CN112301030A - 一种抑制Hippo信号通路和胃癌的基因抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种Hippo信号通路基因抑制剂，属于肿瘤细胞生物学技术领域。本发明所提供的Hippo通路基因抑制剂为LINC02083的siRNA，所述siRNA的正义链如SEQ ID NO.6所示，所示siRNA的反义链如SEQ ID NO.7所示。通过本发明所提供的siRNA能够有效的抑制Hippo通路核心分子YAP和下游分子CTGF和CYR61的蛋白表达。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤细胞生物学技术领域，尤其涉及一种抑制Hippo信号通路和胃癌的基因抑制剂。
背景技术
随着外科手术切除和化疗，放疗技术的高速发展，早期胃癌患者的5年生 存率已经有了显著的提高。但是胃癌发病存在隐匿性，许多胃癌患者早期并没 有典型的症状，患者被确诊时，往往已经处于晚期，此时肿瘤细胞已经发生无 法控制的增殖和迁移，这导致胃癌患者的预后较差。因此，深入的研究胃癌发 生，发展的分子机制，对于胃癌患者的早期诊断和治疗，开发新的分子靶向药 物均具有重要的意义。
长链非编码RNA是一类长度大于200个核苷酸的RNA，由于其缺乏可识别的开放阅读框，因此不具有蛋白质编码能力。根据长链非编码RNA与邻近编码基因的关系，其可以分为正义长链非编码RNA，反义长链非编码RNA，双向长链非编码RNA，内含子长链非编码RNA，基因间长链非编码RNA。由于长链非编码RNA具有复杂的二级和三级结构，因此其可以通过与DNA，RNA和蛋白质相互作用来参与众多的生物学过程，包括表观遗传学修饰，转录调控，转录后调控等。
Hippo通路是一种进化上高度保守的信号传导通路，其在调控器官的生长发育，维持细胞增殖和凋亡的平衡以及组织的稳定方面扮演着重要的作用。YAP是Hippo信号通路中的癌基因，其过表达或过度活化会导致细胞发生过度增殖，凋亡减少和细胞迁移。现有的研究表达YAP在胃癌组织中普遍高表达，其表达量与胃癌恶性程度也呈现出正相关，YAP可以作为治疗胃癌的潜在治疗靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种LINC02083基因抑制剂及其在制备治疗胃癌药物或Hippo通路抑制剂中的应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种长链非编码RNA，所述长链非编码RNA为LINC02083，所述LINC02083的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LINC02083在胃癌细胞中高表达，所述LINC02083的siRNA能够抑制Hippo信号通路。
此外，本发明提供了LINC02083基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的应用。
优选地，所述基因抑制剂为siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
此外，本发明提供了LINC02083基因抑制剂在制备抑制胃癌细胞增殖药物中的应用，所述基因抑制剂为siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
此外，本发明提供了LINC02083基因抑制剂在制备抑制胃癌细胞转移药物中的应用，所述基因抑制剂为siRNA，所述siRNA的正义链如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
此外，本发明提供了一种胃癌药物，所述胃癌药物包括有效剂量的LINC02083基因抑制剂，所述基因抑制剂为siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
优选地，所述LINC02083基因抑制剂为所述胃癌药物的唯一有效成分或有效成分之一。
此外，本发明提供了一种用于制备治疗胃癌药物的基因抑制剂，其特征在于，所述基因抑制剂为LINC02083的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
除此之外，本发明提供了LINC02083基因抑制剂在制备Hippo通路抑制剂中的用途。
优选地，所述基因抑制剂为siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的有益效果在于：
本发明首次发现长链非编码RNA LINC02083基因在胃癌细胞中高表达，其次，本发明提供了LINC02083的siRNA，并且证明si-LINC02083能够显著的抑制胃癌细胞的增殖，集落形成，细胞迁移和细胞侵袭。
同时，本发明发现si-LINC02083能够抑制Hippo通路核心分子YAP及其下游分子CTGF和CRY61的蛋白表达。
附图说明
图1 LINC02083在人正常胃上皮细胞GES-1和胃癌细胞MGC-803，BGC-823和MKN-45中的表达差异。
图2 si-LINC02083-1和si-LINC02083-2对于LINC02083的抑制效果。
图3 CCK-8实验的检测结果。
图4 集落形成实验的检测结果。
图5 细胞迁移和细胞侵袭实验的检测结果。
