CN109880828B - 干扰Mroh7基因表达的siRNA及其应用、干扰方法与药物 - Google Patents

Abstract

本申请提出了干扰Mroh7基因表达的siRNA及其应用、干扰方法与药物，属于分子生物技术与基因工程领域。本申请提出干扰Mroh7基因表达的siRNA及其应用、干扰方法与药物，通过在细胞中转染siRNA，可以调控Mroh7基因表达，进一步影响细胞活力，并调控细胞增殖和凋亡相关基因的正常表达；故此将干扰Mroh7基因表达的siRNA应用到制备提高细胞活力、调控细胞分裂增殖和凋亡等过程药物中，具有较高的实际应用的价值。

Description

干扰Mroh7基因表达的siRNA及其应用、干扰方法与药物

技术领域

本申请涉及到分子生物技术和基因工程领域，即涉及干扰Mroh7基因表达的siRNA及其应用、干扰方法与药物。

背景技术

肝脏是人体中各种物质代谢、能量转换及供应的枢纽和主导器官，是机体内多种重要信息调控分子的“集散地”。肝脏也是人体具备极强再生能力的器官，对其修复再生的相关基因的研究在对肝细胞增值、疾病的治疗及药物的研发中都具有十分重要的意义。利用RNAi技术向哺乳动物细胞中特异性的导入siRNA片段,可以降低靶基因的正常表达，进而降低靶蛋白的表达，从而达到高效特异性的基因治疗效果。

Mroh7基因全长为45290bp，含25个外显子，其外显子分别位于该基因的1-91，185-262，5363-5397，6774-7952，12952-13016，15749-5832，17001-17080，17312-17441，19191-19286，19911-20015，20144-20279，23478-23590，24309-24485，24859-25013，27321-27459，27674-27864，32499-32636，33495-33609，35509-35649，36259-36438，36889-37044，37699-37821，42166-42268，44303-44365，44885-45290bp处，其mRNA全长为4238bp，共编码1123个氨基酸。其保守结构域是pfam05109(Herpes virus major outer envelopeglycoprotein(BLLF1))，该家族由BLLF1病毒晚期糖蛋白组成，也称为gp350/220。它是疱疹病毒的病毒包膜中表达最丰富的糖蛋白，并且是负责刺激体内中和抗体产生的主要抗原。然而，在大鼠体内，Mroh7的功能不明确。

发明内容

本申请的目的在于提出了干扰Mroh7基因表达的siRNA及其应用、干扰方法与药物，本申请提出干扰Mroh7基因表达的siRNA，通过脂质体转染的办法，将影响Mroh7基因表达的siRNA转入细胞内，能干扰Mroh7基因的正常表达，调控细胞活跃度和细胞分裂增殖能力等。

Mroh7基因的保守结构域(Conserved domains)是pfam05109(Herpes virusmajor outer envelope glycoprotein(BLLF1))，该家族由BLLF1病毒晚期糖蛋白组成，也称为gp350/220，是疱疹病毒的病毒包膜中表达最为丰富的一种糖蛋白，并且是负责刺激体内中和抗体产生的主要抗原；因此研究Mroh7基因也有助于研究疱疹病毒和对疱疹病毒引起的疾病的治疗。

第1方面，本申请的实施例提出了干扰Mroh7基因表达的siRNA，干扰Mroh7基因表达的siRNA包括siRNA1、siRNA2和siRNA3至少一种；siRNA1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，siRNA2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，siRNA3的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

在前述实施方式中，siRNA1的靶序列为GTCAATGTGACTTCCAACA；siRNA1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1：5’GUCAAUGUGACUUCCAACA dTdT3’。阴性对照序列为：3’dTdT CAGUUACACUGAAGGUUGU5’。

siRNA2的靶序列为GGTCTCAGCCTGCACTCCA；siRNA2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2：5’GGUCUCAGCCUGCACUCCA dTdT3’。阴性对照序列为：3’dTdTCCAGAGUCGGACGUGAGGU5’。

siRNA3的靶序列为GGATTCCAAGGACGACATA，siRNA3的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3：5’GGAUUCCAAGGACGACAUA dTdT3’。阴性对照序列为：3’dTdTCCUAAGGUUCCUGCUGUAU5’。

