CN112791187A - miR-142-5p在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用 - Google Patents

miR-142-5p在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用 Download PDF

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CN112791187A CN202110002430.7A CN202110002430A CN112791187A CN 112791187 A CN112791187 A CN 112791187A CN 202110002430 A CN202110002430 A CN 202110002430A CN 112791187 A CN112791187 A CN 112791187A
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Abstract

本发明属于医药技术领域；具体涉及miR‑142‑5p在治疗慢性粒细胞白血病(CML)中的作用。本发明发现miR‑142‑5p在CML细胞中表达下调，恢复miR‑142‑5p的表达可抑制CML细胞增殖，诱导细胞凋亡。同时，本发明通过对过表达miR‑142‑5p的K562细胞进行转录组测序分析，找到靶mRNA。miR‑142‑5p通过抑制PI3K/AKT信号通路调节CML细胞生长。本发明阐明了一种基于miRNA与PIK3CD相互作用的分子机制，因此，miR‑142‑5p可用来辅助治疗CML。

Description

miR-142-5p在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及miR-142-5p在治疗CML中的应用。
背景技术
慢性粒细胞白血病(CML)是一种由造血干细胞恶性转化引起的骨髓增生性 疾病，其特征性改变为9号染色体c-abl原癌基因易位到22号染色体BCR导致 BCR-ABL基因的费城(philadelphia chromosome，Ph)染色体的形成。BCR-ABL 融合基因编码的P210bcr-abl融合蛋白具有持续性激活的酪氨酸激酶活性使下游多 条信号通路持续性磷酸化激活，如Ras、磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)， 信号转导和转录激活剂(STATs)以及控制凋亡信号等，继而影响细胞增殖分化和 凋亡，引发CML和大约30％的急性淋巴细胞白血病(ALL)。酪氨酸激酶抑制 剂(TKIs)是目前治疗CML的一线药物，极大程度缓解了CML病人病情，但是服 用TKI存在不良的药物反应以及存在依赖BCR-ABL激酶(例如，BCR-ABL激酶 结构域的点突变和复合突变、BCR-ABL基因过表达)的耐药性以及不依赖 BCR-ABL激酶(例如，CML干细胞的存在和代偿生存途径等)的耐药性，因此， 寻找新的CML治疗靶点具有重要意义。
miRNA是一类单链，由高等真核生物基因组编码的非编码小RNA。miRNA 通过与mRNA3’-非编码区(3’-UTR)结合，负向调节mRNA稳定性和翻译效率， 对生物的发育，分化，凋亡，增殖和造血功能具有重要的调节作用。miRNA表 达异常较常见于实体瘤和血液系统疾病中，大量研究证实miR-142具有造血特异 性，对造血干/祖细胞谱系的形成和分化至关重要，是造血系统中细胞生命活动 主要调节因素，Theresa等人研究表明，miR-142-5p表达降低影响CML病人对伊 马替尼(IM)治疗的响应。因此，探究miR-142-5p在CML中的作用，为临床治 疗慢性粒细胞白血病提供科学依据。
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以磷酸化激活蛋 白激酶B(PKB/AKT)的活性，进而激活下游多种效应分子表达，对肿瘤的发生 发展与侵袭转移起着重要作用。根据组成结构及作用不同的底物分子，PI3K分 为I型、II型、III型三类，其中I型中的PI3Kδ(PIK3CD)主要调控白细胞中信号 转导，是治疗急性淋巴细胞白血病等其他恶性血液瘤的重要靶点。此外，抑制 PI3K表达可显著降低人骨肉瘤细胞、胃癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，因此抑 制PI3K的表达可作为抗肿瘤治疗的有效策略。
