CN109568343B - 促进骨髓间充质干细胞成骨分化的生物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进骨髓间充质干细胞(BM‑MSC)成骨分化的生物制剂，以及一种预防和/或治疗青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的药物组合物。本发明人发现lncAIS是涉及青少年特发性脊柱侧凸(AIS)进展的关键lncRNA，其中lncAIS与NF90相互作用以促进HOXD8mRNA稳定性，从而增强BM‑MSC中的RUNX2转录，导致正常BM‑MSC的成骨分化。相比之下，在AIS患者的BM‑MSC中lncAIS下调使得不能募集NF90，从而消除了HOXD8mRNA稳定性，这阻碍了用于成骨分化的RUNX2转录。因此，可以将过表达lncAIS、HOXD8或RUNX2的BM‑MSC用于制备促进BM‑MSC成骨分化的生物制剂以及预防和/或治疗AIS的药物组合物，从而为预防和/或治疗AIS提供新的手段。

Description

促进骨髓间充质干细胞成骨分化的生物制剂
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及用于促进骨髓间充质干细胞(BM-MSC)成骨分化的生物制剂和用于治疗青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的药物组合物。
背景技术
青少年特发性脊柱侧凸(Adolescent idiopathic scoliosis,AIS)是一种复杂的脊柱三维畸形，主要发生在青春期生长期间10至16岁的女孩中。脊柱侧弯进展可能出现外观畸形、后背疼痛、功能障碍，严重者将出现心肺功能受限等生理功能问题，不同程度影响社会活动。流行性病学调查结果显示在青少年中全球AIS发病率约为2-4％，其中约为10％被诊断患有AIS的人需要治疗。目前AIS的治疗包括支具疗法和外科手术矫正；其中全时支撑疗法可能导致背部疼痛和心理障碍，而使用椎弓根螺钉仪器的矫正手术不可避免地会导致严重的手术创伤，螺钉位置不良时甚至造成永久性的灾难性神经或血管受伤。如果能够尽早检测出AIS发病及其进展的风险，就可能及时采取合适的治疗方案，减少治疗延迟带来的痛苦和不便。在AIS的病因和发病机制上的新进展，如探索AIS发病的分子机制，将有可能为AIS检测以及进展预测和治疗提供更便利的方法。
研究表明，与性别和年龄匹配的对照组相比，AIS患者的骨骼生长异常，并且骨矿物质密度(BMD)持续下降。1982年Burner等人首次报道了AIS患者的骨量减少。大约三分之一的AIS患者BMD较差。据报道，低BMD是AIS女孩曲线进展的关键预后因素。有人认为骨量减少可能是导致AIS脊柱畸形的主要因素。许多研究证实，AIS患者的BMD降低了27％～38％。此外，对骨骼成熟的纵向随访显示，超过80％的AIS女孩持续存在骨量减少，提示骨量减少可能是AIS患者骨代谢的终身系统异常。
间充质干细胞(MSC)存在于所有哺乳动物器官的基质中，可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。此外，MSC在膜内和软骨内骨形成中都是必不可少的。我们以前证实了AIS患者骨髓(BM)的MSC显示出降低的成骨分化能力。Park等人的研究进一步证实了我们的研究结果。我们和其他人的研究表明，AIS患者的MSC在成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的发育过程中发生异常分化，鉴于间充质干细胞(MSC)在骨形成和再吸收中的功能特征，我们推测MSC的异常成骨分化与AIS的发病机理有关。然而，在AIS患者中是如何对MSC进行异常调节的仍然是难以捉摸的。
非编码RNA(ncRNA)被称为生命体中“暗物质”，ncRNA所占全基因组的比例与生物种间的复杂等级有着密切的相关性。ncRNA在发育和基因表达中发挥的复杂精确的调控功能解释了基因组的复杂性，同时也为人们从基因表达调控网络的维度来认识生命体的复杂性开启新的天地。越来越多的证据表明，一系列重大疾病的发生发展与非编码RNA调控失衡相关。
长链非编码RNA(lncRNA)最近被认为是一类基因的超过200个核苷酸(nt)的转录物，其不具备蛋白质编码能力。在各种物种中lncRNA保守性较低，但与蛋白质编码基因相比更具组织特异性。研究表明，lncRNA在基因调控和其他细胞过程中发挥着广泛的作用。lncRNA参与各种生物过程，包括染色质修饰、转录调控、印记和核转运。LncRNA通过多种机制发挥其功能，包括共转录调节、基因表达的调节，核或细胞质复合物的支架，以及与其他RNA的配对。我们最近报道了几种lncRNA参与肝癌干细胞的自我更新维持。最近的研究报道，几种lncRNA调节它们各自的邻近蛋白质编码基因，在中内胚层分化和心脏发育中发挥关键作用。然而，lncRNA在AIS发病机理中的生物学作用尚不清楚。
NF90蛋白是白细胞介素增强子结合因子3(ILF3)蛋白家族最主要的蛋白异构体之一，该家族蛋白与细胞内编码和非编码RNA及病毒始端相互作用，参与涉及细胞发育、细胞周期和病毒感染等多重细胞功能。其中NF90主要存在于细胞核中，是一种调节基因表达或稳定mRNA的RNA结合蛋白。
同源框基因(Homeobox gene,Hox基因)编码含有同源域的转录因子(Hox转录因子)，该转录因子决定沿着动物胚胎的前后体轴的位置同一性，它们在成人组织中广泛表达。在人类中，39种已知的HOX转录因子存在于四个独立的簇HOXA-D中，位于四条不同的染色体上。HOX基因在许多不同谱系和发育途径的胚胎发育过程中调节细胞分化。研究表明，来自不同器官的小鼠MSC的特征在于不同的地形(topographic)HOX代码，而来自人体不同解剖部位的成纤维细胞表达不同的HOX模式。这表明细胞的典型HOX代码反映了不同组织中功能活性HOX基因的特异性表达。
研究表明RUNX2是成骨细胞分化的主要转录调节因子，其在调节成骨细胞成熟和体内平衡中起基础性作用。据报道，Runx2缺陷型小鼠显示弱钙化骨而没有可检测到的成骨细胞，RUNX2通过上调骨基质形成的表达来促进骨形成，包括I型胶原、骨桥蛋白、骨钙蛋白、骨涎蛋白和纤连蛋白。最近研究表明，AIS患者的腰椎和股骨颈的低RUNX2表达与骨矿物质密度(BMD)之间存在正相关关系。
综上所述，为了给AIS提供便利的治疗方法，本发明探索了在骨髓间充质干细胞(BM-MSC)中与青少年特发性脊柱侧凸(AIS)发病相关的标志性lncRNA(我们称为lncAIS)，及其与其他相关调控因子相互作用对AIS发病的具体调控机制。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种促进骨髓间充质干细胞(BM-MSC)成骨分化的生物制剂，以及一种预防和/或治疗青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的药物组合物。
本发明的发明人在对青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的相关研究中发现，LncAIS(基因符号：ENST00000453347)是在AIS患者骨髓间充质干细胞(BM-MSC)中显著差异表达的lncRNA，其在AIS患者BM-MSC中显著下调。本发明的实验证明NF90在BM-MSC中结合lncAIS，并且lncAIS与NF90的相互作用；我们发现在选择的lncAIS沉默的BM-MSC中前10个下调的转录因子中，NF90特异性结合转录因子HOXD8的mRNA，并且HOXD8的mRNA与NF90在BM-MSC中的相互作用；本发明证明了lncAIS和HOXD8在人BM-MSC中高度表达，其中lncAIS与NF90相互作用以促进HOXD8mRNA稳定性，从而增强BM-MSC中的RUNX2转录，导致正常BM-MSC的成骨分化。相比之下，在AIS患者的BM-MSC中lncAIS下调使得不能募集NF90，从而消除了HOXD8mRNA稳定性，这阻碍了用于成骨分化的RUNX2转录。
本发明一个方面提供了促进骨髓间充质干细胞成骨分化的生物制剂，其中所述生物制剂中包含过表达lncAIS、HOXD8、或RUNX2的骨髓间充质干细胞。
在本发明生物制剂的实施方案中，在人骨髓间充质干细胞中lncAIS与NF90相互作用以促进HOXD8mRNA稳定性，从而增强骨髓间充质干细胞中的RUNX2转录，导致骨髓间充质干细胞的成骨分化。
在本发明生物制剂的一些实施方案中，用过表达lncAIS的慢病毒感染正常骨髓间充质干细胞以获得过表达lncAIS的骨髓间充质干细胞。
在本发明生物制剂的另一些实施方案中，用过表达HOXD8的慢病毒感染正常骨髓间充质干细胞以获得过表达HOXD8的骨髓间充质干细胞。
在本发明生物制剂的又一些实施方案中，用过表达RUNX2的慢病毒感染正常骨髓间充质干细胞以获得过表达RUNX2的骨髓间充质干细胞。