图6 抑制LINC02083对于Hippo通路核心分子YAP和下游分子CTGF和CYR61蛋白表达的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的说明，需要说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对本发明内容进行限定。
实施例1
荧光定量RCR检测LINC02083在人正常胃上皮细胞GES-1和胃癌细胞MGC-803，BGC823和MKN-45中的表达差异
1.细胞总RNA提取
（1）将GES-1细胞，MGC-803细胞，BGC823细胞和MKN-45细胞接种于细胞培养板中，培养过夜后，去除培养基，使用PBS洗涤细胞，加入1ml TRIZOL,使用移液枪吹打细胞并将细胞转移至EP管中，室温放置10min；
（2）将EP管置于离心机中，4℃，12000r/min，离心5min，转移上清至新的无RNA酶EP管中，加入200ulμL氯仿，充分混匀后，室温放置10min；
（3）将EP管置于离心机中，4℃，12000r/min，离心15min，将上层400μL水相转移至新的无RNA酶EP管中，加入等体积的预冷异丙醇，充分混匀后，室温静置5min；
（4）将EP管置于离心机中，4℃，12000r/min，离心10min，去除上清，保留沉淀；
（5）加入1ml 75%乙醇，上下颠倒悬浮沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，去除上清，保留沉淀；
（6）将EP管置于通风橱中，待残留的乙醇完全挥发后，加入适量的RNase-free水溶解RNA沉淀，测定RNA纯度和浓度，用于后续实验。
2.逆转录反应
| 组分 | 添加量 |
| Random Primer | 1μL |
| 2×TS Reaction mix | 10μL |
| TransScript RT/RI enzyme | 1μL |
| Total | 2μg |
| RNase-free水 | Up to 20μL |
反应条件：25℃ 10min；42℃ 30min；85℃ 5min。
3.荧光定量PCR反应
| 组分 | 添加量 |
| 2×SYBR试剂 | 10μL |
| cDNA模板 | 1μL |
| 上游引物 | 0.5μL |
| 下游引物 | 0.5μL |
| ddH2O | 8μL |
反应条件：
95℃ 5min；95℃ 15s，62℃ 40s，40个循环。
引物序列如下：
| 基因名称 | 引物序列 |
| LINC02083 | 5’-AGCTGGTGGAGGACAATCACT -3’（SEQ ID NO.2） |
| 5’-GGCTTCTGTGGGCCTGGAAT -3’（SEQ ID NO.3） | |
| β-actin | 5’-ATCATGAAGTGTGACGTGGACAT -3’（SEQ ID NO.4） |
| 5’-AGGAGCAATGATCTTGATCTTCA -3’（SEQ ID NO.5） |
实验结果使用2-△△Ct方法进行处理，得到的结果如图1所示。
从图中可以看出，LINC02083在胃癌细胞中的表达显著高于人正常胃上皮细胞GES-1，其中，MGC-803的相对表达量为3.080±0.0151，BGC-823的相对表达量为3.707±0.135，MKN-45的相对表达量为2.458±0.058，差异均具有统计学意义。从上述的结果可以看出BGC-823细胞中的LINC02083的相对表达量最高，因此，本发明在后续实验中采用BGC-823细胞进行实验。
实施例2
设计LINC02083 siRNA并验证siRNA效果
（1）设计siRNA序列
具体序列如下：
| 基因名称 | siRNA序列 |
| si-LINC02083-1 | GACUGAUGAUAAGCCUAAAGC（SEQ ID NO.6） |
| UUUAGGCUUAUCAUCAGUCUG（SEQ ID NO.7） | |
| si-LINC02083-2 | GGUGAGUAGCACUACAAGAGA（SEQ ID NO.8） |
| UCUUGUAGUGCUACUCACCAU（SEQ ID NO.9） |
（1）实验分组为对照组（空转lip2000），si-NC组（转染si-NC），si-LINC02083-1组（转染si-LINC02083-1）和si-LINC02083-2组（转染si-LINC02083-2）；
（2）将BGC-823细胞接种于细胞培养板中，按照细胞分组进行转染，转染48h后，提取RNA，进行荧光定量PCR检测，实验步骤参照实施例1；
实验结果如图2所示，从图中可以看出，si-LINC02083-1组的LINC02083的相对表达量为0.190±0.034，si-LINC02083-2组的LINC02083的相对表达量为0.256±0.014，差异均具有统计学意义。由于si-LINC02083-1的干扰效果更好，因此，后续所涉及的si-LINC02083均是指si-LINC02083-1。
实施例3
CCK-8实验检测
（1）将转染si-NC和si-LINC02083的细胞消化，调整细胞密度为1.5×104/ml；
（2）吹打混匀细胞后，将细胞接种于96孔板中，每孔100ul，每组设置3个复孔；
（3）分别于1d，2d，3d和4d时使用CCK-8检测OD值并绘制成增殖曲线。
实验结果如图3所示，从增殖曲线可以看出，si-LINC02083能够显著的抑制胃癌细胞BGC-823细胞的增殖速率（在4d时，si-NC组的OD值为1.414±0.031；si-LINC02083组的OD值为0.964±0.025，差异具有统计学意义）。