在前述实施方式中，siRNA的碱基序列即是在靶序列的3’端加上dTdT碱基，而阴性对照则是用随机序列并在3’端加上dTdT碱基，且随机序列不具有功能。

第2方面，本申请的实施例提出了前述的干扰Mroh7基因表达的siRNA在干扰Mroh7基因表达中的应用。

在前述实施方式中，将前述干扰Mroh7基因正常表达的siRNA通过脂质体转染的方法，转染到细胞内，干扰干扰Mroh7基因正常表达，因此可以将siRNA应用到干扰Mroh7基因正常的表达中，能起到研究Mroh7基因功能；以及研究其在细胞分裂增殖和凋亡中的作用和目的。

第3方面，本申请的实施例提出了前述的干扰Mroh7基因表达的siRNA在制备增强细胞活力的药物中的应用。

在前述实施方式中，由于siRNA通过转染进入细胞内部后，可以干扰Mroh7基因的正常表达；Mroh7基因的正常表达被干扰后，造成细胞的活跃度上升，因此可以将前述的干扰Mroh7基因正常表达的siRNA应用于制备增强细胞活力的药物。

第4方面，本申请的实施例提出了前述的干扰Mroh7基因表达的siRNA在制备促进细胞增殖的药物中的应用。

在前述实施方式中，由于siRNA可以干扰Mroh7基因的正常表达，进而促进细胞分裂增殖，故能将前述的干扰Mroh7基因表达的siRNA应用于制备促进细胞分裂增殖的药物中。

第5方面，本申请的实施例提出了前述的干扰Mroh7基因表达的siRNA在制备调控细胞增殖或凋亡相关基因表达的药物中的应用。

在前述实施方式中，由于siRNA会干扰Mroh7基因的正常表达，进而影响细胞的分裂增殖和细胞凋亡的进程；包括影响细胞分裂增殖有关基因和凋亡有关基因的正常表达。

前述在前述第5方面的一些实施例中，干扰Mroh7基因表达的siRNA促进Bcl2和MYC基因的正常表达；抑制Bax基因表达。

第6方面，本申请的实施例提出了一种Mroh7基因表达的干扰方法，其步骤包括：

将前述干扰Mroh7基因表达的siRNA用不含有血清的细胞培养基稀释，得到浓度范围在10-100μg/μL的siRNA溶液；将脂质体用不含血清的培养基稀释，得到浓度范围为20-500μg/mL的脂质体溶液；并室温静置5min。

将siRNA溶液和脂质体溶液混合，得到脂质体-siRNA复合物溶液，室温静置20min；

用培养板培养细胞，当细胞生长到覆盖板底的40％-60％的面积时，吸弃培养基，用无血清的DMEM培养基清洗培养板1-3次；然后加入无血清培养基和脂质体-siRNA复合物溶液混匀；在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下进行转染培养；

转染培养后，将无血清培养基吸弃掉，加入完全培养基进行培养；

最后收集细胞并检测Mroh7基因表达。

在实施例中，将针对Mroh7基因的特异性的siRNA通过脂质体转染法转染进入到细胞中，干扰Mroh7基因的正常表达。在前述第六方面的一些实施例中，在培养板中进行细胞培养时，细胞的含量为3×10⁵-6×10⁵个/mL。

在前述实施方式中，将细胞的密度设定为3×10⁵-6×10⁵个/mL的范围内，能保证脂质体的转化比例和转化效率。

在前述第6方面的一些实施例中，siRNA溶液和脂质体溶液混合室温静置的时间为10-15min。

在前述实施方式中，脂质体作为细胞内外运输物质的载体，通过细胞膜的流动性，进行膜融合的方式将siRNA运输到细胞内；然后通过10-15min的静置，有利于siRNA和靶基因结合。

