CN109722438A - 一种调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA及其应用，属于基因工程及基因治疗技术领域。本发明的技术方案要点为：一种调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA，该siRNA的靶基因序列如序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明采用分子生物学手段，首次确证基因Tcaim与肝细胞增殖有显著相关性，并通过筛查siRNA，筛选得到特异性的针对基因Tcaim的干扰靶点，应用MTT、EdU、qRT‑PCR、Western‑blot技术分析该siRNA干扰靶点对大鼠肝细胞BRL‑3A增殖的影响，结果表明应用siRNA针对该靶点可以有效地抑制大鼠肝细胞BRL‑3A增殖，能够进一步用于制备预防或治疗肝病的药物。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及细胞工程领域，具体涉及一种调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA及其应用。
背景技术
肝脏是动物体内重要的代谢器官和最大的消化腺，结构复杂并且功能多样，对生命的维持具有重要意义。肝脏具有非常强的再生能力，肝再生的机理十分复杂，由多种类型的肝脏细胞高度协调、涉及多种细胞因子和生长因子、多种信号通路参与且受机体精密调控的动态过程。研究肝再生和肝细胞增殖相关基因，对建立治疗和预防肝病方法、开发预防和治疗肝病药物具有重大理论意义和临床应用价值。研究已表明，RNAi技术能特异性地向哺乳动物细胞中导入siRNA，能降低靶基因的表达，进而造成靶蛋白的表达下降，达到高效特异性的基因治疗作用。
Tcaim基因全长为31224bp，含11个外显子，其外显子分别位于该基因的1-198，3130-3199，9402-9558，14683-14935，19860-19982，22388-22485，22871-22962，26968-27200，28515-28646，29681-31224bp处，其mRNA全长为1789bp，共编码505个氨基酸，其保守结构域是pfam14687(DUF4460)和pfam14688(DUF4461)，是个未知功能的结构域，该结构域家族存在于真核生物中，通常长度为103-119个氨基酸。存在保守的HPD序列基序。有两个完全保守的残基(N和F)可能在功能上很重要。然而，在大鼠体内，Tcaim还是一个功能不详的基因，能否促进体外培养的大鼠肝细胞增殖尚不明确。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA及其应用。
本发明采用以下技术方案来解决上述技术问题，一种调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA，其特征在于该siRNA的靶基因序列如序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明所述的调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA，其特征在于该siRNA为以下双链RNA分子中的任意一种：
正义链：5’-AAACCAACUCAGCUUACAUdTdT-3’，
反义链：3’-dTdTUUUGGUUGAGUCGAAUGUA-5’；
正义链：5’-UUGAACACGUCCAAAGCUUdTdT-3’，
反义链：3’-dTdTAACUUGUGCAGGUUUCGAA-5’；
正义链：5’-ACAUAGUCUUAGCCGCCUAdTdT-3’，
反义链：3’-dTdTUGUAUCAGAAUCGGCGGAU-5’。
本发明所述的调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA在制备预防或治疗肝病药物中的应用，其特征在于具体过程为：采用RNAi技术特异性地向哺乳动物和大鼠肝细胞BRL-3A中导入所述调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA来降低靶基因的表达，进而引起靶蛋白的表达下降，达到高效特异性的基因治疗作用。
本发明所述的调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA在制备预防或治疗肝病药物中的应用，其特征在于：通过将所述调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA导入肝细胞BRL-3A中有效抑制肝细胞BRL-3A的增殖并抑制肝细胞BRL-3A的细胞活力。
本发明所述的调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA在制备预防或治疗肝病药物中的应用，其特征在于：将所述调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA导入肝细胞BRL-3A中促使肝细胞BRL-3A中细胞增殖相关基因JUY、BCL2和MYC表达下调，进而有效抑制肝细胞BRL-3A的增殖。
本发明采用分子生物学手段，首次确证基因Tcaim与肝细胞增殖有显著相关性，并通过筛查siRNA，得到特异性的针对基因Tcaim的干扰靶点，应用MTT、EdU、qRT-PCR、Western-blot技术分析该siRNA干扰靶点对大鼠肝细胞BRL-3A增殖的影响，结果表明应用siRNA针对该靶点可以有效地抑制大鼠肝细胞BRL-3A增殖，能够进一步用于制备预防或治疗肝病的药物。
附图说明
图1是Tcaim siRNA转染BRL-3A细胞后Tcaim mRNA和蛋白水平表达情况，NC代表阴性对照，siR1、siR2、siR3表示Tcaim的3个siRNA片段；
图2是Tcaim siRNA转染BRL-3A细胞后对BRL-3A细胞活力的影响，MTT法检测TcaimsiRNA干涉后对细胞活力的影响，*p<0.05；
图3是Tcaim siRNA转染BRL-3A细胞后对BRL-3A细胞增殖的影响，EdU法检测TcaimsiRNA干涉后对细胞增殖的影响，*p<0.05；
图4是Tcaim siRNA转染BRL-3A细胞后对细胞增殖相关基因表达的影响，其中A为干涉Tcaim siRNA后对BRL-3A细胞中JUN、BCL2和MYC的mRNA水平的影响，B为干涉TcaimsiRNA后对BRL-3A细胞中JUN、BCL2和MYC的蛋白水平的影响，所有数据表示为平均值±标准差，*p<0.05，**p<0.01。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
