CN113151267B

CN113151267B - 一种用于降低脐血间充质干细胞氧化应激凋亡的基因抑制剂

Info

Publication number: CN113151267B
Application number: CN202110350415.1A
Authority: CN
Inventors: 王颖翠; 魏国庆
Original assignee: Guangxi Leitai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangxi Leitai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2040-07-22
Also published as: CN111808861A; CN113151267A; CN111808861B

Abstract

本发明涉及一种用于降低脐血间充质干细胞氧化应激凋亡的基因抑制剂，属于生物医学技术领域。本发明所提供的基因抑制剂为LINC01097的siRNA；所述siRNA正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA反义链序列如SEQ ID NO.7所示。通过实验发现，本发明所提供的基因抑制剂能够有效的降低氧化应激所导致的脐血间充质干细胞凋亡，并且能够有效的促进脐血间充质干细胞的增殖。

Description

一种用于降低脐血间充质干细胞氧化应激凋亡的基因抑制剂

本案为分案申请，原申请的发明名称为一种lncRNA在氧化应激引起的脐血间充质干细胞凋亡中的应用，原申请的申请日为：2020-07-22，原申请的申请号为：CN202010711951.5。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种用于降低脐血间充质干细胞氧化应激凋亡的基因抑制剂。

背景技术

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一种严重类型的冠心病。目前，我国急性心肌梗死的发病率和致死率呈现出不断上升的趋势。目前，临床上通常使用药物溶栓，经皮冠状动脉介入术、冠状动脉旁路移植术等治疗措施，这些治疗措施虽然可以恢复冠状动脉再灌注，降低AMI患者的死亡率，但是均无法逆转已经坏死的心肌细胞，也无法修复已经坏死的心肌。因此，治疗后的患者会出现严重的心功能下降。

人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells）是一种能够自我复制和具有多向分化潜能的干细胞，因其具有取材方便，无免疫排斥反应和伦理问题等优势，在临床上具有广泛的应用前景。随着国内外对人脐血间充质干细胞研究的不断深入，脐血间充质干细胞移植在治疗急性心肌梗死时表现出传统治疗方法无法比拟的优势。移植人脐血间充质干细胞之后可以显著地改善患者的心脏功能，改善心肌梗死患者的临床症状和预后。但是，目前的研究表明由于急性心肌梗死患者的心肌内会出现氧化应激、缺血缺氧、免疫炎症反应等微环境，因此移植之后的人脐血间充质干细胞的生存能力大幅下降，细胞出现凋亡，从而使脐血间充质干细胞的移植效果大打折扣。因此，探究降低脐血间充质干细胞凋亡的机制，有效提高脐血间充质干细胞移植后的成活率和增殖速度对于提高脐血间充质干细胞对于急性心肌梗死的治疗效果具有重要的意义。

长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类大于200个核苷酸的非编码RNA。全基因组的研究表明，超过98%的人类基因都是非编码基因。这些不具有蛋白编码潜能的基因组序列曾一度被认为是基因组在进化过程中积累的无功能的“垃圾序列”。然而，随着研究的不断深入，科研人员逐渐发现lncRNA能够在多个层次调控细胞的增殖，分化和凋亡。目前，尚无相关研究对lncRNA在氧化应激引起的脐血间充质干细胞凋亡中的作用进行研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在脐血间充质干细胞氧化应激凋亡中发挥作用的长链非编码RNA。

为实现上述目的，本发明提供了一种用于脐血间充质干细胞氧化应激凋亡的lncRNA，其特征在于，所述lncRNA为LINC01097。

优选地，所述lncRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

此外，本发明提供了一种用于降低脐血间充质干细胞氧化应激凋亡的基因抑制剂，所述基因抑制剂为LINC01097的siRNA。

优选地，所述siRNA正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA反义链序列如SEQID NO.7所示。

此外，本发明提供了LINC01097基因抑制剂在降低脐血间充质干细胞氧化应激凋亡中的用途，所述LINC1097基因抑制剂为LINC01097 siRNA，所述LINC01097 siRNA正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述LINC01097 siRNA反义链序列如SEQ ID NO.7所示。

除此之外，本发明提供了LINC01097基因抑制剂在促进脐血间充质干细胞增殖中的用途，所述LINC01097基因抑制剂为LINC01097 siRNA,所述LINC01097 siRNA正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述LINC01097 siRNA反义链如SEQ ID NO.7所示。

