CN114984031A - miR-181a在制备治疗非依赖于BCR-ABL1的耐药性CML药物中的应用 - Google Patents
miR-181a在制备治疗非依赖于BCR-ABL1的耐药性CML药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了miR‑181a在制备治疗非依赖于BCR‑ABL1的耐药性慢性粒细胞白血病药物中的应用，所述的非依赖于BCR‑ABL1的耐药性慢性粒细胞白血病是指不存在以下任一种突变的伊马替尼耐药性细胞株：T315I、E255K、E255V、G250E、Q252H、Y253H。miR‑181a mimcs能够有效抑制非依赖于BCR‑ABL1的耐药CML细胞生长，经过miR‑181a治疗后的B‑NDG小鼠体重下降较慢，K562‑IMR/luciferas细胞在体内增殖被抑制，miR‑181a在体内和体外均能克服CML耐药性。
Description
技术领域
本发明属于生物药物领域，具体涉及miR-181a在制备治疗非依赖于BCR-ABL1的耐药性慢性粒细胞白血病(CML)药物中的应用。
背景技术
慢性粒细胞白血病是一种血液系统恶性肿瘤，BCR-ABL1融合蛋白是慢性粒细胞白血病发病机制中的核心角色，导致造血细胞克隆性扩增。
在慢性粒细胞白血病(CML)的治疗中，患者容易出现伊马替尼耐药情况，给临床治疗带来挑战。
依据ABL1突变与否，CML患者的耐药性可分为依赖于BCR-ABL耐药和不依赖于BCR-ABL耐药两种情况。BCR-ABL依赖性耐药的原因可能包括：(1)BCR-ABL1中的ABL1发生了突变，最常见是T315I；(2)BCR-ABL1过表达。
在第二代和第三代酪氨酸激酶抑制剂(TKI)药物上市后，这种依赖于BCR-ABL1的耐药CML的临床治疗已经取得了很好的效果。然而，在不依赖于BCR-ABL1的耐药CML治疗中，由于发病原因复杂、多样，临床治疗没有行之有效统一的治疗方案，因而这种耐药症状的临床挑战性更大。
发明内容
本发明的目的在于提供miR-181a在制备治疗非依赖于BCR-ABL1的耐药性慢性粒细胞白血病(CML)药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
miR-181a mimics在制备治疗非依赖于BCR-ABL1的耐药性慢性粒细胞白血病(CML)药物中的应用；
所述的非依赖于BCR-ABL1的耐药性慢性粒细胞白血病是指不存在以下任一种突变的伊马替尼耐药性细胞株：T315I、E255K、E255V、G250E、Q252H、Y253H；
所述的伊马替尼耐药性细胞株是指K562-IMR和KCL22-IMR；
所述miR-181a mimics的序列为：5’-aacauucaacgcugucggugagu-3’；
所述的药物还含有其他活性成分和辅料(载体)；
所述的辅料(载体)优选缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等；
所述药物的剂型为气雾剂、片剂、胶囊剂、滴丸、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质剂、透皮剂、口含剂、栓剂或冻干粉针剂等。
本申请发现，转染miR-181a mimics抑制慢性粒细胞白血病耐药细胞增殖和软琼脂克隆形成能力，还有在移植人源K562-IMR/luciferase的B-NDG小鼠模型发现miR-181a可以抑制体内外CML耐药。
miRNAs被认为是肿瘤预后的潜在生物标志物，miR-181a在血液系统恶性肿瘤的预后和预测方面是非常有前景的。白血病干细胞被认为是出现伊马替尼耐药性和慢性粒细胞白血病复发的主要原因之一。
CML耐药细胞经过miR-181a处理，c-kit阳性细胞的比例有所降低。CD34是白血病干细胞常用标志物。CML耐药细胞经过miR-181a处理，CD34阳性细胞的比例有所降低。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
miR-181a mimcs能够有效抑制非依赖于BCR-ABL1的耐药CML细胞生长，经过miR-181a治疗后的B-NDG小鼠体重下降较慢，K562-IMR/luciferas细胞在体内增殖被抑制，miR-181a在体内和体外均能克服CML耐药性。
附图说明
图1是CML耐药株和敏感株的耐药性检测。
图2是K562-IMR和KCL22-IMR的SNP测序结果；其中，A：K562-IMR；B：KCL22-IMR。
图3是CCK-8法检测miR-181a对K562-IMR和KCL22-IMR细胞抑制作用；其中，A：K562-IMR；B：KCL22-IMR。
图4是CCK-8的方法检测在72h时miR-181a mimics对人CML骨髓标本细胞的影响。
图5是miR-181a处理后CML耐药细胞克隆数；其中，A：克隆形成；B：K562-IMR的克隆形成统计；C：KCL22-IMR的克隆形成统计。
图6是K562-IMR/luciferas细胞稳定表达荧光素酶其中，A：发光强度与细胞数量的对应关系；B：成像亮度与细胞数量对应关系。
图7是人源K562-IMR/luciferas细胞移植B-DNG小鼠构建非依赖性耐药CML小鼠模型；其中，A：小鼠表现为弓背；B：B-NDG小鼠体重变化；C：B-NDG小鼠的荧光强度显示；D：B-NDG小鼠的生存时长比较。
图8是CML敏感株细胞和耐药株细胞中c-kit+细胞的占比。
图9是miR-181a处理后c-kit+细胞占比的变化。
图10是miR-181a处理后c-kit蛋白表达量的变化。
图11是CML敏感株细胞和耐药株细胞中CD34+细胞的占比。
图12是miR-181a处理后CD34+细胞占比的变化。
图13是miR-181a处理后早期凋亡细胞比例的变化；其中，A：K562-IMR；B：KCL22-IMR。
*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，mean±SD。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
miR-181a对不依赖于BCR-ABL1的CML耐药细胞株的抑制作用
1.1 CML耐药株的耐药性检测
K562细胞来源于中国科学院上海细胞库；KCL22细胞由洛杉矶儿童医院的Muschen教授赠送；
通过药物浓度递增方式建立K562-IMR、KCL22-IMR CML耐药细胞株。
配制不同浓度的伊马替尼溶液，通过CCK8检测对敏感株和耐药株细胞作用48h的相对活力。在伊马替尼作用下，敏感株比耐药株对伊马替尼更加敏感。
K562、K562-IMR、KCL22、KCL22-IMR的IC50分别为0.1285μM、3.369μM、0.2005μM、4.026μM。K562-IMR对Imatinib药物的耐药倍数是26.22倍，KCL22-IMR对Imatinib药物的耐药倍数是20.08倍(如图1所示)。
同时对K562-IMR、KCL22-IMR做SNP测序。挑选了在依赖于BCR-ABL耐药中6种较为常见的突变位点，检测了上述两种耐药细胞株中这些突变较为频繁的位点的碱基排序，都没有发现突变情况(如图2所示)。证明了K562-IMR和KCL22-IMR是不依赖于BCR-ABL1的伊马替尼耐药细胞株。
1.2 miR-181a降低K562-IMR和KCL22-IMR细胞活力
通过lipo2000转染检测miR-181a mimics对K562-IMR、KCL22-IMR细胞活力的影响。
使用100nM的miR-181a mimics处理K562-IMR、KCL22-IMR细胞24h、48h和72h。培养到规定的时间后分别利用CCK-8的方法检测K562-IMR、KCL22-IMR细胞的相对活力。根据说明书建议，miR-181a的最佳作用时间为24-96h。实验结果如图3所示，在48h和72h，miR-181amimics对K562-IMR和KCL22-IMR细胞有较强的抑制作用。在48h时K562-IMR与NC相比细胞的相对活力分别降低13.88％和16.13％，KCL22-IMR与NC相比分别降低18.00％和19.17％。
转染的具体操作是：
1)取生长状况良好的CML耐药细胞，细胞计数板进行计数。经过计算后离心管中加入没有血清、没有抗生素的RPMI-1640培养基混匀稀释，以3×105cell/孔的数量接种于6孔板；
2)设置组别BK(空白对照组)、NC(negative control)、miR-181a mimic组，每个组设置3个复孔，转染NC/miRNA mimic浓度每孔为100nM；
NC为随机RNA双链，序列为：
sense:5’-uucuccgaacgugucacgutt-3’
antisense:5’-acgugacacguucggagaatt-3’；
miR-181a mimic的序列为：5’-aacauucaacgcugucggugagu-3’；
PPFIA1-siRNA的序列为：
sense:5’-CCACAAAGCUCUGGAUGAAdTdT-3’
antisense:5’-UUCAUCCAGAGCUUUGUGGdTdT-3’；
3)取一无菌EP管，按5μL/孔的量吸取LipofectamineTM 2000，按250μL/孔加入Opti-MEM稀释，缓慢充分混匀。分别在EP管上按照组别将吸取各组20μM核酸10μL/孔，按250μL/孔加入Opti-MEM稀释，在超净工作台中室温下静置5min；
4)按照稀释LipofectamineTM 2000与稀释核酸体积为1：1的比例吸取，轻柔充分混匀，室温孵育20min；
5)孵育完成后，吸取每孔500μL LipofectamineTM 2000-RNA复合物小心缓慢加入到铺好的细胞中；
6)将6孔板放入温度为37℃、体积分数为5％的细胞培养箱中，静置。放置6h后完成转染。
1.3 miR-181a对人CML骨髓标本细胞活力的影响
如图4所示，miR-181a mimics转染(100nM)人CML骨髓标本细胞(来自广东省第二人民医院)72h，miR-181a mimics组作用于人CML骨髓标本细胞与NC组作比较之后发现，miR-181a mimics组的平均活力为86.42％。与NC组相比，miR-181a mimics可以在一定程度上抑制人CML骨髓标本细胞的增殖。
1.4 miR-181a处理CML耐药细胞后对细胞克隆形成能力的影响
实验设置组别分别：空白对照组(Blank)、100nM NC(negative control)、100nMmiR-181a mimics，每组设置3个复孔。
1)计数后通过无血清无双抗RPMI-1640培养基将细胞稀释，以每孔5000cell/50μL接种于96孔板；
2)按0.25μL/孔的量吸取LipofectamineTM 2000，按25μL/孔加入减血清培养基Opti-MEM稀释，缓慢充分混匀。按照组别将吸取各组20μM核酸0.5μL/孔，按25μL/孔加入Opti-MEM稀释，分别室温孵育5min；
3)按照稀释LipofectamineTM 2000与稀释核酸体积为1：1的比例吸取，轻柔充分混匀，室温孵育20min；吸取每孔50μL LipofectamineTM 2000-RNA复合物缓慢滴加到细胞悬液中；
4)将96孔板放入温度为37℃、体积分数为5％的细胞培养箱中，静置。放置6h后完成转染；
5)取一无菌离心管，倒入25mL 1.2％软琼脂糖胶溶液(保温)后，再加入25mL20％FBS 1640培养基(保温)，充分混匀。在6孔板中每个孔加入1mL混合物(含有0.6％软琼脂糖胶溶液和10％FBS 1640培养基)，降温凝固后即成下层胶；
6)取一无菌离心管，倒入25mL 0.7％软琼脂糖胶溶液(保温)后，再加入25mL20％FBS 1640培养基(保温)，充分混匀。在小核酸转染6h后，收集细胞悬液。每孔细胞与1mL上层胶混合液(含有0.4％软琼脂糖胶溶液和10％FBS 1640培养基)混合，混合后滴加在下层胶上，摇匀。降温凝固后即成含细胞上层胶，将凝胶置于二氧化碳培养箱中培养；
7)当观察到出现克隆后，PBS溶液缓慢流过胶平面3次，吸去PBS溶液。每孔加入500μL 4％多聚甲醛溶液，固定15～30min，PBS清洗胶平面3次；
8)每孔加入1mL0.005％结晶紫染液，静置至克隆团染色；
9)吸去0.005％结晶紫染液，加入PBS重复洗涤，直至染液被洗去；拍照保存，统计每组克隆数量。
结果如图5所示，转染miR-181a mimics能减少K562-IMR细胞的克隆32.24％，减少KCL22-IMR细胞的克隆33.05％；
克隆形成结果显示转染了miR-181a mimics的克隆形成数量明显少于随机对照NC组，克隆大小也小于NC组，明显地抑制了CML耐药细胞克隆形成能力。
1.5 B-NDG小鼠尾静脉注射K562-IMR/luciferase细胞，发病后经miR-181a进行治疗
1.5.1构建K562-IMR/luciferase细胞
通过向K562-IMR细胞稳转荧光素酶报告基因载体(Beijing Biocytogen)，再用嘌呤霉素筛选K562-IMR细胞并维持培养1周即为K562-IMR/luciferase细胞。经完全培养基(RPMI-1640培养基加入10％胎牛血清、1％双抗)对K562-IMR/luciferase细胞进行稀释，以不同的K562-IMR/luciferase细胞数量种植于96孔全白不透光板中，加入200×的荧光素酶底物后孵育30min。孵育完成后经过多功能酶标仪检测，实验结果如图6A所示。
在小动物活体发光成像系统中调至测板模式，以不同的K562-IMR/luciferase细胞数量种植于96孔全白不透光板中，进行检测得到实验结果如图6B所示。实验结果表明，K562-IMR/luciferase细胞数量越多，仪器检测到的荧光强度就越强，表明K562-IMR/luciferase细胞能与荧光素酶底物作用并发出荧光，而且能用于B-NDG小鼠体内后续体内K562-IMR/luciferase细胞作示踪作用。
1.5.2 miR-181a治疗抑制B-NDG小鼠内K562-IMR/luciferas细胞的增殖
4周龄B-NDG(NOD.CB17-Prkdcscid IL2rgtm1/Bcgen)小鼠购自北京百奥塞图公司，B-NDG小鼠以NOD-scid为遗传背景，其中Il2rg基因被敲除，该品种小鼠缺乏成熟的T、B和NK细胞。
购入的小鼠经过两周的隔离检疫后，对每只B-NDG小鼠通过尾静脉注射1×106个K562-IMR/luciferase细胞；注射后当天(第0天)，对每只B-NDG小鼠进行活体成像检测，确认K562-IMR/luciferas细胞经过尾静脉注射进入B-NDG小鼠体内。B-NDG发病后毛发枯燥无光泽，身体消瘦，食欲不振，出现弓背现象(图7A)。
从注射后第10天开始，对小鼠进行分组治疗(每组3只小鼠)，每隔一天分别用药物处理，处理后进行活体成像检测，观察小鼠体内的K562-IMR/luciferase细胞增殖以及转移情况；治疗组别如下：
①IM组：每只B-NDG小鼠给200μL伊马替尼溶液，15mg/kg。
②NC组：每只B-NDG小鼠给200μL 10nmol NC溶液。
③miR-181a mimics：每只B-NDG小鼠给200μL 10nmol miR-181a mimics溶液。
记录B-NDG小鼠死亡时间，称量各组B-NDG小鼠的体重，记录变化，制作不同组中经过药物处理后B-NDG小鼠的存活曲线。
实验结果：与NC组进行比较，经过治疗后的B-NDG小鼠发病治疗后体重下降较慢，代表发病程度的生物发光强度减弱，miR-181a mimics治疗组的小鼠存活时间更长，实验结果如图7所示。
使用miR-181a mimics治疗能够抑制移植人源细胞K562-IMR/luciferase的B-NDG小鼠模型中K562-IMR/luciferase细胞的生长，miR-181a mimics组能够延长B-NDG小鼠存活的时间约4天。
实验结果可以表明通过B-NDG小鼠体内实验证明，通过miR-181a mimics在一定程度上能克服不依赖于BCR-ABL1的CML耐药。
以上结果可以看出，miR-181a mimics能够在一定程度上有效抑制不依赖于BCR-ABL1的CML耐药细胞生长。
实施例2
miR-181a通过抑制白血病干细胞更新和促进细胞凋亡克服不依赖于BCR-ABL1耐药
2.1通过流式细胞仪检测CML敏感株和耐药株中c-kit+的比例
c-kit是造血干细胞生长因子受体，与白血病干细胞相关，通过流式细胞仪检测K562-IMR和KCL22-IMR耐药株和K562和KCL22敏感株中c-kit+的比例。
分别将K562-IMR和KCL22-IMR耐药株和K562和KCL22敏感株与流式抗体c-kit共同孵育，实验结果如图8所示，K562中c-kit+的比例为1.63％、K562-IMR中c-kit+的比例为3.68％(升高2.05％)、KCL22中c-kit+的比例为0.13％、KCL22-IMR中c-kit+的比例为3.69％(升高3.56％)。经过流式细胞仪检测c-kit+的比例可以得知，K562-IMR和KCL22-IMRCML耐药株比K562和KCL22敏感株中c-kit阳性的比例高。
2.2流式细胞仪检测经过miR-181a处理后c-kit+的比例
用miR-181a mimics(100nM)处理K562-IMR细胞和KCL22-IMR细胞(每孔2.5×105个细胞)48h后用流式细胞仪检测c-kit+的比例，实验结果如图9所示。通过检测标志物c-kit+的比例检测miR-181a mimics处理后对c-kit阳性细胞的影响。
在K562-IMR细胞中，NC组的c-kit+比例为6.42％，miR-181a mimics处理后的比例为3.66％。
在KCL22-IMR细胞中，NC组的c-kit+比例为4.70％，miR-181a mimics处理后的比例为3.60％。
miR-181a处理后对c-kit+细胞的比例有所降低。
2.3在Western Blot实验中经过miR-181a mimics处理后c-kit表达
对转染miR-181a mimics的耐药株细胞(实施例1步骤1.2所得)，Western Blot检测K562-IMR细胞和KCL22-IMR细胞中c-kit蛋白的表达水平，如图10所示，转染miR-181amimics能够使c-kit蛋白的表达水平降低。
2.4过流式细胞仪检测CML敏感株和耐药株中白血病干细胞指标CD34+比例
耐药细胞对治疗药物产生耐药性有可能是因为其白血病干细胞(LSCs)，LSC具有自我更新能力。白血病干细胞其干细胞特性能成为复发的根源。同时检测白血病干细胞常见标志物CD34。通过流式细胞仪检测耐药株K562-IMR和KCL22-IMR和敏感株K562和KCL22中CD34+的比例。分别将耐药株K562-IMR和KCL22-IMR和敏感株K562和KCL22与流式抗体CD34共同孵育。