BRL-3A细胞培养：大鼠BRL-3A肝细胞株购自北京医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，培养基为DMEM培养基(Invitrogen公司)，其中含10％的胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司)和200U/mL青霉素和链霉素(Invitrogen公司)。BRL-3A细胞密度达到80％时，用0.25％胰酶37℃消化约2-3分钟，倒置显微镜下观察细胞边缘回缩，形态变圆，且有少量开始随胰酶漂移时，立即加入完全培养基终止消化，按1:5进行细胞传代。于37℃、5％CO2条件下进行细胞培养。
Tcaim的siRNA序列设计、合成：用Ambion、Qiagen、Dharmacon等多种siRNA设计软件，根据GenBank获取大鼠的Tcaim mRNA序列(NM_001110838.1)搜索AA序列并记录每个AA3’端相邻的19个核苷酸，筛选出GC含量在30％-55％之间的siRNA。再根据siRNA基本设计原则进行进一步筛选，并将筛选出的siRNA序列在GenBank的基因组数据库中用BLAST检索其同源性，选用与非同源基因有3个以上的碱基错配的序列，以排除非特异性抑制的可能，在满足以上条件的基础上，最终确定3条Tcaim的siRNA序列(表1)。siRNA序列由广州锐博生物科技有限公司合成，同时合成一个杂乱的不识别任何哺乳动物基因的序列作为阴性对照。
表1 Tcaim的siRNA序列
细胞转染：取对数生长期的BRL-3A细胞，0.25wt％胰酶(Invitrogen公司)消化，按0.3×104个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，于37℃继续培养12h，按脂质体转染试剂(LipofectamineTM 2000，Invitrogen，USA)操作说明书进行细胞转染。简言之，分别将50nM的siRNA和0.2μL转染试剂加入5μL OPTI-MEM培养基，于室温静置5min。将上述溶液轻轻混匀形成转染复合物，室温静置20min，加入到含0.1mL OPTI-MEM培养基的细胞中，于37℃孵育4h，换完全培养基。每个实验组设置3个复孔，实验重复3次。
有效Tcaim siRNA的筛选：Tcaim siRNA转染BRL-3A细胞，48h后收集细胞，提取总RNA，用微量分光光度计检测细胞总RNA的浓度，提取RNA的OD260:280为1.9-2.1，琼脂糖凝胶电泳检测RNA，其中28S:18S的条带为2:1。用qRT-PCR检测Tcaim的表达情况，结果表明转染Tcaim siRNA的BRL-3A细胞中，Tcaim表达量明显低于阴性对照NC组(图1)。用SPSS 13.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)的最小显著性法(least significancedifference，LSD)进行统计学分析，结果表明，siR1组、siR2组与NC(对照)比差异显著(p＜0.05)，siR3组与NC对照比差异极显著(p＜0.01)，为此，后续试验均用siR3。
MTT法：用siRNA转染处理细胞后24h、48h和72时，在含细胞的培养基中加入MTT(Geneview，USA)，使其最终浓度达到0.5mg/mL，于37℃培养箱中继续避光孵育4h，彻底弃去培养基，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO，Geneview，USA)，轻轻震荡10min，充分溶解甲瓒晶体。最后，用Biotek reader酶标仪检测490nm处各孔的吸光值。每个实验组设置5个复孔，实验重复3次。同时设置调零孔和阴性对照孔。
Tcaim对BRL-3A细胞活力的影响：体外培养的BRL-3A细胞干涉Tcaim后24h、48h、72h，MTT检测细胞活力发现转染Tcaim siRNA后，细胞活力与阴性对照(NC)相比，明显低于NC组(图2)，SPSS 13.0软件用单因素方差分析(one-way ANOVA)的LSD法进行组间差异性的统计学分析，结果表明，Tcaim siRNA组与NC组相比，24h和48h细胞活力明显低于对照组(p＜0.05)，表明Tcaim能够通过提高BRL-3A细胞活力促进大鼠BRL-3A细胞存活。
取上述转染48h后的细胞于取材前2h加入EdU溶液，使其终浓度为50μmol/L。操作步骤按EdU试剂盒说明书进行(锐博，广州)。首先用4wt％多聚甲醛固定30min，然后再在2g/L的甘氨酸中脱色孵育5min，再在0.5wt％TritonX-100中脱色10min。接着，在1 X Apollo中孵育30min，再于0.5wt％TritonX-100中孵育10-30min，并于1 x DAPI标记细胞核10min，上述每一个步骤，均用PBS洗3次。最后，用荧光显微镜进行观察和拍照，并用Image-Pro Plus6.0软件对EdU阳性细胞和相应视野下的细胞核分别进行计数。
Tcaim siRNA对BRL-3A细胞增殖的影响：体外培养的BRL-3A细胞干涉Tcaim后48h，EdU检测细胞增殖发现转染Tcaim siRNA后，EdU阳性细胞数与阴性对照(NC)相比，明显低于NC组(图3)，SPSS 13.0软件用单因素方差分析(one-way ANOVA)的LSD法进行组间差异性的统计学分析，结果表明，Tcaim siRNA与NC组相比，EdU阳性细胞数显著降低(p＜0.05)，表明Tcaim siRNA能够抑制大鼠BRL-3A细胞增殖。
实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)：细胞处理后不同取材时间点，用0.25％胰酶消化细胞，PBS洗后收集细胞，按Trizol(Invitrogen Corporation，Carlsbad，California，USA)操作说明书进行细胞总RNA的提取，分光光度计检测其纯度(A260/280吸光值)。根据GenBank登录的基因序列号，用primer express 2.0软件设计基因的引物序列，并由上海生工有限公司合成(表2)。然后，以2μg RNA为模板，按照AMV反转录试剂盒(Promega，USA)操作说明进行反转录，得到第一链cDNA。，取1μL cDNA，按PCR试剂盒(Promega，USA)扩增基因，检测基因的扩增产物荧光信号值，并以β-actin(NM_031144)为内参计算基因的相对表达量(Ratio值)。每个样品做3个复孔，实验重复3次。
表2 The primer sequences of genes for qRT-PCR
