CN109679960A - 一种调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA及其应用 - Google Patents

一种调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA及其应用，属于基因工程及基因治疗技术领域。本发明的技术方案要点为：一种调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA，该siRNA的靶基因序列如序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明采用分子生物学手段，首次确证基因RGD1559786与肝细胞增殖有显著相关性，并通过筛查siRNA，筛选得到特异性的针对基因RGD1559786的干扰靶点，应用MTT、EdU、qRT‑PCR、Western‑blot技术分析该siRNA干扰靶点对大鼠肝细胞BRL‑3A增殖的影响，结果表明应用siRNA针对该靶点可以有效地抑制大鼠肝细胞BRL‑3A增殖，能够进一步用于制备预防或治疗肝病的药物。

Description

一种调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA及其应用
技术领域
本发明属于基因工程及基因治疗技术领域，具体涉及一种调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA及其应用。
背景技术
肝脏是机体的重要器官之一，承担着物质代谢、氨基酸利用、胆汁合成与转化、生物合成与转化、氧化保护、解毒等至少5000种以上的生理作用。研究表明，许多的理化、生物因素等可损伤肝脏，引起肝脏结构、功能异常，导致一系列肝脏疾病。研究肝再生和细胞增殖相关基因，对阐明肝再生的分子机理，揭示肝脏疾病发生机制，建立治疗和预防肝病方法有重要的理论和实用价值。目前，已有大量报道指出，RNAi技术能够特异性地向哺乳动物细胞中导入siRNA，可以降低靶基因的表达，达到高效特异性的基因治疗作用。
RGD1559786基因全长为9386bp，含8个外显子，其外显子分别位于该基因的70-110，323-406，1727-1783，2216-2297，2481-2512，3580-3657，5033-5098，6992-7946bp处，其mRNA全长为1466bp，共编码160个氨基酸。其保守结构域是pfam05907，是功能未知的真核蛋白(DUF866)，该家族由许多功能未知的假设真核蛋白组成，平均长度约165个残基。在大鼠体内，RGD1559786还是一个功能不详的基因，能否促进体外培养的大鼠肝细胞增殖尚不明确。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA及其应用。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA，其特征在于该siRNA的靶基因序列如序列表中SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明所述的调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA，其特征在于该siRNA为以下双链RNA分子中的任意一种：
正义链：5’-UCAGAGAAGUGGCAAUAUAdTdT-3’，
反义链：3’-dTdTAGUCUCUUCACCGUUAUAU-5’；
正义链：5’-GACAUCAAUCUGCAAGAAAdTdT-3’，
反义链：3’-dTdTCUGUAGUUAGACGUUCUUU-5’；
正义链：5’-ACAAUGCAGAAGACAACGAdTdT-3’，
反义链：3’-dTdTUGUUACGUCUUCUGUUGCU-5’。
本发明所述的调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA在制备预防或治疗肝病药物中的应用，其特征在于具体过程为：应用RNAi技术特异性地向哺乳动物和大鼠的肝细胞BRL-3A中导入所述调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA来降低靶基因的表达，进而引起靶蛋白的表达下降，达到高效特异性的基因治疗作用。
本发明所述的调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA在制备预防或治疗肝病药物中的应用，其特征在于：通过将所述调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA导入肝细胞BRL-3A中有效抑制肝细胞BRL-3A的增殖。
本发明所述的调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA在制备预防或治疗肝病药物中的应用，其特征在于：将所述调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA导入肝细胞BRL-3A中促使肝细胞BRL-3A中细胞增殖相关基因JUY、MYC和CCND1表达下调，进而有效抑制肝细胞BRL-3A的增殖。
本发明采用分子生物学手段，首次确证基因RGD1559786与肝细胞增殖有显著相关性，并通过筛查siRNA，筛选得到特异性的针对基因RGD1559786的干扰靶点，应用MTT、EdU、qRT-PCR、Western-blot技术分析该siRNA干扰靶点对大鼠肝细胞BRL-3A增殖的影响，结果表明应用siRNA针对该靶点可以有效地抑制大鼠肝细胞BRL-3A增殖，能够进一步用于制备预防或治疗肝病的药物。
附图说明
图1是RGD1559786siRNA转染BRL-3A细胞后RGD1559786mRNA和蛋白水平表达情况，NC代表阴性对照，siR1、siR2、siR3表示RGD1559786的3个siRNA片段；
图2是RGD1559786siRNA转染BRL-3A细胞后对BRL-3A细胞活力的影响，MTT法检测RGD1559786干涉后对细胞活力的影响，*p<0.05；
图3是RGD1559786siRNA转染BRL-3A细胞后对BRL-3A细胞增殖的影响，EdU法检测RGD1559786干涉后对细胞增殖的影响，*p<0.05；