本发明的有益效果在于：

本发明首次证明了氧化应激导致的脐血间充质干细胞凋亡过程中，LINC01097基因表达量上调，本发明设计siRNA抑制LINC01097后发现，抑制LINC01097能够显著的促进脐血间充质干细胞的增殖，并且能够有效的降低氧化应激所导致的脐血间充质干细胞凋亡，从而为提高脐血间充质干细胞的移植活性提供新的靶点，为临床上增加脐血间充质干细胞治疗心肌梗死的效果提供基础。

附图说明

图1 氧化损伤处理过程中的LINC01097的表达量变化

图2 si-NC组和si-LINC01097组CCK-8检测结果

图3 si-NC组和si-LINC01097组EDU增殖染色检测结果

图4 空白组，si-NC组和si-LINC01097组凋亡率检测结果

图5 空白组，si-NC组和si-LINC01097组凋亡蛋白Caspase3和BAX的检测结果。

具体实施方式

实施例1

获取脐血间充质干细胞

1.选择山东大学齐鲁医院（青岛）妇产科中健康、无急慢性疾病、无传染病、血传检测阴性的剖宫产妇采集脐血。新生儿产出后立即在距胎盘处钳夹结扎脐带并切断，行脐带静脉穿刺直接将脐血引流入装有枸橼酸钠的一次性采血袋内，共约30ml。

2.使用密度梯度离心法和细胞贴壁联合培养方法，分离间充质干细胞，纯化、培养、传代。

实施例2

检测LINC01097在氧化应激导致的脐血间充质干细胞凋亡中的表达量

（1）将脐血间充质干细胞接种于细胞培养板中，实验组使用50mmol/L的H₂O₂处理5小时，对照组未做处理，每组设置3个重复，实验重复3次；

（2）收集细胞按照Trizol试剂盒说明书提取RNA；

（3）按照Takara反转录试剂盒说明书反转录得到cDNA；

（4）按照TaKaRa 一步法荧光定量PCR试剂盒说明书检测LINC01097表达量；

引物序列如下：

基因LINC01097的正向引物为 5’-GGGCCTCAGTTTGCTCATCT-3’（SEQ ID NO.2）

基因LINC01097的反向引物为 5’-TGCGTACTTGCTACATGCCA-3’（SEQ ID NO.3）

基因GAPDH的正向引物为 5’-GTGGAAGGACTCATGACCACA-3’（SEQ ID NO.4）

基因GAPDH的反向引物为 5’-CCAGTAGAGGCAGGGATGATG-3’（SEQ ID NO.5）

荧光定量PCR反应条件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 35s，35个循环。

基因相对表达量按照2^－ΔΔCt计算。

实验结果

实验结果显示，氧化损伤处理后的脐血间充质干细胞中LINC1097的表达量显著升高，实验组LINC01097的相对表达量为2.419±0.059，差异具有统计学意义。

实施例3

设计LINC01097 siRNA并且验证干扰效果

1.根据LINC01097的基因序列设计siRNA，如下：

si-LINC01097-1

正义链 5’-GGGCUGUUGUGAAGAUUAAAU -3’（SEQ ID NO.6）

反义链 5’-UUAAUCUUCACAACAGCCCCU-3’（SEQ ID NO.7）

si-LINC01097-2

正义链 5’-GAGAGAUGUUCUAAAUGUUGC-3’（SEQ ID NO.8）

反义链 5’-AACAUUUAGAACAUCUCUCUG-3’（SEQ ID NO.9）

2.将脐血间充质干细胞接种于6孔培养板中，设置为4组，空白组不做处理，对照组转染si-NC，实验组1转染si-LINC01097-1，实验组2转染si-LINC01097-2，每组设置3个重复，实验重复3次；

3. RNA提取，逆转录反应，荧光定量PCR反应同实施例2；

实验结果

以空白组为基准，si-NC的抑制率为2.4%（差异无统计学意义），si-LINC01097-1的抑制率为84.7%（P< 0.0001，差异具有统计学意义），si-LINC01097-2的抑制率为77.4%（P<0.0001，差异具有统计学意义），可以看出，si-LINC01097-1的抑制效果更好，因此，下述实验所用si-LINC01097均为si-LINC01097-1。

