CN117157083A - 心脏保护因子miR-139-3p及其应用 - Google Patents

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Abstract

心脏保护因子miR‑139‑3p及其应用。提供了miR‑139‑3p在制备调控巨噬细胞极化的制剂中的应用。还提供了在外泌体中过表达miR‑139‑3p的试剂材料在制备用于促进巨噬细胞向M2型极化的制剂中的应用，抑制和/或敲低外泌体中miR‑139‑3p的表达的试剂材料在制备用于抑制巨噬细胞向M2型极化的制剂中的应用，以及miR‑139‑3p在制备调控信号转导与转录激活因子1的表达的制剂中的应用。过表达miR‑139‑3p的外泌体可传递心脏保护性miR‑139‑3p到巨噬细胞中，后者通过抑制Stat1的表达与激活促进M2巨噬细胞极化。

Description

心脏保护因子miR-139-3p及其应用
技术领域
本发明是关于心脏保护因子miR-139-3p及其应用，特别是关于miR-139-3p在抑制巨噬细胞浸润心肌、促进已浸润的巨噬细胞向M2极化、发挥抑制炎症和/或促进心肌修复效应等方面的应用。
背景技术
急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是一种致命性疾病。由于心肌细胞再生能力极弱，干细胞尤其是间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)移植有望成为修复受损心脏的替代疗法。尽管动物实验结果表明干细胞移植疗法可以有效改善AMI动物的心脏功能，但临床试验的结果却未见明显疗效和长期预后获益。这表明目前对AMI相关机制的了解并不透彻，细胞治疗策略仍需优化。
近几年的一些观点认为，旁分泌作用是干细胞发挥心脏修复作用的重要机制，主要由干细胞衍生的外泌体(exosome)介导该过程。外泌体由亲本细胞分泌并携带大量源自亲本的mRNA、非编码RNA(例如miRNA)、蛋白质、脂质等，这些生物活性分子及其在细胞间通讯中发挥的重要作用，使得研究者们开始关注并探索使用干细胞衍生的外泌体治疗缺血性心脏病。
另一方面，巨噬细胞功能对急性心肌梗死的影响一直吸引着研究者们进行探索。急性心肌梗死后一周内，大量来自外周血的单核细胞浸润到缺血和周边区心肌中，进而分化为巨噬细胞。这些单核细胞主要来源于骨髓和脾脏。急性心肌梗死后的前5天是炎症反应的爆发阶段，随后炎症逐渐消退。炎症反应对于心梗后心肌修复是必要的，但过度炎症会使损伤殃及正常心脏细胞，因此炎症的及时消退和控制对心肌修复非常有利。目前控制炎症的手段有：靶向单核细胞减少其聚集心肌，维持巨噬细胞吞噬功能，调节巨噬细胞平衡促进M2极化等。
巨噬细胞在受到刺激因素或外界环境的影响后，会分化为两个主要亚型：M1和M2，这个过程被称之为极化。在体外实验中，常用白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)、IL-10、IL-13、或转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)等刺激巨噬细胞诱导M2极化，伴随信号转导与转录激活因子6(signal transducer and activator oftranscription1,Stat6)的激活；用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)或干扰素γ(interferonγ,IFN-γ)刺激巨噬细胞诱导M1极化，伴随Stat1的激活(Khan J N,Mccann GP.Cardiovascular magnetic resonance imaging assessment of outcomes in acutemyocardial infarction[J].World J Cardiol,2017,9(2):109-133；Makkar R R,Smith RR,Cheng K,et al.Intracoronary cardiosphere-derived cells for heartregeneration after myocardial infarction(CADUCEUS):A prospective,randomizedphase 1trial[J].The Lancet,2012,379(9819):895-904)。急性心肌梗死后，心肌微环境中既存在促M1因子(如IFN-γ)也存在促M2因子(如IL-10,TGF-β)，导致心肌巨噬细胞是M1和M2共存的异质混合体。在心梗后的第1-3天，心肌中主要是M1型巨噬细胞，第5-7天则以M2型巨噬细胞为主(Majka M,M,Badyra B,et al.Concise Review:MesenchymalStem Cells in Cardiovascular Regeneration:Emerging Research Directions andClinical Applications[J].Stem Cells Translational Medicine,2017,6(10):1859-1867)。