第7方面，本申请的实施例提出了一种干扰Mroh7基因表达的药物，干扰Mroh7基因表达的药物包括siRNA，siRNA包括siRNA1、siRNA2和siRNA3中的至少一种；siRNA1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，siRNA2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，siRNA3的碱基序列如SEQID NO.3所示。

同现有的技术相比，本申请包括以下的有益效果：本申请提出干扰Mroh7基因表达的siRNA及其应用、干扰方法与药物，将siRNA转染并输送到细胞内，并调控Mroh7基因表达；进而影响细胞的活跃度和细胞分裂增殖能力，并调控细胞分裂增殖和凋亡相关基因的正常表达；故此将干扰Mroh7基因正常表达的siRNA应用到制备提高细胞活力、调控细胞增殖和凋亡等过程药物中，具有较高的实际应用的价值。

附图说明

为更加清楚地说明本申请实施例的技术方案，以下将对实施例中所需要用到的附图作出简单的介绍，可以理解，下述的附图仅仅是示出了本申请的某一些实施例，故此不应当被当作其是对范围作出的限定，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，也能够根据这些附图而得到其他所相关的附图。

图1是本申请实施例提出3种siRNA干扰Mroh7基因表达的结果图；

图2是本申请实验例提出的3种siRNA干扰Mroh7蛋白表达蛋白质印迹图；

图3是本申请实验例提出的3种siRNA干扰Mroh7蛋白表达相对蛋白表达水平结果图；

图4是本申请实验例提出的转染siRNA2的BRL-3A细胞的活力检测图；

图5是本申请实验例提出的转染siRNA2的BRL-3A细胞增殖结果图；

图6是本申请实验例提出的转染siRNA2的BRL-3A细胞相关基因表达量检测结果图；

图7是本申请实验例提出的转染siRNA2的BRL-3A细胞相关蛋白表达量检测结果图；

图8是本申请实验例提出的转染siRNA2的BRL-3A细胞相关蛋白相对表达量检测结果图。

具体实施方式

以下结合实施例对本申请的实施方案作出详细的描述，但是所属领域技术人员应当理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视作对本申请范围的限制。实施例中没注明详细条件的，按照制造商建议的条件或者常规条件进行。所用试剂或者仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买得到的常规产品。

大鼠BRL-3A肝细胞株购自北京医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；DMEM培养基、青霉素和链霉素购自Invitrogen公司；10％的胎牛血清购自杭州天杭生物科技有限公司。

以下结合实施例对本申请的技术特征以及性能作出进一步详细的描述。

实施例一

本实施例提出了干扰Mroh7基因表达的siRNA，即siRNA1、siRNA2和siRNA3至少一种；siRNA1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，siRNA2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，siRNA3的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

根据大鼠的Mroh7mRNA序列搜索AA序列并记录每个AA碱基片段3’端相邻的19个核苷酸，筛选出的GC含量在30％-55％之间的siRNA序列。然后根据siRNA基本设计原则作出进一步筛选，同时将筛选出的siRNA序列在GenBank的基因组数据库中用BLAST检索其同源性，选用与非同源基因有3个以上的碱基错配的序列，以排除非特异性抑制的可能，在满足以上条件的基础上，最终确定出3条Mroh7的siRNA序列。

