CN109536639B - Eb病毒潜伏膜蛋白在制备鼻咽癌分化诱导治疗诊断试剂中的应用 - Google Patents

Eb病毒潜伏膜蛋白在制备鼻咽癌分化诱导治疗诊断试剂中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109536639B
CN109536639B CN201811400768.2A CN201811400768A CN109536639B CN 109536639 B CN109536639 B CN 109536639B CN 201811400768 A CN201811400768 A CN 201811400768A CN 109536639 B CN109536639 B CN 109536639B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lmp1
nasopharyngeal carcinoma
cebpa
gene
reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811400768.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109536639A (zh
Inventor
王自峰
刘强
严敏
谢佳君
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen University Cancer Center
Original Assignee
Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sun Yat Sen University Cancer Center filed Critical Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority to CN201811400768.2A priority Critical patent/CN109536639B/zh
Publication of CN109536639A publication Critical patent/CN109536639A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109536639B publication Critical patent/CN109536639B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56994—Herpetoviridae, e.g. cytomegalovirus, Epstein-Barr virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • G01N2333/05—Epstein-Barr virus

Abstract

本发明公开了EB病毒潜伏膜蛋白在制备鼻咽癌分化诱导治疗诊断试剂中的应用，本发明发现了定量检测EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的表达量的试剂在制备检测或辅助检测鼻咽癌试剂中的应用。本发明提供了一种新的潜在的针对ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8低表达引起的未分化的鼻咽癌的诊断策略，进一步联合检测LMP1与ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8用于诊断和/或治疗未分化鼻咽癌，为其靶向表观遗传的干预治疗提供潜在的诊断标准和治疗靶标。