蛋白免疫印迹检测(Western blot)：将Tcaim siRNA转染的BRL-3A细胞收集并裂解细胞。用Neuhoff方法测定样品的总蛋白浓度，并取20μg进行SDS-PAGE电泳后转硝酸纤维素膜(PALL公司)。转膜后，将膜置于含5wt％脱脂奶粉的TBS-T缓冲液中于37℃封闭1h。然后用一抗(武汉博士德，一抗：TBS-T为1:500)进行4℃孵育过夜，然后用碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗(用TBS-T稀l:1000释，北京鼎国)进行再标记；用ECL底物发光法进行(上海生工)显色。最后，用图像分析软件Image QuantTMTL进行灰度扫描和蛋白含量分析，内参为β-actin。
Tcaim siRNA对BRL-3A的细胞增殖相关基因表达的影响：用qRT-PCR和Westernblot检测干涉Tcaim siRNA后细胞增殖、凋亡相关基因的表达变化。结果表明，干涉TcaimsiRNA后大鼠BRL-3A细胞中细胞增殖相关基因JUN、BCL2和MYC表达下调(图4)。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
序列表
<110> 河南师范大学
<120> 一种调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA及其应用
<130> 2019
<141> 2019-03-05
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1789
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
acctagtcgg cgggaagaac ctgcttgtgt ctcccgaagc tcccctcgga aacccgcaga 60
tagcggggca gttgatggat gcttggaagc tggcgtgctt tttcggaaat gttttgccac 120
ctgaggcctt ggaggaggtt ctgcctgagg aaggtcctcc ctccttggct tcactactct 180
cgagctttat caggggcaga agccatcaat gccttgaggc ctttctactt tgcagttcat 240
cctgatttct ttggacagca ccccagggaa agggaagtca atgaaaattc tcttaagaga 300
ttaagtgtct atttagaaaa tctccagaaa ccaggcttca agtctctgaa accaactcag 360
cttacatttt atataagaga aaaaacagcg cagaattcct ctgaaggaca ggagcctgtc 420
agtactaccg gattccgagc agtcagattt actttgcaca gcagcgatct gctaagcaca 480
gtattatata ttctcaactc ctgcagtttg cctgttgaac acgtccaaag cttgaacact 540
aatgtgcatt cccagcctct caaggaagct acagggatgc ctgacagacc catcaaatgg 600
cataggtcct attattcctt tactgggttc aaggaccctg acgaagacct tgaacatgtc 660
tcaagagtgg aaacaaccct cacgtcctgg ttaggtagca atggcaaagg tgctgttaaa 720
aagctgaaga acagtctgcc acttaggaag gagctggatc gtctcaagaa cgagctatct 780
gagcttctac aactgtcaga catcaggtgg cagagaggct ggggagtcgc ccatcgctgc 840
agccagctac atagtcttag ccgcctagca cagcagaatc tggagccgct tcagaatgca 900
aaagggtgca ccattgtatt cacagaccgc tctggtatga gtgcactggg ccacgtgatg 960
ctggggacca tggatgtcca ccatcactgg acacggcttt ttgaaagctt gccaaactat 1020
tttgaccttc agaggagaat gtcagcctta gaagaccaaa taagccatct cctaggggga 1080
atccaggtgg tttatatcga agagctgcag cctgcactca cgctggacga gtattactcg 1140
ctccttgaca ccttctacaa ccagctgcag cggagcaggg cacctccccg ccctcagagt 1200
ctgagtggtt tgcagatgat cctcagcagg tatgcaccaa gcttgcatga acttgggcat 1260
tttaatatcc cagccctctc ggatccagca agcctgcagt catttatgag aaccaaagcc 1320
cagcaggcaa gagaaaatat gagaagaaga gagaagttaa aagttattga aaatgaattg 1380
atacaggctt caacaaggaa attttctctg gagaagttat ataaagaacc cagcatttct 1440
agtagacaga tggtagattg ctgtaagaga cttctagaac agtcgctgcc ttatctgcat 1500
gggatgcacc tgtgtgtttc acatttctat tctgttatgc aagatggaga cctgtgcatc 1560
ccatggaact ggaagaaagg agaagccatg aagtaacaca gatctgtttt attttctgaa 1620
gaaatgaaaa actgttgaat ttatttaaat tcagtttgat ataacgttag tatttacatg 1680
ttagaacaaa gtgtctaact gctgctataa aaaagtgggt tttcttttta gtgatcttat 1740
gctaagaaac ttgcttttaa aaggttttat ccgtatgatg ctgatggca 1789
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
