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 모벡터(parental plasmid) 및 미니서클(minicircle) 벡터의 젤 이미지(A) 및 미니서클 벡터에 요산 분해 효소가 삽입되었는지 제한효소를 처리하여 확인한 데이터(B)이다.
도 3은 요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 미니서클 벡터를 HEK293T 세포에 형질전환 시켰을 때, 요산 분해 효소의 발현 정도를 확인한 데이터이다. A는 형광현미경 관찰 세포 사진, B는 형질전환 효율을 나타낸 데이터, C는 요산 분해 효소 발현에 따른 요산 분해능을 확인한 데이터이다.
도 4a는 페글로티카제(Pegloticase)를 코딩하는 유전자가 도입된 미니서클 벡터를, 도 4b는 라스부리카제(Rasburicase)를 코딩하는 유전자가 도입된 미니서클 벡터를, 다양한 조건으로 중간엽 줄기세포에 형질전환 시켰을 때, 형질전환 효율 및 세포 생존율을 확인한 데이터이다.
도 5는 형질전환 조건에 따라 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포의 배양액 속에 포함된 요산 분해 효소 농도를 확인한 데이터이다.
도 6은 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포에서 발현되는 요산 분해 효소 및 줄기세포 마커의 mRNA 발현 정도를 확인한 데이터이다. A는 PCR을 이용한 mRNA 발현 정도를 확인한 데이터이며, B는 GAPDH에 대한 상대적 발현량을 나타낸 데이터이다.
도 7은 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포의 요산 분해능을 확인한 데이터이다.
도 8은 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포의 줄기세포로서의 표현형(phenotype)을 확인한 데이터이다.
도 9는 염증환경(IL-1b, IFN-γ, TNF-α)에서 중간엽 줄기세포(MSC) 및 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포(eMSC)의 세포 모양을 관찰한 사진이다.
도 10 염증환경(IL-1b, IFN-γ, TNF-α)에서 중간엽 줄기세포(MSC) 및 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포(eMSC)의 항염증성 유전자(anti-inflammatory gene)의 mRNA 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 11은 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포를 2회 투여하였을 때, 급성 염증(acute inflammation) 억제 효능을 확인한 데이터이다. A는 줄기세포 1회 주입(7day) 및 MSU + 줄기세포 2회 주입(14day) 후 마우스 발바닥을 찍은 사진이며, B는 MSU 투여 후 발바닥 두께를 나타낸 데이터이다.
도 12는 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포를 투여한 마우스의 발바닥(Footpad) 조직을 면역화학염색방법으로 관찰한 데이터(A) 및 염색을 통한 염증정도를 점수화하여 나타낸 데이터(B) 이다.
도 13은 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포를 투여한 마우스의 발바닥(Footpad) 조직에서 염증성 사이토카인인 TNFα 및 IL-1β의 발현 정도를 확인한 데이터(A) 및 TNFα 및 IL-1β의 발현 정도를 수치화한 데이터이다 (B 및 C).
도 14는 염증 마우스 모델에서 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포 투여에 따른 주입된 고농도의 요산 결정의 크기를 관찰한 데이터이다.
도 15는 염증 마우스 모델에서 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포 투여에 따른 주입된 고농도의 요산 결정의 크기를 수치화하여 나타낸 데이터이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 일관점에서,

(a) 프로모터, 요산 분해 효소(uricase) 단백질을 코딩하는 유전자 및 전사 터미네이터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고,

(b) 상기 (a)의 유전자 발현 카세트 외부에 위치하는, 박테리오파지 람다의 att 부착 서열을 포함하며; 및

(c) 복제 개시점 및 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는 비-바이러스성 벡터가 도입된 요산 분해 효소 과발현 줄기세포에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 서열번호 1은 라스부리카제(Rasburicase)를 코딩하는 유전자이며, 서열번호 2는 페글로티카제(Pegloticase)를 코딩하는 유전자이다. 본 발명에서는 요산 분해 효소 중에서 라스부리카제 및 페클로디카제를 사용하였으나, 목적에 따라 이미 알려진 다양한 요산 분해 효소를 코딩하는 유전자 또는 신규한 재조합 요산 분해 효소를 코딩하는 유전자를 비-바이러스성 벡터에 도입하여 사용할 수 있다.

상기 비-바이러스성 벡터는 "미니서클 벡터"로, 미니서클벡터는 항생제 내성 유전자, 세균성 구조 단백질을 암호화하는 유전자 및 전사 단위 유전자를 제거하여 상대적으로 작은 크기를 가지는 벡터를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어, "줄기세포"는 각종 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖추고 있으며 자가증식 능력을 가지는 세포를 말하며, 초기 배아에서 분리한 배아 줄기세포(embryonic stem cell), 배아기의 원시 생식세포에서 분리한 배아 생식세포(embryonic germ cell) 및 성체의 골수 등에서 분리한 다능성 성체 줄기세포(adult stem cell) 등을 포함한다.

본 발명에서 이용 가능한 줄기세포는, 포유동물의 배아나 태아, 제대혈, 또는 성체 장기나 골수 등의 성체 조직, 피부 또는 혈액 등으로부터 유래된 모든 다능성 줄기세포를 포함하며, 배아 줄기세포와 유사한 형질을 가지는 줄기세포를 포함한다. 이 경우 용어, "배아 줄기세포와 유사한 형질"이란, 배아 줄기세포에 특이적인 표면(항원) 마커가 존재하거나, 배아 줄기세포 특이적인 유전자를 발현하거나, 또는 테라토마(teratoma) 형성 기능을 가지거나, 또는 키메라 마우스 형성능이 있는 등의 배아 줄기세포에 특이적인 세포 생물학적 성질로 정의할 수 있다. 성체 줄기세포의 예로는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell), 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 신경 줄기세포, 지방 줄기세포 등을 들 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게 중간엽 줄기세포, 더 바람직하게는 골수 유래 중간엽 줄기세포를 사용하였다.