Description

EB病毒潜伏膜蛋白在制备鼻咽癌分化诱导治疗诊断试剂中的 应用
技术领域
本发明涉及EB病毒潜伏膜蛋白LMP1的新应用，具体涉及LMP1在制备鼻咽癌分化诱导治疗诊断试剂中的应用。
背景技术
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤，是头颈部最常见的恶性肿瘤，其患病人数占头颈部恶性肿瘤的70％以上，是我国死亡率最高的恶性肿瘤之一。鼻咽癌原发部位隐蔽，早期不容易被发现。鼻咽癌病理分化差，恶性程度高，易呈浸润性生长。早期鼻咽癌最主要的治疗手段是放射治疗，分化型鼻咽癌早期治疗后的五年生存率可达70％以上，生存质量良好，但未分化型鼻咽癌不仅生存质量差，且五年生存率不到10％，给患者及其家人带来极大的痛苦。
鼻咽癌的这一未分化的重要特征提示诱导分化治疗(differentiation therapy)可能是治疗鼻咽癌的一个重要策略。然而，目前为止，关于鼻咽癌分化诱导治疗的精准诊断及治疗分子标记物尚不清楚。
鼻咽癌是典型的EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染相关性肿瘤。几乎所有的鼻咽癌患者都携带EBV。EBV作为诱发鼻咽癌的关键生物学因素的观点已被广泛接受。EBV诱导鼻咽上皮细胞去分化是其诱发鼻咽癌的关键步骤。对EBV转化淋巴细胞及鼻咽上皮细胞的研究显示，EBV潜伏膜蛋白1(latentmembrane protein,LMP1)是EBV诱导鼻咽上皮细胞转化并致瘤的关键蛋白。对LMP1在鼻咽癌中的表达及功能研究显示：LMP1在70％的鼻咽癌组织和几乎所有的EBV感染的侵袭性前鼻咽癌病变组织中显著表达；LMP1阳性的鼻咽癌细胞比LMP1阴性的鼻咽癌细胞更容易发生转移；过表达LMP1能够使永生化的正常鼻咽上皮细胞产生一系列恶性表型(如生长速度显著加快，迁移和侵袭能力显著增强，克隆形成能力显著增强)。对LMP1诱导鼻咽癌发生发展的分子机制研究显示：LMP1是一种不需要配体起作用的CD40模拟分子，其自身通过在细胞膜脂筏上聚集，即可激活下游信号分子，扰乱细胞内正常的信号通路而发挥其致瘤作用；LMP1可以通过JNK-AP-1信号通路激活DNMT1的表达，从而抑制E-Cadherin的表达，增强鼻咽癌的侵袭性；Twist是LMP1诱导鼻咽癌EMT的关键蛋白之一，暗示了上皮间质转化(Epithelial–Mesenchymal Transition,EMT)可能是LMP1诱导鼻咽癌去分化的重要过程；抗凋亡蛋白A20可能是LMP1诱导鼻咽癌去分化的下游蛋白之一。目前为止，转录因子NF-κB、AP-1和STAT被认为是LMP1在细胞核内的效应因子，调节Bcl-2、A20、MMP9等靶基因表达，参与细胞增殖、转化、凋亡和免疫等多种生物学反应过程。
目前，关于鼻咽癌去分化的基因指标及对应的反映鼻咽癌分化的基因指标的研究报道较少，鼻咽癌分化诱导治疗的研究也不成熟。
发明内容
本发明优化了一系列导致鼻咽癌去分化的基因指标及对应的反映鼻咽癌分化的基因指标。在本发明中，我们提出了EB病毒潜伏膜蛋白LMP1驱动的未分化鼻咽癌的基因检测方式，开发了相应的诊断治疗试剂盒奠定了基础。
本发明的目的之一在于提供定量检测EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的表达量的试剂在制备检测或辅助检测鼻咽癌试剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供抑制EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1表达的试剂与促进基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8表达的试剂在制备治疗或辅助治疗鼻咽癌产品中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种检测或辅助检测鼻咽癌的试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一方面，本发明提供了定量检测EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的表达量的试剂在制备检测或辅助检测鼻咽癌试剂中的应用。
优选的，所述鼻咽癌为未分化鼻咽癌。
优选的，定量检测EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的表达量的试剂选自定量检测基因LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的RNA转录水平的试剂、定量检测基因LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的蛋白表达水平的试剂中的至少一种。
优选的，所述定量检测基因LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的RNA转录水平的试剂选自定量检测LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的引物或探针。
优选的，所述定量检测LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的引物为：
定量检测LMP1的引物为：
上游引物F：5’-CGGAAGAGGTTGAAAACAAAGGA-3’(SEQ ID NO:1)
下游引物R：5’-GTACCCAAAAGCAGCGTAGGAAG-3’(SEQ ID NO:2)
定量检测ATOH8的引物为：
上游引物F：5’-TGCCAAGAAGCGCAAGGAG-3’(SEQ ID NO:3)
下游引物R：5’-GTGAGGGCGGAGGGGAGAG-3’(SEQ ID NO:4)
定量检测CHUK的引物为：
上游引物F：5’-ATGAAGAAGTTGAACCATGCCA-3’(SEQ ID NO:5)
下游引物R：5’-CCTCCAGAACAGTATTCCATTGC-3’(SEQ ID NO:6)
定量检测CEBPA的引物为：
上游引物F：5’-AGGAGGATGAAGCCAAGCAGCT-3’(SEQ ID NO:7)
下游引物R：5’-AGTGCGCGATCTGGAACTGCAG-3’(SEQ ID NO:8)
定量检测KRT8的引物为：
上游引物F：5’-TCCTCAGGCAGCTATATGAAGAG-3’(SEQ ID NO:9)
下游引物R：5’-GGTTGGCAATATCCTCGTACTGT-3’(SEQ ID NO:10)。
另一方面，本发明提供了抑制EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1表达的试剂与促进基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8表达的试剂在制备治疗或辅助治疗鼻咽癌产品中的应用。
