CN113106097B - 一种用于牙周膜干细胞成骨分化的促进剂 - Google Patents

一种用于牙周膜干细胞成骨分化的促进剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于牙周膜干细胞成骨分化的促进剂，属于干细胞技术领域。本发明所提供的促进剂能够有效的促进牙周膜干细胞ALP酶活性，细胞矿化，以及成骨转化相关蛋白RUNX2和OCN蛋白表达，因此可将其用于牙周膜干细胞的成骨分化。

Description

一种用于牙周膜干细胞成骨分化的促进剂
本案为分案申请，原申请的发明名称为：一种牙周膜干细胞增殖和成骨分化促进剂，原申请的申请日为：2020-11-11，原申请的申请号为：CN202011252094.3。
技术领域
本发明属于牙周膜干细胞技术领域，尤其涉及一种用于牙周膜干细胞成骨分化的促进剂。
背景技术
牙周炎是常见的口腔疾病之一，其是一种牙周支持组织的慢性炎症性疾病。在临床上，牙周炎患者的主要特征表现为：探诊出血、牙龈红肿、牙周形成以及压槽骨吸收，最终出现牙齿松动和脱落。目前，牙周炎的常规治疗方法有牙周洁治、刮治等基础治疗和牙周翻瓣术、根面平整术等牙周手术治疗，以及联合光动力治疗等方法。然而，这些方法只能暂时缓解患者的症状，而不能从根本上恢复牙周支持组织。
牙周膜干细胞是牙周膜中分离出的一种干细胞，其具有较强的自我增殖与多向分化能力。牙周膜干细胞可以在一定的条件下被诱导使其进行重新编程达到横向分化的目的，故其成为组织再生工程的种子细胞。因此，促进牙周膜干细胞的成骨分化和增殖能力具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于牙周膜干细胞增殖和成骨分化的促进剂。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种用于促进牙周膜干细胞增殖的基因，所述基因为RP11-289F5.1，所述基因的转录序列为ENST00000397864.2，所述ENST00000397864.2的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二方面，提供了RP11-289F5.1沉默试剂在制备牙周膜干细胞增殖促进剂中的应用。
优选地，所述沉默试剂选自shRNA，siRNA，小分子化合物。
优选地，所述沉默试剂为shRNA，所述shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述shRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的第三方面，提供了一种促进牙周膜干细胞增殖的促进剂，所述促进剂为RP11-289F5.1的shRNA，所述shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所诉shRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的第四方面，提供了RP11-289F5.1沉默试剂在制备牙周膜干细胞成骨分化促进剂中的应用。
优选地，所述沉默试剂选自shRNA，siRNA，小分子化合物。
优选地，所述沉默试剂为shRNA，所述shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述shRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的第五方面，提供了一种促进牙周膜干细胞成骨分化的促进剂，所述促进剂为RP11-289F5.1的shRNA，所述shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所诉shRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的有益效果在于，本发明首次发现非编码RNA RP11-289F5.1在牙周膜干细胞成骨分化的过程中表达量下调。其次，本发明设计和合成了沉默RP11-289F5.1的shRNA，并证明了沉默RP11-289F5.1能够有效的促进牙周膜干细胞的成骨分化和增殖。
附图说明
图1 牙周膜干细胞成骨分化过程中RP11-289F5.1表达量的变化。
图2 本发明设计的sh-RP11-289F5.1抑制效果检测结果。
图3沉默RP11-289F5.1对于ALP酶的调控。
图4沉默RP11-289F5.1对于细胞矿化的调控。
图5 沉默RP11-289F5.1对于成骨分化相关蛋白RUNX2和OCN的调控。
图6 沉默RP11-289F5.1对于牙周膜干细胞增殖的调控。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
检测RP11-289F5.1在牙周膜干细胞成骨分化中的变化
1.细胞处理
（1）实验分为两组，对照组使用普通完全培养基进行培养，实验组使用成骨诱导培养基（含10%FBS的α-MEM完全培养基加入100uM维生素C，10nMβ-甘油磷酸钠，10nM地塞米松）进行培养；
（2）将原代培养的牙周膜干细胞接种于6孔细胞培养板中，按照细胞分组进行培养，培养 7天，在1,3,5,7天分别使用荧光定量PCR检测RP11-289F5.1的表达水平；
2.荧光定量PCR检测
（1）将处理的细胞使用PBS清洗，每孔加入1ml Trizol试剂，按照Trizol试剂说明书提取牙周膜干细胞总RNA；
（2）按照基因组DNA逆转录试剂盒说明书，将RNA逆转录为cDNA，置于-20℃保存；
（3）设计RP11-289F5.1和GAPDH引物，引物序列如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（4）配置荧光定量PCR反应液，如下
Figure DEST_PATH_IMAGE003
（5）PCR反应条件：
Stage1:预变形 Reps：1 95℃ 30s；Stage2：PCR反应 Reps：40 95℃ 5s 60℃30s；