图4是RGD1559786siRNA转染BRL-3A细胞后对细胞增殖相关基因表达的影响，干涉RGD1559786siRNA后对BRL-3A细胞中JUN、MYC和CCND1的mRNA水平的影响，所有数据表示为平均值±标准差，*p<0.05，**p<0.01。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
BRL-3A细胞培养：大鼠BRL-3A肝细胞株购自北京医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，培养基为DMEM培养基(Invitrogen公司)，其中含10％的胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司)和200U/mL青霉素和链霉素(Invitrogen公司)。首先将BRL-3A细胞复苏，在CO2培养箱中培养细胞，24h后，视情况进行细胞换液。观察细胞的生长情况，细胞生长至愈合度为75％-85％时，需要对细胞进行传代培养。用0.25％胰酶消化细胞，以1：5传代。然后于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。
RGD1559786的siRNA序列设计、合成：用Ambion、Qiagen、Dharmacon等多种siRNA设计软件，根据GenBank获取大鼠的RGD1559786mRNA序列(NM_001034132.1)搜索AA序列并记录每个AA 3’端相邻的19个核苷酸，筛选出GC含量在30％-55％之间的siRNA。再根据siRNA基本设计原则进行进一步筛选，并将筛选出的siRNA序列在GenBank的基因组数据库中用BLAST检索其同源性，选用与非同源基因有3个以上的碱基错配的序列，以排除非特异性抑制的可能，在满足以上条件的基础上，最终确定3条RGD1559786的siRNA序列(表1)。siRNA序列由广州锐博生物科技有限公司合成，同时合成一个杂乱的不识别任何哺乳动物基因的序列作为阴性对照。
表1 RGD1559786的siRNA序列
细胞转染：取对数生长期生长状态良好的BRL-3A细胞，用0.25％胰酶(Invitrogen公司)消化，按0.3×104个cell/孔接种于96孔细胞培养板中，于37℃，放入CO2培养箱中继续培养12h，按脂质体转染试剂(LipofectamineTM 2000，Invitrogen，USA)操作说明书进行细胞转染，加入适当量的siRNA与适当量的无血清的DMEM培养基混匀，和适当量的转染试剂与无血清的DMEM培养基混匀，静置5min；再将上述两种试剂轻柔的混合，室温静置10-20min，使得转染试剂-siRNA混合物的形成；在混合物静置这段时间，将事先铺好的细胞换液，换做无血清的DMEM培养基；将转染试剂-siRNA混合物加入无血清DMEM培养基中，并充分混匀；37℃孵育4h，换完全培养基。37℃继续培养至取材时间点。简言之，分别将50nM的siRNA和0.2μL转染试剂加入5μL OPTI-MEM培养基，于室温静置5min。将上述溶液轻轻混匀形成转染复合物，室温静置20min，加入到含0.1mL OPTI-MEM培养基的细胞中，于37℃孵育4h，换完全培养基。每个实验组设置3个复孔，实验重复3次。
有效RGD1559786siRNA的筛选：RGD1559786siRNA转染BRL-3A细胞，48h后收集细胞，用0.25％胰酶消化细胞，PBS洗后收集细胞，按Trizol操作说明书进行细胞总RNA的提取，琼脂糖凝胶电泳检测RNA,其中28S:18S的条带为2:1，用微量分光光度计检测细胞总RNA的浓度，并根据OD260/280的比值判断RNA的纯度，比值约为1.9-2.1。用qRT-PCR检测RGD1559786的表达情况，结果表明转染RGD1559786siRNA的BRL-3A细胞中，RGD1559786表达量明显低于阴性对照NC组(图1)。用SPSS 13.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)的最小显著性法(least significance difference，LSD)进行统计学分析，结果表明，siR2组、siR3组与NC(对照)比差异显著(p＜0.05)，siR1组与NC对照比差异极显著(p＜0.01)，为此，后续试验均用siR1。
MTT法：将siRNA转染处理BRL-3A细胞24h、48h和72时，在含细胞的培养基中加入10μlMTT(Geneview，USA)，使其最终浓度达到0.5mg/mL，之后放入CO2培养箱中继续避光培养4h，彻底弃去培养基，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO，Geneview，USA)，轻轻震荡10min，充分溶解甲瓒晶体。最后，在避光条件下，用Biotek reader酶标仪检测490nm处各孔的吸光值。每个实验组设置5个复孔，实验重复3次。
RGD1559786对BRL-3A细胞活力的影响：siRNA干涉体外培养的BRL-3A细胞RGD1559786后24h、48h、72h，MTT检测细胞活力发现转染RGD1559786siRNA 48h后，细胞活力与阴性对照(NC)相比，明显低于NC组(图2)，SPSS 13.0软件用单因素方差分析(one-wayANOVA)的LSD法进行组间差异性的统计学分析，结果表明，RGD1559786siRNA组与NC组相比，48h细胞活力明显低于对照组(p＜0.05)，表明RGD1559786能够通过提高BRL-3A细胞活力促进大鼠BRL-3A细胞存活。
取上述转染48h后的细胞BRL-3A于取材前2h加入EdU溶液，使其终浓度为50μmol/L。操作步骤按EdU试剂盒说明书进行(锐博，广州)。用4wt％多聚甲醛固定30min，在2g/L的甘氨酸中脱色孵育5min，在0.5wt％TritonX-100中脱色10min。在1X Apollo中孵育30min，于0.5wt％TritonX-100中孵育10-30min，于1x DAPI标记细胞核10min，上述每一个步骤，均用PBS洗3次。最后，在荧光显微镜进行观察和拍照，并用Image-Pro Plus 6.0软件对EdU阳性细胞和相应视野下的阳性细胞核分别进行计数。