优选的，所述抑制LMP1表达的试剂选自沉默LMP1表达的siRNA、沉默LMP1表达的shRNA、沉默LMP1表达的反义寡核苷酸链中的至少一种；所述促进基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8表达的试剂为ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的过表达载体。
优选的，所述鼻咽癌为未分化鼻咽癌。
再一方面，本发明提供了一种检测或辅助检测鼻咽癌的试剂盒，所述试剂盒中包含了定量检测EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的表达量的试剂。
优选的，定量检测EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的表达量的试剂选自定量检测基因LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的RNA转录水平的试剂、定量检测基因LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的蛋白表达水平的试剂中的至少一种。
优选的，所述定量检测基因LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的RNA转录水平的试剂选自定量检测LMP1与基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的引物或探针。
优选的，所述鼻咽癌为未分化鼻咽癌。
再一方面，本发明提供了一种治疗或辅助治疗鼻咽癌的试剂盒，所述试剂盒中包含了抑制EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1表达的试剂与促进基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8表达的试剂。
优选的，所述抑制LMP1表达的试剂选自沉默LMP1表达的siRNA、沉默LMP1表达的shRNA、沉默LMP1表达的反义寡核苷酸链中的至少一种；所述促进基因ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8表达的试剂为ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8的过表达载体。
优选的，所述鼻咽癌为未分化鼻咽癌。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种新的潜在的针对ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8低表达引起的未分化的鼻咽癌的诊断策略，进一步联合检测LMP1与ATOH8、CHUK、CEBPA或/和KRT8用于诊断和/或治疗未分化鼻咽癌，为其靶向表观遗传的干预治疗提供潜在的诊断标准和治疗靶标。
附图说明
图1LMP1诱导鼻咽癌细胞去分化。
图2LMP1抑制分化基因ATOH8/CHUK/CEBPA/KRT8转录。
图3.LMP1在动物体内促进鼻咽癌生长，而分化基因ATOH8/CHUK/CEBPA抑制鼻咽癌生长。
具体实施方式
中英文对照：
胎牛血清(FBS)，青霉素(Penicillin)，链霉素(Streptomycin)。
主要试剂
胎牛血清购自Invitrogen公司；基础培养基RPMI-1640及DMEM购自Invitrogen公司。
细胞株和培养基
实施例中涉及到三种细胞的培养。所用到的培养基和配方方法见下说明。
1)CNE1细胞(鼻咽癌细胞株)
培养基：RPMI-1640添加10％胎牛血清(FBS)，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素。
37℃，5％CO2培养，2-3天传代一次。
2)HNE2细胞(鼻咽癌细胞株)
培养基：RPMI-1640添加10％胎牛血清(FBS)，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素。
37℃，5％CO2培养，2-3天传代一次。
3)CNE2细胞(鼻咽癌细胞株)
培养基：RPMI-1640添加10％胎牛血清(FBS)，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素。
37℃，5％CO2培养，2-3天传代一次。
4)293FT细胞(人胚肾细胞株)
培养基：DMEM添加10％胎牛血清，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素。
37℃，5％CO2培养，2-3天传代一次。
下面结合具体实验，进一步阐述本发明内容。下列实验中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如，《分子克隆实验指南》(第三版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
小鼠
4-6周龄BALB/c裸鼠，雌雄各半。
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不限于此。
实施例1
一、稳定表达LMP1细胞株的构建
1.LMP1的克隆和表达载体的构建
PCR扩增LMP1基因编码序列(CDS)全长(Gene ID:3783750)，连接入载体pLVX。
2.包装病毒
转染前一天接种3×106个293FT细胞于10cm培养皿。
具体步骤如下：
第一天：转染前2-3小时给细胞换新鲜培养基。为每一个需转染的细胞准备两只聚苯乙烯管，标记A、B，分别配置A、B液。A液：psPAX2 15μg，pMD2.G 5μg，载体质粒20μg，2MCaCl2 98.4μl，加无菌水至800μl；B液：800ul 2×HBS。在震荡溶液B的同时缓缓的将溶液A匀速的滴加到溶液B中，在室温放置30-40分钟。30-40分钟后缓慢的将混合液均匀地滴入培养皿中，轻轻摇晃培养皿使溶液混合均匀，将细胞放入37℃培养箱中。
第二天：转染16h小时后，换液，15ml培养基。
第三天：收集上清保存于4度，换新鲜培养基15ml。
第五天：4℃2000转离心5分钟，收集上清保存于4℃，转移上清至新管，2ml/管分装并冻入-80度保存。
3.感染细胞
转染前一天接种1×105个CNE1或HNE2细胞于6孔板(密度10％左右)。
具体步骤如下：
1)取1000μl病毒液与1000μl培养基混合，并加入2μl 8mg/ml基因转染增强剂聚凝胺(终浓度为8μg/ml)，混匀；
2)加入细胞中，轻轻摇晃孔板混和；
3)培养2-3天。
4.细胞筛选
1)将培养2-3天的细胞消化，以1:10或1:20传代；
2)传代24h后，加入2ug/ml的嘌呤霉素筛选细胞；
3)抗生素筛选1周后即为阳性克隆。
5.Western Blot分析阳性克隆LMP1是否过表达。