본 발명은 급성 통풍 또는 만성 결절성 통풍에 치료적 효과를 가지는 요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자를 줄기세포에 도입하여 체내 질환 부위에 전달하고 해당부위에 발현시킴으로써, 기존의 단백질 치료제가 가지는 생체 내 분해에 따른 반감기의 감소 및 생리활성의 감소와 같은 문제를 해결하고, 기존의 유전자 치료제가 가지는 전달 효율 및 안정성의 문제를 해결할 수 있으며, 지속적이고 안정적으로 치료 효과를 공급할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 유전자 치료법에 기존에 사용되던 바이러스성 벡터 시스템이 가지는 면역원성 등의 생물학적 안정성의 문제, 그리고 비바이러스성 벡터 시스템이 가지는 전달 효율의 문제를 모두 해결하기 위하여, 치료 유전자를 목적 세포에 효율적으로 전달하며 치료 유전자를 지속적이고 오랫동안 발현시킬 수 있고 생물학적 안전성이 높은 벡터 시스템을 줄기세포에 적용하였다.

구체적으로, 본 발명의 벡터 시스템은, 프로모터, 요산 분해 효소를 코딩하는 유전자 및 전사 터미네이터와 같은 최소한의 필수요소만으로 구성된 유전자 발현 카세트를 포함하며, 기존의 벡터 시스템에 사용되던 복제 개시점 및 항생제 내성 유전자와 같은 선별마커 유전자는 포함하지 않음을 특징으로 한다.

복제 개시점은 주로 박테리아 유래의 서열로서 인체 내에서 불필요한 면역 반응을 일으킬 수 있으며, 항생제 내성 유전자와 같은 선별마커 유전자는 체내 존재하는 세균들에까지 전달될 수 있어 다른 질환으로 인해 동일 군의 치료 항생제를 투여하는 경우 불필요한 항생제 내성을 일으킬 수 있는 문제가 있다. 이에, 본 발명에서는 복제 개시점 및 선별마커 유전자를 포함하지 않음으로써, 불필요한 면역 반응 및 항생제 내성의 문제를 제거할 수 있다. 또한, 원핵세포에서 유래된 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 제거하여 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 아울러, 이로 인해 본 발명의 벡터는 기존의 벡터에 비해 물리적 크기가 작아 제작이 용이하고 전달 효율을 높이고 생물학적 안정성을 개선시킬 수 있다.

본 발명의 벡터는 원형의 수퍼코일 형태의 이중가닥 DNA 임을 특징으로 한다.

본 발명의 벡터에 사용되는 프로모터는 특별한 제한이 없이 당업계에 사용되는 프로모터를 사용할 수 있으며, 유도성 또는 구성적 프로모터를 포함하고, 바람직하게는 CMV(cytomegalovirus) 프로모터일 수 있다.

본 발명의 벡터에 사용되는 전사 터미네이터는 특별한 제한이 없이 당업계에 사용되는 터미네이터를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 요산 분해 효소를 코딩하는 유전자, 및 전사 터미네이터로 구성된 유전자 발현 카세트의 외부에, 부위 특이적 재조합 영역(site specific recombination)을 추가로 포함한다.

부위 특이적 재조합 영역은 DNA 상의 특정한 두 염기서열 간에 재조합이 일어날 수 있는 영역을 말하며, 이러한 부위 특이적 재조합 영역을 이용한 유전자 클로닝 방법은 제한 효소(restriction enzyme) 및 연결 효소(ligase)를 이용하는 기존 방법을 대체할 수 있는 유전자 조작 방법으로 유용하다. 바람직하게, 본 발명에서 부위 특이적 재조합 영역은 대장균 또는 박테리오파아지 람다 유래의 att 부착 서열로서, attB 또는 attP 의 기질 서열, 또는 attR 또는 attL 의 하이브리드 서열일 수 있다.

본 발명에서 요산 분해 효소을 발현하는 벡터는 공지된 다수의 방법, 예를 들어, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 일렉트로포레이션, DEAE 덱스트란(Dextran) 매개 형질감염, 일가양이온성 리포좀 융합, 다가양이온성 리포좀 융합, 원형질 융합, 리포펙타민, 및 네이키드(naked) DNA 전달 등에 의해 세포 또는 조직에 도입될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일구현예에서, 요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 미니서클 벡터를 제조하기 위해, 도 1의 모식도와 같은 과정으로 요산 분해 효소 단백질을 발현하는 미니서클 벡터를 제조하였으며, 요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 라스부리카제(Rasburicase)를 코딩하는 유전자 및 서열번호 2는 페글로티카제(Pegloticase)를 코딩하는 유전자를 사용하였다.

요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 모벡터(parental plasmid) 및 미니서클(minicircle) 벡터의 크기를 확인한 결과, 요산 분해 효소가 도입된 미니서클 벡터의 대략적인 크기는 4kb인 것으로 확인되었으며(도 2A), 제한효소로 절단(enzyme cut) 후 전기영동으로 확인한 결과, 라스부리카제의 크기는 957bp, 페글로티카제의 크기는 966bp로 확인되었다 (도 2B).