发明内容
发明人比较GEO数据库中CML病人miRNA表达谱，筛选出差异性表达的 miR-142-5p，并通过体外实验研究发现恢复miR-142-5p的表达可以诱导CML细胞 凋亡、抑制其增殖。重要的是，通过对恢复表达miR-142-5p的K562细胞进行转 录组测序，找到miR-142-5p靶mRNA，miR-142-5p通过下调PI3K的表达进而抑制 PI3K/AKT信号通路，抑制K562细胞增殖，基于以上研究成果完成本发明。
为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供了miR-142-5p作为慢性粒细胞白血病治疗靶点的应用。
第二方面，本发明提供了miR-142-5p在制备抑制慢性粒细胞白血病药物中的 应用。
本发明的第三个方面，提供一种提高miR-142-5p表达和/或活性提高的物质 在以下1)-7)至少一种中的应用：
1)抑制CML细胞增殖，或者用于制备抑制CML细胞增殖的产品；
2)促进CML细胞凋亡，或者用于制备促进CML细胞凋亡的产品；
3)抑制CML细胞PIK3CD的表达，或者用于制备抑制CML细胞PIK3CD表达 的产品；
4)抑制CML细胞p-AKT的表达，或者用于制备抑制CML细胞p-AKT的表达的 产品；
5)抑制CML细胞Bcl-2的表达，或者用于制备抑制CML细胞Bcl-2表达的产品；
6)抑制CML细胞Bcl-xL的表达，或者用于制备抑制CML细胞Bcl-xL表达的产 品；
本发明获得的有益效果为：本发明确定miR-142-5p可作为慢性粒细胞白血病 的治疗靶点，通过恢复miR-142-5p的表达对K562细胞增殖及细胞克隆产生了显 著抑制。进一步通过对恢复miR-142-5p表达的K562细胞进行转录组测序，找到 其作用靶点。miR-142-5p通过抑制PI3K的表达，进而抑制PI3K-AKT-Bcl-2信号 通路，抑制K562细胞增殖，诱导细胞凋亡。
上述技术方案阐明基于miR-142-5p与PI3K相互作用的分子机制，为慢性粒细 胞白血病的治疗提供了新的科学依据。
附图说明
图1为miR-142-5p在CML中差异表达情况相关图。图A为heat-map分析 两例正常受试者和两例CML患者样本miRNA表达谱。图B为比较HS-5与K562 细胞中miR-142-5p的表达水平结果(***P<0.001)。
图2为miR-142-5p高表达可以抑制K562细胞增殖、诱导细胞凋亡、相关 图。图A为CCK-8测定miR-SN/miR-142-5p mimic转染K562细胞1、3、5、7 天细胞存活率的结果(*P<0.05)。图B为流式细胞术检测miR-SN/miR-142-5p mimic转染K562细胞7天后细胞凋亡结果及计算细胞凋亡率(**P<0.01)。图 C为含有miR-SN/miR-142-5p mimic的K562细胞按1500个细胞/皿接种于软琼 脂培养基上，培养14天后细胞克隆形成结果及计算>50个细胞的克隆形成率(比 例尺：50um，***P<0.001)，图D为柱状图为流式分析的统计图，图E为平板克隆实验的统计图。
图3为miR-142-5p靶向结合PIK3CD相关图；图A为miR-SN/miR-142-5p 稳转株转录组测序部分结果heat-map图；图B为基于TargetScan和miRwalk数 据库绘制的miR-142-5p靶基因预测韦恩图；图C为基于TargetScan预测 miR-142-5p与PIK3CD结合位点设计的荧光素酶报告基因野生型和突变型 PIK3CD3’UTR序列图；图D为HS-5与K562细胞中PIK3CD mRNA表达水平 结果图(***P<0.001)；图E为K562细胞中PIK3CD与miR-142-5p表达相关性 分析图。图F为293T细胞共转染miR-SN/miR-142-5p和野生型/突变型PIK3CD3’ UTR后检测荧光素酶活性结果图(**P<0.01)；图G为K562细胞转染 miR-SN/miR-142-5p后PIK3CD mRNA表达水平结果图(***P<0.001)；图H 为K562细胞转染miR-SN/miR-142-5p后PIK3CD蛋白表达水平结果图。