检测结果如图1所示，图1-A为在高分化的鼻咽癌细胞系CNE1和HNE2中过表达LMP1，相比于对照组(ctrl)，过表达LMP1组(LMP1)细胞形态向细长梭型发生转变，提示细胞分化状态显著降低。图1-B为在CNE1及HNE2中过表达LMP1后，上皮分子标记物(marker)E-cadherin和CK8蛋白表达显著降低；同时间充质marker vimentin和CK13表达显著升高。这一结果也提示鼻咽癌发生显著去分化。图1-C为将过表达LMP1的CNE1细胞与对照组CNE1细胞接种至裸鼠体内，待肿瘤长出后，取出肿瘤进行免疫组化染色。结果表明，过表达LMP1组，上皮maker CK8就E-cadherin表达显著降低，而间充质marker vimentin显著升高。这一体内成瘤实验同样证明LMP1在裸鼠体内可以诱导鼻咽癌细胞去分化。
二、稳定过表达LMP1的功能分析
对获得的LMP1过表达阳性的细胞克隆及对照细胞进行荧光定量PCR分析，检测分化基因ATOH8/CHUK/CEBPA/KRT8的表达。
LMP1荧光定量PCR检测引物为
上游引物F：5’-CGGAAGAGGTTGAAAACAAAGGA-3’(SEQ ID NO:1)
下游引物R：5’-GTACCCAAAAGCAGCGTAGGAAG-3’(SEQ ID NO:2)
ATOH8荧光定量PCR检测引物为
上游引物F：5’-TGCCAAGAAGCGCAAGGAG-3’(SEQ ID NO:3)
下游引物R：5’-GTGAGGGCGGAGGGGAGAG-3’(SEQ ID NO:4)
CHUK荧光定量PCR检测引物为
上游引物F：5’-ATGAAGAAGTTGAACCATGCCA-3’(SEQ ID NO:5)
下游引物R：5’-CCTCCAGAACAGTATTCCATTGC-3’(SEQ ID NO:6)
CEBPA荧光定量PCR检测引物为
上游引物F：5’-AGGAGGATGAAGCCAAGCAGCT-3’(SEQ ID NO:7)
下游引物R：5’-AGTGCGCGATCTGGAACTGCAG-3’(SEQ ID NO:8)
KRT8荧光定量PCR检测引物为
上游引物F：5’-TCCTCAGGCAGCTATATGAAGAG-3’(SEQ ID NO:9)
下游引物R：5’-GGTTGGCAATATCCTCGTACTGT-3’(SEQ ID NO:10)
参考基因GAPDH荧光定量PCR检测引物为
上游引物F：5’-GAATCTACTGGCGTCTTCACC-3’(SEQ ID NO:11)
下游引物R：5’-GTCATGAGCCCTTCCACGATGC-3’(SEQ ID NO:12)。
检测结果见图2，在高分化鼻咽癌细胞系CNE1(图2-A)及HNE2(图2-B)中过表达LMP1，提取RNA反转录成cDNA，然后用荧光定量PCR检测分化基因ATOH8/CHUK/CEBPA/KRT8的表达，结果表明，相比于未过表达LMP1的对照组(Ctrl)，过表达LMP1之后，这些分化基因表达全部显著下降。显示过表达LMP1后，分化基因表达显著下调。
三、稳定表达LMP1或分化基因细胞株的体内成瘤能力分析
将1×106个稳定表达LMP1的高分化鼻咽癌细胞系CNE1及对照细胞接种至4周龄的左、右测背部。约一个半月后取出肿瘤拍照。
将1×107个稳定过表达分化基因ATOH8、CHUK或CEBPA的中分化鼻咽癌细胞CNE2接种至4周龄的左、右测背部。约一个半月后取出肿瘤拍照。
结果见图3，图3-A为将同样数量(1x106)过表达LMP1的高分化鼻咽癌细胞系CNE1及对照细胞接种至裸鼠皮下，约一个半月后取出肿瘤拍照。结果表明，过表达LMP1组的肿瘤体积显著大于对照组。图3-B为将同样数量(1x107)过表达分化基因ATOH8、CHUK、CEBPA的中分化鼻咽癌细胞CNE2及对照细胞接种至裸鼠皮下，约一个半月后取出肿瘤拍照。结果表明，过表达分化基因ATOH8、CHUK、CEBPA组的肿瘤体积显著小于对照组。上述结果说明高分化的CNE1细胞中稳定过表达LMP1显著促进其体内成瘤能力；而在中分化的CNE2细胞中稳定过表达分化基因ATOH8、CHUK或CEBPA等分化基因则显著抑制其体内成瘤能力。
综上所述，本发明通过Western Blot实验、裸鼠体内成瘤实验和免疫组化实验发现LMP1能够诱导鼻咽癌去分化(图1)。进一步研究表明LMP1抑制分化基因ATOH8/CHUK/CEBPA/KRT8表达(图2)。过表达LMP1可显著增强高分化鼻咽癌细胞的体内成瘤能力，而过表达分化基因ATOH8/CHUK/CEBPA则显著抑制鼻咽癌细胞的体内成瘤能力(图3)。这些研究表明LMP1-ATOH8/CHUK/CEBPA/KRT8通路是LMP1阳性的鼻咽癌去分化的关键通路。通过荧光定量PCR或免疫组化联合检测LMP1和ATOH8/CHUK/CEBPA/KRT8的表达情况，可以有效定义LMP1-ATOH8/CHUK/CEBPA/KRT8引发的去分化鼻咽癌病人，为下一步的分化诱导治疗提供诊断标准。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）
<120> EB病毒潜伏膜蛋白在制备鼻咽癌分化诱导治疗诊断试剂中的应用
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
cggaagaggt tgaaaacaaa gga 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
gtacccaaaa gcagcgtagg aag 23
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
tgccaagaag cgcaaggag 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
gtgagggcgg aggggagag 19
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 5
atgaagaagt tgaaccatgc ca 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 6
cctccagaac agtattccat tgc 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 7
aggaggatga agccaagcag ct 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 8
agtgcgcgat ctggaactgc ag 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 9
tcctcaggca gctatatgaa gag 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 10
ggttggcaat atcctcgtac tgt 23