RGD1559786siRNA对BRL-3A细胞增殖的影响：体外培养的BRL-3A细胞干涉RGD1559786后48h，EdU检测细胞增殖发现转染RGD1559786siRNA后，EdU阳性细胞数与阴性对照(NC)相比，明显低于NC组(图3)，SPSS 13.0软件用单因素方差分析(one-way ANOVA)的LSD法进行组间差异性的统计学分析，结果表明，RGD1559786siRNA与NC组相比，EdU阳性细胞数显著降低(p＜0.05)，表明RGD1559786siRNA能够抑制大鼠BRL-3A细胞增殖。
实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)：用0.25％胰酶消化细胞，收集细胞，细胞总RNA抽提按Trizol试剂操作说明书进行(Invitrogen Corporation，Carlsbad，California，USA)，RNA浓度和纯度检测。根据基因在GenBank登录的序列号，用primerexpress 2.0软件设计其相应引物，并由上海生工有限公司合成(表2)。然后，以2μg RNA为模板，参照AMV反转录试剂盒(Promega，USA)的操作说明进行反转录得到相应的cDNA。通过普通PCR反应，摸索并确定最佳退火温度、模板量和引物量后，再进行SYBR Green法的qRT-PCR。最后，取1μL cDNA，按PCR试剂盒(Promega，USA)扩增基因，检测基因的扩增产物荧光信号值，并以β-actin(NM_031144)为内参计算基因的相对表达量(Ratio值)。每个样品做3个复孔，实验重复3次。根据基因在GenBank登录的序列号，用primer express 2.0软件设计其相应引物，并由上海生工有限公司合成(表2)。
表2 The primer sequences of genes for qRT-PCR
RGD1559786siRNA对BRL-3A的细胞增殖相关基因表达的影响：用qRT-PCR检测干涉RGD1559786siRNA后细胞增殖、凋亡相关基因的表达变化。结果表明，干涉RGD1559786siRNA后大鼠BRL-3A细胞中细胞增殖相关基因JUN、MYC和CCND1表达下调(图4)。干涉RGD1559786siRNA后对BRL-3A细胞中JUN、MYC和CCND1的mRNA水平的影响，所有数据表示为平均值±标准差。*p<0.05，**p<0.01。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
序列表
<110> 河南师范大学
<120> 一种调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA及其应用
<130> 2019
<141> 2019-03-05
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1466
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
cagctgtcgc agtagtataa cgtggacgag cagctatggg gaaaatcgca cttcagctca 60
aagccacact ggagaacgtc acgaaccttc ggccagtggg cgaagacttc cggtggtacc 120
tcaagatgaa atgtggcaac tgtggtgaga tttcagagaa gtggcaatat atccggctga 180
tggacagtgt ggcgctgaaa ggaggccgag gcagtgcctc catggtccag aagtgcaagc 240
tgtgtgcacg ggagaactct attgaaattc tgagcagcac catcaagtct tacaatgcag 300
aagacaacga gaagttcaag acaatagtag agtttgagtg ccggggcctt gaaccagttg 360
acttccagcc ccaggctggg tttgctgctg aaggtgtgga gtcagggaca gtcttcagtg 420
acatcaatct gcaagaaaag gactggacag actatgatga gaagactcag gagtctgtgg 480
ggatctttga agtcacccat cagtttgtga agtgctgaac tctctgcctg cacacctgcc 540
tataagaaca gagacagagc tccctgagca gcagttccca tggaggcttc tagctctgct 600
ttcccagcac ctgtaccaag ccctcacagt ctgcatgcca gggctagcca cagttctgag 660
tcccaccaat aaagcccctg ttggtgccgc agtggtatgt gaaggtggtc tgagcagtac 720
ttctccacag ataagaatga attccggagg cctttgcttt ctaatcctac tctgtaccgg 780
atccagtttg cacacagctt aaataaagtc tctccagctc ttaagaaata ggcaggccag 840
cctacaggat caaaggcgtg agagccagtg gcacaaaggc agagaagcca atggagtgct 900
gctgtgaacc cagtagctcc aaactaaaac actcctgagc acatggttct ccagtgaacc 960
caggtatctg tcagctgctc atttcacacc cagagtccac tccagagacc agcagcccac 1020
cgctggccca ttctgtccac gtcacaaaat ccctggctaa tggctctgtt cacttgctgt 1080
gatagagtac ttcctgtcag agtcaacatc aaagtcttcc ctgtgatcag cctctgcgtc 1140