在本发明生物制剂的实施方案中，用pSicoR质粒作为慢病毒表达载体构建含有靶序列的慢病毒，然后感染正常骨髓间充质干细胞以获得过表达lncAIS、HOXD8或RUNX2的骨髓间充质干细胞。
本发明另一个方面提供了用于预防和/或治疗青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的药物组合物，其中所述药物组合物中包含过表达lncAIS、HOXD8或RUNX2的骨髓间充质干细胞(BM-MSC)以及药学上可接受的载体，任选地所述药物组合物还包含治疗AIS的其他药剂。
本文所用术语“表达下调”或“下调”指对于特定核苷酸序列如特定lncRNA序列或HOXD8基因序列，其序列量的测量表明，例如，与对照如正常个体相比，在从AIS患者或具有AIS风险的个体分离的生物样品如BM-MSC中，该序列的表达水平降低。反之，“表达上调”或“上调”指对于特定核苷酸序列如特定lncRNA序列或HOXD8基因序列，其序列量的测量表明，例如，与对照如与正常个体相比，在AIS患者或具有AIS风险的个体分离的生物样品如BM-MSC中，该序列的表达水平增加。
如本发明所用，术语“个体”、“对象”或“患者”包括但不限于人和其他灵长类(例如黑猩猩以及其他猿和猴类)。在一些实施方式中，所述对象或患者是人。
在本发明中，术语“lncAIS(Ensembl基因组数据库基因符号：ENST00000453347)”是指具有目前国际共用核酸数据库GeneBank中该基因所示原始序列的lncRNA，其包括天然的或合成来源的lncRNA。lncAIS类似物是指所述lncRNA经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物学化学修饰后仍具有生物活性的衍生物或变体形式。
在本发明中，术语“HOXD8(NCBI数据库基因ID:3234)”是指具有目前国际共用核酸数据库GeneBank中HOXD8基因所示原始序列的HOXD8，其包括天然的或合成来源的HOXD8及其类似物。HOXD8类似物指其经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物学化学修饰后仍具有生物活性的衍生物或变体形式。
在本发明中，术语“NF90(NCBI数据库基因ID:3609)”是指具有目前国际共用核酸数据库GeneBank中ILF3基因所示原始序列的NF90，其包括天然的或合成来源的NF90及其类似物。NF90类似物指其经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物学化学修饰后仍具有生物活性的衍生物或变体形式。
在本发明中，术语“RUNX2(NCBI数据库基因ID:860)”是指具有目前国际共用核酸数据库GeneBank中RUNX2基因所示原始序列的RUNX2，其包括天然的或合成来源的RUNX2及其类似物。RUNX2类似物指其经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物学化学修饰后仍具有生物活性的衍生物或变体形式。
本发明的药物组合物可以包括经典的药物配制品。可以通过任意常规途径施用根据本发明的药物组合物，只要靶组织通过该途径可以获得即可。
在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物还任选地包含一种或多种其他对治疗AIS有效的药物，这些药物是本领域技术人员所熟知的。本发明的药物组合物可以与其他治疗手段联合施用，用于AIS的预防和/或治疗。
有益效果：
本发明人发现lncAIS是涉及青少年特发性脊柱侧凸(AIS)进展的关键lncRNA，其中lncAIS与NF90相互作用以促进HOXD8mRNA稳定性，从而增强BM-MSC中的RUNX2转录，导致正常BM-MSC的成骨分化。相比之下，在AIS患者的BM-MSC中lncAIS下调使得不能募集NF90，从而消除了HOXD8 mRNA稳定性，这阻碍了用于成骨分化的RUNX2转录。因此，可以将过表达lncAIS、HOXD8或RUNX2的骨髓间充质干细胞(BM-MSC)用于制备促进骨髓间充质干细胞(BM-MSC)成骨分化的生物制剂和治疗青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的药物组合物，从而为预防和/或治疗AIS提供新的手段。
附图说明
图1中a至h所示的结果证明了LncAIS在AIS患者的BM-MSC中下调。具体地，
图1a所示为通过对健康供体和AIS患者的BM-MSC进行了微阵列分析，得到的差异表达的lncRNA的聚类分析图，其中lncAIS是AIS患者的BM-MSC中下调幅度最大的lncRNA。
图1b显示LncAIS位于人的1号染色体上，其被鉴定为保守基因座。
图1c所示为通过实时qPCR对正常健康供体(Normal)和AIS患者的BM-MSC中LncAIS转录物进行比较，结果表明在AIS患者来源BM-MSC中lncAIS显著下调。
图1d所示为通过Northern印迹对正常健康供体(Normal)和AIS患者的BM-MSC中的LncAIS表达进行比较，结果表明AIS患者的BM-MSC中lncAIS下调。
图1e所示为通过编码能力评估工具(CPAT)分析，LncAIS无编码潜力，其中XIST转录物用作非编码基因对照，GAPDH和RUNX2用作编码基因对照。
图1f所示为采用pcDNA4-myc-his质粒进行的外翻译测定结果表明，lncAIS不产生任何可检测的肽，其中KLF4用作编码蛋白质对照。
图1g所示的BM-MSC细胞分级分离测定结果表明，lncAIS主要分布在人BM-MSC的细胞核中，其中HMBS RNA、ACTIN RNA和GAPDH RNA作为细胞质基因表达的阳性对照，U1RNA充当核基因表达的阳性对照。
图1h所示的RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)测定结果表明，相对于正常健康供体(Normal)，AIS患者的BM-MSC中lncAIS下调，其中红色：lncAIS探针(probe)；绿色：肌动蛋白(Actin)；细胞核由DAPI复染。
图2中a至i所示的结果证明了LncAIS敲低抑制成骨分化和骨形成。具体地，
图2a所示为shlncAIS BM-MSC与shCtrl(加扰对照)BM-MSC的lncAIS转录物比较，使用慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)在正常健康供体BM-MSC中沉默lncAIS，lncAIS转录物明显降低。
图2b所示为shlncAIS BM-MSC与shCtrl(加扰对照)BM-MSC的细胞增殖比较，结果表明shlncAIS处理的BM-MSC细胞中lncAIS消耗抑制BM-MSC的增殖。
图2c所示为通过伤口愈合测定法，分别测量shlncAIS BM-MSC与shCtrl(加扰对照)BM-MSC的细胞迁移，结果表明lncAIS敲低不影响BM-MSC的迁移能力。
图2d所示为采用Hoechst 33342/PI双染色和流式细胞术，分析shlncAIS BM-MSC与shCtrl(加扰对照)BM-MSC的细胞凋亡，结果表明shlncAIS处理的BM-MSC细胞中lncAIS消耗不显著改变细胞凋亡。
图2e所示为shlncAIS BM-MSC与shCtrl(加扰对照)BM-MSC中的自我更新相关基因的表达水平比较，结果表明lncAIS消耗显著抑制BM-MSC中自我更新相关基因(NANOG、POU5F1和SOX2)的表达水平。
图2f所示为shlncAIS BM-MSC与shCtrl(加扰对照)BM-MSC中的成骨分化基因的表达水平比较，结果表明lncAIS消耗显著下调成骨分化基因(ALPL、BSP、RUNX2、LPL和PPAR)的表达水平。
图2g所示为shlncAIS BM-MSC与shCtrl(加扰对照)BM-MSC中的ALP染色比较，结果表明lncAIS敲低显著抑制成骨分化。
图2h所示为shlncAIS BM-MSC与shCtrl(加扰对照)BM-MSC中的Von Kossa染色比较，结果表明lncAIS敲低使矿物质沉积减少。
图2i所示为通过在NOD/SCID小鼠中使用异位骨形成模型，对shlncAIS BM-MSC与shCtrl(加扰对照)BM-MSC的体外成骨分化和体内异位骨形成进行比较，其中通过FastGreen染色测量骨基质形成，并通过Alcian Blue染色测量骨成熟度；结果表明lncAIS敲低抑制体外成骨分化和体内异位骨形成。
图3中a至i所示的结果证明了LncAIS过表达促进成骨分化和骨形成。具体地，
图3a显示通过慢病毒在正常(Normal)BM-MSC中过表达lncAIS显著增加了其细胞增殖。
图3b和3c显示通过慢病毒在正常BM-MSC中过表达lncAIS增强了自我更新相关基因(NANOG、POU5F1和SOX2)(图3b)和成骨分化基因(ALPL、BSP、RUNX2、LPL和PPAR)(图3c)的表达水平。