Claims (10)

1.定量检测EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1与基因CEBPA的表达量的试剂在制备检测或辅助检测鼻咽癌试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述鼻咽癌为未分化鼻咽癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：定量检测EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1与基因CEBPA的表达量的试剂选自定量检测基因LMP1与基因CEBPA的RNA转录水平的试剂、定量检测基因LMP1与基因CEBPA的蛋白表达水平的试剂中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述定量检测基因LMP1与基因CEBPA的RNA转录水平的试剂选自定量检测LMP1与基因CEBPA的引物或探针。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述定量检测LMP1与基因CEBPA的引物为：
定量检测LMP1的引物为：
上游引物F：5’-CGGAAGAGGTTGAAAACAAAGGA-3’（SEQ ID NO:1），
下游引物R：5’-GTACCCAAAAGCAGCGTAGGAAG-3’（SEQ ID NO:2）；
定量检测CEBPA的引物为：
上游引物F：5’- AGGAGGATGAAGCCAAGCAGCT-3’（SEQ ID NO:7），
下游引物R：5’- AGTGCGCGATCTGGAACTGCAG-3’（SEQ ID NO:8）。
6.抑制EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1表达的试剂与促进基因CEBPA表达的试剂在制备治疗或辅助治疗鼻咽癌产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制LMP1表达的试剂选自沉默LMP1表达的siRNA、沉默LMP1表达的shRNA、沉默LMP1表达的反义寡核苷酸链中的至少一种；所述促进基因CEBPA表达的试剂为CEBPA的过表达载体。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述鼻咽癌为未分化鼻咽癌。
9.一种检测或辅助检测鼻咽癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含了定量检测EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1与基因CEBPA的表达量的试剂。
10.一种治疗或辅助治疗鼻咽癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含了抑制EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1表达的试剂与促进基因CEBPA表达的试剂。
CN201811400768.2A 2018-11-22 2018-11-22 Eb病毒潜伏膜蛋白在制备鼻咽癌分化诱导治疗诊断试剂中的应用 Active CN109536639B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811400768.2A CN109536639B (zh) 2018-11-22 2018-11-22 Eb病毒潜伏膜蛋白在制备鼻咽癌分化诱导治疗诊断试剂中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811400768.2A CN109536639B (zh) 2018-11-22 2018-11-22 Eb病毒潜伏膜蛋白在制备鼻咽癌分化诱导治疗诊断试剂中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109536639A CN109536639A (zh) 2019-03-29
CN109536639B true CN109536639B (zh) 2022-02-22