또한, 미니서클 벡터에 삽입된 요산 분해 효소 단백질이 세포 내에서 유의적으로 발현할 수 있는지 확인한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 미니서클 벡터로 형질전환된 HEK293T 세포에서 요산 분해 효소가 정상적으로 발현되는 것을 확인하였으며, 생성된 요산 분해 효소에 의해 요산이 분해되는지 확인한 결과, 대조군에 비해 요산 농도가 감소되는 것을 확인하였다.

본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서, 본 발명에서 제작한 요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 미니서클 벡터를 일렉트로포레이션(Electroporation) 방법을 이용하여 중간엽 줄기세포에 형질전환 시켰다 (이하, "eMSC"로 혼용 표기함).

도 4a 및 도 4b는 다양한 조건에서 mcPegloticase 및 mcRasburicase를 형질전환 시켰을 때 형질전환 효율을 나타낸 것으로, 요산 분해 효소 종류에 따라 최적 형질전환 효율이 상이한 것을 확인하였으며, 세포 생존율을 고려하여 두 미니서클 모두 Pulse voltag 1400, Pulse width 20, Pluse no. 2 회 조건으로 형질전환을 수행하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 상기 조건으로 형질전환 시켰을 때 중간엽 줄기세포의 배양액 속에서 요산 분해 효소가 생성된 것을 확인하였다.

도 6은 상기 중간엽 줄기세포에서 발현되는 요산 분해 효소 및 줄기세포 마커의 mRNA 발현 정도를 확인한 것으로, 중간엽 줄기세포의 마커 유전자가 유의적으로 발현하는 것을 확인하였으며, 요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA가 유의적으로 발현하는 것을 확인하였다.

또한, 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포 배양액에서 요산 분해 효소 정도를 확인한 결과, 라스부리카제(Rasburicase) 또는 페글로티카제(Pegloticase)가 도입된 중간엽 줄기세포의 배양액에서 통계적으로 유의한 요산 감소가 관찰되었다 (도 7). 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포의 줄기세포로서의 표현형(phenotype)을 확인하기 위해, 중간엽 줄기세포의 양성(CD73, CD105) 및 음성(CD34, CD45) 마커의 발현 여부를 확인였다. 그 결과, 형질전환되지 않은 일반 중간엽 줄기세포와 비교하였을 때, 형질전환된 중간엽 줄기세포의 표현형이 그대로 유지되고 있음을 확인하였다 (도 8).

본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서는, 염증환경(IL-1b, IFN-γ, TNF-α 처리)에서 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포가 항염증 효과를 보이는지 확인한 결과, 세포 사멸이 억제되는 것을 확인하였다 (도 9). 또한, 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포는 전염증성 메커니즘에 해당하는 NLRP3의 mRNA 발현에는 영향을 주지 않는 것으로 확인되었으나, 항염증성 유전자(anti-inflammatory gene)인 IL-1RN, IL-10, TGF-β의 mRNA 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다 (도 10).

본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서는, MSU 투여 전에 7일간격으로 총 2번 마우스의 혈관으로 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포(eMSC)를 먼저 주입한 다음, MSU를 마우스 뒷발에 주입하여 급성 통풍 마우스 모델을 제작하였다.

그 결과, 고농도 요산 결정을 투여한 그룹(대조군)에 비해 줄기세포를 투여한 그룹이 급성 염증(acute inflammation)이 억제되는 것을 확인하였다 (도 11). 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포를 투여한 마우스의 발바닥(Footpad) 조직을 면역화학염색방법으로 관찰한 결과, 대조군에 비해 조직 괴사 및 염증이 감소한 것을 확인하였으며 (도 12), 염증성 사이토 카인 발현 역시 감소한 것을 확인하였다 (도 13).

본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서는, 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포(eMSC)의 만성 통풍 치료 효능을 확인하기 위해, 고농도 요산 결정(MSU)을 피하주사로 주입한 다음, 7일 후 주입된 MSU 부위에 MSC 또는 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포(eMSC)를 주입하였다. 그 결과, MSU 단독 투여군의 경우, 주입된 MSU가 계속 유지되는 것을 확인하였다 (도 14). 반면, mcRasburicase-MSC 및 mcPegloticase-MSC 투여군의 경우, MSU 크기가 현저하게 감소하는 것을 확인하였다 (도 15).

즉, 본 발명의 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포는 지속적이고 안정적으로 요산 분해 효소의 발현이 가능하며, 줄기세포에서 발현된 요산 분해 효소로 인해 효과적으로 통풍에 의한 염증을 감소시키는 것을 확인하였다. 이는 본 발명에서 제조한 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포를 급성 또는/및 만성 결절성 통풍에 적용하였을 때, 효과적으로 요산을 분해할 수 있을 뿐만 아니라 염증을 개선시킬 수 있으므로, 급성 또는/및 만성 결절성 통풍의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 통풍의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 통풍은 급성 통풍 또는 만성 결절성 통풍인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 1000mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 미니서클 벡터 제조

1-1 : 요산 분해 효소를 발현하는 미니서클 벡터 제조

본 발명에서 요산 분해 효소의 발현을 유도하기 위해, 도 1와 같은 과정으로 미니서클 벡터를 제조하였다.

