CN111849993B - 一种用于促进骨髓间充质干细胞成骨分化的基因抑制剂 - Google Patents
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- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
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- C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
Abstract
本发明公开了一种用于促进骨髓间充质干细胞成骨分化的基因抑制剂。所述的基因抑制剂为LINC01877的shRNA。通过ALP酶活性检测，茜素红染色，实时荧光定量RCR和Western Blot本发明证明LINC01877基因抑制剂能够存进骨髓间充质干细胞的ALP酶活性，钙化水平，成骨分化相关基因RUNX2、ALP和OCN基因的mRNA水平和蛋白水平表达，因此，LINC01877基因抑制剂可以用于制备骨髓间充质干细胞的成骨分化促进剂来促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。
Description
本案为分案申请，原申请的发明名称为：LINC01877在骨髓间充质干细胞成骨分化中的应用，原申请的申请日为：2020-03-18，原申请的申请号为：CN202010190581.5。
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种用于促进骨髓间充质干细胞成骨分化的基因抑制剂。
背景技术
骨髓间充质干细胞是成体干细胞的一种，骨髓间充质干细胞来源于间质，具有高度的可塑性。骨髓间充质干细胞的功能是为造血提供结构和功能支持。在一定的条件刺激下，骨髓间充质干细胞可以分化为软骨细胞，成骨细胞，脂肪细胞以及神经细胞等。由于骨髓间充质干细胞具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，因此在维持骨的动态平衡以及缺损修复再生方面起着重大作用。因此，研究骨髓间充质干细胞的成骨机制对于治疗骨质疏松等代谢性骨病的具有重要的临床意义。
长链非编码RNA是一类长度大于200nt，并且不编码蛋白质的RNA。在过去的研究中，长链非编码NRA通常被认为是一类无生物学功能的“垃圾”RNA。然而，随着研究的不断深入，科研人员逐渐发现长链非编码RNA能够在转录水平或者是转录后水平调节编码蛋白质基因的表达，并且广泛的参与到细胞分化，疾病发生，个体发育等多种重要的生命过程。研究显示，长链非编码RNA可能在间充质干细胞的增殖和分化过程中扮演的着重要的作用。因此，寻找的新的能够促进间充质干细胞成骨分化的长链非编码RNA用于制备间充质干细胞成骨分化促进剂，对于间充质干细胞的进一步开发利用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种对于骨髓间充质干细胞成骨分化具有促进作用的LINC01877基因抑制剂。
为实现上述目的，本发明提供了一种LINC01877基因抑制剂作为骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂的应用。
优选地，所述LINC01877基因抑制剂为shRNA。
优选地，所述shRNA正义链为：
5'- CACCGCATTCGCCATCTAGAGAGACCGAAGTCTCTCTAGATGGCGAATGC -3'，
所述shRNA反义链为
5'- AAAAGCATTCGCCATCTAGAGAGACTTCGGTCTCTCTAGATGGCGAATGC -3'。
优选地，所述应用包括LINC01877基因抑制剂作为骨髓间充质干细胞矿化促进剂的应用。
优选地，所述应用包括LINC01877基因抑制剂作为骨髓间充质干细胞中ALP基因，OCN基因和RUNX2基因促进剂的应用。
优选地，所述LINC01877的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；所述LINC01877的反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。