图3d所示为，与成体分化期间的载体转染的BM-MSC相比，lncAIS过表达增加了成骨标志物基因如骨桥蛋白(OPN)、COL1A1和IBSP的蛋白水平。
图3e和3f所示为ALP染色(图3e)和Von Kossa染色(图3f)结果表明，lncAIS过表达增强BM-MSC的成骨分化。
图3g所示为通过NOD/SCID小鼠体内异位骨形成模型显示，lncAIS过表达的正常BM-MSC(Normal+oelncAIS)显著增加小鼠移植物中类骨质的数量和大小。
图3h和3i所示为通过慢病毒感染在AIS患者的BM-MSC中实施lncAIS表达，结果表明在AIS患者的BM-MSC中过表达lncAIS(AIS+oelncAIS)也可以将自我更新相关基因(NANOG、POU5F1和SOX2)(图3h)和成骨分化基因(ALPL、BSP、RUNX2、LPL和PPAR)(图3i)的表达水平挽救至正常水平。
图3j和3k所示的ALP染色(图3j)和Von Kossa染色(图3k)结果表明，在AIS患者的BM-MSC中强制的lncAIS表达(AIS+oelncAIS)也恢复了成骨分化能力。
图4中a至l所示的结果证明了LncAIS激活HOXD8转录。具体地，
图4a所示为对lncAIS沉默(shLncAIS)和shCtrl处理的BM-MSC进行转录组微阵列分析的热图，其中列出了shlncAIS的BM-MSC中前10个下调的TF。
图4b所示为对shCtrl和shLncAIS的BM-MSC进行实时qPCR比较分析，结果表明在BM-MSC中前10个下调TF中，作为BM-MSC标记基因的HOXD8在BM-MSC中表达最高。
图4c所示为用表达shHOXD8的慢病毒感染正常BM-MSC以耗尽HOXD8，然后用CCK-8试剂盒检测细胞增殖；结果表明与shCtrl处理的细胞相比，HOXD8消耗(shHOXD8)抑制BM-MSC的增殖。
图4d和4e所示为用表达shHOXD8的慢病毒感染正常BM-MSC以耗尽HOXD8，分别在MSC维持培养基(图4d)和OriCell MSC成骨分化培养基(图4e)中培养指定的BM-MSC，实时qPCR评估结果表明HOXD8消耗抑制了BM-MSC中自我更新相关基因(NANOG、POU5F1和SOX2)(图4d)和成骨分化基因(ALPL、BSP、RUNX2、LPL和PPAR)(图4e)的表达水平。
图4f和4g所示为用表达shHOXD8的慢病毒感染正常BM-MSC以耗尽HOXD8，将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养，ALP染色(图4f)和Von Kossa染色(图4g)结果表明，通过HOXD8消耗抑制了成骨分化。
图4h所示为用过表达HOXD8(oeHOXD8)的慢病毒感染正常BM-MSC后在MSC培养基中培养，结果表明HOXD8过表达显著增加正常BM-MSC中的细胞增殖速率。
图4i和4j所示为用过表达HOXD8(oeHOXD8)的慢病毒感染正常BM-MSC后，分别在MSC培养基(图4i)和OriCell MSC成骨分化培养基(图4j)中培养，实时qPCR评估结果表明HOXD8过表达增加BM-MSC中自我更新相关基因(NANOG、POU5F1和SOX2)(图4i)和成骨分化基因(ALPL、BSP、RUNX2、LPL和PPAR)(图4j)的表达水平。
图4k和4l所示为用过表达HOXD8(oeHOXD8)的慢病毒感染正常BM-MSC后在OriCellMSC成骨分化培养基中培养，ALP染色(图4k)和Von Kossa染色(图4l)结果表明，HOXD8过表达增强BM-MSC的成骨分化。
图5中a至l所示的结果证明了LncAIS与NF90相互作用以增强HOXD8的mRNA稳定性。具体地，
图5a所示为通过RT-qPCR评估表明正常BM-MSC中lncAIS的消耗(shLncAIS)不影响其邻近基因的表达水平，其中NS表示不显著，这表明lncAIS可能在反式中发挥其调节作用。
图5b所示为生物素标记的RNA敲低测定，以鉴定来自BM-MSC裂解物的可能的lncAIS相关蛋白，结果表明NF90在BM-MSC中结合lncAIS。
图5c所示为通过RNA下拉(敲低)测定验证了lncAIS与NF90的相互作用，然后通过抗-NF90抗体进行免疫印迹分析。
图5d所示为将BM-MSC裂解物与抗-NF90(Anti-ILF3)抗体一起温育，通过免疫沉淀(RIP)测定验证了lncAIS与NF90的相互作用。
图5e所示为在BM-MSC的细胞核中将lncAIS与NF90共定位。通过RNA-FISH用lncAIS探测BM-MSC，然后对NF90进行免疫荧光染色。红色：lncAIS探针；绿色：NF90；细胞核由DAPI复染。
图5f和图5g所示为，用表达shNF90的慢病毒感染正常BM-MSC，分别在MSC培养基(图5f)和OriCell MSC成骨分化培养基(图5g)中培养，实时qPCR评估结果表明NF90消耗(shNF90)抑制了BM-MSC中自我更新相关基因(NANOG、POU5F1和SOX2)(图5f)和成骨分化基因(ALPL、BSP、RUNX2、LPL和PPAR)(图5g)的表达水平。
图5h和图5i所示为，用表达shNF90的慢病毒感染正常BM-MSC后在OriCell MSC成骨分化培养基中培养，ALP染色(图5h)和Von Kossa染色(图5i)结果表明，NF90消耗(shNF90)抑制了BM-MSC的成骨分化。
图5j所示为通过RIP测定分析BM-MSC中指定的mRNA与NF90的相互作用；将BM-MSC裂解物与抗-NF90抗体一起温育，然后进行RNA免疫沉淀和实时qPCR，结果表明在选择的lncAIS沉默的BM-MSC中前10个下调的转录因子中，NF90特异性结合HOXD8的mRNA。
图5k所示为通过RIP测定验证HOXD8的mRNA与NF90在BM-MSC中的相互作用；将BM-MSC裂解物与抗-NF90抗体一起温育，然后进行RIP测定。另外如图5l所示，在Act D处理后的指定时间点，通过实时qPCR测量来自指定BM-MSC的HOXD8mRNA稳定性。结果表明，BM-MSC中的lncAIS消耗(shLncAIS)消除了NF90与HOXD8mRNA的3'-UTR区域的相互作用(图5k)，并因此导致HOXD8 mRNA衰减(图51)。一致地，AIS患者的BM-MSC中NF90与HOXD8mRNA的3'-UTR区域的相互作用是不可检测的(图5k)，而且也消除了HOXD8mRNA的稳定性(图5l)。
图6中a至h所示的结果证明了HOXD8启动RUNX2表达以驱动成骨分化。具体地，
图6a所示为通过ChIP测定，HOXD8、RNA聚合酶II(Pol II)和H3K4me3一起在RUNX2启动子上高度富集。
图6b所示为用指定的慢病毒感染正常BM-MSC，并通过qPCR评估RUNX2表达。结果表明，HOXD8的消耗(shHOXD8)抑制了BM-MSC中的RUNX2表达，相反，在HOXD8沉默的BM-MSC中HOXD8的过表达(shHOXD8+oeHOXD8)可以恢复RUNX2表达；这表明RUNX2基因是HOXD8的下游靶标。
图6c和图6d所示为用指定的慢病毒感染正常BM-MSC，并分别在MSC培养基(图6c)和OriCell MSC成骨分化培养基(图6d)中培养，实时qPCR评估结果表明，在lncAIS沉默(shLncAIS)的BM-MSC中恢复HOXD8或RUNX2可以很好地挽救自我更新相关基因(NANOG、POU5F1和SOX2)(图6c)和成骨分化基因(ALPL、BSP、RUNX2、LPL和PPAR)(图6d)的表达水平。
图6e和图6f所示为用指定的慢病毒感染正常BM-MSC，在MSC培养基中培养3天后在OriCell MSC成骨分化培养基中培养以诱导成骨分化，ALP染色(6e)和Von Kossa染色(图6f)结果表明，在lncAIS沉默的BM-MSC中恢复HOXD8或RUNX2可以很好地将成骨分化能力恢复到正常水平。
图6g和图6h所示为将指定的BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天诱导成骨分化，ALP染色(图6g)和Von Kossa染色(图6h)的结果验证了，在AIS患者的BM-MSC中强制表达HOXD8或RUNX2也可以将成骨分化能力恢复到正常水平。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
以下为本发明实施例所用材料和一般性方法
抗体和试剂