在本实施例中，siRNA1的靶序列具体地为GTCAATGTGACTTCCAACA；siRNA1的碱基序列具体如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1：5’GUCAAUGUGACUUCCAACA dTdT3’。阴性对照序列具体地为：3’dTdT CAGUUACACUGAAGGUUGU5’。

siRNA2的靶序列具体地为GGTCTCAGCCTGCACTCCA；siRNA2的碱基序列如SEQ IDNO.2所示，SEQ ID NO.2：5’GGUCUCAGCCUGCACUCCA dTdT3’。阴性对照序列具体地为：3’dTdTCCAGAGUCGGACGUGAGGU5’。

siRNA3的靶序列具体地为GGATTCCAAGGACGACATA，siRNA3的碱基序列如SEQ IDNO.3所示，SEQ ID NO.3：5’GGAUUCCAAGGACGACAUA dTdT3’。阴性对照序列具体地为：3’dTdTCCUAAGGUUCCUGCUGUAU5’。

siRNA的序列即是在靶序列的末尾加上dTdT碱基得到。

本实施例还提出一种干扰Mroh7基因表达的药物，干扰Mroh7基因表达的药物包括siRNA，siRNA包括siRNA1、siRNA2和siRNA3中至少一种；siRNA1对应的的碱基序列为SEQ IDNO.1，siRNA2对应的的碱基序列为SEQ ID NO.2，siRNA3的对应的碱基序列为SEQ ID NO.3。

实施例二

本实施例提出一种干扰Mroh7基因表达的方法，步骤如下：

1.1将干扰Mroh7基因正常表达的siRNA采用不含有血清的培养基进行稀释，制备得到浓度为10μg/μL的siRNA溶液。

1.2将脂质体采用不含血清的培养基进行稀释，制备得到浓度为20μg/μL的脂质体溶液；

1.3将siRNA溶液和脂质体溶液进行混合，制备得到脂质体与siRNA复合物溶液，在室温下静置20min；

1.4在6孔的培养板中按照2mL/孔加入的完全培养基，培养BRL-3A细胞，每个培养孔中细胞的浓度为3×10⁵个/mL；

1.5在37℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下进行细胞培养，至培养的细胞覆盖40％-60％的板底面积；

1.6吸弃培养孔中的培养基，用无血清的细胞培养基清洗细胞1-2次；

1.7清洗后加入脂质体与siRNA复合物溶液在37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下进行24h的细胞转染和培养；

1.8转染培养后，吸取无血清细胞培养基，加入完全培养基进行培养；

1.9收集细胞并进行Mroh7基因表达的检测。

实施例三

本实施例提出一种干扰Mroh7基因表达的方法，步骤如下：

1.1将干扰Mroh7基因正常表达的siRNA采用不含有血清的培养基进行稀释，制备得到浓度为100μg/μL的siRNA溶液。

1.2将脂质体采用不含血清的培养基进行稀释，制备得到浓度为500μg/μL的脂质体溶液；

1.3将siRNA溶液与脂质体溶液进行混合，混合的时间为10min，制备得到脂质体与siRNA复合物溶液；

1.4在6孔细胞培养板的培养孔中按照2mL/孔添加量加入的完全培养基，培养BRL-3A细胞，每个培养孔中细胞的浓度为6×10⁵个/mL；

1.5在37℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下进行细胞培养，至培养的细胞覆盖40％-60％的板面积；