图4为Western blot检测转染miR-SN/miR-142-5p表达载体的K562细胞 PI3K-AKT-Bcl-2信号通路蛋白的表达。
图5为pmirGLO双荧光素酶报告基因载体图谱。
具体实施方式
以下具体实例旨在对本发明作进一步的说明，充分的展示本发明的方案和目 的。
应当注意的是，实例中所使用的术语仅是为了清楚描述实施方式，并非对本 发明构成任何限制。例如，若上下文未明确指出，单数形式也意图包括复数形式。 此外，当在本说明书中使用术语“/”和/或“及”时，其指明存在操作、步骤和/ 或它们的组合；技术人员应理解本发明中使用的术语如“miR”和“miRNA”的 变化形式，除特殊说明外，本发明中特定名称miRNA即指成熟的miRNA。
miR-142-5p核苷酸序列：cauaaaguagaaagcacuacu，见SEQ ID NO.1
miR-142-5p mimic：cauaaaguagaaagcacuacu
guauuucaucuuucgugauga，见SEQ ID NO.2
miR-SN mimic:uuuguacuacacaaaaguacug
aaacaugauguguuuucaugac,，见SEQ ID NO.3
实施例1
1.材料与方法
1.1细胞系和细胞培养
HS-5、K562、293T细胞购自江苏凯基生物技术股份有限公司。K562细胞培 养于含10％胎牛血清(美国BI公司)的RPMI-1640培养液(江苏凯基生物技术 股份有限公司)中，293T细胞使用含10％胎牛血清的DMEM培养基(江苏凯基 生物技术股份有限公司)培养，均置于5％CO2，37℃湿化培养箱中。
1.2 RT-qPCR检测miR-142-5p和基因mRNA表达水平
1.2.1细胞样本中总RNA的提取
在无RNA酶环境下操作，严格按照Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)说明 书进行。
(1)收集适量PBS洗涤后的细胞，加入1ml Trizol，充分吹打，冰上孵育
5min。完全溶解核蛋白复合物。
(2)加入氯仿0.2ml/管，剧烈震荡15秒，充分混匀对后续RNA纯化非常重 要，15～30℃下继续孵育2～3分钟。4℃，12000rmp离心10分钟。
(3)离心后液体分为三层(上层无色水样层为RNA，中层白色絮状沉淀层 为DNA和底层红色有机相层)。小心吸取上层透明水相层至另一干净的Rnase free 的EP管中，切勿吸到中间蛋白层以免影响后续收集的RNA纯度。
(4)加入等体积异丙醇，充分混匀，15～30℃下孵育lO分钟。12000rmp， 4℃离心10分钟。离心后管底可见白色胶状沉淀，即为要提取的RNA。
(5)小心弃去上清，加入1ml 75％乙醇，漩涡振荡30s，12000rmp，4℃离 心10分钟，对RNA沉淀进行洗涤。
(6)上清尽量用枪头吸取干净(注意不要吸到RNA沉淀)，管内沉淀在超 净台中鼓风静置干燥3-5min。加入适量的DEPC水溶解RNA沉淀，枪头吹打混匀， 分装，-20℃短期保存。
(7)打开Nanodrop300检测仪，ddH2O清洗仪器的检测孔，吸取1-2ul提取的 RNA样品置于仪器的检测孔，检测相应RNA浓度(OD260/OD280在1.8-2.0之间)。
1.2.2 mRNA qRT-PCR
本课题利用SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒(南京诺唯赞生物科技有 限公司)检测各组细胞目的基因mRNA表达水平。按表1所示的体系于42℃中反 应2min去除基因组DNA，随后按逆转录体系加入5×qRT Super Mix按表2所示程 序进行RT-PCR反应。最后，以逆转录产物为模板按表3所示反应体系在表4所示 的程序进行qPCR反应，GAPDH用作内源性对照，使用2-△△CT法计算得出各基 因相对表达量。
表1基因组DNA去除反应体系
Figure BDA0002882059160000041
表2 RT-PCR反应程序