实施例4

（1）将转染si-NC和si-LINC01097的脐血间充质干细胞接种于细胞板中（2000个/孔），每组设置3个复孔；

（2）分别在培养第一天，第三天，第五天和第七天使用CKK-8检测OD值。

实验结果如图2所示，可以看出si-LINC01097组的细胞增殖速率明显快于si-NC组，第7天时，si-NC组的OD值1.03±0.05，si-LINC01097组的OD值为1.32±0.04，差异具有统计学意义，说明抑制LINC01097能够促进脐血间充质干细胞的增殖速率。

实施例5

（1）将转染si-NC和si-LINC01097的脐血间充质干细胞接种于细胞板中（4000个/孔），每组设置3个复孔；

（2）培养48h后，每孔加入50 μmol/L Edu培养基，37℃、5% CO₂培养箱中培养2h；

（3）弃去培养基，PBS清洗2遍，每次5min，加入4%多聚甲醛室温固定30min；

（4）弃去固定液，加入0.2%甘氨酸摇床孵育5min，PBS清洗5min；

（5）加入0.5% Triton-100处理10min，PBS清洗5min；

（6）每孔加入100μL Apollo染色反应液，避光室温摇床孵育30min，弃去反应液；

（7）加入 Triton-100 摇床清洗2次，每次10min；

（8）加入100μl甲醇清洗5min，PBS清洗5min；

（9）加入DAPI染色20min，PBS清洗3次，每次5min，荧光显微镜下观察。

从图3可以看出，si-LINC01097组增殖细胞的数量，明显多于si-NC组，说明抑制LINC01097能够促进脐血间充质干细胞的增殖。

实施例6

（1）将空白对照组，si-NC组，si-LINC01097组接种于6孔板中，每组设置3个复孔，培养过夜后，si-NC组和si-LINC01097组使用50 mmol/L的H₂O₂处理5小时；

（2）每组收集 2×10⁵个细胞，PBS洗涤1次；

（3）离心后重悬于200μl缓冲液，加入5μl Annexin V-FITC混合，室温下避光孵育10min；

（4）加入10μl PI，通过流式细胞仪检测凋亡率。

实验结果如图4所示，可以看出，抑制LINC01097后，氧化应激所导致的脐血间充质干细胞凋亡率显著降低（si-NC组凋亡率为15.030±0.608，si-LINC01097组凋亡率为9.243±0.363，差异具有统计学意义（P< 0.001）），说明LINC01097 siRNA能够用于抑制氧化应激所导致的脐血间充质干细胞凋亡。

实施例7

（1）将空白对照组，si-NC组，si-LINC01097组接种于6孔板中，每组设置3个复孔，培养过夜后，si-NC组和si-LINC01097组使用50mmol/L的H₂O₂处理5小时；

（2）处理结束后，弃去培养基，加入PBS清洗3次，加入100μl蛋白裂解液进行蛋白提取；

（3）使用BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度为2μg/μl；

（4）每孔加入10μl蛋白样品，进行电泳，恒压90V 20min，恒压120V 1h；

（5）电泳结束后，进行电转，恒流250mA 1小时；

（6）将NC膜取出，放入到5%的脱脂奶粉中，室温封闭1h；

（7）孵育Csapase3，BAX和GAPDH一抗，4℃孵育过夜；

（8）PBS清洗3次，每次10min，孵育二抗，室温孵育1h；

（9）PBS清洗3次，每次10min，进行显影曝光。

实验结果如图5所示，从图中可以看出，抑制LINC01097后能够显著的降低氧化应激所导致的Caspase3和BAX蛋白上调。

从上述结果可以看出，在氧化应激环境下，脐血间充质干细胞中LINC01097的表达量明显升高，抑制LINC01097能够促进脐血间充质干细胞的增殖，而且，抑制LINC01097。

序列表

<110> 青岛思拓新源细胞医学有限公司

<120> 一种用于降低脐血间充质干细胞氧化应激凋亡的基因抑制剂

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2122

<212> DNA

<213> 人源(Human)