1.6吸弃培养孔中的培养基，用无血清的细胞培养基清洗细胞1-2次；

1.7清洗后加入脂质体与siRNA复合物溶液在35℃，5％CO₂饱和湿度条件下，进行6h的细胞转染和培养；

1.8转染培养后，吸取无血清培养基，加入完全培养基进行培养；

1.9收集细胞并进行Mroh7基因表达检测。

实施例四

本实施例提出一种干扰Mroh7基因表达的方法，步骤如下：

1.1将干扰Mroh7基因正常表达的siRNA采用不含有血清的培养基进行稀释，制备得到浓度为70μg/μL的siRNA溶液。

1.2将脂质体采用不含血清的培养基进行稀释，制备得到浓度为200μg/μL的脂质体溶液；

1.3将siRNA溶液与脂质体溶液进行混合，混合的时间为15min，制备得到脂质体-siRNA复合物溶液；

1.4在6孔的培养板的培养孔中按照2mL/孔的添加量加入的完全培养基，培养BRL-3A细胞，每个培养孔中细胞的浓度为5×10⁵个/mL；

1.5在37℃温度条件下，5％CO₂，饱和湿度的条件下进行细胞培养，培养至细胞覆盖50％的板底；

1.6吸弃培养孔中的培养基，用无血清的细胞培养基冲洗细胞1-2次；

1.7冲洗后加入脂质体与siRNA复合物溶液在38℃，5％CO₂，饱和湿度条件下进行14h的细胞转染和培养；

1.8转染培养后，吸取无血清培养基，加入完全培养基进行培养；

1.9收集细胞并进行Mroh7基因表达检测。

实验例

本实验例以该实施例三的转染方法进行转染，并将实施例一中的三种siRNA，即siRNA1(siR1)、siRNA2(siR2)和siRNA3(siR3)，分别地转染大鼠BRL-3A肝细胞。

RRL-3A细胞的培养，培养基为DMEM培养基，于37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下进行细胞培养。

细胞转染：将处于对数生长期的BRL-3A细胞，用浓度为0.25％胰蛋白酶进行消化处理，并按3×10³个cell/孔的浓度将细胞接种于96孔培养板的培养孔中，37℃、5％CO₂继续培养12h，按脂质体转染试剂(LipofectamineTM 2000，Invitrogen,USA)说明书上的操作步骤进行细胞转染。分别将50nM的siRNA和0.2μL转染试剂加入5μLOPTI-MEM培养基，混匀，得到稀释后的siRNA溶液和脂质体溶液，室温静置5min。然后将前述两种溶液混匀，形成脂质体-siRNA转染复合物，室温静置20min，加入到含0.1mL OPTI-MEM培养基的细胞中，37℃5％CO₂、饱和湿度条件下孵育4h，换完全培养基。每个实验组设置3个复孔，实验重复3次。同时设置空白对照和阴性对照。

1、对Mroh7基因和蛋白的表达的影响

转染后48h收集细胞，按照Trizol试剂说明书操作提取总RNA，其中Total RNA的28S:18S的条带为2:1，提取RNA的OD260:280为1.9-2.1的范围。用qRT-PCR检测Mroh7基因的正常表达情况，并通过western blot法检测Mroh7蛋白的表达量。

提取总RNA的实验方法如下：

第一步，弃培养基，加入1mL的Trizol试剂室温消化5min；

第二步，12000rpm离心5min，取上清；

第三步，加入200μL的氯仿，振荡混匀后室温放置15min；

第四步，在4℃，12000rpm离心5min，取上清至另外一个RNase free的EP管中；

第五步，加入500μL的异丙醇加入到EP管中混匀，室温放置5-10min；

第六步，在4℃，12000rpm离心10min，弃上清；

第七步，加入1mL的75％的乙醇，振荡离心管，悬浮沉淀；

第八步，在4℃，12000rpm离心10min，弃上清，室温晾干；

第九步，加入50μLddH₂O溶解，得到总RNA。

进行荧光定量PCR的反应采用ABI PRISM7500 Real-time System(appliedBiosystem)和TransStartqPCR Super Mix进行检测。选用Actin基因作为内参基因。

反应体系(20μL)：

反应条件：

温度	反应时间
		94℃	30s
94℃	5s
		60℃	34s 40个循环

Western blot的实验方法如下：

按照配方配置10％的分离胶和5％的浓缩胶：

10％的分离胶(10mL)

ddH<sub>2</sub>O	4.0mL
		30％Acrylamide	3.3mL
1.5M Tris-HCl(pH8.8)	2.5mL
		10％SDS	0.1mL
10％APS	0.1mL
		TEMED	0.004mL