Figure BDA0002882059160000042
表3 qPCR反应体系
Figure BDA0002882059160000051
表4 mRNA qPCR反应程序
Figure BDA0002882059160000052
1.2.3 miRNA qRT-PCR
本课题利用染料法hairpin-it miRNAqRT-PCR定量试剂盒(上海吉玛制药技 术有限公司)采用颈环法按表5逆转录体系按25℃，30min，42℃，30min，85℃， 5min，4℃保存的程序进行逆转录得到cDNA，随后按表6体系和表7程序进行qPCR， 使用2-△△CT法计算得出miR-142-5p表达水平，qRT-PCR引物序列表见表8。
表5 miRNA RT-PCR反应体系
Figure BDA0002882059160000053
表6 miRNA qPCR反应体系
Figure BDA0002882059160000054
表7 miRNA qPCR反应程序
Figure BDA0002882059160000055
Figure BDA0002882059160000061
表8 qPCR引物序列
Figure BDA0002882059160000062
1.3细胞转染
取对数生长期的293T细胞(1.0×106个/孔)接种于6孔板，培养24h，待细胞 生长至汇合度约为60％-70％时进行转染，按Lipofectamine 2000说明书，取5μL lipo2000溶于250μL opti-MEM培养基中并加入2ug构建有靶基因野生型/突变型 3’UTR的双荧光素酶报告基因质粒(美国普洛麦格公司)，室温孵育5min。将5ul miR-SN(miR-SN是与miRNA 142-5pmimic同长随机序列但没有活性，作为阴性对 照)或5ul miRNA 142-5p mimic广州锐博生物科技有限公司)溶于250ul opti-MEM 培养基中，混匀静置。再分别将lipo2000和miR-SN或miRNA 142-5p1:1混匀，室温静 置20min。期间将6孔板中的培养液换为1.5mlopti-MEM培养基，将上述混合物分别 加入对应孔中，培养6h，6h后将培养液换为含有10％FBS的DMEM培养液。
96孔板中铺设2×104个K562细胞，分别加入8ul miR-SN(阴性对照)/8ul miR-142-5p病毒原液(上海吉玛制药技术有限公司)与0.8ulpolybrene(1ug/ul)， 吹打混匀。转染24小时后扩大培养，待扩大培养至6孔板体积时加入适量嘌呤霉 素(4ug/ml)持续筛选1周，得到miR-142-5p稳定表达的细胞株。
1.4细胞增殖检测
CCK-8试剂盒(Dojindo)检测细胞增殖，收集转染miR-SN\miR-142-5p mimic K562对数生长期细胞，稀释成合适浓度的细胞悬液，将细胞悬液按每孔5000个 细胞/100ul加入96孔细胞培养板中，每实验组做5个平行副孔，以只加培养基的 孔作空白对照，每孔加入10ul CCK-8检测试剂，避光37℃反应3～4h，酶标仪读 取450nm处的吸光度值，空白孔调零，计算细胞增殖。
1.5细胞凋亡检测
收集转染miR-SN、miR-142-5p mimic的K562细胞，预冷的PBS洗涤细胞 2次，调整细胞浓度为1×106个/mL。按照细胞凋亡试剂盒(上海翊圣生物科技 有限公司)说明书检测细胞凋亡比率。
1.6双荧光素酶报告基因实验
基于TargetScan、miRwalk等生物信息学数据库分析结果，设计与miR-142-5p 互补配对的PIK3CD野生型和突变型pmirGLO双荧光素酶质粒 (WT-PIK3CD-3’UTR、MUT-PIK3CD-3’UTR)，将293T细胞于转染前一天接种 到6孔板中，WT-PIK3CD-3’UTR/MUT-PIK3CD-3’UTR分别与 miRNA-NC/miR-142-5p mimic共转染至293T细胞中，37℃培养箱继续培养 48h，收集并裂解细胞，荧光素酶报告基因检测试剂盒(南京碧云天生物技术公 司)检测萤火虫荧光素酶活性，使用海肾荧光素酶活性将萤火虫荧光素酶活性归 一化。
1.7 Western blot