aaaccaactc agcttacat 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
ttgaacacgt ccaaagctt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
acatagtctt agccgccta 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
aaaccaacuc agcuuacau 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
uuugguugag ucgaaugua 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
uugaacacgu ccaaagcuu 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
aacuugugca gguuucgaa 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
cauagucuua gccgccua 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
uguaucagaa ucggcggau 19
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
tccctccttg gcttcactac tc 22
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
cattgacttc cctttccctg g 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
gcgtcaacag ggagatgtca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
ttccacaaag gcatcccagc 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
acccaacatc agcggtcg 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
cgtgactgtc gggttttcca 20
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
ggctgttcat ctgtttgtct tcat 24
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
cccttttctt tacggtctcg gt 22
Claims (5)
1.一种调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA，其特征在于该siRNA的靶基因序列如序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA，其特征在于该siRNA为以下双链RNA分子中的任意一种：
正义链：5’-AAACCAACUCAGCUUACAUdTdT-3’，
反义链：3’-dTdTUUUGGUUGAGUCGAAUGUA-5’；
正义链：5’-UUGAACACGUCCAAAGCUUdTdT-3’，
反义链：3’-dTdTAACUUGUGCAGGUUUCGAA-5’；
正义链：5’-ACAUAGUCUUAGCCGCCUAdTdT-3’，
反义链：3’-dTdTUGUAUCAGAAUCGGCGGAU-5’。
3.权利要求1或2所述的调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA在制备预防或治疗肝病药物中的应用，其特征在于具体过程为：应用RNAi技术特异性地向哺乳动物和大鼠肝细胞BRL-3A中导入权利要求1或2所述的调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA来降低靶基因的表达，进而引起靶蛋白的表达下降，达到高效特异性的基因治疗作用。
4.权利要求1或2所述的调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA在制备预防或治疗肝病药物中的应用，其特征在于：通过将权利要求1或2所述的调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA导入肝细胞BRL-3A中有效抑制肝细胞BRL-3A的增殖并降低肝细胞BRL-3A的细胞活力。
5.权利要求1或2所述的调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA在制备预防或治疗肝病药物中的应用，其特征在于：将权利要求1或2所述的调节肝细胞增殖的新基因Tcaim的siRNA导入肝细胞BRL-3A中促使肝细胞BRL-3A中细胞增殖相关基因JUY、BCL2和MYC表达下调，进而有效抑制肝细胞BRL-3A的增殖。
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| Title |
|---|
| J. SCHUMANN ET AL.: "The Mitochondrial Protein TCAIM Regulates Activation of T cells and Thereby Promotes Tolerance Induction of Allogeneic Transplants", 《AMERICAN JOURNAL OF TRANSPLANTATION》 * |
| JIAHUI WANG ET AL.: "A novel DNAJ protein, TCAIM, drives proteolysis of a-ketoglutarate dehydrogenase and regulates mitochondrial metabolism", 《RESEARCH SQUARE》 * |
| 张春艳等: "新蛋白C7orf42促进大鼠肝细胞BRL-3A增殖", 《解剖学报》 * |
| 高航等: "MiR-382促进大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖", 《解剖学报》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109722438B (zh) | 2022-12-23 |
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