实施例4
集落形成实验
（1）使用胰蛋白酶将转染si-NC和si-LINC02083的BGC-823消化并制备成细胞悬液；
（2）将100μl 1×104个BGC-823细胞和1900μl完全培养基混合，加入
入至35mm培养皿中，继续培养14天，每4天更换一次完全培养基；
（3）当培养皿中，出现肉眼可见的细胞克隆时，去除培养基，使用PBS清洗细胞3次，加入4%的多聚甲醛固定15min；
（4）去除多聚甲醛，使用结晶紫染色15min,去除染色液，使用PBS清洗染色液，室温干燥后，进行拍照。
实验结果如图4所示，从图中可以看出，si-LINC02083能够显著的抑制胃癌细胞BGC-823细胞的集落形成。
实施例5
细胞迁移实验
（1）将转染si-NC和si-LINC02083的BGC-823细胞消化，使用PBS漂洗2次后，使用无血清培养基进行细胞重悬，并将细胞悬液浓度调整为2×105/ml；
（2）在Transwell小室的上室中加入100μl细胞悬液，在下室加入600μl含10%FBS的完全培养基， 放入细胞培养箱中培养24小时；
（3）将小室取出去除上室的液体，加入800μl的甲醛，室温固定30min；
（4）去除甲醛，加入结晶紫染色液，室温染色15min后使用清水进行多次浸泡与冲洗；
（5）使用湿棉棒将底部膜上的细胞去除，将小室底面向上逐渐的晾干，在显微镜下进行拍照。
实验结果如图5细胞迁移所示，从图中可以看出，相较于si-NC，转染si-LINC02083的细胞穿过Transwell小室的数量明显减少，说明si-LINC02083能够显著的抑制胃癌细胞BGC-823的细胞迁移能力。
实施例6
细胞侵袭实验
（1）将Matrigel基质胶置于4℃条件下进行解冻，使用预冷的不含血清的培养基将Matrigel基质胶稀释至浓度为1mg/ml；
（2）将100μl稀释好的Matrigel基质胶添加到Transwell小室的上室中，细胞培养箱中放置4h；
（3）将转染si-NC和si-LINC02083的BGC-823细胞消化，使用PBS漂洗2次后，使用无血清培养基进行细胞重悬，并将细胞悬液浓度调整为2×105/ml；
（4）在Transwell小室的上室中加入100μl细胞悬液，在下室加入600μl含10%FBS的完全培养基， 放入细胞培养箱中培养24小时；
（5）将小室取出去除上室的液体，加入800μl的甲醛，室温固定30min；
（6）去除甲醇，加入结晶紫染色液，室温染色15min后使用清水进行多次浸泡与冲洗；
（7）使用湿棉棒将底部膜上的细胞去除，将小室底面向上逐渐的晾干，在显微镜下进行拍照。
实验结果如图5细胞侵袭所示，从图中可以看出，相较于转染si-NC的细胞，转染si-LINC02083的细胞穿过Matrigel胶的数量明显减少，说明si-LINC02083能够显著的抑制胃癌细胞BGC-823的细胞侵袭能力。
实施例7
Western Blot检测si-LINC02083对于Hippo通路核心分子YAP及其下游分子CTGF和CYR61的影响
（1）将BGC-823细胞接种于细胞培养板中，转染si-NC和si-LINC02083,转染48h后，加入150μl蛋白裂解液，用细胞刮将细胞全部刮下；
（2）冰上裂解30min，每隔10min使用涡旋震荡器震荡1min，重复3次；
（3）裂解结束后，将蛋白样品置于离心机中，12000g，4℃，离心15min；
（4）将上清转移至新的离心管中，使用BCA法检测蛋白样品浓度，使用SDS LoadingBuffer调整蛋白样品浓度；
（5）配置SDS-PAGE分离胶和浓缩胶，置于电泳槽中，加入电泳液，添加蛋白样品和蛋白Marker；
（6）浓缩胶恒压80V，分离胶恒压120V，当溴酚蓝到达分离胶底部时停止电泳；
（7）按照海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫的顺序安装转膜夹，恒流300mA，电转1.5h；
（8）电转结束后，将PVDF膜取出置于TBST配置的5%的脱脂奶粉中，在水平摇床上室温封闭1.5h；
（9）按照抗体说明书稀释YAP，CYR61,CTGF和β-actin，根据相应蛋白大小裁剪PVDF膜孵育一抗，4℃孵育过夜；
（10）回收一抗，使用TBST清洗PVDF膜，共3次，每次10min；
（11）按照说明书，孵育二抗，室温孵育1h；
（12）去除二抗，使用TBST清洗PVDF膜，共3次，每次10min，添加发光液进行显影曝光。
实验结果如图6所示，从图中可以看出，si-LINC02083能够显著的抑制Hippo通路核心分子YAP及其下游分子CTGF和CYR61的蛋白表达。
综上所述，本发明发现LINC02083在胃癌细胞中高表达，抑制LINC02083可以抑制胃癌细胞的增殖速率，集落形成，细胞迁移，细胞侵袭，从而可以用于制备治疗胃癌的药物。除此之外，抑制LINC02083能够有效的抑制Hippo通路核心分子YAP及其下游分子CTGF和CYR61的蛋白表达。
序列表
<110> 济南帕斯维德生物科技有限公司
<120> 一种抑制Hippo信号通路和胃癌的基因抑制剂
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 530
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 1
ttgagctttt caggcctcat tttcactata ggaccagtga ataactctgg atggcagata 60
