CN117398464A - circRERE的抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及circRERE的抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用，涉及生物医药技术领域，所述circRERE的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的circRERE是潜在的缺血性心脏病的治疗靶点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及circRERE的抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用。
背景技术
缺血性心脏病严重危害人类健康。全球每年有2000万人死于心血管疾病，缺血性心脏病是主要的死亡原因。对于缺血性心脏病目前临床常用的治疗方法有药物治疗、冠脉植入手术治疗、外科手术搭桥术等，但药物具有潜在的不良反应、部分药物甚至会对预后产生不利影响，手术治疗也存在风险。探索新的治疗靶点对缺血性心脏病的治疗有积极的意义。
环状RNA(circRNA)是一种单链的非编码RNA，其结构为一种没有自由末端的共价闭环。环状RNA通过多种机制在生物体内发挥生理功能，参与靶基因表达的调控。研究表明环状RNA可以作为心血管疾病的一种潜在的治疗靶点，深入研究环状RNA在缺血性心脏病中的作用机制，发掘在生理和病理状态下差异表达的环状RNA对缺血性心脏病的治疗具有潜在的巨大意义。鉴于此，本发明提供circRERE的抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供circRERE的抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用。
本发明解决上述技术问题，第一方面是提供：circRERE的抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用，所述circRERE的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
说明，所述circRERE为环状RNA；所述circRERE的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，且首尾连接成环状结构。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的心肌细胞circRERE是潜在的缺血性心脏病的治疗靶点；
(2)在体外细胞学实验中，心肌细胞系HL-1模拟心梗状态下心肌缺氧的表现中，此circRERE在细胞中的表达量显著增加，奠定了作为缺血性心脏病潜在治疗靶点的细胞分子学基础；
(3)过表达此circRERE使心肌细胞活力下降，表明了此circRERE与缺血性心脏病的发生发展密切相关，证实了此circRERE作为缺血性心脏病治疗靶点的潜能；
(4)过表达此circRERE使心肌细胞的凋亡程度加重，提示了此circRERE可能参与缺氧诱导的心肌细胞凋亡，提示了此circRERE作为缺血性心脏病潜在治疗靶点的治疗机制；
(5)在小鼠体内通过本发明提供的siRNA下调此circRERE，使心肌缺血小鼠心肌组织中凋亡标志蛋白cleave Caspase 3蛋白表达水平下降，血清中心肌损伤标志物的水平降低，心肌损伤程度减轻，说明此circRERE可作为缺血性心脏病的治疗靶点。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述抑制剂通过抑制所述circRERE来减轻心肌缺血损伤，从而治疗缺血性心脏病。
本发明第二个方面一种治疗缺血性心脏病的药物，所述药物包括靶向circRERE的抑制剂。
进一步，所述靶向circRERE的抑制剂包括小分子化合物、蛋白、多肽、多糖、糖蛋白、糖肽、核酸中的任意一种或至少两种的组合。
进一步，所述核酸为siRNA。在小鼠体内通过本发明提供的siRNA下调此circRERE，此circRERE的下调使心肌缺血小鼠心肌组织中凋亡标志蛋白cleave Caspase 3蛋白表达水平下降，血清中心肌损伤标志物的水平降低，心肌损伤程度减轻，验证了本发明提供的siRNA对缺血性心脏病的治疗作用。
进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。
进一步，所述药物的剂型为注射剂或口服靶向药。
所述药物为药学上可接受的任意剂型均可。所述药物的适合给药剂量，根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。
进一步，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
所述药物组合物中的活性成分(本发明的靶向circRERE的抑制剂)的实际剂量应根据多种相关因素来确定，包括待治疗的疾病严重程度、施用途径、患者年龄、性别、体重，因此，上述剂量不应以任何方式限制本发明的保护范围。所述药学上可接受的载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。
附图说明
图1为本发明circRERE结构示意图；
图2为本发明人和小鼠circRERE序列比对图；
图3为本发明使用circRERE的引物对心肌缺血模型组小鼠和假手术组小鼠进行circRERE表达量检测的结果图；
图4为本发明使用circRERE的引物对缺血缺氧模型组HL-1心肌细胞和正常组HL-1心肌细胞进行circRERE表达量检测的结果图；
图5为本发明HL-1心肌细胞转染过表达circRERE质粒后，circRERE过表达效果检测的结果图；
图6为本发明过表达circRERE组和对照组HL-1心肌细胞经过缺血缺氧诱导后的细胞活力检测的结果图；