收集各组细胞，使用预冷的PBS洗涤细胞，使用含蛋白酶抑制的裂解液裂 解细胞冰上裂解细胞10min，4℃，12000rpm，10min提取总蛋白，BCA试剂盒 (上海瑞捷生物科技有限公司)测定总蛋白浓度。调整蛋白样品浓度，将不同处 理的组别的蛋白标齐至相同浓度，加入5xloding buffer,100℃金属浴5min使蛋白 变性，制备的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，条带湿转到PVDF膜，5％的 脱脂牛奶室温下封闭2h，TBST缓冲液洗脱3次，10min/次，特异性一抗稀释 液4℃孵育过夜，相同种属二抗稀释液室温孵育2h，TBST缓冲液洗脱3次后Tanon2500凝胶成像仪分析凝胶。
1.8软琼脂集落形成实验(CFC)
制备1.2％和0.7％低浓度琼脂糖溶液，高温灭菌，置于42℃水浴中备用，1.2％ 琼脂糖溶液中加入等体积含20％FBS的2×1640细胞培养液混合，迅速倒入6cm 细胞培养皿(3ml/皿)中，室温凝固30min，培养基稀释细胞制成7500个细胞/ml 的单细胞悬液(1500个细胞/孔)。0.7％琼脂糖溶液按1：1体积加入含20％FBS的 2×1640细胞培养液混合，加入0.2ml细胞悬液混合均匀后铺于底层1.2％琼脂 上(2ml/皿)，每组重复铺设3个细胞培养皿，待低浓度琼脂糖凝固后，置37℃ 培养箱培养约14天后显微镜下观察，计数大于50个细胞的集落数，计算细胞克 隆形成率。
1.9小RNA文库的构建和测序
使用Trizol试剂提取总RNA。NanoDrop ND-1000分析RNA纯度 (1.8<OD260/280<2.0)和浓度。委托联川生物公司建库并在Illumina Novaseq 6000 上进行双端测序。
1.10统计学方法
每组数据重复三次，采用SPSS22统计软件进行数据分析，所有实验数据均 呈正态分布，结果用均数±标准差(x±s)表示，采用t检验(Student”s test)单因素 方差分析(one-way ANOVA)对样本实验结果进行统计分析。以P<0.05为差异有统 计学意义。其中*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
2.研究结果
2.1 miR-142-5p在CML细胞中表达下调
首先，根据GEO数据库GSE28825中CML患者miRNA微阵列数据进行 Heat-map分析(图1A)，结果显示相较于健康受试者组相比，CML患者组 miR-142-5p表达水平降低。进一步，通过RT-qPCR检测miR-142-5p在K562细 胞系中的表达。结果显示与正常对照组HS-5细胞相比，K562细胞中miR-142-5p 表达水平降低(图1B)。
2.2 miR-142-5p抑制K562细胞增殖、诱导细胞凋亡、降低细胞集落形成能 力
基于miR-142-5p在CML中表达降低，我们推测miR-142-5p在CML中作 为肿瘤抑制因子发挥作用，为了验证miR-142-5p对CML细胞生物学功能的影响， 向K562细胞系中转染miR-SN/miR-142-5p，转染细胞1、3、5、7天后CCK8 检测细胞增殖情况。结果显示，与转染miR-SN组相比转染miR-142-5p后，K562 细胞生长受到抑制(图2A)。流式细胞仪检测转染miR-SN、miR-142-5p mimic 四天后K562细胞凋亡情况，结果显示转染miR-142-5p mimic组细胞凋亡比率增 加，表明miR-142-5p可增加细胞凋亡(图2B)。同时，将含有miR-SN、miR-142-5p 的K562细胞CFC检测，结果显示，miR-142-5p组计数大于50个细胞的集落比 例低于对照组(图2C)。这些结果证明miR-142-5p可以抑制K562细胞增殖、诱 导细胞凋亡、降低细胞集落形成能力。
2.3 miR-142-5p靶向PIK3CD