ccctgaagca cctcttcctg gtcccaactt atctcctgtt ctgcttccag ccagctctcg 1200
gagtgaagac cgcaatcatg gtccactgag tctcgtggaa ccgaagatcc ccacacagca 1260
gacagagctg tgagtgcagg caatgagtat gctgtgcctt catacttggg gaaccaccat 1320
ttggaaaaac tgtttccaca cacatttctc cagtactcta ctggagaaaa gaaagattgt 1380
atttttaatt gtgcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1466
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
tcagagaagt ggcaatata 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
gacatcaatc tgcaagaaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
acaatgcaga agacaacga 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
ucagagaagu ggcaauaua 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
agucucuuca ccguuauau 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
gacaucaauc ugcaagaaa 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
cuguaguuag acguucuuu 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
acaaugcaga agacaacga 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
uguuacgucu ucuguugcu 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
tgaaggtgtg gagtcaggga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
caacaggggc tttattggtg 20
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
ggctgttcat ctgtttgtct tcat 24
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
tcccttttct ttacggtctc ggt 23
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
acccaacatc agcggtcg 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
cgtgactgtc gggttttcca 20
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
acatccgtaa agacctctat gccaca 26
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
gtgctaggag ccagggcagt aatc 24

Claims (5)

1.一种调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA，其特征在于该siRNA的靶基因序列如序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA，其特征在于该siRNA为以下双链RNA分子中的任意一种：
正义链：5’-UCAGAGAAGUGGCAAUAUAdTdT-3’，
反义链：3’-dTdTAGUCUCUUCACCGUUAUAU-5’；
正义链：5’-GACAUCAAUCUGCAAGAAAdTdT-3’，
反义链：3’-dTdTCUGUAGUUAGACGUUCUUU-5’；
正义链：5’-ACAAUGCAGAAGACAACGAdTdT-3’，
反义链：3’-dTdTUGUUACGUCUUCUGUUGCU-5’ 。
3.权利要求1或2所述的调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA在制备预防或治疗肝病药物中的应用，其特征在于具体过程为：应用RNAi技术特异性地向哺乳动物和大鼠的肝细胞BRL-3A中导入权利要求1或2所述的调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA来降低靶基因的表达，进而引起靶蛋白的表达下降，达到高效特异性的基因治疗作用。
4.权利要求1或2所述的调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA在制备预防或治疗肝病药物中的应用，其特征在于：通过将权利要求1或2所述的调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA导入肝细胞BRL-3A中有效抑制肝细胞BRL-3A的增殖。
5.权利要求1或2所述的调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA在制备预防或治疗肝病药物中的应用，其特征在于：将权利要求1或2所述的调节肝细胞增殖的新基因RGD1559786的siRNA导入肝细胞BRL-3A中促使肝细胞BRL-3A中细胞增殖相关基因JUY、MYC和CCND1表达下调，进而有效抑制肝细胞BRL-3A的增殖。
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