Family

ID=65849988

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811400768.2A Active CN109536639B (zh) 2018-11-22 2018-11-22 Eb病毒潜伏膜蛋白在制备鼻咽癌分化诱导治疗诊断试剂中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109536639B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111172284A (zh) * 2020-02-25 2020-05-19 郑州大学第一附属医院 用以对头颈癌进行监测、疗效评估的生物标记物
CN117431241B (zh) * 2023-04-14 2024-03-22 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 靶向LMP1的shRNA、载体及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101104852A (zh) * 2006-07-10 2008-01-16 中山大学肿瘤防治中心 与鼻咽癌相关的人类新基因loc344967及其编码的蛋白产物
CN102268477A (zh) * 2011-06-15 2011-12-07 中山大学肿瘤防治中心 一种与鼻咽癌相关的EB病毒miRNA的应用
CN103736103A (zh) * 2013-12-27 2014-04-23 中山大学附属肿瘤医院 抑癌基因atoh8及其编码蛋白的应用
CN103757104A (zh) * 2012-12-28 2014-04-30 中山大学肿瘤防治中心 用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒及基因芯片
CN104630353A (zh) * 2015-01-20 2015-05-20 中山大学肿瘤防治中心 一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估的试剂盒

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090192114A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-30 Dmitriy Ovcharenko miR-10 Regulated Genes and Pathways as Targets for Therapeutic Intervention

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101104852A (zh) * 2006-07-10 2008-01-16 中山大学肿瘤防治中心 与鼻咽癌相关的人类新基因loc344967及其编码的蛋白产物
CN102268477A (zh) * 2011-06-15 2011-12-07 中山大学肿瘤防治中心 一种与鼻咽癌相关的EB病毒miRNA的应用
CN103757104A (zh) * 2012-12-28 2014-04-30 中山大学肿瘤防治中心 用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒及基因芯片
CN103736103A (zh) * 2013-12-27 2014-04-23 中山大学附属肿瘤医院 抑癌基因atoh8及其编码蛋白的应用
CN104630353A (zh) * 2015-01-20 2015-05-20 中山大学肿瘤防治中心 一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估的试剂盒