为鉴别miR-142-5p的直接作用靶点，我们利用慢病毒构建了miR-SN、 miR-142-5p稳转株，并进行转录组测序。综合miR-142-5p转染组表达量下调显 著基因并使用targetscan、miRwalk在线数据库预测miR-142-5p潜在靶点(图3A)。 根据数据库评估及转录组基因富集结果，我们重点关注与细胞周期调节相关的 PIK3CD，现有研究证明PIK3CD是治疗血液系统恶性肿瘤的重要靶点，PI3K抑 制剂如LY294002、CAL-101等可抑制急性白血病细胞增殖。PIK3CD与 miR-142-5p结合位点如图3B。RT-qPCR检测K562与HS-5细胞系中PIK3CD的 表达情况，结果显示K562细胞中PIK3CD表达水平明显高于HS-5细胞，相关 性分析表明K562细胞中miR-142-5p与PIK3CD表达呈负相关(图3C)。双荧光 素酶报告基因检测结果显示，miR-142-5p显著抑制了含WT-PIK3CD-3’UTR的报 告基因质粒的酶活，突变其3'-UTR位点后，荧光素酶活性未见有显著变化(图 3D)。Western blot和RT-qPCR结果显示，过表达miR-142-5p的K562细胞中 PIK3CD mRNA及蛋白表达水平显著低于对照组(图3E)。
2.4 miR-142-5p通过PI3K-AKT-Bcl-2/Bcl-xL通路调控CML细胞功能
转染miR-142-5p表达载体的K562细胞western blot结果显示，相较于miR-SN 组K562细胞，p-AKT、Bcl-2、Bcl-xL表达水平下降(图4)。表明，miR-142-5p可 以通过PI3K-AKT-Bcl-2/Bcl-xL信号通路抑制上述CML细胞增殖、克隆形成能力。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> miR-142-5p在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> miR-142-5p(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
cauaaaguag aaagcacuac u 21
<210> 2
<211> 42
<212> RNA
<213> miR-142-5p mimic(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
cauaaaguag aaagcacuac uguauuucau cuuucgugau ga 42
<210> 3
<211> 44
<212> RNA
<213> miR-NC mimic(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
uuuguacuac acaaaaguac ugaaacauga uguguuuuca ugac 44

Claims (5)

1.miR-142-5p在制备作为慢性粒细胞白血病治疗靶点的应用。
2.miR-142-5p在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
3.miR-142-5p mimic在制备慢性粒细胞白血病药物中应用，其特征在于所述的miR-142-5p mimic核苷酸序列为：
cauaaaguagaaagcacuacu， guauuucaucuuucgugauga 。
4.促进miR-142-5p表达和/或活性提高的物质在如下1)-6)至少一种中的应用：
1) 抑制CML细胞增殖，或者制备用于抑制CML细胞增殖的产品；
2) 促进CML细胞凋亡，或者制备用于促进CML细胞凋亡的产品；
3) 抑制CML细胞PI3K的表达，或者制备用于抑制CML细胞PI3K的表达的产品；
4) 抑制CML细胞p-AKT的表达，或者制备用于抑制CML细胞p-AKT的表达的产品；
5) 抑制CML细胞Bcl-2的表达，或者制备用于抑制CML细胞Bcl-2的表达的产品；
6)抑制CML细胞Bcl-xL的表达，或者制备用于抑制CML细胞Bcl-xL的表达的产品。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述促进miR-142-5p表达和/或活性提高的物质包括人工合成miR-142-5p的短发夹RNA、基于RNA水平的microRNA功能性获得技术、miRNA mimics技术上调miR-142-5p表达和/或促进其活性的物质和化合物类促进剂。
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