（6）使用2-ΔΔCt法进行数据分析，结果如图1所示。
从实验结果中可以看出，在牙周膜干细胞成骨分化的过程中，RP11-289F5.1的表达量逐渐降低，在培养第7天时，对照组的RP11-289F5.1的表达量为0.973±0.009，实验组的RP11-289F5.1的表达量为0.492±0.018，差异具有统计学意义。综上所述，在牙周膜干细胞成骨分化的过程中RP11-289F5.1的表达量逐渐下调。
实施例2
沉默RP11-289F5.1促进牙髓干细胞ALP酶活性
由于RP11-289F5.1的表达在牙髓干细胞的成骨分化过程中逐渐下调，因此我们猜想，抑制RP11-289F5.1的表达可以有效的促进牙髓干细胞的成骨分化。
1.设计sh-RP11-289F5.1并验证抑制效果
（1）设计合成RP11-289F5.1的shRNA，sh-RP11-289F5.1的序列如下所示（使用载体为pENTR™/U6）：
sh-RP11-289F5.1 序列
Top Strand 5'-CACCGCTGAAGAACGCAATCCAACAGAGATGTTGGATTGCGTTCTTCAGC -3'，SEQ ID NO.6
Bottom Strand 5'-AAAAGCTGAAGAACGCAATCCAACATCTCTGTTGGATTGCGTTCTTCAGC -3',SEQ ID NO.7
（2）使用荧光定量PCR检测sh- RP11-289F5.1的抑制效果，实验结果如图2所示。从图中可以看出，sh-RP11-289F5.1组的RP11-289F5.1的表达量为0.263±0.046，说明sh-RP11-289F5.1可以有效的抑制RP11-289F5.1。
2.沉默RP11-289F5.1研究其对牙周膜干细胞ALP酶活性的影响
（1）实验分为3组，NC组使用完全培养基进行培养；sh-NC组转染sh-NC并使用成骨分化培养基进行培养；sh-RP11-289F5.1组转染RP11-289F5.1并使用成骨分化培养基进行培养；
（2）按照步骤（1）实验分组进行培养，成骨诱导分化7天后，使用PBS清洗细胞，漂洗细胞2次，使用4%多聚甲醛固定细胞30min；
（3）弃去固定液，使用PBS漂洗2次，配置BCIP/NBT染色工作液，每孔加入1.5mlBCIP/NBT染色液，室温避光孵育30min；
（4）去除BCIP/NBT染色液，使用去离子水漂洗2次，拍照记录。
实验结果如图3所示，从图中可以看出，NC组无明显的ALP染色，sh- RP11-289F5.1组的ALP染色比sh-NC组更深，说明沉默RP11-289F5.1能够有效的促进牙周膜干细胞ALP酶的活性。
实施例3
沉默RP11-289F5.1研究其对牙周膜干细胞矿化的影响
（1）实验分为3组，NC组使用完全培养基进行培养；sh-NC组转染sh-NC并使用成骨分化培养基进行培养；sh-RP11-289F5.1组转染RP11-289F5.1并使用成骨分化培养基进行培养；
（2）按照步骤（1）实验分组进行培养，成骨诱导分化21天后，使用PBS清洗细胞，漂洗细胞2次，使用4%多聚甲醛固定细胞30min；
（3）弃去固定液，使用PBS漂洗2次，配置茜素红染液，每孔加入1.5ml 茜素红染液，室温避光孵育30min；
（4）去除茜素红染液，使用去离子水漂洗2次，拍照记录。
实验结果如图4所示，从图中可以看出，NC组无明显的矿化结节形成，sh- RP11-289F5.1组的矿化程度显著高于sh-NC组，说明沉默RP11-289F5.1能够促进牙周膜干细胞的矿化水平。
实施例4
（1）实验分为3组，NC组使用完全培养基进行培养；sh-NC组转染sh-NC并使用成骨分化培养基进行培养；sh-RP11-289F5.1组转染RP11-289F5.1并使用成骨分化培养基进行培养；
（2）成骨分化诱导14天后，去除培养基，使用PBS清洗3次；
（3）加入细胞裂解液裂解细胞，收集裂解液至1.5ml EP管中，超声波破碎提取蛋白5min，2s超声/3s暂停循环；
（4）4℃，12000r/min离心20min，收集沉淀；
（5）使用BCA法测量蛋白浓度，加入5×SDS上样缓冲液；
（6）配置12%分离胶，上样20ug，浓缩胶80V，30min，分离胶120V至溴酚蓝跑到分离胶底部；
（7）电泳结束后，在电转夹的黑色面上依次放置海绵垫、滤纸凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫，去除气泡加紧，250mA恒流电转1.5h；
（8）电转结束后，将PVDF膜取出使用TBST漂洗5min，然后加入到5%的脱脂奶粉中，室温摇床封闭1h；
（9）按照RUNX2，OCN，β-actin蛋白大小进行裁膜，放入到加有抗体的小槽内，4℃，孵育过夜；
（10）将PVDF膜取出置于TBST中洗膜3次，每次10min；
（11）根据相应抗体的要求，孵育二抗，室温孵育1h；
（12）去除二抗，使用TBST洗膜3次，每次10min，添加化学发光液，进行显影曝光。
实验结果如图5所示，从图中可以看出，相较于sh-NC组，sh- RP11-289F5.1组的RUNX2和OCN蛋白表达的表达量上调，说明沉默RP11-289F5.1能够有效的促进牙周膜干细胞成骨分化相关蛋白RUNX2蛋白和OCN蛋白的表达。
综合实施例2-4可以得出，沉默RP11-289F5.1能够有效的促进牙周膜干细胞的成骨分化。
实施例5
（1）实验分组为sh-NC组和sh-RP11-289F5.1组，sh-NC组转染sh-NC，sh-RP11-289F5.1组转染sh-RP11-289F5.1；
（2）将三代对数成长期的牙周膜干细胞接种于96孔板中，每孔加入2000个细胞，连续培养7天，每两天进行1次换液；
（3）分别在1,3,5,7天使用CCK-8检测吸光度并绘制生长曲线。
从图中可以看出，sh-RP11-289F5.1组的增殖速率明显快于sh-NC组。其中，1天时，二者差异无统计学意义；3天时，sh-NC组的OD值为0.260±0.029，sh-RP11-289F5.1组的OD值为0.399 ±0.041，P<0.05；5天时，sh-NC组的OD值为0.376±0.043，sh-RP11-289F5.1组的OD值为0.516 ±0.042，P<0.05；7天时，sh-NC组的OD值为0.436±0.43，sh-RP11-289F5.1组的OD值为0.606±0.042，P<0.05。