구체적으로, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 라스부리카제(Rasburicase)를 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 페글로티카제(Pegloticase)를 코딩하는 유전자(cDNA)를 사용하였다. 상기 각각의 유전자를 빈 벡터(mock vector)인 모체 플라스미드(CMV-MCS-EF1-RFP-SV40-PolyA; 제조사: System Biosciences, Mountain View, 미국)에 삽입하였다. 삽입시, 요산 분해 효소 서열은 CMV 프로모터 하위에 존재하는 다클로닝 부위(multiple cloning site) 내 XbaI 및 BamHI 사이의 서열에 삽입하여 성장인자 유전자를 포함하는 모벡터를 제조하였다. 라스부리카제(Rasburicase) 또는 페글로티카제(Pegloticase)를 포함하는 각각의 모벡터(ppRasburicase, ppPegloticase)를 각각 ZYCY10P3S2T E.coli 세포에 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 단일 콜로니 단위로 분리하여 이를 500 ㎍/㎖ 카나마이신이 포함된 LB 배지 2 ㎖에 접종하여 2 시간 동안 30 ℃에서 초기배양하였다. 그런 다음, 1 ℓ 배양 플라스크에 200 ㎖ terrific broth (TB)를 가하고, 초기 배양한 배지 100 ㎕를 접종하여 30 ℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하면서 15 시간 동안 배양하였다. 배양 후 모벡터 플라스미드를 미니서클 벡터로 전환하기 위해, 4% 1N NaOH 및 20% L-아라비노즈 200 ㎕를 포함하는 LB 배지 200 ㎖를 배양 플라스크에 첨가하였다. 배지가 첨가된 플라스크는 다시 30 ℃에서 200 rpm으로 5 시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후, 세포를 수득하여 NucleoBond Xtra 플라스미드 정제 키트(Macherey-Nagel, Duren, Germany)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 XbaI 및 BamHI으로 이중 절단하여 제조된 미니서클의 크기 및 삽입된 라스부리카제(Rasburicase) 또는 페글로티카제(Pegloticase) 유전자를 확인하였다. 라스부리카제(Rasburicase) 또는 페글로티카제(Pegloticase)가 삽입된 각각의 벡터는 mcRasburicase 및 mcPegloticase로 명명하였다. 음성 대조군을 제조하기 위해서, 라스부리카제(Rasburicase) 또는 페글로티카제(Pegloticase)가 삽입되지 않은 모체 플라스미드(ppMock)를 이용하여 동일 방법으로 미니서클 벡터(mcMock)를 제조하였다.

그 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, 요산 분해 효소가 도입된 미니서클 벡터의 대략적인 크기는 4kb, mcMock는 3kb인 것으로 확인되었으며, 도 2B에 나타난 바와 같이, 제한효소로 절단(enzyme cut) 후 전기영동으로 확인한 결과, mcRasburicase는 957bp의 라스부리카제(Rasburicase) 유전자와 약 3kb의 미니서클의 2개 밴드로 나타났으며, mcPegloticase는 966bp의 페글로티카제(Pegloticase) 유전자와 약 3kb의 미니서클의 2개 밴드로 나타나는 것을 확인하였다.

1-2 : 요산 분해 효소의 형질도입(transduction) 효율 확인

라스부리카제(Rasburicase) 또는 페글로티카제(Pegloticase)가 세포 내로 형질도입 되었을 때 유의적으로 발현 활성을 나타낼 수 있는지 확인하고자, mcRasburicase 또는 mcPegloticase 내에 함께 존재하는 RFP(로다민) 의 발현 정도를 측정하였다.

구체적으로, Opti-MEM 배지(Thermo Fisher Scientific) 내에서 상기 실시예 1-1에서 제조한 mcRasburicase 또는 mcPegloticase를 리포펙타민(lipofectamine)과 20분 동안 혼합하였다. 그런 다음, 혼합된 벡터-리포펙타민 혼합물을 HEK293T 세포에 첨가하여 37 ℃의 5% CO₂ 배양기에서 6 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 위상차 현미경으로 세포의 형태(morphology)를 확인한 다음, 형광 현미경을 사용하여 HEK293T 세포 내 RFP 발현 수준을 관찰하였다.

그 결과, 도 3A 및 도 3B에 나타난 바와 같이, 요산 분해 효소 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 미니서클 벡터로 형질전환된 HEK293T 세포에서 요산 분해 효소가 정상적으로 발현되는 것을 확인하였다.

또한, 세포 배양 배지에 존재하는 요산 분해 효소를 확인하기 위해 요산 분석 키트(Uric acid assay kit; abcam)를 사용하였다. 구체적으로, mcRasburicase 또는 mcPegloticase으로 형질전환 된 HEK293T 세포가 5x10⁶ 개의 세포수가 되도록 회수한 다음, 1100rpm에서 2분 동안 원심분리하여 죽은 세포를 제거하고 배양배지 상등액을 수득하였다. 그 다음, 요산 분석 키트를 이용하여 40 nmol/㎖ 요산이 포함된 용기에 상기에서 수득한 배양배지 상등액을 각 그룹별 3 세트씩 첨가한 다음, 37 ℃에 30분간 반응시켰다. 그 후, 570nm의 OD값을 측정하여 분해되지 않은 요산의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 3C에 나타난 바와 같이, mcRasburicase 또는 mcPegloticase으로 형질전환된 경우 대조군에 비해 요산 농도가 감소하는 것을 확인하였다. 즉, 형질전환된 HEK293T 세포에서 발현하는 요산 분해 효소의 요산분해능이 정상적으로 유지되고 있음을 확인하였다.

요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포 제조

2-1 : 요산 분해 효소 단백질 발현 미니서클 벡터로 형질전환된 중간엽 줄기세포 제조

본 발명에서는 상기 실시예 1-1에서 제조한 mcRasburicase 또는 mcPegloticase를 중간엽 줄기세포에 형질전환 시켜 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포를 제조하였다.