M1型巨噬细胞分泌细胞因子、趋化因子、生长因子和基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)，如TNFα、IL-1β、IL-6、IL-12、iNOS等，具有促进炎症、清除细胞碎片、降解细胞外基质的作用，但M1巨噬细胞的持续存在会导致梗死扩大、妨碍炎症消退和疤痕形成。M2型巨噬细胞生成抗炎、促血管生成、促修复的因子，如CD206、Arg1、IL-10、血管内皮生长因子、TGF-β等，具有吞噬凋亡细胞，促进血管新生和疤痕修复的作用(Koudstaal S,Jansen of Lorkeers S J,Gaetani R,et al.Concise review:heart regeneration andthe role of cardiac stem cells[J].Stem Cells Transl Med,2013,2(6):434-43)。因此，通过调节巨噬细胞平衡使其从M1向M2极化可有效改善梗死后心肌修复、提高心功能。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种可作为心脏保护因子的miRNA。
本发明的另一目的在于提供所述miRNA的相关应用。
本案发明人在研究中发现，miR-139-3p是一种与巨噬细胞极化相关的心脏保护因子。与高表达miR-139-3p的外泌体(MSCATV-Exo)相比，抑制外泌体中miR-139-3p的高表达后的外泌体MSCATV-Exo(miR inhibitor)使巨噬细胞M2型标志物表达水平降低。过表达miR-139-3p的外泌体MSC-Exo(miR mimic)可增加巨噬细胞中M2型标志物的表达水平。发明人的研究还发现，信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator oftranscription 1,Stat1)是miR-139-3p的一个靶基因。双荧光素酶报告基因实验表明miR-139-3p能与Stat1的3’UTR区特异结合后抑制其表达。miR-139-3p mimic或inhibitor降低或增加巨噬细胞中总Stat1表达水平；miR-139-3p mimic降低LPS刺激后的巨噬细胞中Stat1磷酸化水平。心梗大鼠心肌内注射MSCATV-Exo(miR inhibitor)后，心肌组织M2型标志物表达水平较MSCATV-Exo治疗组降低。心肌内注射MSC-Exo(miR mimic)后，心肌组织中M2型标志物表达水平与MSCATV-Exo治疗组相当。
从而，本发明提供了miR-139-3p作为心脏保护因子的相关应用。
具体而言，一方面，本发明提供了miR-139-3p在制备调控巨噬细胞极化的制剂中的应用。
根据本发明的具体实施方案，本发明提供了在外泌体中过表达miR-139-3p的试剂材料在制备用于促进巨噬细胞向M2型极化的制剂中的应用。
根据本发明的具体实施方案，其中，用于促进巨噬细胞向M2型极化的制剂包括过表达miR-139-3p的外泌体。优选地，所述外泌体为骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)衍生的外泌体。
根据本发明的具体实施方案，其中，在外泌体中过表达miR-139-3p的试剂材料包括：通过基因技术在外泌体中过表达miR-139-3p的试剂材料，和/或通过药物预处理干细胞而使得干细胞分泌高表达miR-139-3p的外泌体的试剂材料。优选地，所述药物预处理干细胞的药物例如可为他汀类药物，例如阿托伐他汀(atorvastatin,ATV)。
根据本发明的具体实施方案，本发明提供了抑制和/或敲低外泌体中miR-139-3p的表达的试剂材料在制备用于抑制巨噬细胞向M2型极化的制剂中的应用。
根据本发明的具体实施方案，其中，抑制和/或敲低外泌体中miR-139-3p的表达的试剂材料包括：miR-139-3p抑制剂、通过基因技术敲低外泌体中miR-139-3p的表达的试剂材料中的一种或多种。
根据本发明的具体实施方案，本发明提供了miR-139-3p作为巨噬细胞向M2型极化的调控因子的相关应用。
根据本发明的具体实施方案，其中，促进巨噬细胞向M2型极化的试剂材料包括：miR-139-3p模拟物、通过基因技术提高巨噬细胞中miR-139-3p的表达的试剂材料中的一种或多种。
另一方面，本发明还提供了miR-139-3p在制备调控信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,Stat1)的表达的制剂中的应用。
根据本发明的具体实施方案，本发明提供了过表达miR-139-3p的试剂材料在制备降低巨噬细胞中总Stat1表达水平的制剂中的应用。