针对H3K4me3(9751)的抗体购自Cell Signaling Technology(Danvers，USA)。针对人HOXD8(ab228450)和NF90(ab89100)的抗体购自Abcam(Cambridge，USA)。针对人RNA聚合酶II(克隆4H8)的抗体购自Active Motif(Carlsbad，USA)。抗β-肌动蛋白(克隆AC-74)的抗体来自Sigma-Aldrich(St.Louis，USA)。针对Myc(克隆9E10)的抗体来自Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz，USA)。针对COL1A1(BA0325)、IBSP(BA2329)和OPN(PA1432)的抗体来自Boster(中国武汉)。与Alexa-594缀合的二抗购自Molecular probes Inc(Eugene，USA)。链霉亲和素珠来自Sigma-Aldrich(St.Louis，USA)。蛋白质A/G珠来自SantaCruz Biotechnology(Santa Cruz，USA)。碱性磷酸酶检测试剂盒购自Millipore(Millerica，USA)。SuperReal预混合加qPCR缓冲液来自TIANGENBiotech(中国北京)。OriCell BM-MSC成骨分化试剂盒来自Cyagen(HUXMA-90021，中国)。Von Kossa染色试剂盒来自Genmed Scientifics(中国上海)。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)来自Dojindo(Kumamoto，Japan)。Fast Green染色试剂盒和Alcian Blue染色试剂盒来自XinhualvyuanBiotechnology(中国北京)。
本发明的探针、引物和shRNA基因序列
表1：用于RNA FISH的lncAIS(11-228nt)探针序列
Figure BDA0001858669260000061
Figure BDA0001858669260000071
表2：用于lncAIS敲低的shLncAIS基因序列
基因 基因序列 序列编号
shLncAIS#1 5’-TTCCTAATCCTGCTCCAG-3’ SEQ ID NO:4
shLncAIS#2 5’-ATAGACATCTGGTTTCTGG-3’ SEQ ID NO:5
shLncAIS#3 5’-TTAGGACATAGACATCTG-3’ SEQ ID NO:6
表3：用于HOXD8敲低的shHOXD8基因序列
基因 基因序列 序列编号
shHOXD8#1 5’-GCTCGTCTCCTTCTCAAAT-3’ SEQ ID NO:7
shHOXD8#2 5’-GGCCGAGCTGGTACAATAT-3’ SEQ ID NO:8
shHOXD8#3 5’-GACAAACCTACAGTCGCTT-3’ SEQ ID NO:9
表4：用于NF90敲低的shNF90基因序列
基因 基因序列 序列编号
shNF90#1 5’-AAACCCAGTGAAGCACAGG-3’ SEQ ID NO:10
shNF90#2 5’-AAGCCTGTCTGTTTCTTGC-3’ SEQ ID NO:11
shNF90#3 5’-AATCCCATGCATCTGCAGC-3’ SEQ ID NO:12
表5：qRT-PCR分析中用于cDNA扩增的引物序列
Figure BDA0001858669260000072
Figure BDA0001858669260000081
患者和样本
从42名AIS患者(平均年龄14.5岁，范围12-17岁)和25名健康供体(平均年龄14.9岁，范围12-17岁)获得骨髓(BM)抽吸物。在AIS组中，所有患者都接受了全面的临床和放射学检查，以排除脊柱侧凸的其他原因并确定AIS的诊断。在对照组中，25名年龄和性别匹配的受试者中的每一个经体格检查具有直脊柱和正常的向前弯曲测试。进入研究时，他们被证实没有任何相关的医学疾病或脊柱畸形。该研究经中国医学科学院伦理委员会和北京协和医院批准。在进入研究之前，从所有受试者及其父母获得书面知情同意书。
细胞分离、培养和成骨分化测定
从AIS患者和健康供体收集人骨髓组织。所有实验均按照中国医学科学院伦理委员会和北京协和医院批准的程序进行。如下文(Zhuang Q,Mao W,Xu P,Li H,Sun Z,Li S,et al.Identification of Differential Genes Expression Profiles and Pathwaysof Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells of Adolescent Idiopathic ScoliosisPatients by Microarray and Integrated Gene Network Analysis.Spine 2016,41(10):840-855)所述分离和培养人BM-MSC。用补充有10％FBS和100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM培养人293T细胞。使用标准方案在293T细胞中产生慢病毒。使用lipofectin(Invitrogen)进行转染。对于shRNA敲低和过表达实验，将靶序列构建到pSicoR质粒中。慢病毒由293T细胞产生。筛选3种shRNA构建体中最有效的shRNA用于以下实验。在每个测定中使用三个独立的敲低细胞系进行生物学重复。进行至少四次独立实验作为生物学重复。用于基因敲低的shRNA基因序列列于以上表2-4中。为了诱导成骨分化，将第三代BM-MSC接种在六孔板中，并根据制造商的方案用成骨诱导培养基处理。培养基每3天更换一次。
伤口愈合试验
将培养皿用0.1％明胶(v/v)在37℃下涂覆1小时。将1×106个BM-MSC细胞铺板以产生汇合的单层。培养细胞以完全粘附和扩散。通过用p200移液管尖端手动刮擦细胞单层来产生伤口。使用参考点标记获取第一图像。将细胞在组织培养箱中培养24小时。通过匹配第一图像的拍摄区域来获取第二图像。
编码潜力分析
根据制造商的说明，通过编码潜力评估工具(CPAT)在http://lilab.research.bcm.edu/cpat/的网站上分析lncAIS的编码潜力。XIST转录物用作非编码基因对照。GAPDH和RUNX2用作编码基因对照。
细胞分级分离分析
根据制造商的说明书，使用NE-PER核和细胞质提取试剂盒(Pierce)裂解BM-MSC，然后进行核和细胞质分级分离。使用TRIzol Reagent(Invitrogen)提取RNA，然后用RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)纯化。通过M-MLV逆转录酶(Promega)和qRT-PCR分析进行逆转录。ACTIN RNA和GAPDH RNA作为细胞质基因表达的阳性对照。U1RNA充当核基因表达的阳性对照。
ALP和Von Kossa染色
根据制造商的方案，使用ALP染色试剂盒监测ALP染色。根据制造商的方案，使用Von Kossa染色试剂盒监测矿物沉积。用Nikon EclipseTi显微镜(Nikon，Japan)获得图像。通过ImageJ量化矿物沉积的颜色强度。
Northern印迹
用TRIzol从BM-MSC提取总RNA。将来自每个样品的10μg RNA进行甲醛变性琼脂糖电泳，然后用20×SSC缓冲液(3.0M NaCl和0.3M柠檬酸钠，pH7.0)转移至带正电荷的NC膜。将膜进行UV交联，并与通过体外转录产生的生物素标记的RNA探针(IncAIS 11-228nt)一起温育。根据制造商的说明书，用HRP-缀合的链霉亲和素检测生物素信号用于Cheniluminescent核酸检测模块。
RNA FISH
根据Biosearch Technologies的方案产生荧光缀合的lncAIS探针。用于RNA FISH的lncAIS(11-228nt)探针组序列如以上表1中SEQ ID NO:1-3所示。将BM-MSC与DNA探针组杂交，然后用指定的抗体染色。用Olympus FV1200激光扫描共聚焦显微镜(Olympus，Japan)获得图像。
微阵列分析
根据制造商的说明书，使用TRIzol Reagent(Invitrogen)从BM MSC提取RNA，然后用RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)纯化。使用One-Cycle Target Labeling andControl Reagents(Affymetrix，SantaClara，CA，USA)产生cDNA，并用GeneChip WT标记试剂盒(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)产生cRNA。将生物素标记的片段化(≤200nt)cRNA，在45℃下与Affymetrix GeneChip Human transcript array 2.0(Affymetrix)杂交16小时。在Affymetrix Fluidics Station 450中洗涤并染色GeneChip。使用安装在