aatcataggg tggagagaaa ggagtagaag gcttcaatga tgataccctg tttccgtcaa 120
tgacagataa ggcccgaaga tccagactga tgataagcct aaagctggtg gaggacaatc 180
actactggat tctaccacag aaggctgcaa acacggctga ggatttttac taaagttaca 240
aaaatcatta tcgttctggg gaatccacct gccatggtga gtagcactac aagagaggcc 300
catgcagcaa agaattgaaa cctctaaaca atagccatgt aagtaagttt ggaaatggat 360
tcttagccta accttaggat aactgtggcc ccaggcaata gctggactgg aatcttatag 420
agattttgca ccaaaaccgc ttagctcatc tgctaccaga ttccaggccc acagaagccc 480
tgagattaaa aaaatgtttg aagatttagg ctacgaagtt ttggataatt 530
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
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gacugaugau aagccuaaag c 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ucuuguagug cuacucacca u 21
Claims (10)
1.一种长链非编码RNA，其特征在于，所述长链非编码RNA为LINC02083，所述LINC02083的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LINC02083在胃癌细胞中高表达，所述LINC02083的siRNA能够抑制Hippo信号通路。
2.LINC02083基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述基因抑制剂为siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
4.LINC02083基因抑制剂在制备抑制胃癌细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述基因抑制剂为siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
5.LINC02083基因抑制剂在制备抑制胃癌细胞转移药物中的应用，其特征在于，所述基因抑制剂为siRNA，所述siRNA的正义链如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反义链序列如SEQID NO.7所示。
6.一种胃癌药物，其特征在于，所述胃癌药物包括有效剂量的LINC02083基因抑制剂，所述基因抑制剂为siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
7.根据权利要求6所述的胃癌药物，其特征在于，所述LINC02083基因抑制剂为所述胃癌药物的唯一有效成分或有效成分之一。
8.一种用于制备治疗胃癌药物的基因抑制剂，其特征在于，所述基因抑制剂为LINC02083的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
9.LINC02083基因抑制剂在制备Hippo通路抑制剂中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述基因抑制剂为siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111743912A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-10-09 | 济南帕斯维德生物科技有限公司 | 一种用于制备促进结肠癌细胞凋亡和抑制结肠癌细胞迁移的基因抑制剂 |
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2020
- 2020-11-05 CN CN202011220586.4A patent/CN112301030B/zh active Active
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|---|---|---|---|---|
| CN111743912A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-10-09 | 济南帕斯维德生物科技有限公司 | 一种用于制备促进结肠癌细胞凋亡和抑制结肠癌细胞迁移的基因抑制剂 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
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| CN112301030B (zh) | 2022-05-27 |
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