<400> 1

aacgaccggg cctcttccgg aggcctgcgg cagagtcgcc taagcatttg aatggacctc 60

agccctagga ccctggcgcc ctcggaaacc ggatctgagg tccggatcac taacgttcag 120

agatgcaagg gaagccgaga agttgccgaa agggcctgag agctgcttct ccttctccct 180

gggcagcaaa cctccaagcc tgtgcgggcc aatctttgca tcctggtaac cagcgcttta 240

tttagcgcct aatcgctttc ctgtcctgca atggagactg agggcagagg agagtgcagc 300

ttatccaaga tctcaaggct agtaattggt gagaaaattc tgcacagaac cattcccagt 360

ggtgagactg tttttgtcct tcagcccggg aaaggcagac ctggctccct ccttttattt 420

gcaagcctca aaaccatcaa gacaggcaaa gacactcgaa gggcgcggac cttcgctgag 480

acgccaccca cgcaagtgga ggaagcactt gcgccactgc tgagcggttg gaaggggaac 540

actgcagcga tgacccacga gtgtcaacga gaccaggtgc ccattaggga aacagagatg 600

gagaagaaat cacgcgccaa ggtctgaaat tcggcgtggc tctcactcga catctcccca 660

ttctcgccac ccgtgcaccc gcctgcagcg gcgcaccggg ctcggtgctg cacctgcctc 720

ctggcgcctg cgccactgcc cccgcgcggg tcccaccgcg caggacgccc cttcctgctt 780

ccgacgtctg ctgtggatca cacgcggtcg ctgccaaagc ctccatttcg gttctgaccc 840

agtgactttg gggacgccca gggaggagat gtggagagga tgtggccaag gtgaaccagc 900

cagtgtaagt gctaatgctt ctggcttctc ggtaacacct accctgcccc accacccaaa 960

tcgggccttg atcaaaaaag aagcgtcttg acaatacatt tttagacata aataagttga 1020

aggtgcccac ggagggaggt tgaaaacatt tgattatcag gacagagtag aagcctgttt 1080

ggctcatcct tttggccagc tctaaagcag cagtggacac ttctttgcga ttttgcaagg 1140

atgtttgtga atgtactttg taactcctag aaaataggca aaaaaccgtg agtggatgta 1200

gtcgcaccgc tggcacctgt aagaacgcgc cctaaagctg tggaactgct attcaggttc 1260

caggcacacg tctcaagcct caaacctcca agagttgcct tagctgctca ttttactggt 1320

aagaagacgg aggtcaagcc tgaagatagt ggctctgctg ttttcttagg ctgcttgaag 1380

ctttagataa gcaggaaaat tccatcaaag aaatccctgt atgtaaattg ggagaaaaag 1440

atatgatgaa tattaatgca gaggcctctg aacaaatgga acctccattt tcacatccag 1500

cacaggatca tttgcagcca gacaacctga gagtcaaccc caactctacc ttttactaat 1560

tgcatgatat tgggcctcag tttgctcatc tgtaaattgg gtgcagtgat agaatctatc 1620

ccacagggtt ttgctgagca ttaaatgagt ttaaacttgt agatggctta gaataatgcc 1680

tggcatgtag caagtacgca gttactggcg cctggtgtat atagtaagta ctcgatatac 1740

attaactatt tttcaaagac accacagctc acctgggaag gaatctcagg tatttgcctg 1800

agattcaagc aaacaaatat ggaagctacc aaaggctcat gaagcctgaa ggatccttgc 1860

agagagatgt tctaaatgtt gcctagaaag gcagtttgga gggaggcctc tccagtcaga 1920

ggtctggatg ctaagtttag ctctgccaca tattagccag gtaattttga agtaataaac 1980

aatctctttg tgcctccatt tcttcttgtg taaaatgagg ggctgttgtg aagattaaat 2040

aaatacatgt aaagcattta aagccagacc tggcagaaag ggtgctttat gtttgcttta 2100

aaaatatata tgtacaacat tt 2122

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggcctcagt ttgctcatct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcgtacttg ctacatgcca 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtggaaggac tcatgaccac a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccagtagagg cagggatgat g 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggcuguugu gaagauuaaa u 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uuaaucuuca caacagcccc u 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagagauguu cuaaauguug c 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aacauuuaga acaucucucu g 21

Claims

1.抑制LINC01097表达的siRNA在制备降低脐血间充质干细胞氧化应激凋亡药物中的应用，其特征在于，所述siRNA正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA反义链序列如SEQID NO.7所示。

2. 抑制LINC01097表达的siRNA在制备用于促进脐血间充质干细胞增殖的药物中的应用，其特征在于，所述siRNA正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA反义链序列如SEQID NO.7所示。

3.抑制LINC01097表达的siRNA在制备降低氧化应激导致的脐血间充质干细胞Caspase3蛋白表达上调的药物中的应用，其特征在于，所述siRNA正义链序列如SEQ IDNO.6所示，所述siRNA反义链序列如SEQ ID NO.7所示。