Figure BDA0001858669260000091
Scanner3000 7G中的
Figure BDA0001858669260000092
GeneChipCommand Console(AGCC)扫描GeneChips。使用Affymetrix默认分析设置和全局缩放作为归一化方法，使用RobustMultichip Analysis(RMA)算法分析数据。给出的值是log2RMA信号强度。微阵列数据以登录号(GSE110359)保存在GEO中。
RNA敲低试验
用生物素RNA标记混合物(Roche)在体外获得生物素标记的lncAIS全长(有义)和反义RNA，然后与从BM-MSC分离的核提取物一起温育。通过链霉亲和素珠拉下(pull down)RNA结合蛋白。用SDS-PAGE分离下拉组分，然后进行银染色。通过LTQ Orbitrap XL质谱法分析由lncAIS富集的差异条带或用指定的抗体进行免疫印迹。
RNA免疫沉淀(RIP)测定
BM-MSC用1％甲醛处理，然后用不含RNase的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl[pH7.4]，150mM NaCl，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，5mM EDTA，2mM PMSF，20mg/ml抑肽酶，20mg/ml亮抑酶肽，10mg/ml胃蛋白酶抑制剂A，150mM苯甲脒，1％Nonidet P-40和RNase抑制剂)溶解。将样品在冰上超声处理并离心。将上清液预先清除并与指定的抗体一起温育，然后进行蛋白A/G珠免疫沉淀。从洗脱液中提取总RNA。通过qPCR分析LncAIS富集。引物列于表S1中。
染色质免疫沉淀(ChIP)测定
根据标准方案(Upstate)进行定量ChIP。将从固定在1％甲醛中的BM-MSC(2×106)剪切的染色质(超声处理至200-500bp)与4μg抗体一起在4℃温育过夜，然后用鲑鱼精子DNA/蛋白质琼脂糖珠进行免疫沉淀。在洗涤、洗脱和交联反转后，纯化来自每个ChIP样品和相应输入样品的DNA，并使用qPCR分析。用于qRT-PCR中cDNA扩增的各引物对列举于以上表5中。
体内异位骨形成
将总共2×106个人BM-MSC与约100mg湿润的HA/TCP陶瓷粉末(NationalEngineering Research Center for Biomaterials，Chengdu，China)在37℃下孵育过夜。将细胞皮下植入8周龄NOD/SCID小鼠的背部表面。8周后收获植入物，在4％多聚甲醛中固定，在10％EDTA中脱钙，包埋在石蜡中，然后切片并染色。通过快速绿色染色将骨质组织染成绿色。通过阿尔新蓝染色将软骨组织染成蓝色以指示骨成熟。
统计分析
在本发明中使用未配对的学生t检验作为统计分析。使用Microsoft Excel或SPSS13进行统计学计算。当P<0.05时，P值显著。
实施例
实施例1：鉴定LncAIS是在AIS患者骨髓间充质干细胞(BM-MSC)中下调的显著差异表达的lncRNA
为了鉴定青少年特发性脊柱侧凸(AIS)中涉及的关键lncRNA，我们对来自5个健康供体和12个AIS患者的BM-MSC进行了微阵列分析。在正常BM-MSC与AIS患者的BM-MSC中有1483个lncRNA显示差异表达，其中718个上调，765个下调，如图1a所示。在AIS患者的BM-MSC中下调幅度最大的lncRNA中，我们专注于我们称为lncAIS(基因符号：ENST00000453347)的未被表征的lncRNA。LncAIS位于人的1号染色体上，包含4个外显子，是全长476nt的转录物。lncAIS被鉴定为保守基因座，如图1b所示。
按照常规操作进行实时qPCR，分析正常健康供体的BM-MSC和AIS患者的BM-MSC中的LncAIS转录物，扩增lncAIS的cDNA引物如上述表5中SEQ ID NO:13-14所示。BM-MSC来自20个健康供体和30个AIS患者。将相对基因表达倍数标准化为内源性β-肌动蛋白，并计数为平均值±S.D。**，P<0.01。结果证实与来自健康供体的BM-MSC相比，在AIS患者来源BM-MSC中lncAIS显著下调，如图1c所示。
通过Northern印迹检测正常健康供体的BM-MSC和AIS患者的BM-MSC中的lncAIS表达。将217nt的lncAIS(11-228nt)的探针(其序列如以上表1中SEQ ID NO:1-3所示)标记，用于northern印迹分析。分别从指定的正常健康供体BM-MSC和AIS患者的BM-MSC中提取RNA，将18SrRNA(1482-1725nt)用作上样对照。BM-MSC来自3个健康供体和3个AIS患者。如图1d所示，Northern印迹进一步验证了，AIS患者的BM-MSC中lncAIS下调，图中显示仅有lncAIS一个转录物。
通过编码能力评估工具(CPAT)分析显示，LncAIS无编码潜力；其中XIST转录物用作非编码基因对照，GAPDH和RUNX2用作编码基因对照，如图1e所示。将LncAIS转录物克隆到pcDNA4-myc-his质粒，并转染到293T细胞中48小时。用抗-Myc抗体通过免疫印迹，分析Myc-融合蛋白的表达。KLF4用作编码蛋白质对照。体外翻译测定表明，lncAIS不产生任何可检测的肽，如图1f所示。
先将BM-MSC裂解，再进行核和细胞质分级分离和RNA提取，然后进行qRT-PCR分析。HMBS RNA、ACTIN RNA和GAPDH RNA作为细胞质基因表达的阳性对照。U1RNA充当核基因表达的阳性对照。N：核级分。C：细胞质级分。用于qRT-PCR分析中cDNA扩增的各引物对列举于以上表5中。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。细胞分级分离测定结果表明，lncAIS主要分布在人BM-MSC的细胞核中，如图1g所示。
通过RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)测定在BM-MSC中观察lncAIS，然后进行免疫荧光染色。红色：lncAIS探针；绿色：肌动蛋白；细胞核由DAPI复染。比例尺，20μm。lncAIS探针序列如以上表1中SEQ ID NO:1-3所示。观察了超过100个典型细胞。RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)进一步验证了，在AIS患者的BM-MSC中lncAIS下调，以及lncAIS在细胞核中的分布，如图1h所示。
总之，我们揭示了lncAIS在正常人BM-MSC中高度表达，而在AIS患者BM-MSC中显著下调。
实施例2：LncAIS敲低抑制成骨分化和骨形成
为了探索lncAIS在AIS发病机制中的生理作用，我们使用慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)在健康正常BM-MSC中敲低lncAIS(用于lncAIS敲低的shLncAIS基因序列如以上表2中SEQ ID NO:4-6所示)，并通过实时定量PCR确认敲低效率，如图2a所示。用表达shlncAIS的慢病毒感染BM-MSC并在MSC培养基中培养3天，然后用实时qPCR检测lncAIS的mRNA水平。用于qRT-PCR中cDNA扩增的各引物对列举于以上表5中。将相对基因表达倍数变化标准化为内源性β-肌动蛋白，并计数为平均值±S.D。**，P<0.01。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。
通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定法，测定shlncAIS BM-MSC与shCtrl(加扰对照)BM-MSC的细胞增殖。每孔接种1×103个人BM-MSC，接种后24小时加载CCK-8试剂。每2天测量OD450。将吸光度变化计算为平均值±S.D。**，P<0.01。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。如图2b所示，我们发现，与加扰对照(shCtrl)处理的BM-MSC细胞相比，shlncAIS处理的BM-MSC细胞中的lncAIS消耗抑制BM-MSC的增殖。
通过伤口愈合测定法，分别测量shlncAIS BM-MSC与shCtrl(加扰对照)BM-MSC的细胞迁移。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。比例尺，10μm。如图2c所示，伤口愈合测定结果表明，lncAIS敲低不影响BM-MSC的迁移能力。
通过采用Hoechst 33342/PI双染色，然后流式细胞术，分析shlncAIS BM-MSC与shCtrl(加扰对照)BM-MSC的细胞凋亡。数据代表使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。如图2d所示，与shCtrl处理的BM-MSC相比，shlncAIS处理的BM-MSC细胞中的lncAIS消耗不显著改变细胞凋亡。