根据本发明的具体实施方案，本发明提供了抑制和/或敲低外泌体中miR-139-3p的表达的试剂材料在制备用于增加巨噬细胞中总Stat1表达水平的制剂中的应用。
根据本发明的具体实施方案，本发明提供了过表达miR-139-3p的试剂材料在制备用于增加巨噬细胞中总Stat1表达水平的制剂中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种提高心肌组织M2型标志物表达水平的方法，该方法包括：向需要的受试者给予过表达miR-139-3p的外泌体。
另一方面，本发明还提供了一种治疗急性心肌梗死的方法，该方法包括：向需要的受试者给予过表达miR-139-3p的外泌体。通过过表达miR-139-3p的外泌体，可实现以下至少一种效果：减少心梗急性期心肌中巨噬细胞浸润、控制炎症反应，并促进浸润的巨噬细胞从M1型向M2型转化，促进心肌修复，减小心梗面积，改善心功能；和/或传递心脏保护性miR-139-3p到巨噬细胞中，通过抑制Stat1的表达与激活促进M2巨噬细胞极化。
本发明的具体实验表明，过表达miR-139-3p的外泌体治疗能更加有效地减少心梗急性期心肌中巨噬细胞浸润、控制炎症反应，并促进浸润的巨噬细胞从M1型向M2型转化，促进心肌修复，减小心梗面积，改善心功能。过表达miR-139-3p的外泌体MSCATV-Exo可传递心脏保护性miR-139-3p到巨噬细胞中，后者通过抑制Stat1的表达与激活促进M2巨噬细胞极化。
附图说明
图1A至图1G显示大鼠骨髓间充质干细胞衍生的外泌体提取与鉴定。其中，图1A：经ATV预处理或未经ATV预处理的大鼠骨髓间充质干细胞外体分离的示意方案。图1B：流式细胞术分析大鼠骨髓间充质干细胞表面标志物。图1C：显微镜下观察经二甲基亚砜或ATV处理的骨髓间充质干细胞的形态。图1D：透射电子显微镜扫描外小体的形态。图1E：外泌体蛋白质标记的Western blot分析。图1F：用不同浓度(2μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)的MSC-Exo或MSCATV-Exo处理24小时后，对M2巨噬细胞标记物Arg1的蛋白表达进行Western blot分析。图1G：用LPS刺激大鼠骨髓源巨噬细胞(BMDM)6小时，然后与40μg/mL MSC-Exo或MSCATV-Exo再孵育48小时，Western blot分析Arg1在BMDM中的蛋白表达。
图2A至图2I显示MSCATV-Exo对急性心肌梗死大鼠心室功能、心肌梗死大小、巨噬细胞浸润和M2极化的优越作用。其中，图2A：各组在AMI后第28天的代表性M型超声心动图。图2B：各组在AMI后第0、3、7、28天LVEF、LVFS、LVESV和LVEDV的动态变化，n＝6-7/组。图2C：第28天Masson三色染色的心脏横截面代表。图2D：图2C中各组梗死面积的量化，n＝6-7/组。图2E：急性心肌梗死后第3天梗死边缘区内CD68+或CD206+巨噬细胞的典型共焦图像。图2F：图2E中CD68+或CD206+巨噬细胞的定量，n＝6-7/组。图2G：各组梗死心肌中iNOS和Arg1表达的Western blot分析。图2H：图2G中iNOS和Arg1表达的定量，每组n＝3。图2I：通过qPCR测量梗死区M1(iNOS，IL-12，TNF-α)和M2(Arg1，IL-10，CD206)巨噬细胞标志物的mRNA表达，每组n＝3-4。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图3A至图3D显示MSCATV-Exo和MSC-Exo对体外巨噬细胞极化的影响。其中，图3A：PKH-67标记的MSCATV-Exo或MSC-Exo(绿色)通过大鼠BMDM摄取(红色)。图3B：免疫印迹分析BMDM中iNOS和Arg1的蛋白表达。图3C：图3B中iNOS和Arg1表达的定量，每组n＝3。图3D：定量PCR分析图3B中所述BMDM中巨噬细胞标记物(M1:iNOS、IL-12、TNF-α；M2:Arg1、IL-10、CD206)的mRNA表达，每组n＝4。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图4A至图4B显示MSCATV-Exo和MSC-Exo差异表达的miRNA。其中，图4A：火山图显示MSCATV-Exo和MSC-Exo所有差异表达的miRNA。图4B：qRT-PCR验证miRNA在MSCATV-Exo和MSC-Exo中的表达情况。