加入TEMED之后立即将分离胶倒入两块玻璃板之间，并在胶面上覆盖一层ddH₂O，保持胶面水平，静置至胶完全凝固。将ddH₂O倒掉，用滤纸吸干，制备得到浓缩胶。

5％浓缩胶(4mL)

ddH<sub>2</sub>O	2.7mL
		30％Acrylamide	0.67mL
1M Tris-HCl(pH6.8)	0.5mL
		10％SDS	0.04mL
10％APS	0.04mL
		TEMED	0.004mL

加入TEMED后立即将浓缩胶倒入两块玻璃板之间，插上样品梳,静置至胶凝固即可。

电泳检测：

1.1蛋白样品的处理：取适量蛋白样品加入5×Loading buffer(样品:Loadingbuffer＝4:1)，混匀，95℃变性5min，4℃保存备用；

1.2安装好电泳装置，样品上样，80V电泳至溴酚蓝进入分离胶，加大电压至120V，电泳至溴酚蓝刚好跑出分离胶；

1.3PVDF膜剪成与胶等大，甲醇浸泡30sec后转移至转膜缓冲液中平衡20min；同时海绵片，滤纸片，PAGE胶也放入转膜缓冲液中平衡；

1.4黑色夹板，海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵、白色夹板依次排好，确保胶与膜之间没有气泡，夹紧装置，夹板按电极方向放入转移槽中，加入转膜缓冲液；

1.5插好电极，稳流350mA转膜1h(转膜过程中装置会发热，将其置于冰盒中冷却)；

1.6卸下装置；PVDF膜用转膜缓冲液漂洗一下，加入封闭液室温封闭2h；

1.7弃封闭液，加入封闭液10mL+1μL一抗(1:10,000)室温结合1h；

1.8用TBST缓冲液洗膜3次，每次15min；

1.9加入TBST缓冲液+11μL二抗(1:10,000)室温轻轻摇动1h；

1.10用TBST缓冲液洗膜3次，每次15min；

1.11加入显色液晃动显色10min；倒掉显色液加入ddH₂O终止反应，并观察照相记录。

基因表达量的结果请参阅图1，从图1中可以知晓，转染siRNA1(siR1)、siRNA2(siR2)和siRNA3(siR3)后的BRL-3A细胞实验组中的Mroh7基因的表达量明显低于该对照组；统计学分析结果表明，siRNA1和siRNA3与对照组的差异显著(p＜0.05)，而siRNA2(siR2)组与对照组的差异极显著(p＜0.01)；由于siRNA2(siR2)的实验效果较好，故后续试验均用siRNA2(siR2)组进行。

蛋白质的表达量结果请参阅图2和图3，从图中可以知晓，与对照组比较，转染3种siRNA的小鼠BRL-3A肝细胞的实验组的Mroh7蛋白的表达量均出现下降的趋势；而其中转染siRNA2(siR2)的实验组下降最为明显。从图3的相对蛋白表达量的实验数据也能明确看出，转染siRNA1(siR1)、siRNA2(siR2)和siRNA3(siR3)的实验组的Mroh7蛋白均明显下降，而转染siRNA2的实验组的Mroh7蛋白表达下降最多，即转染siR2对Mroh7基因和蛋白的表达影响最大。且蛋白的实验结果与基因表达量的实验结果一致。

2、对细胞活力的影响

本实验中采用MTT法测定细胞的活力，包括以下步骤：

2.1使用siRNA2转染BRL-3A细胞，将BRL-3A细胞接种于96孔板中；

2.2待细胞长到50％时，将siRNA2转染BRL-3A细胞中，在5％CO₂、37℃培养箱中培养48h后；

2.3在含细胞的培养基中加入MTT(Geneview,USA)，使其最终浓度达0.5mg/mL；

2.4于37℃避光继续培养4h，弃去各孔中的培养基；

2.5每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO，Geneview，USA)，振荡10分钟溶解，使得二甲亚砜完全溶解；

2.6将96孔板置于Biotek reader酶标仪检测490nm处各孔的吸光值。每个实验组设置5个复孔，实验重复3次。

注意事项，由于MTT具有致癌性，且见光易分解，操作的时候要注意正好保护措施，且细菌对MTT敏感，相关实验应该进行无菌操作，保证材料细胞来源的一致性。

结果请参阅图4，体外培养的BRL-3A细胞通过siRNA2转染干涉Mroh7后24h、48h、72h；并通过MTT检测细胞活力；发现转染Mroh7 siRNA后，细胞活力与阴性对照(NC)相比，明显高于NC组，用单因素方差分析(one-way ANOVA)的LSD法进行组间差异性的统计分析，结果表明，Mroh7siRNA2组与NC组相比，通过siRNA2干扰Mroh7基因表达24h、48h和72h，实验组的细胞活力明显高于对照组(p＜0.05)，表明Mroh7能够通过抑制BRL-3A细胞活力抑制大鼠BRL-3A细胞存活，即通过siRNA2转染BRL-3A干扰Mroh7基因，能提高细胞的活力。

3、验证转染siRNA2后对BRL-3A细胞增殖的影响

使用siRNA2转染BRL-3A细胞。将BRL-3A细胞接种于96孔板中，待细胞长到50％时，将siRNA2转染BRL-3A细胞中，转染48h后的细胞于取材前2h加入EdU溶液，使其终浓度为50μmol/L。操作步骤按EdU试剂盒说明书进行(锐博，广州)。用4％多聚甲醛固定30min，再在2g/L的甘氨酸中脱色孵育5min，再在0.5％TritonX-100中脱色10min。接着，在1×Apollo中孵育30min，再于0.5％TritonX-100中孵育10-30min，并于1×DAPI标记细胞核10min，在前述的每一个步骤，均用PBS洗3次。最后，用荧光显微镜进行观察并拍照，并用Image-Pro Plus6.0软件对EdU阳性细胞和相应视野下的细胞核分别进行计数。

DAPI为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100％)，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。

DAPI染色的步骤包括：

3.1使用siRNA2转染BRL-3A细胞。将BRL-3A细胞接种于96孔板中，待细胞长到50％时，将siRNA2转染BRL-3A细胞中；

3.2转染48h后，将DAPI染色剂加入到培养基中，使DAPI染色剂的终浓度为100ng/mL；

3.3共同孵育过夜，用PBS缓冲液漂洗细胞至少6次；

3.4用蛋白酶消化后离心收集细胞；

3.5在360-400nm的激发波长的荧光显微镜下观察细胞染色情况。

注意事项：DAPI强烈致癌，操作时需要带上手套，贮存液用70％的酒精配置，浓度为100mg/mL，可用黑纸包住，长期冻存，使用的时候按照1；1000的比例用PBS缓冲液稀释，使得终浓度为100ng/mL即可；DAPI是非常优秀的DNA染料，固定过和没有固定过的细胞均可以使用DAPI染色分析。

结果请参阅图5，通过siRNA2转染BRL-3A中干扰Mroh7基因的正常表达后48h，EdU检测细胞增殖发现转染Mroh7siRNA后，EdU阳性细胞数与阴性对照(NC)相比，明显高于NC组，利用单因素方差分析(one-way ANOVA)的LSD法进行组间差异性的统计学分析，结果表明，Mroh7基因的siRNA2干扰的实验组与NC组相比，EdU阳性细胞数显著升高(p＜0.05)，表明Mroh7能够抑制大鼠BRL-3A细胞增殖，即通过siRNA2转染BRL-3A干扰Mroh7基因，能促进细胞的增殖。

4、对细胞增殖和凋亡相关基因BCL2、MYC和Bax表达年以及相关蛋白表达量的影响

由于细胞增殖和凋亡是两个相互矛盾的存在，因此选择Bax基因作为凋亡基因的表征基因。

将siRNA2转染BRL-3A细胞，在37℃，5％CO₂条件下培养，48h后细胞总RNA抽提按Trizol试剂操作说明书进行(Invitrogen Corporation,Carlsbad,California,USA)，分光光度计检测其纯度(A260/280吸光值)。然后，以2μg RNA为模板，按照AMV反转录试剂盒(Promega，USA)操作说明进行反转录，得到第一链cDNA。取1μL的单链cDNA，按qRT-PCR试剂盒(Promega，USA)说明书加入各项试剂，扩增基因，检测基因的扩增产物荧光信号值，并以β-actin(NM_031144)为内参计算基因的相对表达量(Ratio值)。每个样品做3个复孔，实验重复3次。检测引物如表1所示。

表1 qRT-PCR检测的引物

用Neuhoff方法测定蛋白浓度，将得到的蛋白用裂解液稀释，并取20μg进行SDS-PAGE电泳、转硝酸纤维素膜(PALL公司)。转膜完成后，将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T缓冲液中37℃封闭1h。然后用一抗(武汉博士德，一抗:TBS-T为1:500稀释)进行孵育，用碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗(用TBS-T稀l:1000稀释，北京鼎国)进行孵育；用ECL底物发光法进行(上海生工)显色。最后，用图像分析软件Image QuantTMTL进行灰度扫描和蛋白含量分析。

荧光定量分析结果请参阅图6，从图中可以看出，与对照组相比，细胞增殖相关的基因如BCL2基因和MYC基因的表达量呈明显上升趋势；而与细胞凋亡相关基因如Bax表达量却是呈下降趋势；即通过siRNA2干涉Mroh7基因后，大鼠BRL-3A细胞中细胞增殖相关基因BCL2和MYC表达上调，而细胞凋亡基因Bax则明显下调。

蛋白免疫印迹实验结果请参阅图7和8，BCL2和MYC蛋白表达量明显上升，而蛋白Bax表达量则明显下降；尤其是通过图8中的蛋白相对水平可以看出Bcl2蛋白的上调水平达到极显著的差异，蛋白Bax表达量明显下降水平也达到极显著的差异水平。这与相关基因表达水平变化一致。即通过siRNA2干涉Mroh7基因，可以促进细胞增殖相关基因BCL2和MYC表达上调，抑制凋亡Bax基因表达。

由于通过siRNA2干涉Mroh7基因，能够促进细胞活力，细胞的增殖能力增强；因为细胞增殖增强就必然抑制细胞的凋亡。

故此，可以将siRNA1、siRNA2以及siRNA3，尤其是siRNA2应用到制备增强细胞活力、促进细胞增殖以及促进细胞增殖相关基因表达、抑制细胞凋亡基因表达的药物中。

综上所述，本申请实施例提出的干扰Mroh7基因表达的siRNA及其应用、干扰方法与药物，通过siRNA干扰Mroh7基因表达，可以调控细胞活力、细胞增殖等，具有较好的应用前景。

以上所描述的实施例是本申请示例性的实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没作出创造性劳动前提下获得到的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

Claims (3)

1.一种干扰Mroh7基因表达的siRNA在制备增强细胞活力的药物中的应用，其特征在于，所述siRNA的碱基序列为5’ GGUCUCAGCCUGCACUCCA dTdT3’；

所述细胞为大鼠BRL-3A肝细胞。

2.一种干扰Mroh7基因表达的siRNA在制备促进细胞增殖的药物中的应用，其特征在于，所述siRNA的碱基序列为5’ GGUCUCAGCCUGCACUCCA dTdT3’；

所述细胞为大鼠BRL-3A细胞。

3.一种干扰Mroh7基因表达的siRNA在制备调控细胞增殖或凋亡相关基因表达的药物中的应用，其特征在于，所述siRNA的碱基序列为5’ GGUCUCAGCCUGCACUCCA dTdT3’；

所述细胞为调控大鼠BRL-3A细胞；

所述调控细胞增殖或凋亡相关基因表达为：促进Bcl2基因和MYC基因的正常表达；抑制Bax基因表达。

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