중간엽 줄기세포는 가톨릭 중앙의료원 세포 치료센터에서 제공 받은 골수 유래 중간엽 줄기세포(bone marrow derived MSC; passage 4)를 사용하였으며, 중간엽 줄기세포는 형질전환이 어려운 것으로 알려져 있으므로, 형질전환 효율이 높은 일렉트로포레이션(Electroporation) 방법을 이용하여 mcRasburicase 또는 mcPegloticase를 중간엽 줄기세포에 형질전환 시켰다.

구체적으로, 중간엽 줄기세포가 1x10⁵ 개/웰이 되도록 배양용기에 접종한 다음, mcRasburicase 및 mcPegloticase를 각각 0.5 ㎍/㎕으로 첨가하였다. 이후, 최적 형질전환 조건을 확립하기 위해, 다양한 조건(Pulse voltag 850 ~ 1700, Pulse width 10 ~ 40, Pluse no. 1 ~ 3 회)으로 형질전환 시킨 후, 세포를 위상차 현미경으로 세포의 형태(morphology)를 확인한 다음, 형광 현미경을 사용하여 중간엽 줄기세포 내 RFP 발현 수준을 관찰하였다.

그 결과, mcPegloticase의 경우 도 4a에 나타난 바와 같이, Pulse voltag 1400, Pulse width 20, Pluse no. 2 회 조건 및 Pulse voltag 950, Pulse width 30, Pluse no. 2 회 조건에서 형질전환 효율이 높은 것을 확인하였다. mcRasburicase는 도 4b에 나타난 바와 같이, Pulse voltag 1400, Pulse width 20, Pluse no. 2 회 조건 및 Pulse voltag 1600, Pulse width 10, Pluse no. 3 회 조건에서 형질전환 효율이 높은 것을 확인하였다.

하지만, 일렉트로포레이션 방법은 세포 생존율이 감소하는 문제가 있기 때문에, 이를 고려하여 이후의 실험은 mcPegloticase 및 mcRasburicase 모두 Pulse voltag 1400, Pulse width 20, Pluse no. 2 회 조건으로 형질전환을 수행하였다.

2-2 : 요산 분해 효소 단백질 발현 확인

본 발명에서는 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포에서 실제로 요산 분해 효소가 합성되는지 확인하고자 하였다.

요산 분해 효소의 양은 Uricase ELISA kit를 사용하여 측정하였으며, 요산 분해 효소 과발현 시키기 위해 3일 동안 유지된 세포 배양액을 1N NaOH를 이용하여 pH8.0로 조정한 다음, Uricase ELISA kit에서 제공하는 메뉴얼대로 수행하였다. 각 웰에 Uricase working regent와 각 그룹별 세포 배양액을 각 50 ㎕씩 첨가한 다음, 30분후에 450nm에서 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포의 배양액 속에서 요산 분해 효소가 생성된 것을 확인하였다.

2-3 : 요산 분해 효소의 mRNA 발현 확인

본 발명에서는 상기 실시예 2-1에서 제조한 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포가 줄기세포의 특성을 유지하면서 요산 분해 효소를 발현하는지 확인하기 위해, 요산 분해 효소 및 줄기세포 마커의 mRNA 발현 정도를 확인하였다.

먼저, 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포를 수득하여 트리졸(Trizol, Thermo Fisher Scientific 사)에 현탁하여 세포를 파쇄하고, mRNA를 추출하였다. 추출한 mRNA를 주형으로 하여, RevertAid^TM First Strand cDNA 합성 키트(Thermo Fisher Scientific)로 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 다시 주형으로 하여 MSC 마커 유전자인 CD45, CD90, CD44 및 CD105와 라스부리카제(Rasburicase) 및 페글로티카제(Pegloticase)에 대한 PCR을 수행하여 각각의 유전자의 발현 수준을 확인하였다. 동일한 유전자에 대하여 3 회 반복하여 정량 분석한 다음, 동일 세포 내 GAPDH 발현 수준을 기준으로 하여 각각의 유전자 발현 수준 값을 보정하였다.

PCR 수행을 위한 프라이머 정보

	프라이머 서열(5'-3')	서열 번호
CD45	AGCACCTACCCTGCTCAGAA	3
	TTCAGCCTGTTCCTTTGCTT	4
CD90	CTAGTGGACCAGAGCCTTCG	5
	TGGAGTGCACACGTGTAGGT	6
CD44	AAGGTGGAGCAAACACAACC	7
	AGCTTTTTCTTCTGCCCACA	8
CD105	CACTAGCCAGGTCTCGAAGG	9
	CTGAGGACCAGAAGCACCTC	10
Rasburicase	ATCACGGCTAAGCAGAACCC	11
	ACATTGCGCTTCTCTTCGGA	12
Pegloticase	AAGTGGAATTCGTCCGCACT	13
	TAAGGCCCTGCGAACTTCTG	14
GAPDH	CGAGGACAGCGTGATCTTCA	15
	CTTAGCGAGATCCGGTGGAG	16

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 중간엽 줄기세포의 마커 유전자가 유의적으로 발현하는 것을 확인하였으며, 요산 분해 효소인 라스부리카제(Rasburicase) 및 페글로티카제(Pegloticase)를 코딩하는 유전자의 mRNA가 유의적으로 발현하는 것을 확인하였다.

2-4 : 요산 분해 효소 활성 확인

요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포가 생산한 요산 분해 효소의 활성을 확인하였다. 효소 활성은 요산 분석 키트(Uric acid assay kit; abcam)를 사용하여 측정하였으며, 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 수행하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 요산 분해 효소를 과발현 하는 중간엽 줄기세포 배양액에서 요산 분해 효소 정도를 확인한 결과, 라스부리카제(Rasburicase) 또는 페글로티카제(Pegloticase)가 도입된 중간엽 줄기세포의 배양액에서 통계적으로 유의한 요산 감소가 관찰되었다.