图5A至图5L显示miR-139-3p是体外靶向Stat1的MSCATV-Exo介导的巨噬细胞极化效应器。其中，图5A：分离MSCATV-Exo-miR inhibitor和MSC-Exo-miR mimics并孵育LPS预处理的大鼠BMDM的方案示意图。图5B：BMDM中巨噬细胞M1标记物iNOS和M2标记物Arg1的蛋白质表达。图5C：图5B中iNOS和Arg1表达的定量，n＝3/组。图5D：定量PCR分析图5A中所述BMDM中巨噬细胞标记物(M1:iNOS、IL-12、TNF-α；M2:Arg1、IL-10、CD206)的mRNA表达，每组n＝3-4。图5E：miR-139-3p模拟物直接转染LPS预处理的BMDM的方案示意图。图5F：BMDM中巨噬细胞M1标记物iNOS和M2标记物Arg1的蛋白表达。图5G：如图5F中iNOS和Arg1表达的定量，n＝3/组。图5H：定量PCR分析图5E中所述BMDM中巨噬细胞标记物(M1:iNOS、IL-12、TNF-α；M2:Arg1、IL-10、CD206)的mRNA表达，每组n＝3-4。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。图5I、图5J：转染miR-139-3p mimic或inhibitor的大鼠BMDM中Stat1的蛋白表达，每组n＝3。图5K、图5L：用LPS刺激并用miR-139-3p mimic或inhibitor转染的BMDM中iNOS、Arg1和p-Stat1的蛋白表达，每组n＝3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图6A至图6I显示MSCATV-Exo通过转移miR-139-3p增强AMI大鼠梗死区M2巨噬细胞极化。其中，图6A：AMI后第3天梗死区内CD68+(M1)和CD206+(M2)巨噬细胞的代表性共焦图像。图6B：图6A中CD68+或CD206+巨噬细胞的定量，n＝6-7/组。图6C：各组在AMI后第28天的代表性M型超声心动图。图6D：根据超声心动图图像比较各组左室射血分数和左室射血分数，每组n＝6-7*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图6E：第28天用Masson三色染色法对AMI心脏的代表性横截面进行观察。图6F：各组梗死面积的量化E，n＝6-7/组。图6G：Western blot分析各组梗死心肌中iNOS、Arg1和p-Stat1的表达。图6H：iNOS、Arg1和p-Stat1表达的量化(G)，每组n＝3。图6I：通过qPCR测量梗死区巨噬细胞M1(iNOS、IL-12、TNF-α)和M2(Arg1、IL-10、CD206)标记物的mRNA表达，每组n＝3-4。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图7显示本发明主要发现的示意性总结。在梗死边缘区心肌内注射大鼠骨髓MSCATV-Exo将上调的miR-139-3p输送到浸润的巨噬细胞，并通过抑制Stat1表达和激活促进M2巨噬细胞极化，促进梗死后的心脏修复。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的特点及所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
各实施例中，通用的实验材料和方法如下：
1.原代骨髓来源巨噬细胞的分离和培养
(1)选用雄性、体重60-80g的SD大鼠，颈椎脱臼法处死后置于75％酒精中浸泡3分钟左右；
(2)在生物安全柜中，沿大鼠后肢外侧剪开皮肤，钝性分离皮肤和肌肉，取下股骨和胫骨，浸于冷PBS中；
(3)进一步剔除附着在骨骼上的肌肉、软骨等；
(4)剪去骨骼两端少量骨骺，方便冲出骨髓腔中骨髓细胞；用2毫升注射器针头吸取IMDM完全培养基，插入骨骼两端，反复冲洗，收集冲出的骨髓细胞；
(5)配制巨噬细胞培养液：高糖DMEM培养基+10％胎牛血清+1％双抗+20ng/mlCSF；
(6)冲出的骨髓细胞液用70微米无菌滤网过滤掉组织残渣，500g离心5分钟，弃上清，用巨噬细胞培养基重悬细胞；
(7)将细胞悬液接种于10厘米培养皿中，1只大鼠的2条后肢提取的骨髓细胞可种4个10厘米皿；或者直接接种在12孔培养板中进行培养，方便后续实验；
(8)放于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
(9)每2天更换培养基，观察细胞分化情况；
(10)6-7天后可见已分化好的巨噬细胞，即可用于后续实验。
2.大鼠巨噬细胞极化实验
(1)实验中设置了M1型、M2型巨噬细胞组作为对照：
M1组：向巨噬细胞中加入终浓度为100ng/mL的LPS；
M2组：向巨噬细胞中加入终浓度为10ng/ml IL-4和10ng/ml IL-13；
(2)后续体外实验中，各种类型外泌体的浓度均为40μg/mL。
3.外泌体中miRNA的提取
由于外泌体中暂无合适的内参，故在提取外泌体miRNA时要引入外参，本发明中使用的是化学合成RNA单链、线虫来源的cel-miR-39-3p(锐博，广州)作为外参。具体步骤如下：
(1)根据不同组别外泌体蛋白浓度，取同等蛋白量的外泌体，分别加入500微升TRIZOL，混匀静置10分钟后使其完全裂解，彻底混匀；