在MSC维持培养基中培养BM-MSC。通过实时qPCR在指定的BM-MSC中评估自我更新相关基因的表达水平。用于qPCR中cDNA扩增的各引物对列举于以上表5中。将相对基因表达倍数变化标准化为内源性β-肌动蛋白，并计数为平均值±S.D。**，P<0.01。数据代表使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。如图2e所示，当细胞在MSC维持培养基中培养时，lncAIS消耗显著抑制BM-MSC中自我更新相关基因(NANOG、POU5F1和SOX2)的表达水平。
将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天。通过实时qPCR在指定的BM-MSC中评估成骨分化基因的表达水平。用于qPCR中cDNA扩增的各引物对列举于以上表5中。将相对基因表达倍数变化标准化为内源性β-肌动蛋白，并计数为平均值±S.D。**，P<0.01。数据代表使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。如图2f所示，当细胞在成骨分化培养基中培养时，lncAIS消耗显著下调成骨分化基因(ALPL、BSP、RUNX2、LPL和PPAR)的表达水平。
将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天诱导成骨分化，在成骨分化的第6天进行碱性磷酸酶(ALP)染色。比例尺，10μm。如图2g所示，通过ALP染色确定lncAIS敲低显著抑制成骨分化。
将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天诱导成骨分化，进行VonKossa染色以检测第12天的矿物质沉积。比例尺，10μm。通过ImageJ量化矿物沉积的颜色强度。将强度变化计算为平均值±S.D。**，P<0.01。如图2h所示，通过Von Kossa染色确定lncAIS敲低使矿物质沉积减少。
为了进一步确定lncAIS在体内的作用，我们在NOD/SCID小鼠中使用了异位骨形成模型。将指定的BM-MSC植入NOD/SCID小鼠中。植入8周后，通过Fast Green染色测量骨基质形成。黑色箭头表示上图中的骨形成。通过ImageJ量化骨样区域。将阳性染色区域计为平均值±S.D。**，P<0.01。通过Alcian Blue染色测量骨成熟度。每组N＝6只小鼠。BM-MSC来自3个健康供体。比例尺，50μm。将shCtrl或shlncAIS感染的BM-MSC与羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)骨架一起孵育，并皮下植入NOD/SCID小鼠中8周。如图2i所示，我们观察到shCtrl感染的BM-MSC可以在小鼠移植物中形成大量的类骨质，而shlncAIS感染的BM-MSC在小鼠移植物中形成较少的类骨质。因此，lncAIS敲低抑制体外成骨分化和体内异位骨形成。
实施例3：LncAIS过表达促进成骨分化和骨形成
我们通过慢病毒在正常BM-MSC中过表达lncAIS，首先将靶序列构建到pSicoR质粒中，并同时应用pMD2.G及psPAX2载体包装病毒，然后再感染目标BM-MSC。LncAIS过表达(oeLncAIS)显著增加正常BM-MSC的细胞增殖(图3a)。一致地，lncAIS过表达增强了自我更新相关基因(NANOG、POU5F1和SOX2)和成骨分化基因(ALPL、BSP、RUNX2、LPL和PPAR)的表达水平(图3b，3c)。此外，与成体分化期间的载体转染的BM-MSC相比，lncAIS过表达还增加了成骨标志物基因如骨桥蛋白(OPN)、COL1A1和IBSP(图3d)的蛋白质水平。因此，通过ALP染色(图3e)和Von Kossa染色(图3f)lncAIS过表达增强BM-MSC的成骨分化。最后，通过NOD/SCID小鼠体内异位骨形成模型，lncAIS过表达的BM-MSC显著增加小鼠移植物中类骨质的数量和大小(图3g)。
为了确定lncAIS在AIS病理过程中的作用，我们通过慢病毒感染在AIS患者的BM-MSC中实施lncAIS表达。值得注意的是，在AIS患者的BM-MSC中过表达lncAIS也可以将自我更新相关基因(NANOG、POU5F1和SOX2)和成骨分化基因(ALPL、BSP、RUNX2、LPL和PPAR)的表达水平挽救至正常水平(图3h，3i)。重要的是，AIS患者的BM-MSC中强制的lncAIS表达也恢复了成骨分化能力(图3j，3k)。总之，lncAIS促进BM-MSC启动成骨分化。
实施例4：确定LncAIS激活HOXD8转录
对lncAIS沉默(shLncAIS)和shCtrl处理的BM-MSC进行转录组微阵列分析比较(用于lncAIS敲低的shlncAIS基因序列如以上表2中所示)，结果如图4a的热图所示，其中选择了lncAIS沉默的BM-MSC中前10个下调的转录因子(TF)；并检测它们在正常BM-MSC中的表达水平。数据来自使用源自2个健康供体的BM-MSC的两个独立实验。每个匹配的shCtrl和shLncAIS来自相同的健康BM-MSC供体。
如图4b所示，对shCtrl和shLncAIS的BM-MSC进行实时qPCR比较分析，结果表明在shLncAIS处理的BM-MSC中前10个下调TF中，作为BM-MSC标记基因的HOXD8在正常BM-MSC中表达最高。数据来自使用源自2个健康供体的BM-MSC的两个独立实验。每个匹配的shCtrl和shLncAIS来自相同的健康BM-MSC供体。然而，当前尚未表征HOXD8在调节BM-MSC的成骨分化中的作用。
然后通过慢病毒介导的shRNA在正常BM-MSC中耗尽HOXD8。用表达shHOXD8的慢病毒感染BM-MSC(用于HOXD8敲低的shHOXD8基因序列如以上表3中所示)，并在MSC培养基中培养3天，然后用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。将吸光度变化计算为平均值±S.D。**，P<0.01。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。如图4c所示，与shCtrl处理的细胞相比，HOXD8消耗抑制BM-MSC的增殖。
在MSC维持培养基中培养指定的BM-MSC，通过实时qPCR评估自我更新相关基因的表达水平。将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天，通过实时qPCR评估成骨分化基因的表达水平。用于qPCR中cDNA扩增的各引物对列举于以上表5中。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。如图4d和4e所示，HOXD8消耗抑制了BM-MSC中自我更新相关基因(NANOG、POU5F1和SOX2)和成骨分化基因(ALPL、BSP、RUNX2、LPL和PPAR)的表达水平。
将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天诱导成骨分化，在成骨分化的第6天进行ALP染色，如图4f所示。将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天诱导成骨分化，进行Von Kossa染色以指示第12天的矿物质沉积，如图4g所示。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。比例尺，10μm。通过ImageJ量化矿物沉积的颜色强度，将强度变化计算为平均值±S.D。**，P<0.01。ALP染色(图4f)和Von Kossa染色(图4g)结果表明，通过HOXD8消耗抑制了成骨分化。
用过表达HOXD8的慢病毒感染BM-MSC，并在MSC培养基中培养3天，然后用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。每孔接种1×103个人BM-MSC。接种后24小时，加载CCK-8试剂。每2天测量OD450。将吸光度变化计算为平均值±S.D。**，P<0.01。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。如图4h所示，结果表明HOXD8过表达(oeHOXD8)显著增加正常BM-MSC中的细胞增殖速率。