图7为本发明通过Western blotting检测过表达circRERE组和对照组HL-1心肌细胞经过缺血缺氧诱导后的凋亡标志蛋白cleave Caspase 3水平的蛋白条带图；
图8为本发明通过Western blotting检测过表达circRERE组和对照组HL-1心肌细胞经过缺血缺氧诱导后的凋亡标志蛋白cleave Caspase 3蛋白表达水平的统计图；
图9为本发明C57BL/6小鼠心肌注射下调circRERE的siRNA后，circRERE敲低效果检测的结果图；
图10为本发明通过Western blotting检测敲低circRERE组和对照组C57BL/6小鼠建立心肌缺血模型后的凋亡标志蛋白cleave Caspase 3水平的蛋白条带图；
图11为本发明通过Western blotting检测敲低circRERE组和对照组C57BL/6小鼠建立心肌缺血模型后的凋亡标志蛋白cleave Caspase 3水平的统计图；
图12为本发明敲低circRERE组和对照组C57BL/6小鼠建立心肌缺血模型后血清中的心肌损伤标志物cTn I水平检测的结果图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购得的常规产品。
实施例1：C57 BL/6小鼠上验证circRERE表达水平与缺血性心脏病之间的关系
通过体内实验在C57BL/6小鼠(购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司)上验证circRERE表达水平与缺血性心脏病之间的关系。
1.材料与方法：
1.1动物饲养：
将22-25g雄性C57BL/6小鼠，饲养在标准实验动物饲养条件下(室温为：22±2℃，相对湿度为：50-60％，黑暗/光照循环为：12h)。整个实验过程均遵守“实验动物饲养管理与使用指南”。
1.2模型建立：
在进行建立心脏缺血模型前对实验小鼠禁食、不禁水12h。以异氟烷麻醉小鼠，模型组小鼠结扎冠脉左前降支，假手术组小鼠仅穿线不结扎，以MS4000生物信号定量记录分析系统监测心电图，以QRS波幅加大，ST段抬高，T波高耸或倒置作为缺血成功标准。
1.3RNA提取和RT-qPCR检测：
根据试剂的使用说明，用Trizol试剂(购买于天根生化科技(北京)有限公司)分离总RNA。根据One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂(购买于北京全式金生物技术有限公司)说明书逆转录总RNA，根据/>GreenqPCR SuperMix试剂(购买于北京全式金生物技术有限公司)说明书完成RT-qPCR反应。根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：目的基因相对表达量＝2^(-△Ct)，△Ct＝Ctgene-Ctcontrol。
2.实验结果：
如图1所示，circRERE由基因的外显子反向剪接所形成。
如图2所示，circRERE在人和小鼠中高度保守。
如图3所示，使用RT-qPCR方法测定了假手术组和心肌缺血模型组小鼠的心肌组织中circRERE的表达量。模型组小鼠心肌组织中circRERE的表达量发生了显著性变化，显著高于假手术组。由于在病理状态下发生显著性上调或下调的circ RNA可能与疾病的发生发展有关，因此发生显著性上调的circRERE可能是潜在的药物治疗靶点，有望用于新药开发。
实施例2：在细胞水平验证circRERE与缺血性心脏病导致的心肌损伤的关系
通过体外实验在细胞水平验证circRERE与缺血性心脏病导致的心肌损伤的关系。
1.材料与方法：
1.1细胞培养：
小鼠心肌细胞系(HL-1)(购买于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司)使用含有10％胎牛血清(购买于依科赛生物科技股份有限公司)的MEM培养基(购买于GIBCO公司)，在含有5％二氧化碳的37度孵箱中培养。
1.2缺氧处理：
培养的心肌细胞在含有95％N2/5％CO2混合气体的培养室中进行缺氧处理。
1.3细胞转染：
circRERE过表达质粒订购自吉凯公司，根据LipofectamineTM3000试剂(购买于Thermo Fisher Scientific公司)说明书转染过表达质粒。
1.4RNA提取和RT-qPCR检测：
与实施例1相同，此处不再重复叙述。
1.5细胞活力检测：
根据细胞增殖-毒性检测试剂盒(购买于白鲨生物科技有限公司)的使用说明检测细胞活力。
1.6cleave Caspase 3蛋白水平检测：
用RIPA裂解液(购买于北京索莱宝科技有限公司)裂解细胞后离心收集上清，用BCA试剂盒(购买于上海碧云天生物技术有限公司)检测蛋白浓度。加入5×上样缓冲液(购买于上海碧云天生物技术有限公司)混匀，煮沸10min后进行SDS-PAGE电泳，之后将蛋白转移到PVDF固定载体(购买于sigma-aldrich公司)上。用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉(购买于上海雅酶生物医药科技有限公司)封闭2h，与cleave Caspase 3、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的一抗(购买于Abcam公司)在4℃孵育过夜，之后在室温与二抗(购买于Abcam公司)孵育1h。使用ECL显色液(购买于广东珠江桥生物科技股份有限公司)显影，通过凝胶成像系统采集图像，使用Image J软件对条带进行灰度分析。
2.实验结果：
如图4所示，为了进一步验证circRERE在药物开发中的潜力，选取小鼠HL-1心肌细胞，模拟心梗状态下心肌缺氧的表现(方法详见材料实施例2的1.2记载)。结果显示，缺氧处理组和对照组相比circRERE的表达量显著升高。这表明了，在心肌细胞缺氧的条件下，细胞中circRERE水平升高，这是circRERE作为缺血性心脏病药物的治疗靶点的细胞分子学基础。