(2)加入200nM、55微升的外参，彻底混匀，静置5-10分钟；
(3)加入100微升氯仿，上下颠倒混匀数次后，静置于冰上5分钟待其分层；
(4)以4℃、12000g离心15分钟；
(5)小心吸取最上层的透明液体(含RNA)，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，静置沉淀30分钟；
(6)以4℃、12000g离心15分钟；
(7)弃上清，加入500微升75％乙醇(无水乙醇和双蒸水配制)，颠倒混匀重悬沉淀；
(8)以4℃、8000g离心5分钟；
(9)弃上清，加入500微升75％乙醇，颠倒混匀重悬沉淀；
(10)以4℃、8000g离心5分钟；
(11)弃上清，室温下自然风干EP中多余的液体；
(12)加入10-25微升DEPC水(可根据沉淀量调整)溶解沉淀，可在56℃水浴锅中促溶15分钟；
(13)取1-2微升样本用Nanodrop测定总RNA浓度。
4.外泌体小RNA(small RNA)测序
(1)外泌体RNA提取及质检采用梯度超速离心法提取大鼠骨髓间充质干细胞来源的外泌体MSC-Exo和MSCATV-Exo后，考虑到外泌体中RNA含量较低，对于外泌体中small RNA表达谱检测，采用美基生物的HiPure Liquid RNA Mini Kit提取外泌体RNA，具体步骤见商品说明书。采用Qubit或Agilent 2200对样品质检，质检内容包括外泌体RNA的浓度、总量及RNA片段长度分布峰图。
其中，若Agilent 2200峰图有>500个核苷酸的大片段峰，代表外泌体样本可能存在核糖体或支原体污染。
(2)文库制备与质检提取到的外泌体RNA，先后连接3’端和5’的接头，逆转录成cDNA，再进行PCR扩增，切胶回收目的片段文库，质检合格的文库上机测序。
(3)上机测序使用Illumina HiSeqTM 2500进行上机测序。
(4)信息分析Illumina HiSeqTM 2500测序所得的原始数据，首先进行过滤：去掉数据序列两端的接头，去除片段长度<17个核苷酸的序列和低质量的序列等，完成数据的初步过滤并获得高质量数据。将高质量数据与大鼠参考基因组比对获得全基因组序列分布图谱，并与非编码RNA数据库(miRBase，Rfam和piRNABank)进行比对及分类注释。对鉴定出来的miRNA进行表达量计算、miRNA表达聚类和样品间差异表达miRNA分析，以差异倍数|log2(FoldChange)|>1且显著性水平P值<0.05为标准。对于差异显著的miRNA，采用miRWalk、TargetScan、miRDB和miRTarBase四个软件进一步预测miRNA的靶基因，并对靶基因进行基因功能(gene ontology，GO)和KEGG生物通路富集分析。
5.细胞转染miRNA模拟物或抑制剂
(1)将待转染的细胞种植于12孔细胞板中，待细胞密度达60％汇合时开始转染；
(2)取5微升lipo 3000和100微升opti-MEM混合，室温孵育5分钟；
(3)取10微升浓度为100nM的miRNA mimic或miRNA inhibitor、100微升opti-MEM混合，室温孵育5分钟；
(4)将(2)和(3)溶液混合，室温孵育20分钟；
(5)将(4)中得到的转染混合液加入12孔板中，在细胞培养箱中孵育；
(6)6-10小时后更换培养基，继续培养或进行其他药物干预后实验。
6.双荧光素酶报告基因实验
(1)实验分组
1)WT 3’UTR+NCmimic：WT为野生型(wild type)；
2)WT 3’UTR+miR-139-3p mimic；
3)Mut 3’UTR+NC mimic：Mut为突变型(mutated)；
4)Mut 3’UTR+miR-139-3p mimic。
(2)实验过程
1)将293T细胞系接种在96孔培养板中，细胞密度为1-2×104个/毫升，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，细胞密度达50-80％时即可开始转染；
2)用7.5微升1X riboFECTTMCP Buffer稀释0.25微升20μM mimic储存液和1微升100ng/μl Stat1基因3’UTR双荧光素酶报告载体质粒，轻轻混匀，室温孵育5分钟；
3)混合液制备：向2)中加入0.75微升riboFECTTMCP Reagent，轻轻吹打混匀，室温孵育0-15分钟；
4)将riboFECTTMCP混合液加入到90.50微升细胞培养基中，轻轻混匀；
5)将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24h；
6)取出待检测的培养板，吸去培养基，每孔加入75微升新鲜培养基，并加入75微升配制的luciferase底物，涡旋振荡10分钟，用酶标仪测定萤火虫荧光素酶基因(hLuc)荧光值；