实验结果如图11所示，K562中CD34阳性细胞的比例为0.28％、K562-IMR中CD34阳性细胞的比例为2.01％(升高1.73％)、KCL22中CD34阳性细胞的比例为0.27％、KCL22-IMR中CD34阳性的比例为1.72％(升高1.45％)。经过流式细胞仪检测CD34阳性细胞的比例可以得知，K562-IMR和KCL22-IMR比K562和KCL22中LSC的比例高。
2.5流式细胞仪检测经过miR-181a处理后CD34+的比例
在大多数CML患者中，TKI可以诱导分子缓解，但是CML被阻碍治愈有部分原因是CML干细胞的持续存在。CD34是白血病干细胞(LSC)的表面标记，用miR-181a mimics处理K562-IMR细胞和KCL22-IMR细胞48h后用流式细胞仪检测CD34+的比例，实验结果如图12所示。
通过检测标志物CD34阳性的比例检测miR-181a处理后对LSC的影响。
在K562-IMR细胞中，NC组的CD34+比例为2.94％，miR-181a处理后的比例为1.39％。
在KCL22-IMR细胞中，NC组的CD34阳性比例为4.00％，miR-181a处理后的比例为3.41％。
实验结果表明miR-181a可通过抑制CD34阳性细胞抑制K562-IMR细胞和KCL22-IMR细胞的增殖。
2.6经过流式细胞仪检测经过miR-181a处理后凋亡增加
为了研究miR-181a对细胞的凋亡是否有影响，通过转染miR-181a mimics，流式细胞仪进行检测K562-IMR细胞和KCL22-IMR细胞中早期细胞凋亡的比例，经过实验验证，如图13所示，miR-181a mimics处理后能够升高K562-IMR细胞中早期凋亡细胞比例0.64％，在KCL22-IMR升高0.30％；
转染miR-181a能够使细胞早期凋亡的比例有所增高。以凋亡途径的药物来恢复凋亡途径构成了一种有前途的抗癌治疗方法，可能通过刺激外源性途径诱导细胞凋亡可以克服对治疗药物的抵抗。
以上结果表明，miR-181a处理后，CML耐药株CD34+和c-kit+的比例降低，miR-181a能减少白血病干细胞克服不依赖于BCR-ABL的耐药性。同时，经过miR-181a处理过后早期凋亡的比例降低，miR-181a能诱导细胞凋亡克服不依赖于BCR-ABL的耐药性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.miR-181a mimics在制备治疗非依赖于BCR-ABL1的耐药性慢性粒细胞白血病药物中的应用，其特征在于：
所述的非依赖于BCR-ABL1的耐药性慢性粒细胞白血病是指不存在以下任一种突变的伊马替尼耐药性细胞株：T315I、E255K、E255V、G250E、Q252H、Y253H；
所述miR-181a mimics的序列为：5’-aacauucaacgcugucggugagu-3’。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的伊马替尼耐药性细胞株是指K562-IMR和KCL22-IMR。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物还含有其他活性成分和辅料。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的辅料为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为气雾剂、片剂、胶囊剂、滴丸、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质剂、透皮剂、口含剂、栓剂或冻干粉针剂。
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-
2022
- 2022-07-22 CN CN202210865714.3A patent/CN114984031B/zh active Active
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JIA FEI等: "miR-181a Post-Transcriptionally Downregulates Oncogenic RalA and Contributes to Growth Inhibition and Apoptosis in Chronic Myelogenous Leukemia (CML)", vol. 7, no. 3, pages 32834 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114984031B (zh) | 2023-09-29 |
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