此外，本发明提供了一种长链非编码RNA，其特征在于，所述长链非编码RNA为LINC01877，所述LINC01877的基因抑制剂能够作为骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂，所述LINC01877在GeneBank中的ID为101927641，所述LINC01877的转录本为NR_110270.1。
除此之外，本发明提供了一种用于促进骨髓间充质干细胞成骨分化的基因抑制剂，其特征在于，所述基因抑制剂为LINC01877的shRNA；
所述shRNA正义链为：
5'- CACCGCATTCGCCATCTAGAGAGACCGAAGTCTCTCTAGATGGCGAATGC -3'，
所述shRNA反义链为
5'- AAAAGCATTCGCCATCTAGAGAGACTTCGGTCTCTCTAGATGGCGAATGC -3'。。
本发明的有益效果在于：
本发明首次证明了长链非编码RNA LINC01877在骨髓间充质干细胞中的作用，证明LINC01877基因抑制剂能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，因此，LINC01877基因抑制剂可以用于制备骨髓间充质干细胞成骨分化的促进剂，来加速骨髓间充质干细胞的成骨分化，从而克服细胞移植来源少的问题。
附图说明
图1 骨髓间充质干细胞成骨分化过程中LINC01877的表达量变化
图2 LINC01877基因抑制剂对于LINC01877表达的抑制效果
图3 LINC01877基因抑制剂对于骨髓间充质干细胞ALP酶活性的影响
图4 LINC01877基因抑制剂对于骨髓间充质干细胞钙化水平的影响
图5 LINC01877基因抑制剂对于RUNX2基因表达的影响
图6 LINC01877基因抑制剂对于ALP基因表达的影响
图7 LINC01877基因抑制剂对于OCN基因表达的影响
图8 LINC01877基因抑制剂对于ALP，RUNX2和OCN蛋白表达的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。如无特别说明，本发明所涉及的技术均为分子生物学或细胞生物学常规技术手段，其中涉及的酶、试剂以及反应条件均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。
实施例1
检测骨髓间充质干细胞在0d，7d，14d时，LINC01877的表达情况
1.RNA提取
（1）将人骨髓间充质干细胞接种至培养板中，加入成骨分化培养基，分别在第0d，7d和14d（每组设置3个重复）加入1ml Trizol收集细胞，转移至2ml离心管中，室温放置10min；
（2）将离心管置于低温高速离心机中，12000转离心5min，取上清；
（3）将200μl氯仿加入到上清中，混匀后，室温放置15min；
（4）将离心管置于低温高速离心机中，12000转离心5min，取750μl上清，转移至新的离心管中；
（5）加入750μl的预冷异丙醇混匀，放置10min；
（6）将离心管置于低温高速离心机中，12000转离心10min，小心去除上清；
（7）将1ml 75%乙醇加入到沉淀中，颠倒混匀后，将离心管置于低温高速离心机中，8000转，4℃，离心5min；
（8）小心去除上清，静置5-10min至乙醇完全蒸发；
（9）加入DEPC水溶解沉淀，测定RNA纯度和浓度。
2.逆转录反应
逆转录反应参照TAKARA反转录试剂盒。
逆转录反应体系：5×PrimeScript RT master mix 2μl；RNA模板 0.5μg；RNaseFree水 to 10μl。
逆转录反应条件：37℃ 15min；85℃ 5s；4℃ 冷却。
3.实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR按照TAKARA qPCR（SYBR）试剂盒进行扩增，反应条件：95 ℃ 120s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s 35 个循环。
按照2-△△Ct方法处理实时定量PCR数据，计算LINC01877的表达变化，实验结果如图1所示。
引物序列
LINC01877
Forward primer 5'-AGCCCAAGAGATGAAACTGGAG-3'（SEQ ID NO.1）
Reverse primer 5'-CACCATGAGTAAAGGAGCCTGT-3'（SEQ ID NO.2）
GAPDH
Forward primer 5'- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'（SEQ ID NO.3）