7)加入配制的75微升stop regent，振荡10分钟，用酶标仪测定海肾荧光素酶基(hRluc)荧光值；
8)数据分析：将各孔hRluc的荧光值与hLuc的荧光值比较，将比值与对照孔的比值进行统计分析。
实施例1.miR-139-3p介导促进巨噬细胞M2极化
1.大鼠骨髓MSC来源外泌体鉴定
分离、培养大鼠骨髓MSC至第3-4代，待细胞生长至亚汇合状态时，给予1μmol/LDMSO或1μmol/L ATV干预24h，换液为不含胎牛血清的IMDM培养基后继续培养48h，收集细胞条件培养基后经梯度超速离心提取分别获得外泌体MSC-Exo和MSCATV-Exo(图1A)。流式细胞术鉴定出提取的原代MSC高比例表达表面标志物CD29和CD90，表达CD45和CD11b/c的细胞比例非常低，表明本发明提取的MSC纯度较高(图1B)。1μmol/L ATV的浓度为本案发明人前期研究确定的最佳浓度。显微镜下经1μmol/L ATV或DMSO处理的MSC形态学上无明显差异(图1C)。透射电子显微镜观察到MSC衍生的外泌体为茶托样或一侧凹陷的半球形膜结构，直径在100nm左右(图1D)。MSC衍生的外泌体表达Alix、CD63、TSG101和CD81等外泌体标志蛋白(图1E)。摸索体外模型最适合的外泌体浓度，发现用40μg/ml浓度的外泌体能达到最佳的促进M2极化的效果，后续体外实验选用该浓度(图1F)。体外模型中相同浓度下(40μg/ml)，MSCATV-Exo相对于MSC-Exo有着更好的促进巨噬细胞M2极化的效果(图1G)。
2.心肌内注射MSCATV-Exo有效改善急性心梗大鼠的心功能，并显著促进巨噬细胞浸润和巨噬细胞M2极化
急性心梗大鼠模型前降支结扎30分钟后，在梗死周边区分3点心肌内注射100μl共105μg外泌体(MSC-Exo或MSCATV-Exo)或等体积PBS。小动物超声结果显示：在心梗后第28天，相对于AMI模型组，MSC-Exo或MSCATV-Exo治疗组的LVEF值和LVFS值显著提高，LVEDV和LVESV值较AMI组的低，表明这两种外泌体治疗都可改善心功能；但MSCATV-Exo治疗组的LVEF值、LVFS值、LVEDV值和LVESV值较MSC-Exo治疗组的改善更加显著，表明MSCATV-Exo治疗的心肌保护效果更优(图2A、图2B)。Masson染色结果表明，相对于AMI模型组，MSC-Exo或MSCATV-Exo治疗组的心肌梗死面积显著减小；且MSCATV-Exo治疗组的心肌梗死面积较MSC-Exo治疗组的减小更显著(图2C、图2D)。以上结果表明，MSCATV-Exo治疗比普通MSC-Exo治疗能更加有效地减小梗死面积、改善心室功能。
为了进一步明确MSCATV-Exo治疗对心梗急性期心肌组织中巨噬细胞浸润及亚型的影响，本发明检测了心梗第3天梗死周边区心肌中巨噬细胞的表达情况。免疫荧光结果显示，AMI组梗死周边区心肌CD68+巨噬细胞数量较假手术组明显增多；相对于AMI组，外泌体组的梗死周边区CD68+巨噬细胞数量减少；相对于MSC-Exo组，MSCATV-Exo组的CD68+巨噬细胞数量减少更加明显(图2E-图2F)。进一步荧光标记M2型巨噬细胞(CD206+)结果显示，MSCATV-Exo组梗死周边区心肌中CD206+巨噬细胞数量较AMI组或MSC-Exo组都显著增多(图2E、图2F)。Western blot和qPCR结果显示，MSCATV-Exo组心肌组织中M2巨噬细胞标志物Arg1、IL-10、CD206的蛋白或mRNA表达量较AMI组或MSC-Exo组显著增高，而M1巨噬细胞标志物iNOS、IL-12、TNF-α的蛋白或mRNA表达量显著降低(图2G、图2H、图2I)。以上结果表明，心肌内注射MSCATV-Exo较普通MSC-Exo更加显著地减少心梗急性期梗死周边区心肌中CD68+巨噬细胞数量，但增加CD206+巨噬细胞数量。
3.MSCATV-Exo促进体外培养的巨噬细胞从M1型向M2型极化
在体外实验探索了MSCATV-Exo对巨噬细胞极化的影响。首先用PKH-67标记外泌体后加入到大鼠骨髓巨噬细胞的培养基中，免疫荧光结果可观察到巨噬细胞能有效摄取外泌体(图3A)。接着先用100ng/mL的LPS刺激巨噬细胞6小时，模拟急性心梗时体内炎症微环境、诱导巨噬细胞向M1极化，然后换液加入外泌体作用48小时。Western blot和qPCR结果显示，相对于空白对照组，M1组巨噬细胞中iNOS、IL-12、TNF-α的蛋白或mRNA表达水平增高，M2组巨噬细胞中Arg1、IL-10、CD206的蛋白或mRNA表达水平增高，表明M1和M2模型建立成功；相对于M1组，外泌体组Arg1、IL-10、CD206的蛋白或mRNA表达水平明显增高，iNOS、IL-12、TNF-α的蛋白或mRNA表达水平明显降低；相对于MSC-Exo组，MSCATV-Exo组Arg1、IL-10、CD206的蛋白或mRNA表达水平较高，iNOS、IL-12、TNF-α的蛋白或mRNA表达水平较低(图3B、图3C、图3D)。以上结果表明，MSCATV-Exo显著降低LPS刺激后的巨噬细胞表达M1型标志物、促进其表达M2型标志物，且较普通MSC-Exo的效应更强。