如图5所示，为了证明circRERE参与了缺血性心脏病的病理过程以及进一步研究其作为治疗靶点的潜力。本发明构建了过表达circRERE的质粒，使用质粒转染HL-1心肌细胞，转染后circRERE表达量显著上升，表明转染成功，后续实验在此基础上完成。
如图6所示，转染过表达circRERE的质粒后，缺氧诱导的HL-1细胞活力显著下降。表明了circRERE与缺氧导致的心肌细胞损伤相关，证实了此环状RNA作为缺血性心脏病治疗靶点的潜能。
如图7和8所示，转染过表达circRERE的质粒后，缺氧诱导的HL-1细胞的cleaveCaspase 3蛋白水平显著上调。cleave Caspase 3蛋白是促进细胞凋亡的标志性蛋白，其水平升高会导致细胞损伤加重，这提示了circRERE可能参与到了缺氧所诱导的心肌细胞凋亡的过程，提示了此环状RNA作为缺血性心脏病潜在治疗靶点的治疗机制。
实施例3：证明circRERE为缺血性心脏病的治疗靶点
通过siRNA下调C57 BL/6小鼠circRERE表达水平，证明circRERE为缺血性心脏病的治疗靶点，并验证此siRNA对缺血性心脏病的治疗作用。
1.材料与方法：
1.1动物饲养：
与实施例1相同，此处不再重复叙述。
1.2模型建立：
与实施例1相同，此处不再重复叙述。
1.3circRERE的敲低：
敲低circRERE的siRNA核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。以异氟烷麻醉小鼠，打开胸腔，通过注射器将siRNA原位注射入心肌组织。
1.4RNA提取和RT-qPCR检测：
与实施例1相同，此处不再重复叙述。
1.5cleave Caspase 3蛋白水平检测：
与实施例2相同，此处不再重复叙述。
1.6ELISA检测血清中cTn I含量：
造模结束后收集血液，于室温静置1h使血液凝固，之后将血液以5000g的转速离心10min，收集上层血清。根据Mouse TNNI3/cTn-I(Troponin I Type 3,Cardiac)ELISA Kit试剂盒(购买于Elabscience)说明书检测cTn I含量。
2.实验结果：
如图9所示，为了证明circRERE可作为缺血性心脏病的治疗靶点，本发明设计了下调circRERE的siRNA并通过心肌注射转染小鼠心肌组织，转染后circRERE表达量显著下降。表明转染成功，后续实验在此基础上完成。
如图10和11所示，转染下调circRERE的siRNA后，心肌缺血模型小鼠的cleaveCaspase 3蛋白水平显著下降。cleave Caspase 3蛋白是促进细胞凋亡的标志性蛋白，其水平降低可减轻细胞损伤，这验证了敲低circRERE的siRNA发挥了减轻心肌缺血导致的心肌组织凋亡的作用。
如图12所示，转染下调circRERE的siRNA后，心肌缺血模型小鼠的心肌损伤标志物cTn I水平显著下降。验证了下调circRERE可减轻心肌缺血导致的心肌组织损伤，证明了circRERE可作为缺血性心脏病的治疗靶点。另一方面，转染本发明提供的siRNA可使心肌组织损伤减轻，这验证了此siRNA对缺血性心脏病有治疗作用。
综上可知，本发明选择C57 BL/6小鼠构建心肌缺血模型，还选取了HL-1心肌细胞构建缺血缺氧模型，并用RT-qPCR方法对circRERE进行了测定，确定其在缺血心肌中的表达上调。为了进一步研究circRERE在制备治疗缺血性心脏病的药物中的潜能，本发明在构建了缺血缺氧模型的HL-1心肌细胞上观察了过表达circRERE后心肌细胞的损伤加重、凋亡程度加深，验证了circRERE导致缺氧所诱导的心肌细胞损伤加重。之后本发明设计了敲低circRERE的siRNA，在心肌缺血模型小鼠体内通过siRNA敲低circRERE表达水平，观察了敲低circRERE前后小鼠凋亡程度、心肌损伤程度，证明了circRERE可作为缺血性心脏病的治疗靶点，并且验证了本发明提供的siRNA对缺血性心脏病的治疗作用。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (8)
1.circRERE的抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用，其特征在于，所述circRERE的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述circRERE的抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂通过抑制所述circRERE来减轻心肌缺血损伤，从而治疗缺血性心脏病。
3.一种治疗缺血性心脏病的药物，其特征在于，所述药物包括靶向circRERE的抑制剂。
4.根据权利要求3所述一种治疗缺血性心脏病的药物，其特征在于，所述靶向circRERE的抑制剂包括小分子化合物、蛋白、多肽、多糖、糖蛋白、糖肽、核酸中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求4所述一种治疗缺血性心脏病的药物，其特征在于，所述核酸为siRNA。
6.根据权利要求5所述一种治疗缺血性心脏病的药物，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。
7.根据权利要求3所述一种治疗缺血性心脏病的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂或口服靶向药。
8.根据权利要求3所述一种治疗缺血性心脏病的药物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
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