Reverse primer 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'（SEQ ID NO.4）
实验结果
实验结果如图1所示，从图1可以看出，在7d时，LINC01877的相对表达量为0.643±0.069，差异不具有统计学差异；14d时，LINC01877的相对表达量为0.366±0.063，差异具有统计学意义；上述结果说明，LINC01877的相对表达量在骨髓间充质干细胞成骨分化的过程中，呈现出下降的趋势，在14d时，LINC01877的表达量相较于0d显著下调。
实施例2
LINC01877基因抑制剂对于骨髓间充质干细胞成骨分化过程中ALP酶活性的影响
1.sh-LINC01877干扰效果检测
（1）转染前24h将骨髓间充质干细胞接种于6孔板中；
（2）弃去培养基，加入无血清培养基，将空白对照，sh-NC和sh-LINC01877（正义链为5'- CACCGCATTCGCCATCTAGAGAGACCGAAGTCTCTCTAGATGGCGAATGC -3'（SEQ ID NO.5），
反义链为5'- AAAAGCATTCGCCATCTAGAGAGACTTCGGTCTCTCTAGATGGCGAATGC -3'(SEQ ID NO.6)；质粒载体为pENTR™/U6）按照Lipofectamine 2000说明书进行转染，每组设置3个重复；
（3）过夜培养后，更换为有血清培养基，即得到相应的骨髓间充质干细胞。
（4）加入成骨分化培养基，培养7d；
（5）弃去培养基，用PBS洗涤3次，提取RNA，检测sh-LINC01877对于LINC01877表达量的抑制情况；RNA提取步骤，逆转录反应步骤，实时荧光定量PCR步骤同实施例1。
实验结果
实验结果如图2所示，从图中可以看出，相较于空白对照组，sh-NC的相对表达量为0.896±0.034，sh-LINC01877的 LINC01877的相对表达量为0.146±0.027（p < 0.01），即sh-LINC01877的抑制率为85.4%。
实施例3
ALP酶活性检测
（1）转染前24h将骨髓间充质干细胞接种于6孔板中；
（2）弃去培养基，加入无血清培养基，将sh-NC和sh-LINC01877按照Lipofectamine2000说明书进行转染，每组设置3个重复；
（3）过夜培养后，更换为有血清培养基，即得到相应的骨髓间充质干细胞。
（4）加入成骨分化培养基，培养7d；
（5）弃去培养基，用PBS洗涤3次，每孔加入200μl Triton X-100,在冰上处理30min；
（6）将裂解后的细胞转移至离心管中，4℃，12000r/min,离心5min，收集上清液；
（7）在96孔板中，每孔加入10μl的上清液，50μl显色底物和40ul检测缓冲液；
（8）轻轻的摇匀，然后将96孔板放入到酶标仪中，405nm下检测OD值。
实验结果
实验结果如图3所示，从图中可以看出，相较于sh-NC，sh-LINC01877的ALP的相对酶活力为2.11±0.356（p < 0.05），显著高于sh-NC组，说明LINC01877的基因抑制剂能够提高骨髓间充质干细胞的ALP酶活性。
实施例4
茜素红染色检测干扰LINC01877对于骨髓间充质干细胞钙化的影响
（1）转染sh-NC和sh-LINC01877的骨髓间充质干细胞成骨培养14d后取出，弃去细胞培养基；
（2）使用PBS洗涤细胞3次，每孔加入2ml 4%多聚甲醛，室温固定30min；
（3）弃去多聚甲醛，使用PBS洗涤3次；
（4）每孔加入1.5ml的茜素红染液，37℃放置30min；
（5）使用PBS洗涤细胞3次，进行拍照。
实验结果如图4所示，通过图4可以看出，相对于si-NC组，sh-LINC01877组的茜素红染色的钙结节的数量更多，说明抑制LINC01877能够存进骨髓间充质干细胞的钙化。
实施例5
实时荧光定量PCR检测LINC01877基因抑制剂对于成骨分化相关基因RUNX2、ALP、OCN mRNA水平的影响
（1）转染前24h将骨髓间充质干细胞接种于6孔板中；
（2）弃去培养基，加入无血清培养基，将sh-NC和sh-LINC01877 按照Lipofectamine 2000说明书进行转染，每组设置3个重复；
（3）过夜培养后，更换为有血清培养基，即得到相应的骨髓间充质干细胞。
培养7天后，提取RNA，RNA提取步骤，逆转录步骤，荧光定量RCR步骤同实施例1。