2-5 : 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포의 표현형 확인

요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포의 줄기세포로서의 표현형(phenotype)을 확인하기 위해, 중간엽 줄기세포의 양성(CD73, CD105) 및 음성(CD34, CD45) 마커의 발현 여부를 확인였다

먼저, 제작된 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포를 TE buffer(Gibco)를 처리 후, 37℃에서 2분 동안 반응시켜 단일 세포로 분리하였다. 각 분리된 세포가 1x10⁵ 개가 되도록 수득한 다음, Fixation/Permeabilization kit(Invitrogen)를 이용해서 세포를 고정시키고, 양성(CD73-BV421, CD105-PE-Cy7)과 음성(CD34-APC, CD45-PE) 항체를 이용하여 세포 표면막에 붙여주어 FACS 기기를 이용하여 분포를 확인하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 형질전환되지 않은 일반 중간엽 줄기세포와 비교하였을 때, mcRasburicase 또는 mcPegloticase이 형질전환된 중간엽 줄기세포의 표현형이 그대로 유지되고 있음을 확인하였다.

염증 환경에서 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포의 항염 효과 확인

본 발명에서는 염증환경에서 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포가 항염증 효과를 보이는지 확인하였다.

제작된 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포 및 형질전환되지 않은 중간엽 줄기세포가 각각 5x10⁵ 개가 되도록 접종한 다음, IL-1b, IFN-γ 및 TNF-α 50ng/㎖로 48시간동안 처리하여 미믹(mimic)한 염증 환경을 조성하였다. 48시간 이후, 줄기세포를 수득하여 트리졸(Trizol, Thermo Fisher Scientific 사)에 현탁하여 세포를 파쇄하고, mRNA를 추출하였다. 추출한 mRNA를 주형으로 하여, RevertAid^TM First Strand cDNA 합성 키트(Thermo Fisher Scientific)로 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 다시 주형으로 하여 항염증 마커 유전자인 IL-1RN, IL-10, TGF-β 및 NLRP3에 대한 PCR을 수행하여 각각의 유전자의 발현 수준을 확인하였다. 동일한 유전자에 대하여 3 회 반복하여 정량 분석한 다음, 동일 세포 내 GAPDH 발현 수준을 기준으로 하여 각각의 유전자 발현 수준 값을 보정하였다.

PCR 수행을 위한 프라이머 정보

	프라이머 서열(5'-3')	서열 번호
IL-1RN	AGAAGACCTCCTGTCCTATG	17
	TACTCGTCCTCCTGGAAGTA	18
IL-10	TGCCTTCAGCAGAGTGAAGA	19
	CTCAGACAAGGCTTGGCAAC	20
TGF-β	TGGTTGTACAGGGCCAGGA	21
	TGCGGCAGCTGTACATTGA	22
NLRP3	AGCTGACCAACCAGAGCTTC	23
	TTCGACATCTCCTTGGTCCT	24
GAPDH	CGAGGACAGCGTGATCTTCA	15
	CTTAGCGAGATCCGGTGGAG	16

도 9에 나타난 바와 같이, IL-1b, IFN-γ 및 TNF-α를 처리한 경우, 일반 MSC 및 mcMock MSC에서는 세포의 형태가 변하거나 세포가 사멸된 것으로 관찰된 반면, 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포(eMSC)는 세포 사멸이 억제되는 것으로 관찰되었다.

또한, 도 10에 나타난 바와 같이, 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포는 전염증성 메커니즘에 해당하는 NLRP3의 mRNA 발현에는 영향을 주지 않는 것으로 확인되었으나, 항염증성 유전자(anti-inflammatory gene)인 IL-1RN, IL-10, TGF-β의 mRNA 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다.

요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포의 급성 통풍 억제 효능 확인

4-1 : 동물모델 제작

본 발명에서는 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포의 급성 통풍 억제 효능을 확인하고자 하였다.

수컷 DBA1/j 마우스 (25 g, 6주령)는 오리엔트바이오에서 구입하였다. 이들을 5개의 그룹으로 나누어 표준조건 하에서 1주 순화하였으며 이후 실험에 사용되었다 (온도 22±2 ℃, 습도 55±5 %, 12 h-명/암 사이클, 음식/물 자유식). 모든 실험은 실험동물관리기준의 가이드라인과 가톨릭대학교 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 수행하였다. 마우스는 하기와 같이 5마리씩 5개의 그룹으로 나누었다.

그룹 1 : 고농도 요산 결정(MSU; 3 ㎎/㎕) 단독 투여군(MSU)

그룹 2 : MSU + 양성 대조군 투여군(colchicine)

그룹 3 : MSU + 중간엽 줄기세포 투여군(MSC)

그룹 4 : MSU + mcRasburicase 형질전환된 중간엽 줄기세포 투여군(mcRasburicase-MSC)

그룹 5 : MSU + mcPegloticase 형질전환된 중간엽 줄기세포 투여군(mcPegloticase-MSC)

중간엽 줄기세포 또는 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포를 1x10⁵ 개가 되도록 준비한 다음, MSU 투여 전에 7일간격으로 마우스의 혈관으로 주입하였다. 중간엽 줄기세포 주입 후, 7일째 또는 14일째 MSU를 마우스 오른쪽 뒷발에 3 ㎎/㎕로 주입하였다.

도 11에 나타난 바와 같이, MSU 주입 24시간 후에 발의 두께를 확인한 결과, 7일 간격으로 1회 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포를 투여한 그룹에 비해 7일 간격으로 2회 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포를 투여한 그룹에서 급성 염증(acute inflammation)이 억제되는 것을 확인하였다.