4.MSCATV-Exo中miRNA的表达谱分析
进行外泌体长链非编码RNA测序，以差异倍数|log2(FoldChange)|>1且显著性水平P值<0.05为标准，miRNA表达差异分析发现了上调表达的miR-139-3p(图4A)。用qPCR实验再次验证外泌体MSC-Exo和MSCATV-Exo中miR-139-3p的表达量，结果(图4B)与测序结果一致。
5.miR-139-3p介导促进巨噬细胞M2极化
本发明用miR-139-3p的抑制剂(inhibitor)或模拟物(mimic)转染MSCATV或MSC后提取相应的外泌体MSCATV-Exo(inhibitor)和MSC-Exo(mimic)，用此外泌体作用于LPS刺激后的巨噬细胞(图5A)。Western blot和qPCR结果发现：相对于LPS+MSCATV-Exo(NCinhibitor)组，LPS+MSCATV-Exo(miR inhibitor)组Arg1、IL-10、CD206的蛋白或mRNA表达水平降低，iNOS、IL-12、TNF-α的蛋白或mRNA表达水平升高；LPS+MSC-Exo(miR mimic)组Arg1、IL-10、CD206、iNOS、IL-12、TNF-α的蛋白或mRNA表达水平则和LPS+MSCATV-Exo组相近(图5B、图5C、图5D)。
本发明用miR-139-3p mimic直接转染LPS干预后的巨噬细胞(图5E)。Westernblot和qPCR结果发现：相对于M1组，LPS+miR-139-3p mimic组Arg1、IL-10、CD206的蛋白或mRNA表达水平增高，iNOS、IL-12、TNF-α的蛋白或mRNA表达水平降低(图5F、图5G、图5H)。
以上结果表明，无论是用干扰miR-139-3p表达后的外泌体还是直接用miR-139-3p干扰物去作用于LPS干预后的巨噬细胞，miR-139-3p过表达后会使M2型标志物表达升高、M1标志物降低，反之，miR-139-3p敲低后会使M2型标志物表达降低、M1标志物升高，表明MSCATV-Exo通过传递miR-139-3p实现促进体外巨噬细胞向M2极化的作用。
为了全面分析miR-139-3p与M2极化相关的靶基因，本发明同时用miRWalk、TargetScan、miRDB和miRTarBase四个软件对其靶基因进行预测。其中，TargetScan预测到Stat1是miR-139-3p的一个靶基因。由于Stat1激活后可促进M1极化，故本发明拟定Stat1为miR-139-3p的靶基因，并提出科学假设：miR-139-3p高表达会抑制Stat1的表达和激活，从而抑制巨噬细胞向M1极化、促进向M2极化。
本实施例做了荧光素酶报告基因实验验证miR-139-3p与Stat1转录本3’UTR靶片段的配对结合。将构建好的pmiR-RB-ReportTM双荧光素酶质粒载体和miR-139-3p mimic共同转染293T细胞，荧光素酶活性检测结果表明：miR-139-3p mimic降低了Stat1野生型WT3’UTR组的荧光素酶活性，但对突变型Mut 3’-UTR组的荧光素酶活性无明显影响，表明miR-139-3p可与Stat1转录本3’UTR靶片段配对结合。
接着，本发明用miR-139-3p mimic或inhibitor转染巨噬细胞，Western blot实验结果表明：miR-139-3p mimic可降低Stat1总蛋白的表达水平，而使用miR-139-3pinhibitor后Stat1总蛋白水平则不会降低(图5I、图5J)。LPS刺激巨噬细胞后再转染miR-139-3pmimic或inhibitor，发现过表达miR-139-3p可明显降低Stat1的磷酸化水平、促进Arg1蛋白表达、抑制iNOS蛋白表达；而敲低miR-139-3p表达后，LPS刺激后的巨噬细胞中Stat1的磷酸化水平和iNOS蛋白表达水平依旧较高，Arg1蛋白表达水平依旧较低(图5K、图5L)。
综上，以上结果证明了miR-139-3p主要通过靶向抑制Stat1的表达和激活发挥促进M2、抑制M1的功能。
实施例2.miR-139-3p介导了MSCATV-Exo的促心肌巨噬细胞M2极化功能
本实施例在动物体内验证了miR-139-3p的作用。按照同样的方法给予急性心肌梗死模型大鼠心肌内注射miR-139-3p表达水平受干扰后的外泌体即MSCATV-Exo(miRinhibitor)或MSC-Exo(miR mimic)，检测心梗急性期即第3天时心肌组织中巨噬细胞极化的情况。免疫荧光结果表明，相对于MSCATV-Exo组，MSCATV-Exo(miR inhibitor)组心肌CD68+巨噬细胞数量增加，CD206+巨噬细胞数量降低；而MSC-Exo(miR mimic)组CD68+巨噬细胞数量降低水平、CD206+巨噬细胞数量升高水平则和MSCATV-Exo组相当(图6A、图6D)。
小动物超声结果显示：在心梗后第28天，相对于MSCATV-Exo组，MSCATV-Exo-miRinhibitor组的LVEF值和LVFS值显著降低，而相对于MSCATV-Exo-miR inhibitor组，MSC-Exo-miR mimic组LVEF与LVFS值又显著提高(图6B、图6E)。Masson染色结果表明，相对于MSCATV-Exo组，MSCATV-Exo-miR inhibitor组的心肌梗死面积显著升高；且MSC Exo-miRmimic组的心肌梗死面积较MSCATV Exo-miR inhibitor组心梗面积显著减小(图6C、图6F)。以上结果表明，miR-139-3p在MSCATV-Exo发挥治疗心肌梗死、缩小梗死面积的作用中起到重要作用。
Western blot和qPCR结果表明：相对于MSCATV-Exo组，MSCATV-Exo(miR inhibitor)组梗死周边区心肌组织中Arg1、IL-10、CD206的蛋白或mRNA表达水平降低，iNOS、IL-12、TNF-α的蛋白或mRNA表达水平升高，Stat1蛋白磷酸化水平升高，表明敲低miR-139-3p表达水平后的MSCATV-Exo治疗组心肌组织中浸润的M2型巨噬细胞比例降低了；而MSC-Exo(miRmimic)组Arg1、IL-10、CD206、iNOS、IL-12、TNF-α及Stat1磷酸化水平则与MSCATV-Exo组的相当，与MSCATV-Exo(miR inhibitor)组的有明显差异(图6G、图6H、图6I)。
以上结果综合说明，ATV预处理使MSC衍生的外泌体中高表达miR-139-3p，MSCATV-Exo心肌内注射后通过向损伤心肌中传递miR-139-3p，抑制更多的巨噬细胞浸润心肌、促进已浸润的巨噬细胞向M2极化，发挥抑制炎症、促进心肌修复效应(图7)。

Claims (13)

1.miR-139-3p在制备调控巨噬细胞极化的制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，该应用包括：在外泌体中过表达miR-139-3p的试剂材料在制备用于促进巨噬细胞向M2型极化的制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，用于促进巨噬细胞向M2型极化的制剂包括过表达miR-139-3p的外泌体。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述外泌体为骨髓间充质干细胞衍生的外泌体。
5.根据权利要求2所述的应用，其中，在外泌体中过表达miR-139-3p的试剂材料包括：通过基因技术在外泌体中过表达miR-139-3p的试剂材料，和/或通过药物预处理干细胞而使得干细胞分泌高表达miR-139-3p的外泌体的试剂材料。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述药物预处理干细胞的药物为他汀类药物，例如阿托伐他汀。
7.根据权利要求1所述的应用，该应用包括：抑制和/或敲低外泌体中miR-139-3p的表达的试剂材料在制备用于抑制巨噬细胞向M2型极化的制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，抑制和/或敲低外泌体中miR-139-3p的表达的试剂材料包括：miR-139-3p抑制剂、通过基因技术敲低外泌体中miR-139-3p的表达的试剂材料中的一种或多种。
9.miR-139-3p在制备调控信号转导与转录激活因子1(signal transducer andactivator of transcription 1,Stat1)的表达的制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，该应用包括：过表达miR-139-3p的试剂材料在制备降低巨噬细胞中总Stat1表达水平的制剂中的应用。
11.根据权利要求9所述的应用，该应用包括：抑制和/或敲低外泌体中miR-139-3p的表达的试剂材料在制备用于增加巨噬细胞中总Stat1表达水平的制剂中的应用。
12.一种提高心肌组织M2型标志物表达水平的方法，该方法包括：向需要的受试者给予过表达miR-139-3p的外泌体。
13.一种治疗急性心肌梗死的方法，该方法包括：向需要的受试者给予过表达miR-139-3p的外泌体，从而实现以下至少一种效果：
减少心梗急性期心肌中巨噬细胞浸润、控制炎症反应，并促进浸润的巨噬细胞从M1型向M2型转化，促进心肌修复，减小心梗面积，改善心功能；和/或
传递心脏保护性miR-139-3p到巨噬细胞中，通过抑制Stat1的表达与激活促进M2巨噬细胞极化。
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