综合上述结果可以看出，沉默RP11-289F5.1能够有效的促进牙周膜干细胞的增殖。
本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 杨桂梅
<120> 一种用于牙周膜干细胞成骨分化的促进剂
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 791
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 1
gacaggatcc cactgtgtca cccaggctga agtgcagtgg caccattata gctcactgca 60
gccttgaact cttgggctca agtgatcctc ctacctcagc ctcccgagta gctgggacta 120
cagaaatgtc aattgcctac ctgatggctg tgaaaaacag aaagaagaaa caaagacata 180
tctgtatgta aaggttgagc ttgaaaaaag aaaactactc ttgacgctga agaacgcaat 240
ccaacatgaa agaatgctta tttcaagttt tacctgaatc tacctagagc tgaatttctt 300
atctatactt tactacagat attctgcttt gtgcagatct acaatggatc attaaagtca 360
aaggacaatt acttatcttt ctactcctcc cagtacccaa gacctgagag tgagatatta 420
aattcgtcct tagatctttc atgcaatgtt acagctcttt ggaactcctc atgaagctcc 480
tcctctccat ggtggaattt tactctgagg agagataggc taaaatgttt cagtccccta 540
tatgataagt ccaaaatcac cgtttcacat atatgctgac ctgatacatt gagtcactga 600
tacgtgtctt tccaccttca gtatattttc tttgactagc tttattgctt ccctgtgatg 660
ctgaattttg agcatggatg tgtgtgtcca taacaaaacc atcctaggta aactgaattt 720
ggttatttga atttcataat tactctttac tccaagtgtt gtggattcat gatgcaaatt 780
tacccattcc c 791
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctactcctcc cagtacccaa ga 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggagcttcat gaggagttcc aa 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtcaccagg gctgctttta 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggatctcgct cctggaagat g 21
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccgctgaa gaacgcaatc caacagagat gttggattgc gttcttcagc 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaaagctgaa gaacgcaatc caacatctct gttggattgc gttcttcagc 50

Claims (6)

1. RP11-289F5.1沉默试剂在制备牙周膜干细胞ALP酶活性促进剂中的应用,其特征在于，所述RP11-289F5.1的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述沉默试剂为shRNA，所述shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述shRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
3. RP11-289F5.1沉默试剂在制备牙周膜干细胞的细胞矿化促进剂中的应用,其特征在于，所述RP11-289F5.1的序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述沉默试剂为shRNA，所述shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述shRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
5. RP11-289F5.1沉默试剂在制备牙周膜干细胞RUNX2和OCN蛋白表达促进剂中的应用,其特征在于，所述RP11-289F5.1的序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述沉默试剂为shRNA，所述shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述shRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
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