4-2 : 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포에 의한 급성 통풍 억제 효과 확인

MSU 주입 24시간 후에 발의 두께를 확인한 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 7일 간격으로 1회 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포를 투여한 그룹에 비해 7일 간격으로 2회 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포를 투여한 그룹에서 급성 염증(acute inflammation)이 억제되는 것을 확인하였다.

또한, 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포를 투여한 마우스의 발바닥(Footpad) 조직을 면역화학염색방법으로 관찰하였다.

마우스 발 조직에 4% 포르말린 용액(paraformalin solution)을 조직의 10배정도 첨가한 다음, 4℃에서 1일 동안 보관하였다. 그 후, 20% 산성탈회용액을 2일 간격으로 3주동안 갈아준 뒤, 조직에서 물을 빼는 과정인 수세 과정을 거친 다음, 파라핀(paraffin)에 하루 동안 보관하였다. 조직편 전체를 일정한 형태로 경화시키고 동시에 조직 내 공간을 메워 조직의 구조적 변형이 발생하지 않도록 하는 과정인 포매(embedding)과정을 통해 파라핀 블록을 만들고 4㎛ 두께로 절편(section) 슬라이드(slide)를 제작하였다. 제작된 슬라이드를 60℃의 슬라이드 플레이트(slide plate) 위에서 하룻밤 동안 반응시킨 다음, 자일렌(xylene) 및 에탄올(ethanol)을 이용하여 파라핀을 제거하고(diparaffine 단계), 헤마톡실린-에오(Hematoxylin & Eosin) 용액으로 염색하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 대조군(MSU 단독 투여군)에 비해 조직 괴사가 감소한 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 일반 MSC 투여군에 비해 mcRasburicase 또는 mcPegloticase 형질전환된 중간엽 줄기세포 투여군에서 염증이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.

나아가, 염증성 사이토카인인 TNFα 및 IL-1β의 발현 정도를 확인하기 위해, 요산 분해 효소를 과발현하는 중간엽 줄기세포를 투여한 마우스의 발바닥(Footpad) 조직을 TNFα 및 IL-1β 항체로 각각 염색하여 염증 유발 세포를 관찰하고, 이를 수치화하여 나타내었다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 mcRasburicase 또는 mcPegloticase 형질전환된 중간엽 줄기세포 투여군에서 TNFα 및 IL-1β 발현량이 감소하는 것을 확인하였다. 특히, mcPegloticase 형질전환된 중간엽 줄기세포 투여군은 양성 대조군(colchicine) 투여군과 비슷한 수준으로 IL-1β 발현이 감소된 것을 확인하였다.

요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포의 만성 통풍 치료 효능 확인

5-1 : 동물모델 제작

본 발명에서는 요산 분해 효소 과발현 중간엽 줄기세포(eMSC)의 만성 통풍 치료 효능을 확인하기 위해, 상기 실시예 4와 같이 마우스를 준비하였으며, 마우스는 하기와 같이 5마리씩 5개의 그룹으로 나누었다.

그룹 1: MSU 단독 투여군(MSU)

그룹 2: MSU + 중간엽 줄기세포 투여군(MSC)

그룹 3: MSU + 빈벡터(mock vector)로 형질전환된 중간엽 줄기세포 투여군(mcMock-MSC)

그룹 4: MSU + mcRasburicase 형질전환된 중간엽 줄기세포 투여군(mcRasburicase-MSC)

그룹 5: MSU + mcPegloticase 형질전환된 중간엽 줄기세포 투여군(mcPegloticase-MSC)

각 그룹의 마우스에 고농도 요산 결정(MSU) 90 ㎎/㎕를 피하주사로 100㎕ 주입하여 고농도 요산 결정(High dose MSU) 동물모델을 제작하였다. MSU 주입 후 7일 간격으로 MSC 또는 eMSC를 1x 10⁶ 개/100㎕가 되도록 Tophi 부위(피하로 주사한 고농도 요산 결정이 뭉쳐진 부분)에 바로 주입한 다음, 7일 간격으로 14일까지 MSU를 관찰하였다.

5-2 : MSU 크기 비교

상기 실시예 5-1의 그룹별로 7일 간격으로 14일까지 MSU를 관찰하였으며, CT를 통해 고농도 MSU의 크기 차이를 확인하였다. 분석프로그램인 ITK-SNAP을 이용하여 MSU 크기를 수치화하여 나타내었다.

도 14 및 도 15에서 7일군은 고농도 MSU 주입 후 7일 후, 14일군은 고농도 MSU 주입 7일 후 MSC 또는 eMSC를 주입한 다음 7일 후를 관찰한 것을 의미한다.

그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, MSU 단독 투여군의 경우, 주입된 MSU가 계속 유지되는 것을 확인하였다. 반면, 도 15에 나타난 바와 같이, mcRasburicase-MSC 및 mcPegloticase-MSC 투여군의 경우, MSU 크기가 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.