在MSC维持培养基中培养指定的BM-MSC，通过实时qPCR评估自我更新相关基因的表达水平，如图4i所示。将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天，如图4j所示。通过实时qPCR在指定的BM-MSC中评估成骨分化基因的表达水平。用于qPCR中cDNA扩增的各引物对列举于以上表5中。将相对基因表达倍数变化标准化为内源性β-肌动蛋白，并计数为平均值±S.D。**，P<0.01。数据代表使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。如图4i和4j所示，结果表明HOXD8过表达增加BM-MSC中自我更新相关基因(NANOG、POU5F1和SOX2)和成骨分化基因(ALPL、BSP、RUNX2、LPL和PPAR)的表达水平。
将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天诱导成骨分化，在成骨分化的第6天进行ALP染色，如图4k所示。将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天诱导成骨分化，进行Von Kossa染色以指示第12天的矿物质沉积，如图4l所示。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。比例尺，10μm。通过ImageJ量化矿物沉积的颜色强度，将强度变化计算为平均值±S.D。**，P<0.01。如图4k和4l所示，结果表明HOXD8过表达增强BM-MSC的成骨分化。
总之，上述实验结果表明HOXD8是BM-MSC的成骨分化所必需的。
实施例5：确定LncAIS与NF90相互作用以增强HOXD8的mRNA稳定性
LncRNA通常与其附近蛋白质编码基因的调控呈正相关。然而，如图5a所示，通过RT-qPCR评估我们发现，BM-MSC中lncAIS的消耗不影响其邻近基因的表达水平(用于lncAIS敲低的shlncAIS基因序列如以上表2中所示)，其中相对基因表达倍数变化计算为平均值±S.D。NS，不显著。引物列于表S1中。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。这表明lncAIS可能在反式中发挥其调节作用。
然后进行生物素标记的RNA敲低测定，以鉴定来自BM-MSC裂解物的可能的lncAIS相关蛋白。使用全长lncAIS转录物(正义)和反义序列对照，然后进行质谱分析，用BM-MSC的裂解物进行生物素-RNA下拉，如图5b所示，确定NF90在BM-MSC中结合lncAIS。NF90是白细胞介素增强子结合因子3(ILF3)家族的蛋白质，是一种调节基因表达或稳定mRNA的RNA结合蛋白。
如图5c所示，通过RNA下拉测定验证了lncAIS与NF90的相互作用，然后通过抗-NF90抗体进行免疫印迹分析。用于NF90敲低的shNF90基因序列如以上表4中所示。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。
将BM-MSC裂解物与抗-NF90抗体一起温育，然后进行RIP测定。提取RNA并反向转录，通过实时qPCR分析LncAIS转录物，用于qRT-PCR中cDNA扩增的各引物对列举于以上表5中。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。如图5d所示，通过免疫沉淀(RIP)测定验证了lncAIS与NF90的相互作用。
RNA敲低(图5c)和RNA-免疫沉淀(RIP)测定(图5d)的结果证实了lncAIS与NF90的相互作用。
如图5e所示，在BM-MSC的细胞核中将lncAIS与NF90共定位。通过RNA-FISH用lncAIS探测BM-MSC，然后对NF90进行免疫荧光染色。红色：lncAIS探针；绿色：NF90；细胞核由DAPI复染。比例尺，50μm。lncAIS探针序列如以上表1中SEQ ID NO:1-3所示。观察了超过100个典型细胞。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。
上述实验数据表明，在BM-MSC中lncAIS与NF90蛋白结合。
为了进一步确定NF90如何调节成骨分化以及AIS的发病机制，我们通过慢病毒介导的shRNA在正常BM-MSC中耗尽NF90。
如图5f所示，用表达shNF90的慢病毒感染BM-MSC，并在MSC培养基中培养3天，通过实时qPCR评估自我更新相关基因的表达水平。如图5g所示，将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天，通过实时qPCR在指定的BM-MSC中评估成骨分化基因的表达水平。用于qRT-PCR中cDNA扩增的各引物对列举于以上表5中。将相对基因表达倍数变化标准化为内源性β-肌动蛋白，并计数为平均值±S.D。**，P<0.01。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。图5f和5g所示的结果表明，NF90消耗抑制了BM-MSC中自我更新相关基因(NANOG、POU5F1和SOX2)和成骨分化基因的表达水平。
将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天诱导成骨分化，在成骨分化的第6天进行ALP染色，如图5h所示。将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天诱导成骨分化，进行Von Kossa染色以指示第12天的矿物质沉积，如图5i所示。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。比例尺，10μm。通过ImageJ量化矿物沉积的颜色强度，将强度变化计算为平均值±S.D。**，P<0.01。ALP染色(图5h)和Von Kossa染色(图5i)的结果验证了受抑制的成骨分化。
以上实验数据表明，NF90是BM-MSC的成骨分化所必需的。
据报道，NF90与PARP1mRNA的3'-UTR区相互作用以维持其mRNA稳定性。我们通过RIP测定分析BM-MSC中指定的mRNA与NF90的相互作用。将BM-MSC裂解物与抗-NF90抗体一起温育，然后进行RNA免疫沉淀和实时qPCR。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。如图5j所示，在我们选择的lncAIS沉默的BM-MSC中前10个下调的转录因子中，NF90特异性结合HOXD8的mRNA。
通过RIP测定验证了HOXD8的mRNA与NF90在BM-MSC中的相互作用。将BM-MSC裂解物与抗-NF90抗体一起温育，然后进行RIP测定。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验，如图5k所示。如图5l所示，在Act D处理后的指定时间点，通过实时qPCR测量来自指定BM-MSC的HOXD8mRNA稳定性。数据显示为平均值±S.D.**，P<0.01。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。
图5k所示结果表明，BM-MSC中的lncAIS消耗消除了NF90与HOXD8mRNA的3'-UTR区域的相互作用，并因此导致HOXD8mRNA衰减(图51)。一致地，如图5k所示，AIS患者的BM-MSC中NF90与HOXD8mRNA的3'-UTR区域的相互作用是不可检测的，而且也消除了HOXD8mRNA的稳定性(图5l)。
以上实验结果表明，lncAIS与NF90相互作用以维持正常BM-MSC中HOXD8mRNA的稳定性。
实施例6：确定HOXD8启动RUNX2表达以启动成骨分化
鉴于RUNX2是成骨分化的关键转录因子，我们进一步探索lncAIS通过HOXD8调节BM-MSC成骨分化的机制。将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天。通过实时qPCR在指定的BM-MSC中评估成骨分化基因的表达水平。用于qRT-PCR中cDNA扩增的各引物对列举于以上表5中。将相对基因表达倍数变化标准化为内源性β-肌动蛋白，并计数为平均值±S.D。**，P<0.01。数据代表使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。如图2f所示，当细胞在成骨分化培养基中培养时，lncAIS消耗显著下调成骨分化基因(ALPL、BSP、RUNX2、LPL和PPAR)的表达水平，而且我们注意到lncAIS敲低显著降低了RUNX2表达。
通过ChIP测定，HOXD8与RNA聚合酶II(Pol II)和H3K4me3一起在RUNX2启动子上高度富集。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。如图6a所示，HOXD8、RNA聚合酶II和转录活性标记物H3K4me3都富集在RUNX2基因的相同区域上。
用指定的慢病毒感染BM-MSC，并通过qPCR评估RUNX2表达。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。如图6b所示，HOXD8的消耗抑制了BM-MSC中的RUNX2表达，相反，在HOXD8沉默的BM-MSC中HOXD8的过表达可以恢复RUNX2表达。这些结果表明RUNX2基因是HOXD8的下游靶标。
如图6c所示，用指定的慢病毒感染正常BM-MSC，并在MSC培养基中培养指定的BM-MSC 3天。通过实时qPCR评估自我更新相关基因的表达水平。用于qRT-PCR中cDNA扩增的各引物对列举于以上表5中。将相对基因表达倍数变化标准化为内源性β-肌动蛋白，并计数为平均值±S.D。**，P<0.01。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。
如图6d所示，用指定的慢病毒感染正常BM-MSC，并在MSC培养基中培养3天。在OriCell MSC成骨分化培养基中培养指定的BM-MSC 3天。通过实时qPCR评估成骨分化基因的表达水平。用于qRT-PCR中cDNA扩增的各引物对列举于以上表5中。将相对基因表达倍数变化标准化为内源性β-肌动蛋白，并计数为平均值±S.D。**，P<0.01。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。
结果表明，在lncAIS沉默的BM-MSC中恢复HOXD8(oeHOXD8)或恢复RUNX2(oeRUNX2)可以很好地挽救自我更新相关基因(NANOG、POU5F1和SOX2)和成骨分化基因(ALPL、BSP、RUNX2、LPL和PPAR)的表达水平(图6c，6d)。
如图6e所示，用指定的慢病毒感染正常BM-MSC，并在MSC培养基中培养3天。将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养以诱导成骨分化。在成骨分化的第6天进行ALP染色。比例尺，10μm。
如图6f所示，用指定的慢病毒感染正常BM-MSC，并在MSC培养基中培养3天。将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养以诱导成骨分化。进行Von Kossa染色，以指示第12天的矿物质沉积。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。比例尺，10μm。矿物沉积的颜色强度通过Image J定量。强度变化计算为平均值±S.D。**，P<0.01。
结果表明，在lncAIS沉默的BM-MSC中恢复HOXD8或RUNX2可以很好地将成骨分化能力恢复到正常水平(图6e，6f)。
如图6g所示，将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天诱导成骨分化，在成骨分化的第6天进行ALP染色，比例尺，10μm。如图6h所示，将BM-MSC在OriCell MSC成骨分化培养基中培养6天诱导成骨分化，进行Von Kossa染色以指示第12天的矿物质沉积，比例尺，10μm。数据来自使用源自3个健康供体的BM-MSC的三个独立实验。通过ImageJ量化矿物沉积的颜色强度，将强度变化计算为平均值±S.D。**，P<0.01。ALP染色(图6g)和VonKossa染色(图6h)的结果验证了，在AIS患者的BM-MSC中强制表达HOXD8或RUNX2也可以将成骨分化能力恢复到正常水平。
本发明的实验结果表明，lncAIS和HOXD8在人BM-MSC中高度表达，其中lncAIS与NF90相互作用以促进HOXD8mRNA稳定性，从而增强BM-MSC中的RUNX2转录，导致正常BM-MSC的成骨分化。相比之下，在AIS患者的BM-MSC中lncAIS下调使得不能募集NF90，从而消除了HOXD8mRNA稳定性，这阻碍了用于成骨分化的RUNX2转录。
总之，lncAIS在调节BM-MSC的成骨分化中起关键作用，并且lncAIS的下调参与AIS的发病机制。本研究表明，lncRNA可能代表AIS发病机制的另一层调节，可作为AIS的重要生物标志物。因此，具有lncAIS或HOXD8过表达的BM-MSC可以为AIS治疗提供潜在的疗法。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> 促进骨髓间充质干细胞成骨分化的生物制剂
<130> P18105
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
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ttcctaatcc tgctccag 18
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ttaggacata gacatctg 18
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gacaaaccta cagtcgctt 19
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ggagcaggat taggaagc 18
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ctcctgctac acgctttcc 19
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agaaaatcac ccatgctgg 19
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tgacggggtc acccacactg tgcccatcta 30
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ctagaagcat ttgcggtgga cgatggaggg 30
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gcagttaagt tcaggagctt cagg 24
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cttacccacg attctccatc tgt 23
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caaaggcaaa caacccactt 20
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tctgctggag gctgaggtat 20
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tcattcccgg agtagcagag t 21
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gaaccgccct tgtaatcg 18
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 48
cgctttcctg aagaacagc 19

Claims (5)

1.促进骨髓间充质干细胞成骨分化的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂中包含过表达lncAIS的骨髓间充质干细胞，所述lncAIS所在Ensembl基因组数据库基因符号为ENST00000453347，在人骨髓间充质干细胞中lncAIS与NF90相互作用以促进HOXD8 mRNA稳定性，从而增强骨髓间充质干细胞中的RUNX2转录，导致骨髓间充质干细胞的成骨分化。
2.如权利要求1所述的生物制剂，其特征在于，用过表达lncAIS的慢病毒感染正常骨髓间充质干细胞以获得过表达lncAIS的骨髓间充质干细胞。
3.如权利要求2所述的生物制剂，其特征在于，用pSicoR质粒作为慢病毒表达载体构建含有靶序列的慢病毒，然后感染正常骨髓间充质干细胞以获得过表达lncAIS的骨髓间充质干细胞。
4.预防和/或治疗青少年特发性脊柱侧凸的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包含过表达lncAIS的骨髓间充质干细胞以及药学上可接受的载体，所述lncAIS所在Ensembl基因组数据库基因符号为ENST00000453347。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含治疗青少年特发性脊柱侧凸的其他药剂。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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