引物序列如下：
RUNX2
Forward primer 5'-GGACGAGGCAAGAGTTTCA-3'（SEQ ID NO.7）
Reverse primer 5'-TGGTGCAGAGTTCAGGGAG-3'（SEQ ID NO.8）
ALP
Forward primer 5'-ACGTGGCTAAGAATGTCATC-3'（SEQ ID NO.9）
Reverse primer 5'-CTGGTAGGCGATGTCCTTA-3'（SEQ ID NO.10）
OCN
Forward primer 5'-CAAAGGTGCAGCCTTTGTGTC-3'（SEQ ID NO.11）
Reverse primer 5'-TCACAGTCCGGATTGAGCTCA-3'（SEQ ID NO.12）
实验结果
实验结果如图5-7所示，从图中可以看出，sh- LINC01877组的RUNX2相对表达量为3.820±0.542（p < 0.01），ALP相对表达量为2.486±0.176（p < 0.01），OCN相对表达量为1.876±0.156（p < 0.05），差异具有统计学意义。说明，LINC01877的基因抑制剂能够有效的促进成骨相关基因RUNX2,ALP,OCN的表达。
实施例6
Western Blot检测LINC01877基因抑制剂对于成骨相关基因RUNX2,ALP,OCN蛋白表达的影响
（1）转染前24h将骨髓间充质干细胞接种于6孔板中；
（2）弃去培养基，加入无血清培养基，将sh-NC和sh-LINC01877按照Lipofectamine2000说明书进行转染；
（3）过夜培养后，更换为有血清培养基，即得到相应的骨髓间充质干细胞。
（4）培养7天后，每孔加入100μL PIPA裂解液，细胞充分裂解后，使用细胞刮刀将细胞刮下，并将细胞收集至离心管中；
（5）冰上放置30min，使细胞完全裂解；
（6）4℃，12000g离心20分钟，吸取上清，使用BCA法检测蛋白浓度，调整蛋白浓度为2μg/ml，100℃煮5min，即得到蛋白样品；
（7）配置10% SDS-PAGR胶，每孔加入10μL蛋白样品；
（8）恒压90V电泳，待电泳条带完全的跑出浓缩胶时，将电压调整至130V，直至溴酚蓝完全跑出分离胶；
（9）按照海绵-滤纸-分离胶-NC膜-滤纸-海绵的模型放置转膜夹，250mA电转1.5h；
（10）电转结束后，将NC膜取出置于5%的脱脂奶粉中，摇床封闭1h；
（11）按照蛋白大小，将RUNX2、ALP、OCN和β-actin蛋白条带剪下，孵育相应的一抗，4℃，摇床封闭过夜；
（12）使用TBST洗膜3次，每次10min，孵育二抗，室温摇床孵育60min；
（13）使用TBST洗膜3次，每次10min，洗好后，进行曝光，得到的结果如图8所示。
实验结果
实验结果如图8所示，从图中可以看出，相较于sh-NC组，sh-LINC01877组的ALP、RUNX2和OCN的蛋白水平均出现一定程度的上调，说明LINC01877的基因抑制剂能够促进成骨分化相关基因RUNX2、ALP和OCN的蛋白表达。
综上所述，本发明证明LINC01877基因在骨髓间充质干细胞成骨分化的过程中表达量逐渐的降低，通过LINC01877基因抑制剂能够促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的ALP酶活性，钙化，成骨分化相关基因RUNX2、ALP和OCN的mRNA和蛋白水平表达来促进间充质干细胞的成骨分化。
序列表
<110> 山东殷氏干细胞有限公司
<120> LINC01877在骨髓间充质干细胞成骨分化中的应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1 .0
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Claims (1)
1.一种用于促进骨髓间充质干细胞成骨分化的基因抑制剂，其特征在于，所述基因抑制剂为LINC01877的shRNA；所述shRNA正义链为：5'- CACCGCATTCGCCATCTAGAGAGACCGAAGTCTCTCTAGATGGCGAATGC -3'，所述shRNA反义链为5'- AAAAGCATTCGCCATCTAGAGAGACTTCGGTCTCTCTAGATGGCGAATGC -3'。
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