또한, MSC 세포 막에 추적(tracking) 가능하게 염색을 진행 후 상기 실시예 5-1과 동일 한 방법으로 진행했을 때, MSC가 등부위에서 다른 부위로 이동하는 것은 확인 되지 않았다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for preventing or treating Gout comprising stem cells overexpressing Uricase <130> 1067388 <150> KR 10-2019-0057014 <151> 2019-05-15 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 960 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rasburicase <400> 1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtggccacag cggccgatgt ccactcgtca 60 gctgttaagg ccgcgagata tggtaaggat aatgttcgag tgtacaaggt tcataaagac 120 gaaaaaacag gggtacagac ggtgtatgaa atgaccgtct gtgtgctctt ggaaggggag 180 atagagacgt catacacaaa agctgacaac agtgttatcg tcgcgacgga cagtatcaaa 240 aacactatct atatcacggc taagcagaac ccggttacgc ctccagaatt gtttggatct 300 attctcggta cacatttcat cgaaaaatac aatcatatac atgcggctca tgtgaacatc 360 gtgtgccaca gatggacccg catggatata gacgggaaac cacacccgca tagttttatc 420 cgagactccg aagagaagcg caatgttcag gtagacgtgg tggagggcaa gggtatagat 480 atcaagagca gcctgagcgg cctcactgtg ttgaagtcca caaactcaca gttttgggga 540 ttcttgagag atgaatatac tacactgaag gaaacgtggg accgcattct ctccacagat 600 gtggacgcta catggcaatg gaaaaatttt agtgggcttc aggaggttcg gtctcacgtt 660 ccaaaattcg acgcaacgtg ggctactgcg cgggaagtca cgctcaaaac atttgccgaa 720 gataattctg catccgtgca agcaacgatg tacaaaatgg cggagcagat cctggcacga 780 cagcaactga tcgagaccgt cgagtactcc ctgccaaaca agcattattt cgaaatcgac 840 ctttcttggc acaaagggtt gcagaatacc gggaagaatg ccgaagtatt tgcacctcag 900 agtgatccta acggtctcat taagtgtaca gtggggagat ccagtttgaa gtcaaagctc 960 960 <210> 2 <211> 951 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegloticase <400> 2 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtggccacag cggccgatgt ccactcgaca 60 tacaaaaaaa atgacgaagt ggaattcgtc cgcactggct acgggaagga tatgattaag 120 gtcttgcaca ttcagagaga cgggaaatat cattcaatta aggaagttgc gactacggta 180 cagttgaccc tcagttccaa aaaagattac ctccacgggg acaattcaga tgtcattcct 240 actgatacga ttaaaaatac cgtaaacgta ttggcgaagt ttaaggggat taaatcaatc 300 gagacatttg cggtcactat ctgcgagcat tttctcagct cattcaaaca tgtcatacga 360 gcccaagttt atgtcgagga ggtgccctgg aagcgatttg agaagaacgg tgtgaagcac 420 gtacatgcgt ttatatacac gcctacaggc acgcactttt gtgaagtgga acaaattaga 480 aacggtcccc cggttatcca cagtggaata aaagatctca aagtactcaa gacgacccag 540 tctgggtttg aaggattcat caaggatcag tttaccactc ttccagaggt taaagatcga 600 tgttttgcca cacaggtgta ttgtaaatgg agatatcatc aggggcgcga cgtggatttt 660 gaggctacat gggacactgt gcggtccata gttctccaga agttcgcagg gccttatgac 720 aagggcgagt acagcccgtc tgtccagaaa accttgtacg acatacaggt tcttaccctc 780 ggccaggttc ccgaaataga agacatggag atctctctcc ctaacataca ctacctcaat 840 atcgatatgt ctaaaatggg ccttattaat aaagaagagg tcctgctccc actggacaac 900 ccctacggga agataactgg cactgtgaaa aggaaattgt cttcccggct t 951 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD45_F <400> 3 agcacctacc ctgctcagaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD45_R <400> 4 ttcagcctgt tcctttgctt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD90_F <400> 5 ctagtggacc agagccttcg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD90_R <400> 6 tggagtgcac acgtgtaggt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44_F <400> 7 aaggtggagc aaacacaacc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44_R <400> 8 agctttttct tctgcccaca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD105_F <400> 9 cactagccag gtctcgaagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD105_R <400> 10 ctgaggacca gaagcacctc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rasburicase_F <400> 11 atcacggcta agcagaaccc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rasburicase_R <400> 12 acattgcgct tctcttcgga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegloticase_F <400> 13 aagtggaatt cgtccgcact 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegloticase_R <400> 14 taaggccctg cgaacttctg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_F <400> 15 cgaggacagc gtgatcttca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_R <400> 16 cttagcgaga tccggtggag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1RN_F <400> 17 agaagacctc ctgtcctatg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1RN_R <400> 18 tactcgtcct cctggaagta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10_F <400> 19 tgccttcagc agagtgaaga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10_R <400> 20 ctcagacaag gcttggcaac 20 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-b_F <400> 21 tggttgtaca gggccagga 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-b_R <400> 22 tgcggcagct gtacattga 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NLRP3_F <400> 23 agctgaccaa ccagagcttc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NLRP3_R <400> 24 ttcgacatct ccttggtcct 20

Claims (6)

1. (a) 프로모터, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 라스부리카제(Rasburicase) 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 페글로티카제(Pegloticase) 단백질을 코딩하는 유전자 및 전사 터미네이터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고,
   (b) 상기 (a)의 유전자 발현 카세트 외부에 위치하는, 박테리오파지 람다의 att 부착 서열을 포함하며; 및
   (c) 복제 개시점 및 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는 비-바이러스성 벡터가 일렉트로포레이션(Electroporation) 방법으로 형질전환 된 라스부리카제(Rasburicase) 또는 페글로티카제(Pegloticase) 과발현 골수유래 중간엽 줄기세포.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항의 라스부리카제(Rasburicase) 또는 페글로티카제(Pegloticase) 과발현 골수유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 통풍의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
   
6. 제5항에 있어서, 상기 통풍은 급성 통풍 또는 만성 결절성 통풍인 것을 특징으로 하는 통풍의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

Images