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Downregulation of ATOH8 induced by EBV-encoded LMP1 contributes to the malignant phenotype of nasopharyngeal carcinoma;Zifeng Wang等;《Oncotarget》;20160503;第7卷(第18期);第26765-26779页 *
IKKα restoration via EZH2 suppression induces nasopharyngeal carcinoma differentiation;Min Yan等;《Nat Commun》;20140417;第5卷(第1期);第1-15页 *
Proteomic Characterization Reveals a Molecular Portrait of Nasopharyngeal Carcinoma Differentiation;Zhefeng Xiao等;《J Cancer》;20170211;第8卷(第4期);第570-577页 *
Quantitative proteomic analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded nasopharyngeal carcinoma using iTRAQ labeling, two-dimensional liquid chromatography, and tandem mass spectrometry;Zhefeng Xiao等;《J Histochem Cytochem》;20100630;第58卷(第6期);第517-527页 *
Zifeng Wang等.Downregulation of ATOH8 induced by EBV-encoded LMP1 contributes to the malignant phenotype of nasopharyngeal carcinoma.《Oncotarget》.2016,第7卷(第18期), *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109536639A (zh) 2019-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109536639B (zh) Eb病毒潜伏膜蛋白在制备鼻咽癌分化诱导治疗诊断试剂中的应用
CN107661509B (zh) 一种linc00673基因的靶向抑制剂及其用途
CN111617249B (zh) hsa_circ_0007444在制备治疗卵巢癌的药物中的应用
CN109321656B (zh) 蛋白depdc1作为诊断三阴乳腺癌的标记物的用途
CN111743912B (zh) 一种用于制备促进结肠癌细胞凋亡和抑制结肠癌细胞迁移的基因抑制剂
CN109988765B (zh) 一种fendrr基因的靶向抑制剂及其用途
CN114457158B (zh) Hsa_circ_0006867作为食管癌分子靶标在制备药物和试剂盒中的应用
CN107523566B (zh) 一种mcm3ap-as1基因的靶向抑制剂及其用途
CN110791566A (zh) 人shcbp1基因的用途及相关产品
CN109097358B (zh) 一种lncRNA在预防或治疗高血压中的应用
CN110129319B (zh) 一种PRALR的siRNA及其用途
CN112175997B (zh) 靶向外泌体pkm2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的应用
CN110643707B (zh) 一种与ESCC相关的lncRNA LLNLR-299G3.1及其应用
CN111088357B (zh) 针对escc的肿瘤标志物及其应用
CN109295220B (zh) miR-495-5p在制备诊断、预后、预防或治疗胰腺癌的产品中的应用
CN112980956B (zh) 抑制肺癌生长的靶标与诊断标志物uc.336及其应用
CN116637123B (zh) 敲降或下调C15orf39基因表达的试剂在制备治疗胃癌的药物中的应用
CN112999238B (zh) Linc00167在制备抑制肿瘤血管生成药物中的应用
CN111118154B (zh) Linc01272在制备肿瘤检测试剂和/或治疗药物中的应用
CN110241118B (zh) 一种zfas1基因的靶向抑制剂及其用途
CN114480390B (zh) 靶向抑制ZNF22基因表达的siRNA、siRNA质粒、慢病毒及其构建方法和应用
CN116656682A (zh) 一种galns抑制剂及其逆转鼻咽癌细胞生长的方法和应用
CN117551647A (zh) 一种用于抑制人CircRNA cdc20表达的干扰RNA及其应用
CN114908157A (zh) Snord89作为内膜癌诊断的标志物及其应用
CN117887851A (zh) Ccdc86作为肝癌诊断、预后生物标志物和治疗靶标的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant