CN111743912A - 一种用于制备促进结肠癌细胞凋亡和抑制结肠癌细胞迁移的基因抑制剂 - Google Patents
一种用于制备促进结肠癌细胞凋亡和抑制结肠癌细胞迁移的基因抑制剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于制备促进结肠癌细胞凋亡和抑制结肠癌细胞迁移的基因抑制剂，属于生物医学技术领域。本发明通过实验证明，LINC02360基因抑制剂能够促进结肠癌细胞的凋亡，并且能够通过调E‑cadherin和N‑cadherin的蛋白表达来抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭。因此，LINC02360的siRNA能够用于制备促进结肠癌细胞凋亡的药物，并且可以用于制备抑制结肠癌细胞迁移和侵袭的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种用于制备促进结肠癌细胞凋亡和抑制结肠癌细胞迁移的基因抑制剂。
背景技术
结肠癌是胃肠道中一种常见恶性肿瘤。近年来，随着我们饮食结构、生活习惯的变化，我国结肠癌的发病率和死亡率保持上升趋势。尽管，目前结肠癌的手术治疗、辅助治疗、靶向治疗等治疗手段取得了较大的进展，但是结肠癌晚期患者的预后依然不是十分乐观。目前，依然缺乏特效的治疗药物。
非编码RNA是近年来发现的一类在生物体内普遍存在并在生命活动中发挥重要功能的RNA分子，与mRNA、tRNA以及rRNA不同，其并不参与编码蛋白质。长链非编码RNA是一类长度大于200个核苷酸的RNA分子，其不具有编码蛋白质的潜力。现有的研究发现，长链非编码RNA在X染色体沉默以及基因组印迹等多种调控过程中发挥着重要作用。研究表明，lncRNA在细胞生理和病理活动中发挥着重要的作用，并且参与肿瘤等疾病的发生和发展过程。因此，进一步探究长链非编码在结肠癌中的分子基础，发现新的与结肠癌相关的长链非编码RNA对于寻找新的治疗靶点开发新的治疗药物具有重要的意义。
目前，长链非编码RNA LINC02360在结肠癌及其他恶性肿瘤中的作用还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效促进结肠癌细胞凋亡和抑制结肠癌细胞迁移的基因抑制剂。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种长链非编码RNALINC02360基因抑制剂在制备促进结肠癌细胞凋亡药物中的用途。
此外，本发明提供了一种长链非编码RNA LINC02360基因抑制剂在制备抑制结肠癌细胞迁移和侵袭药物中的用途。
优选地，所述基因抑制剂为siRNA。
优选地，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.7所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.8所示。
此外，本发明提供了一种基因抑制剂，所述基因抑制剂为长链非编码RNALINC02360的siRNA；所述基因抑制剂用于抑制结肠癌细胞迁移和侵袭；所述基因抑制剂用于促进结肠癌细胞凋亡。
除此之外，本发明提供了一种长链非编码RNA，其特征在于，所述长链非编码RNA为LINC02360；所述LINC02360在结肠癌细胞中高表达；抑制LINC02360能够抑制结肠癌细胞迁移和侵袭；抑制LINC02360能够促进结肠癌细胞凋亡。
本发明的有益效果在于：
本发明首次通过实验证明，长链非编码RNA LINC02360的siRNA能够有效的抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭，并且能够有效的促进结肠癌细胞的凋亡，从而为进一步制备抑制结肠癌细胞迁移以及促进结肠癌细胞凋亡药物提供基础，并且为进一步制备结肠癌治疗药物提供可能。
附图说明
图1 LINC02360在正常结肠上皮细胞系FHC和结肠癌细胞SW480、SW620、HCT116和HT29中的表达差异
图2 LINC02360 siRNA的抑制效果检测
图3 LINC02360 siRNA对结肠癌细胞凋亡的影响
图4 LINC02360 siRNA对结肠癌细胞迁移和细胞侵袭的影响
图5 LINC02360 siRNA对EMT相关蛋白E-cadherin和N-cadherin的影响。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进行进一步的说明，需要说明的是，本发明实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明。
实施例1
检测LINC02360在正常结肠上皮细胞系FHC和结肠癌细胞SW480、SW620、HCT116和HT29中的表达差异。
1.提取RNA
（1）将FHC细胞、SW480、SW620、HCT116和HT29接种于6孔板中，培养48h后，使用PBS清洗细胞2次，之后每孔加入1mL Trizol，反复吹打细胞使Trizol和细胞充分混匀，将混合液转移至EP管中，室温放置5min；
（2）4℃，12000r/min，离心5分钟，将上清转移至新的无RNase的EP管中，每个EP管中加入200μL预冷的氯仿，颠倒混匀后，室温放置10min；
（3）4℃，12000r/min，离心5min，将上清转移至新的无RNA酶EP管中，加入等体积的预冷异丙醇，混匀后，4℃静置10min；
（4）4℃，12000rpm/min，离心20分钟，将上层500μL无色水相转移至新的无RNase EP管中；
（5）加入500μL预冷的异丙醇，充分混匀，冰上放置1小时；
（6）4℃，12000rpm/min，离心20分钟，去除上清，保留RNA沉淀，加入1mL DEPC水配置的乙醇水溶液，洗涤沉淀；
（7）4℃，12000rpm/min，离心5min，去除上清，并且尽可能去除残留在管壁上的液体，室温干燥RNA，至沉淀半透明，加入40μL DEPC水。
2.检测LINC02360基因表达
（1）逆转录反应
反应条件：25℃ 10min；42℃ 30min；85℃ 5min。
（2）荧光定量PCR反应
反应条件：95℃ 5min；95℃ 15s，60℃ 40s，40个循环。
（3）引物序列
LINC02360
Forward Primer 5'-GGTAGAGGTGAAGCTTCGCA- 3'（SEQ ID NO.1）
Reverse Primer 5'-ACACCACGAGACAGTTTAGGA- 3'（SEQ ID NO.2）
GAPDH
Forward Primer 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC- 3'（SEQ ID NO.3）
Reverse Primer 5'-CCACCTGGTGCTCAGTGTAG- 3'（SEQ ID NO.4）
采用2-△△Ct方法处理实验数据，结果如图1所示。
实施例2
检测si-LINC02360基因抑制剂对于LINC02360的抑制效果
si-LINC02360和Control siRNA序列如下所述：
Control siRNA 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU- 3'（SEQ ID NO.5）
5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA- 3'（SEQ ID NO.6）
si-LINC02360 5'- GAAUGAUGUGAAUGGUUAACC- 3'（SEQ ID NO.7）
5'-UUAACCAUUCACAUCAUUCAG- 3'（SEQ ID NO.8）
（1）将SW480细胞接种于细胞板上，参照lip2000说明书进行转染，分为对照组，controlsiRNA组，si-LINC02360组，每组设置3个重复；
（2） 转染6小时去除转染培养基，更换为正常培养基，培养48h后，提取RNA，逆转录，荧光定量PCR，具体实验步骤参照实施例1。
实验结果如图1所示，从图中可以看出，control siRNA组对于SW480细胞中的LINC02360的表达无显著影响，si-LINC02360可以显著降低SW480细胞中LINC02360的表达量，抑制率为82%。
实施例3
流式细胞仪检测LINC02360对于结肠癌细胞凋亡的影响
（1）将SW480细胞接种于6孔细胞板上，参照lip2000说明书进行转染，分为controlsiRNA组，si-LINC02360组，每组设置3个重复；
（2）用胰酶将细胞消化下来，细胞计数后，取1×106个细胞，1000rpm，4℃离心10min，弃去上清；
（3）加入1ml预冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，4℃，1000rpm离心10min，弃去上清，重复3次；
（4）将细胞重悬与200μL Binding Buffer，加入10μL Annexin V-FITC轻轻混匀，避光室温反应15min；
（5）加入300μL Binding Buffer和5μL PI上机进行检测。
实验结果如图3所示，从图中可以看出，抑制LINC02360可以显著增加结肠癌细胞SW480细胞凋亡的数量（Control si-RNA组凋亡率为3.66±0.44，si-LINC02360组凋亡率为12.76±0.38），差异具有统计学意义。
实施例4
（1）将分别转染Control si-RNA和si-LINC02360的SW480细胞消化后制成细胞悬液，计数后调整细胞浓度为2×105/ml；
（2）将100μL细胞悬液接种于Transwell小室的上室，在Transwell小室的下室加入600μL含10%血清的培养基，细胞培养箱培养24h；
（3）用镊子小心的将小室取出，吸干上室的液体，转移到预先加有800μL甲醇的孔中，室温固定30min；
（4）用镊子小心的将小室取出，吸干上室的固定液，转移到预先加有800μL Giemsa染液的孔中，室温染色20min；
（5）用PBS洗涤小室，吸取上室液体，用棉棒小心擦去上室的细胞，倒置小室使底面朝上，放于显微镜下进行拍照。
从图4的细胞迁移可以看出，si-LINC02360组的细胞穿过Transwell小室的数量明显少于Control si-RNA组，LINC02360的siRNA能够显著的抑制结肠癌细胞的迁移。
实施例5
（1）将Matrigel胶在4℃过夜融化，使用200μL 4℃预冷的无血清培养基加入到40μLMatrigel胶中，冰上混匀；
（2）将100μL混匀后的Matrigel胶垂直加入到小室上室底部，37℃温育4小时；
（3）将分别转染Control si-RNA和si-LINC02360的SW480细胞消化后指成细胞悬液，计数后调整细胞浓度为2×105/ml；
（4）将100μL细胞悬液接种于Transwell小室的上室，在Transwell小室的下室加入600μL含10%血清的培养基，细胞培养箱培养24h；
（5）用镊子小心的将小室取出，吸干上室的液体，转移到预先加有800μL甲醇的孔中，室温固定30min；
（6）用镊子小心的将小室取出，吸干上室的固定液，转移到预先加有800μL Giemsa染液的孔中，室温染色20min；
（7）用PBS洗涤小室，吸取上室液体，用棉棒小心擦去上室的细胞，倒置小室使底面朝上，放于显微镜下进行拍照。
从图4细胞侵袭可以看出，相较于Control si-RNA组，si-LINC02360组通过Transwell小室的细胞数目明显减少，说明LINC02360的 si-RNA那个有效的抑制肠癌细胞的侵袭。
实施例6
Western Blot检测LINC02360对于结肠癌细胞EMT相关蛋白的影响
（1）将SW480细胞接种于6孔细胞板上，参照lip2000说明书进行转染，分为controlsiRNA组，si-LINC02360组，每组设置3个重复；
（2）转染48h后，每孔加入100μL RIPA细胞裂解液，充分裂解之后，使用细胞刮刀将细胞刮下，使用移液枪将细胞收集至EP管中，4℃冰上放置30min；
（3）4℃，12000rpm/min离心30分钟，吸取上清，使用BCA法测定蛋白浓度，加入SDS上样缓冲液将蛋白浓度调整为2μg/μL，100℃水浴煮5min，得到蛋白样品；
（4）配置5%上层胶和12%下层胶，配置好后，每孔加入10μL蛋白样品开始电泳；
（5）电泳结束后，250mA转膜1.5小时；
（6）转膜结束后，将NC膜取出，放入TBST配置的5%脱脂奶粉中封闭1h；
（7）按照抗体说明书孵育E-cadherin和N-cadherin，β-actin，4℃孵育过夜；
（8）孵育结束后，使用PBST洗膜3次，每次5分钟，孵育二抗1h；
（9）孵育结束后，使用PBST洗膜3次，每次5分钟，进行显影曝光。
从图5可以看出，LINC02360的siRNA能够抑制N-cadherin的蛋白表达并且可以促进E-cadherin的蛋白表达。说明LINC02360 siRNA能够通过调控N-cadherin和E-cadherin的表达来调控结肠癌细胞的细胞迁移和细胞增殖。
序列表
<110> 济南帕斯维德生物科技有限公司
<120> 一种用于制备促进结肠癌细胞凋亡和抑制结肠癌细胞迁移的基因抑制剂
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtagaggtg aagcttcgca 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaccacgag acagtttagg a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttcaccacca tggagaaggc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccacctggtg ctcagtgtag 20
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaugaugug aaugguuaac c 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
uuaaccauuc acaucauuca g 21
Claims (6)
1.长链非编码RNALINC02360基因抑制剂在制备促进结肠癌细胞凋亡药物中的用途。
2.长链非编码RNA LINC02360基因抑制剂在制备抑制结肠癌细胞迁移和侵袭药物中的用途。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述基因抑制剂为siRNA。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述siRNA的正义链序列如SEQ IDNO.7所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.8所示。
5.一种基因抑制剂，其特征在于，所述基因抑制剂为长链非编码RNA LINC02360的siRNA；所述基因抑制剂用于抑制结肠癌细胞迁移和侵袭；所述基因抑制剂用于促进结肠癌细胞凋亡。
6.一种长链非编码RNA，其特征在于，所述长链非编码RNA为LINC02360；所述LINC02360在结肠癌细胞中高表达；抑制LINC02360能够抑制结肠癌细胞迁移和侵袭；抑制LINC02360能够促进结肠癌细胞凋亡。
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Legal Events
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Effective date of registration: 20210913 Address after: 314000 building 4, Jiake Pioneer Park, 3556 linggongtang Road, Daqiao Town, Nanhu District, Jiaxing City, Zhejiang Province Applicant after: Zhejiang Shengyan Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 250014 room 602, unit 3, No. 5812, Erhuan East Road, Lixia District, Jinan City, Shandong Province Applicant before: Jinan passway Biotechnology Co.,Ltd. |
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| GR01 | Patent grant | ||
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